Stabil KOAH Olgularında Balgam ve Bronkoalveoler Lavajda İnflamatuvar Hücrelerin Karşılaştırılması ve Bronş Biyopsisinde Patolojik Değişikliklerin İncelenmesi # Erdoğan ÇETİNKAYA*, Figen KADAKAL*, Faruk ALKAN**, Nail YILMAZ***, Günay Aydın TOSUN***, Veysel YILMAZ*, Sema UMUT*** * Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, ** İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, *** İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, İSTANBUL # Bu çalışma, XXV. Türkiye Solunum Araştırmaları Derneği Ulusal Kongresi (5-9 Haziran 1999) nde serbest bildiri olarak ve European Respiratory Society 1999 Annual Congress Madrid, Spain October 9-13 de poster olarak sunulmuştur. ÖZET Çalışmamızın amacı; stabil KOAH lı hastalarda, balgamda ve bronkoalveoler lavaj (BAL) daki inflamatuvar hücreleri karşılaştırmak ve bronş mukozasındaki değişiklikleri saptamaktı. Stabil 10 KOAH lı hasta çalışmaya alındı. Olguların yaşları 39-62 arasında, ortalama 50 ± 8 yıl olup hepsi erkekti. Ortalama 39.2 ± 20.6 (20-76) paket/yıl sigara içmekteydiler. Öksürük, balgam ve nefes darlığı tümünde mevcuttu. Solunum fonksiyon testlerinde FEV 1 mutlak ortalama 1.70 ± 0.33 (min 1.26- max 2.24 L), beklenen ortalama %53.4 ± 3.03 (min-max %50-60). Bronkoskopiden önce spontan olarak balgam alındı. Fiberoptik bronkoskopi ile orta lobdan ya da linguladan BAL yapıldı, sağ alt lob bazal segment karinalarından biyopsiler alındı. Bronş biyopsileri ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu (EM) ile incelendi. Olguların balgamda hakim olan hücre nötrofil iken, BAL da makrofajlardı. Balgamda alveoler makrofaj %13, epitel hücreler %7, lenfositler %2, nötrofiller %78 oranında saptandı. Buna karşılık BAL da makrofajlar %80, nötrofiller %11, lenfositler ise %9 oranındaydı. Bronş biyopsisinin ışık mikroskobik incelemesinde bronş epitel deskuamasyonunda, goblet hücrelerinde ve silsiz hücrelerde artma mevcuttu. Lenfosit ve nötrofil infiltrasyonu dikkat çekici idi. EM incelemelerde goblet hücre artışı ve bu hücrelerde endoplazmik retikulum artışı, protein sentezi artışına uygun görüntüler, silendirik epitel hücrelerinde sil dejenerasyonu, siliya kaybı mevcuttu. Polimorf lökosit artışı, lenfosit artışı, plazma hücre artışı ve bu hücrelerde ribozomal artışlar vardı. Nonselüler bazal membran kalınlaşması ve bunun altındaki inflamatuvar hücreler ve fibroblast artışı dikkat çekici idi. ANAHTAR KELİMELER: KOAH, balgam, bronş biyopsisi, bronkoalveoler lavaj, ışık mikroskobu, elektron mikroskobu SUMMARY COMPARISON OF INFLAMMATORY CELLS IN SPUTUM AND BRONCHOALVEOLAR LAVAGE, AND INVESTIGATION PATHOLOGIC CHANGES IN BRONCHIAL BIOPSIES IN PATIENTS WITH STABLE COPD We aimed to compare the inflammatory cells in bronchoalveolar lavage (BAL) and in sputum to determine the changes in the bronchial mucosa in subjects with stable chronic obstructive pulmonary diseases (COPD). We examined 10 male subjects with stable COPD (mean age 50 ± 8 years). The mean predicted FEV 1 values were 53.4 ± 3.03 sputum was taken spotaneously before bronchoscopy. BAL was performed with fiberoptic bronchoscope either from a segmental bronchus of the middle lobe or of the lingula. Biopsies were taken from a subcarina of basal segment bronchi of the right lower lobe. Bronchial biopsies were examined with light and electron microscopy (EM). The predominant cells were neutrophils (78%) in the sputum. They were followed by alveolar macrophages (13%), epithelial cells (7%) and lymphocy- 75
Çetinkaya E, Kadakal F, Alkan F, Yılmaz N, Tosun GA, Yılmaz V, Umut S. tes (2%). The percentages of cells were found to be 80% for macrohages 11% for neutrophis and 9% for lymphocytes in BAL. Light microscopic examination of the bronchial biopsy showed an increase goblet cells, desquamation in bronchial epithelial and cells without cilia. Infiltration of lymphocytes an neutrophils was remarkable. EM examinations suggested an increase endoplasmic reticulum and protein synthesis in goblet cells. Cilia s degeneration and loss of cilia were apparent in cylindric epithelial cells. The thickenin of basement membrane, the increase of fibroblasts and the inflammatory cells beneath the membrane were significant. KEY WORDS: COPD, sputum, bronchial biopsy, bronchoalveolar lavage, light microscopy, electron microscopy GİRİŞ Son yıllarda, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) nda stabil dönemde hava yollarında inflamasyonun varlığı giderek önem kazanmıştır. Bu inflamasyonun başlıca hücreleri ise nötrofil, makrofaj ve CD8 lenfositlerdir (1,2). Bu çalışmada, stabil KOAH lı hastalarda, balgamda ve bronkoalveoler lavaj (BAL) daki inflamatuvar hücrelerin karşılaştırılması ve bronş mukozasındaki değişikliklerin saptanması amaçlandı. GEREÇ ve YÖNTEM American Thoracic Society (ATS) konsensus raporuna göre KOAH tanısı konulan 10 stabil hasta çalışmaya alındı. Hastaların yaşları 39-62 arasında olup ortalaması 50 ± 8 yıldı ve hepsi erkekti. Hastalık süreleri 4-38 yıl arasında değişmekteydi. Öksürük, balgam çıkarma ve nefes darlığı yakınmaları tümünde mevcuttu. Hepsi sigara içiciydi. İçilen sigara ortalaması 39.2 ± 20.6 paket/yıl (20-76) idi. Kendilerinde ya da ailelerinde astım ya da allerjik rinit öyküsü ve KOAH dışında pulmoner veya sistemik hastalık bulgusu yoktu. Prick testlerinde aeroallerjen ekstraktlarına karşı herhangi bir allerji saptanmadı. Solunum fonksiyon testlerinde mutlak FEV 1 ortalaması 1.70 ± 0.33 (1.26-2.24 L), beklenen ortalama yüzdesi %53.4 ± 3.03 (%50-60) idi. Tüm hastalara 200 µg salbutamol inhalasyonundan 15 dakika sonra yapılan reversibilite testinde FEV 1 de artış %12 den azdı. Kan gazlarında po 2 ortalaması 67.7 mmhg, pco 2 ortalaması 45.4 mmhg idi. Bronkoskopide premedikasyon olarak diazepam ve atropin, lokal anestezik olarak da %2 lik lidokain kullanıldı. Fiberoptik bronkoskopi (Olympus BF Type 1 T 30) lingula ya da orta lob bronşunun subsegmentine wedge yapılarak BAL yapıldı. 100 ml serum fizyolojik kullanıldı. 20 ml enjektörlerle 5 kez verildi ve yavaş şekilde aspire edildi. Verilen miktarın yaklaşık %60 (60 ml) ı geri alındı. 50 ml nin üstündeki lavaj yeterli kabul edildi. Milimetreküpteki hücre miktarları, total BAL miktarı gazlı bezden süzülerek tüm materyal santrifüj edildi. 1 cm 3 e indirgenen miktar homojenize edilerek buradan kan hücreleri (lökositler) sayar gibi Thoma sayma kamerasında mm 3 teki total hücre miktarı bulundu. İkiyüz hücre sayılarak elde edilen değerler yüzde oranlara indirgendi (3-6). Balgam bronkoskopiden önce alındı. Yaklaşık 3-5 cc balgam üzerine aynı miktarda serum fizyolojik ilave edilip materyal homojenize edildi. Santrifüj işleminden sonra süpernatandan direkt yayma yapıldı. Lökositlerin ayrımını yapmak, sayılarını belirlemek ve squamöz epitel hücrelerini ayırmak için May Grunwald-Giemsa ile boyandı. İkiyüz hücre sayılarak yüzde değerler bulundu. mm 3 teki total hücre miktarını saptamak için de BAL daki gibi işlemler yapıldı (7). Bronş biyopsileri sağ alt lob bazal segment karinalarından alındı (2-5 adet). Biyopsiler, ışık mikroskopisi için formole, elektron mikroskopisi için gluteraldehid solüsyonu içerisine ayrı ayrı konularak laboratuvara nakledildi. Biyopsi incelemeleri; rutin parafin blokları takiben 4 µ kalınlığında kesitler alınarak hematoksilen eozin ile boyanıp ışık mikroskobuyla incelendi. Elektron mikroskobik inceleme ise; gluteraldehidli solüsyondaki biyopsi materyaline ön fiksasyon işlemlerinden sonra Osmium tetraoksit ile muamele ederek postfiksasyon işlemi yapıldı. Dehidratasyon işlemleri sonucu materyal gömme ortamına alındı. Ultramikrotomda kesitler alındıktan sonra 500A kesitlik parçalar boyandı ve M 10 elektron mikroskobu ile ultrastrüktürel yapı değerlendirildi. SONUÇLAR Balgamda total hücre ortalaması 21 x 10 6 /mm 3 (12-25 x 10 6 mm 3 ) idi. Formülde %78 ile hakim hücre nötrofillerdi. Bunu %13 ile makrofaj, %1.5 ile lenfosit izlemekteydi (Tablo 1). BAL da total hücre ortalaması 26 x 10 6 /mm 3 (22-38 x 10 6 /mm 3 ) idi. Hücre profilinde ortalama %80 makrofaj, %10.9 nötrofil ve %9 oranında lenfosit saptandı (Tablo 2). 76
Stabil KOAH Olgularında Balgam ve Bronkoalveoler Lavajda İnflamatuvar Hücrelerin Karşılaştırılması ve Bronş Biyopsisinde Patolojik Değişikliklerin İncelenmesi Tablo 1. Olguların balgam sitolojisi sonuçları (% oranları). PNL* Lenfosit Eozinofil Alveoler makrofaj Bronşiyal epitel Olgular (%) (%) (%) (%) hücresi (%) 1 (GK) 100 - - - - 2 (YB) 88 - - 12-3 (NA) 46 - - 37 17 4 (AY) 100 - - - - 5 (YA) 78 10-8 4 6 (DP) 60 6-8 20 7 (SÖ) 88 - - 12-8 (YE) 88 - - 10 2 9 (AT) 58 - - 22 20 10 (KT) 74 - - 22 4 * PNL: Polimorfonükleer lökosit. Tablo 2. Olguların bronkoalveoler lavaj sitolojisi sonuçları (% oranları). PNL* Lenfosit Eozinofil Alveoler makrofaj Bronşiyal epitel Olgular (%) (%) (%) (%) hücresi (%) 1 (GK) 3 12-85 - 2 (YB) 1 15-84 - 3 (NA) 4 6-90 - 4 (AY) 34 12-54 - 5 (YA) 10 6-84 - 6 (DP) 3 12-85 - 7 (SÖ) 3 8 1 88-8 (YE) 8 8-84 - 9 (AT) 5 10-85 - 10 (KT) 38 2-58 - * PNL: Polimorfonükleer lökosit. Biyopsi materyallerinin ışık mikroskobu ile incelenmesinde bronş epitel deskuamasyonu, goblet ve siliyasız hücre artışı, polimorf nüveli lökosit ve lenfosit infiltrasyonu saptandı. Hastalarımızın elektron mikroskobu bulguları; goblet hücrelerinde ve goblet hücrelerin sekretuar komponentinde artış, bu hücrelerde endoplazmik retikulum artışı, protein sentezinde artış, siliya dejenerasyonu, kaybı ve anomalisi, nötrofil, lenfosit ve plazma hücre infiltrasyonu, bu hücrelerde ribozom artışı, nonselüler bazal membran kalınlaşması olarak sıralanabilir (Resim 1,2,3). Resim 1. Siliya enine kesit. Siliyer dejenerasyon (elektron mikroskobu). 77
Çetinkaya E, Kadakal F, Alkan F, Yılmaz N, Tosun GA, Yılmaz V, Umut S. yapılan çalışmalarda belirtilmektedir (8,11). Bizim çalışmamızda olguların balgamında, stabil dönemde olmalarına rağmen belirgin düzeyde nötrofil yüksekliği gözlenmekteydi (%78.5). Stabil dönemdeki olgularımızın balgamında nötrofillerin yüksek oranda bulunması değişik şiddetlerde inflamasyon zeminine sahip olduklarını ve stabil dönemde bile inflamasyonun devam ettiğini düşündürmüştür. Resim 2. Bazal membran kalınlaşması (elektron mikroskobu). Resim 3. Bronş mukoza kalınlaşması, metaplazik epitel (elektron mikroskobu). TARTIŞMA Son yıllarda, KOAH gelişiminde genetik ve çevresel etkenlerin yanında hava yollarında kronik inflamasyonun da rolü olduğu ileri sürülmektedir (8-10). KOAH da akciğer inflamasyonunun mevcudiyeti günümüzde üç farklı yöntemle incelenmektedir: Balgam (spontan ya da indüklenmiş), bronşiyal ve bronkoalveoler lavaj ve bronkoskop aracılığıyla alınan ya da cerrahi örneklerden elde edilen bronş biyopsileridir. Bronkoskopik incelemeler daha invaziv ve tekrarlanmasının zor olması nedeniyle, spontan ya da indüklenmiş balgamda hücre sayımının kullanımı KOAH da bronş inflamasyonunun belirlenmesi için uygun noninvaziv metod olarak görülmektedir (6). Kronik bronşit zemininde gelişen KOAH lı olguların infeksiyonlara bağlı akut alevlenme dönemlerinde balgamda nötrofillerin yoğun olarak bulunduğu bilinmektedir. KOAH lı olguların stabil döneminde de balgamda hakim olan hücrelerin nötrofiller olduğu Normal, sigara içmeyen bireylerde BAL daki hücre profili makrofajlar %80-90, lenfositler %5-15, nötrofiller %1-2 ve eozinofiller %0.2-0.5 oranlarında bulunur. Skuamöz epitelyal hücreler esas olarak bulunmaz, bronşiyal hücreler nadiren bulunur. BAL da %1 in üzerinde epitelyal hücreler saptandığında bronşiyal materyalle kontamine olduğu kabul edilir (12). Sigara içimi BAL da, %80-90 ını makrofajların oluşturduğu, total hücre sayısında 5 kat artışa neden olmaktadır (13). Pesci ve arkadaşları KOAH lı olgularla normal bireyleri karşılaştırdıkları çalışmalarında, KOAH lı olguların bronş lavajında normal kişilere göre nötrofillerin sayısında artma, makrofajların ve lenfositlerin sayısında ise anlamlı azalma olduğunu saptamışlardır (14). Maestrelli ve arkadaşlarının çalışmasında, BAL da en belirgin hücre grubunun makrofajlar olduğu, balgamda ise nötrofil miktarının sayıca BAL dakinden fazla olduğu saptanmıştır (8). Çalışmamızda, BAL da ortalama makrofajlar %80, nötrofiller %10.9 ve lenfositler %9 oranında bulundu. Olgularımızda balgamdaki kadar olmasa da; BAL da da nötrofiller artmıştı. Bu artışın normal bireylerden fazla olması, KOAH lı olgularda stabil dönemlerde de inflamasyonun devam ettiğini ve bu durumunda bronşiyollerin ve alveollerin harabiyetinin nedeni olabileceğini düşündürmüştür. KOAH ta bronş duvarındaki patolojik değişikliklerin epitel deskuamasyonu, goblet hücre ve skuamöz metaplazisi, mukoz bezlerde artma, bronş düz kaslarında hipertrofi, subepitelyal fibrozis olduğu bilinmektedir. KOAH lı hastalardaki inflamasyonda nötrofiller, lenfositler ve doku makrofajları rol oynamaktadır. İnflamasyonun olduğu asıl bölge, kıkırdak yapılarının olmadığı küçük hava yollarıdır (15-17). Lacoste ve arkadaşları kronik bronşit ve KOAH lı olgularda yaptıkları bronşiyal biyopsi çalışmasında, bronş mukozasında bronşları infiltre eden asıl hücrelerin lenfositler gibi mononükleer hücreler ve nadiren de nötrofiller olduğunu saptamışlardır (18). 78
Stabil KOAH Olgularında Balgam ve Bronkoalveoler Lavajda İnflamatuvar Hücrelerin Karşılaştırılması ve Bronş Biyopsisinde Patolojik Değişikliklerin İncelenmesi BAL periferik hava yollarını ve alveoler boşluğunun hücrelerini örneklerken, balgamın daha çok santral hava yollarının hücrelerini temsil ettiği bilinmektedir. BAL da makrofajları, balgamında nötrofilleri, submukozada ise lenfositleri baskın bulmamız, yöntemlerin hava yollarının farklı kompartmanlarını incelediğinden kaynaklanmaktadır. Elektron mikroskobik incelemelerimizde subepitelyal alanda, nonselüler bazal membran kalınlaşması, bunun altında inflamatuvar hücreler ve fibroblast artışı saptamamız, literatürle uyumlu olarak, KOAH lı olgularda stabil dönemde de bronş mukozasında bir inflamasyon ve subepitelyal fibrozisin varlığını gösterebilir (19). Sonuç olarak, stabil dönemdeki KOAH lı olgularımızda balgamda nötrofiller, BAL da ise makrofajlar en baskın hücrelerdir. Bronş biyopsilerinde submukozada lenfositik bir inflamasyon ve bazal membran kalınlaşması saptanmıştır. KAYNAKLAR 1. Turato G, Di Stefano A, Meastrelli P et al. Effect of smoking cessation on airway inflammation in chronic bronchitis. Am J Respir Crit Care Med 1995;152:1262-7. 2. Saetta M. Airway pathology of COPD compared with asthma. Eur Respir Rev 1997;7:221-5. 3. Saltini C, Hance AJ, Ferrans VJ et al. Accurate quantification of cells recovered by bronchoalveolar lavage. Am Rev Respir Dis 1984;130:650-8. 4. Robert B, Hal B, Donald Z, Gray H. Bronchoalveolar lavage in allergic asthmatics. Am Rev Res Dis 1987;135: 1204-9. 5. Klech H, Pohl W. Technical recommendations and quidlines for bronchoalveolar lavage. Eur Respir J 1989;2: 561-85. 6. National Institutes of Health. Workshop summary and guidelines: Investigative use of bronchoscopy, lavage and bronchial biopsies in asthma and other airways disease. J Allergy Clin Immunol 1991;88:808-14. 7. Yılmaz N. Solunum sistemi sitolojisi. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, 1995;84-90. 8. Maestrelli P, Seatta M, Stefano AD et al. Comparison of leukocyte counts in sputum, bronchial biopsies, and bronchoalveolar lavage. Am J Respir Crit Care Med 1995;152:1926-31. 9. Cosio MG, Guerassimov A. Chronic obstructive pulmonary disease. Inflammation of small airways and lung parencyma. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:521-5. 10. Thompson AB, Daughton D, Robbins RA et al. Intraluminal airway inflammation in chronic bronchitis. Characterization and correlation with clinical parameters. Am Rev Respir Dis 1989;140:1527-37. 11. Ronchi MC, Piragino C, Rosi E et al. Role of sputum differential cell count in detecting airway inflammation in patients with chronic bronchial asthma or COPD. Thorax 1996;51:1000-4. 12. Drent M, Jacobs JA, Wagenaar SjSc. Bronchoalveolar lavage. In: Oliviere P, Dubois RM, eds. European Respiratory Monography. UK: ERS Journals Ltd, 2000;5:63-78. 13. Shapiro SD. The macrophage in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Med 1999;160(Suppl): 22-32. 14. Pesci A, Balbi B, Majori M et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 1998;12: 380-6. 15. Corrigan CJ, Kay AB. The roles of inflammatory cells in the pathogenesis of asthma and of chronic obstructive pulmonary disease. Am Rev Respir Dis 1991;143:1165-8. 16. American Thoracic Society. Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1995;152(Suppl): 77-120. 17. European Respiratory Society. Consensus statement: Optimal assessment and management of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 1995;8:1398-420. 18. Lacoste JY, Bousquet J, Chanez P et al. Eosinophilic and neutrophilic inflammation in asthma, chronic bronchitis, and chronic obstructive pulmonary disease. J Allergy Clin Immunol 1993;92:537-48. 19. Oktar H, Yılmaz N, Yaman M. Kronik bronşitli hastaların bronş mukozasındaki ultrastrüktürel değişimler. Solunum Hastalıkları Dergisi 1992;3:159-64. Yazışma Adresi Erdoğan ÇETİNKAYA Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Zeytinburnu/İSTANBUL e-mail: ecetinkaya@superonline.com 79