ZEYTİNYAĞINA RENK VEREN YAPAY BİLEŞENLERİN ULTRAVİYOLE-GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTROFOTOMETRESİ İLE İNCELENMESİ Işılay Bal 1, Ümran Seven 2*, Şeref Güçer 3 1 Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü 4. Sınıf Öğrencisi 2, 3 Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü 16059 Görükle/Bursa * useven@uludag.edu.tr Zeytinyağı, zeytin ağacı (Olea europaea sativa) meyvelerinden elde edilen, hiçbir kimyasal işlem görmeden doğal hali ile tüketilebilen, oda sıcaklığında sıvı olan bir yağdır. Zeytinin yetiştirildiği yer, olgunluk derecesi, hasat tekniği, yağ çıkarma sistemi ve muhafaza şekli zeytinyağı kalitesine etki eden faktörler arasındadır. Bununla birlikte zeytinyağına renk veren bileşenler de karakterizasyon çalışmalarında ve yağın kalitesinin saptanmasında önem arz etmektedir (1,2). Doğal zeytinyağındaki renklendiriciler ve bunların kimyasal yapıları bilinmekle birlikte karışım halinde piyasaya sunulmuş zeytinyağı örneklerinde farklı bileşenler mevcut olabilmektedir. Bu bileşenlerin belirlenmesinde ise örnek hazırlama basamağı ölçüm basamağının gereklerini karşılayacak şekilde düzenlenmelidir. Çalışmamızda, zeytinyağına doğal rengini veren bileşenlerin incelenmesi ve yağ örneklerinde katkı maddesi olarak kullanılabilecek boyar maddelerin analizi üzerinde durulmaktadır. Bu amaçla, yağda çözünen ve gıda maddelerinde kullanımı yasaklanmış azo boyarmadde sınıfında yer alan sudan boyalarının zeytinyağında kullanılması durumunda yağdan ekstraksiyonu üzerinde incelemeler yapılmaktadır. Boyarmaddenin uygun ekstraksiyon yöntemini takiben ultraviyole-görünür bölge spektrofotometresi (UV-VIS) ile kalitatif ve kantitatif analizini sağlayabilecek bir analitik yöntem önerisi geliştirilmekte ve bu yöntemin zeytinyağında farklı azo boyar maddeler kullanıldığındaki uygulanabilirliği tartışılmaktadır. Anahtar Kelimeler: Zeytinyağı, renk, reklendirici, ultraviyole-görünür bölge spektrofotometresi, sudan I. Giriş Renk, gıdanın önemli özelliklerinden biridir. Gıdalara renk verici kimyasalların katılmasının başlıca iki nedeni bulunmaktadır. Birincisi; Işığa, havaya, aşırı sıcağa, neme ve depolama koşullarına maruz kalmasından dolayı renk kaybını dengelemektir. İkincisi ise; gıda hammaddesindeki doğal veya mevsimsel değişiklikleri veya tüketici beklentilerini karşılamak için işleme ve depolamanın etkilerini telafi etmek olarak belirtilmiştir (Kötü kalitesini maskeleme veya gizleme amacıyla renklerin kullanımı kabul edilemez) (3). Tek başına gıda olarak tüketilmeyen, gıda ham maddesi ve/veya gıda işlemeye yardımcı madde olarak kullanılmayan, tek başına besleyici değeri olan veya olmayan, seçilen teknoloji gereği kullanılan işlem sırasında kalıntı veya türevleri mamul maddelerde bulunabilen, gıdaların hazırlanması, tasnifi, işlenmesi, ambalajlanması, taşınması, depolanması ve dağıtımı sırasında gıda maddelerinin tat, koku, görünüş, yapı ve diğer niteliklerini korumak, düzeltmek veya istenmeyen değişikliklere engel olmak amacıyla kullanımına izin verilen maddeler gıda katkı maddeleri olarak tanımlanır (4). Özetle; Katkı maddeleri, gıda maddelerinin dayanıklılığını arttırmak, içindeki şekeri telafi etmek ve gıda maddelerine, arzu edilen tadı, kıvamı ve rengi alması için ilave edilen maddelere verilmiş ortak bir terimdir. Kullanılan katkı maddeleri her zaman beyan edilir. Bunlar bazen kendi adları ile bildirilir, bazı zamanlar da ise kendilerine verilmiş avrupa kodu ile bildirilir (E-numarası). Katkı maddeleri dört ana gruba ayrılmıştır; koruyucu katkı maddeleri, antioksidanlar, kıvam verici maddeler ve renk katkı maddeleri. Herbirinin belli bir görevi vardır. Koruyucu katkı maddeleri (E-numarası 200 299 arası) ve antioksidanlar (E 300 399), bakteri, mantar ve mayanın oluşmasını engelleyerek, yiyeceğin kısa zamanda bozulmasını önler. Renk katkı maddeleri yiyeceğe arzu edilen rengi verir. E-numarası 100 199 arası ve kıvam katkı maddeleri veya 183
koyulaştırıcı katkı maddeleri (E 400 499) ürünlerin arzu edilen kıvamda olmasını sağlar. Diğer yaygın katkı maddeleri tatlandırıcı maddelerdir (E-numarası 950 ve yukarısı) (5). Gıda katkı maddesi kanser ilişkisi renk verici maddeler için de düşünülmektedir. Bugün kanser yapıcı olduğu düşünülen renk vericilerin kullanılması yasaktır. Ancak günümüzde üreticiler tarafından suistimali en çok yapılan katkı maddesi renk vericilerdir. Şekerlemeler ile yapılan bir araştırmada renk vericilerin sadece %21 oranında uygun görülenlerden ve uygun dozda kullanıldığını göstermiştir. Geri kalan %64 lük kısmın izin verilenlerden fakat yüksek miktarlarda kullanıldığını, %15 in ise izin verilmeyen renk vericilerden olduğunu göstermiştir (6). Zeytinyağında Renklendiriciler Zeytin yağı kalitesine etki eden faktörlerin etki derecelerine bakıldığında zeytinin olgunluk derecesinin % 50, zeytin hasat tekniğinin % 30, yağ çıkarma sisteminin % 15 ve muhafaza şeklinin de % 5 kaliteye etki etmekte olduğu bildirilmektedir (7). Zeytinyağının bileşenleri içinde renklendiricilerin yeri çizelge 1 de görülmektedir (8). Çizelge 1. Zeytinyağı bileşenleri 184 Temel Bileşenler (% 99) (Sabunlaşan Maddeler) Eser Bileşenler ( % 1) (Sabunlaşmayan Maddeler) Zeytinyağı Bileşenleri Yağ Asitleri Oleik Asit (% 56 83) Linoleik Asit (% 3.5 20) Palmitik Asit (% 7.5 20) Stearik Asit (% 0.5 5.0) Linolenik Asit (% < 1.5) Alfa Tokoferol ( 12 150 mg / kg) Steroller (180 260 mg / 100 g yağ) Fenolik Bileşenler (30 500 mg /kg) Hidrokarbonlar Triterpenik Alkoller (255 mg /100 g yağ) Alifatik Alkoller (290 mg/ 100 g yağ) Fosfolipitler (40 135 mg / kg) Aroma Bileşenleri (250 500 mg / kg) Renk Vericiler Klorofiller (1 10 mg / kg) Feofitinler (0.2 24 mg / kg)) Kaynak: http://www.zae.gov.tr/zeytinyagi/bilesen.htm Gıda Renkleri Nasıl Tanımlanır? Bir gıda rengi, gıda katkı maddesidir ve öncelikle gıdaya renk katmada veya gıdanın renginin geri kazandırılmasında kullanılır. Renklendiriciler aşağıdakileri kapsamaktadır: Herhangi bir doğal gıda bileşeni ve normalde gıda olarak tüketilmeyen ve gıda bileşeni olarak kullanılmayan herhangi bir doğal kaynak (örneğin tohum, meyve ve sebzelerden izole edilmiş renkler) gıda renklerinin kullanımı gittikçe artmaktadır. Kimyasal sentez veya biyosentez ile üretilmiş doğala özdeş ürünler, Tartrazin gibi insan yapımı sentetik ürünler, Doğal veya sentetik olsa da bütün renk katkılarının güvenliği, kesinlikle test edilmeli ve bu testler periyodik olarak tekrarlanmalıdır (9).
Günümüzde gıda sanayinin gelişmesine bağlı olarak uygulanan işleme tekniklerinin gıdaların görünüş özellikleri üzerinde meydana getirdiği olumsuz etkiler, gıdaların teknolojik nedenlerle renklendirilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmıştır. Gıdaları tüketici için daha cazip hale getiren bu renklendiriciler arasında gıdalara eklenmesi yasak olan boyalarda yer almaktadır. Buna örnek olarak bazı azo grubu renklendiricileri verebiliriz. Azo grubu renklendiricileri en çok kullanılan sentetik organik renklendiricilerdendir. Bu boyaların bir kısmının toksikolojik etkilerinden dolayı gıdalarda kullanımı yasaklanmıştır. Çünkü bazı azo boyalarının oral alımla aminlere parçalanabilmesi ve bazı aminlerinde kanserojen olması sebebiylen bu boyaların gıdalarda kabul edilebilir bir sınır düzey bulunmamaktadır Bu boyalardan sudan I kanserojen olarak belirlenmiş ve gıdalarda yasaklanmıştır (10). Boyanın yapısı çizelge 2 de görülmektedir (11) Çizelge 2. Sudan I in kimyasal yapısı ve karakteristik özellikleri Sudan I (C 16 H 12 N 2 O) Molekül Kütlesi=248,284 g/mol N N HO Erime Noktası ( C ) Sudaki Çözünürlük Buhar Basıncı (mm Hg) 134 * 0,674 ** 7,3 10-8** * :Teorik, ** : Tahmini, Sıcaklık=25 C Kaynak: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ Müsaade edilen gıda renklendiricileri ve bunların maksimum seviyeleri Council Directive 94/36/EC de belirtilmiştir. Sudan boyaları illegal olarak kullanılabilen sarı-turuncu renkli iyonik olmayan ve yağda çözünen; ayrıca daha çok endüstriyel alanda kullanılan boyalardır. Bunların tayininde UV-VIS, LC ve LC-MS teknikleri yaygın olarak kullanılırken; eser düzeyde bulunmaları halinde LC-MS uygun bir teknik olarak görülmüştür (12 18). Materyal ve Yöntem Esterleştirme çalışmaları için 10mL 3M lık potasyum hidroksit çözeltisi-90 ml metanol içeren metanolik sodyum hidroksit çözeltisi ve 10mL 3M lık potasyum hidroksit çözeltisi- 90 ml etanol içeren etanolik sodyum hidroksit çözeltisi kullanılmıştır. Yaklaşık 0,05g zeytinyağı ile yaklaşık 0,005g zeytinyağı ve 0,001g boya içeren standart katmalı örneklere 10mL metanolik potasyum hidroksit çözeltisi eklenerek 20 ml lik cam viallere alınmış; aynı işlemler etanolik potasyum hidroksit çözeltisi kullanılarak tekrarlanmıştır. Esterleştirme işlemi, vialleri, 80 C ye ısıtılan su banyosunda 30 dakika bekletilerek gerçekleştirilmiştir. Oda sıcaklığına soğutulan örnekler 70 ml n-hegzan ile ekstrakte edilmiş ve hegzan fazı önce 70 C de döner vakum buharlaştırıcıda 2 ml kalana kadar; sonra azot atmosferinde kuruluğa kadar uçurulmuştur. Kalıntı 4 ml metanolde çözülerek geri kazanım değerlerini belirleyecek UV/VIS ölçümleri için uygun derişimlerde seyreltik çözeltiler hazırlanmıştır. Metanolde sudan I boyası standart çözeltileri de (1, 3, 5, 10, 20 mg/l) hazırlanmış; tüm çözeltilerin ultraviyole-görünür bölge spektrofotometresinde ölçümleri yapılmıştır. Ayrıca karşılaştırma amacı ile işlem görmemiş yağ örneği ile işlem görmemiş ve sudan I boyası katılmış yağ örneğinin de UV-VIS spektrumu alınmıştır. Çalışmamızda ATI UNICAM UV 2 model UV-VIS spektrofotometre kullanılmıştır. 185
Bulgular ve Tartışma UV-VIS spektrofotometre ile elde edilen veriler çizelge 3 ve şekil 1 de belirtilmiştir. Çizelge 3. UV-VIS ile elde edilen analitik parametreler ( max =479 nm) Sudan I Kalibrasyon Eğrisi y=0,0465x+0,0075 R 2 =0,9977 LOD LOQ 0,037 0,124 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0465x + 0,0075 R 2 = 0,9977 0 5 10 15 20 25 Şekil 1. Kalibrasyon eğrisi (UV-VIS) İşlem görmemiş yağ örneğinin spektrumu ve sudan boyası katılmış yağ örneğinin spektrumu ile absorbans değerleri kıyaslandığında yüzde geri kazanım 107,8 olarak tespit edilmiştir. Bu iki spektrum, esterleşme yapılmış örnek spektrumuna göre daha komplekstir, zemin sinyalinde yükselme ve çakışmalar gözlenmiştir. Bu nedenle yüzde geri kazanımı %50 altına düşse de esterleşme sonrası UV-VIS spektrofotometrede çalışma kolaylığı olduğu görülmektedir. Ayrıca etanol ile yapılan esterleştirme işlemi metanol ile karşılaştırıldığında yüzde geri kazanım değeri daha yüksek olduğundan tercih edilebilir. Sonuç Zeytinyağının işlenmesi sırasında doğal pigment kompozisyonundaki değişimler rengi etkileyen faktörlerin başında gelmektedir. Çalışmamızda zeytinyağına katkı maddesi olarak yağda çözünen boyalar katılması halinde bunların tespitlerine yönelik metod gelişimi, renk bakımından uygun olabilecek sudan I boyarmaddesi model alınarak yapılmıştır. Zeytinyağının kompleks yapısı nedeni ile doğrudan UV-VIS analizlerinde beklendiği üzere zorluklar olacağı görülmektedir. Ancak uygun ekstraksiyon, deriştirme ya da esterleştirmede olduğu gibi yapının kimyasal olarak kısmen değiştirilmesi ile analizlerinin yapılabileceği kanısına varılmıştır. Kantitatif analizde UV-VIS tekniğinin yetersiz kaldığı, bu amaçla kaynama noktası düşük olan parçalanma ürünleri üzerinden gaz kromatogarfisi-kütle spektrometresi (GC- MS) ile çalışılabileceği düşünülmektedir. Kaynaklar 1. Zeiner M, Steffan I, Cindric I. J.2005. Determination of trace elements in olive oil by ICP- AES and ETA-AAS:A pilot study on the geographical characterization. Microchemical Journal, 81:171-176. 2. Zeytinyağı ve çeşitleri. http://www.gida2000.com/kpk_k.htm 3. http://wwgıda Katkı Maddeleri Nedir? 4. http://www.saglikligida.com/hijyen.html 5. http://www.naaf.no/tr/astm-kols-alerji-ve-egzama-hakknda-bilgiler/mat/faktaarkoverfolsomhet-mot-tilsetningsstoffer-tyrkisk-faydal-bilgiler-gda-katk-maddelerine-kar-arhassaslk/ 186
6. http://www.ailehekimince.com/gidakatkimaddeleri.htm 7. http://www.gida2000.com/kpk_k.htm 8. http://www.zae.gov.tr/zeytinyagi/bilesen.htm 9. http://www.guncelle.com/lise-hayati/334732-g-da-sanayiinde-kullan-lan-boyar-maddelernelerdir.html 10. http://www.tarimsalpazarlama.com/makale.php?id=1825 11. Kaynak: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 12. Cornet V, Govaert Y, Moens G, Van Loco J, Degroodt JM. 2006. Development of a fast analytical method for the determination of sudan dyes in chili- and curry-containing foodstuffs by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection. Journal of Agrıcultural And Food Chemıstry, 54: 639 644. 13. Calbiani F, Careri M, Elviri L, Mangia A, Zagnoni I. 2004. Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan azo-dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole orthogonal-acceleration time of flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1058: 127 135. 14. Calbiani F, Careri M, Elviri L, Mangia A, Pistara L, Zagnoni I. 2004. Development and in-house validation of a liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of Sudan I, Sudan II, Sudan III and Sudan IV in hot chilli products. Journal of Chromatography A, 1042: 123 130. 15. Ma M, Luo XB, Chen B, Sub SP, Yao SZ. 2006. Simultaneous determination of watersoluble and fat-soluble synthetic colorants in foodstuff by high-performance liquid chromatography-diode array detection-electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1103: 170 176. 16. Zhang YP, Zhang YJ, Gong WJ, Gopalan AI, Lee KP. 2005. Rapid separation of Sudan dyes by reverse-phase high performance liquid chromatography through statistically designed experiments. Journal of Chromatography A,1098: 183-187. 17. Ghanadzadeh, A; Ghanadzadeh, H; Ghasmi, G. 2000. On the molecular structure and Aggregative properties of Sudan dyes in the anisotropic host. Journal of Molecular Liquids, 88:299-308. 18. Puoci F, Garreffa C, Iemma F, Muzzalupo R, Spizzirri UG, Picci N. 2005. Molecularly imprinted solid phase extraction for detection of Sudan I in food matrices. Food Chemistry, 93:349-353. 187