ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ SALVIA FRUTICOSA BİTKİ EKSTRAKTININ METABOLİK AKTİVATÖR VARLIĞINDA VE YOKLUĞUNDA İNSAN LENFOSİTLERİNDE GENOTOKSİK VE ANTİ-GENOTOKSİK ETKİSİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SALVIA FRUTICOSA BİTKİ EKSTRAKTININ METABOLİK AKTİVATÖR VARLIĞINDA VE YOKLUĞUNDA İNSAN LENFOSİTLERİNDE GENOTOKSİK VE ANTİ-GENOTOKSİK ETKİSİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 06/08/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir...... Prof.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Doç.Dr.Hasan Basri İLA Yrd.Doç.Dr.Ahmet KAYRALDIZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No FEF2009YL44. Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ SALVIA FRUTICOSA BİTKİ EKSTRAKTININ METABOLİK AKTİVATÖR VARLIĞINDA VE YOKLUĞUNDA İNSAN LENFOSİTLERİNDE GENOTOKSİK VE ANTİ-GENOTOKSİK ETKİSİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Yıl : 2010, Sayfa: 84 Jüri : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Doç. Dr. Hasan Basri İLA Yrd.Doç.Dr. Ahmet KAYRALDIZ Bu çalışmada, S9mix varlığında ve yokluğunda Salvia fruticosa (Sf) bitkisinin yaprak ekstraktının insan periferal lenfositlerinde genotoksik ve antigenotoksik etkileri; kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom anormalliği (KA), mikronükleus (MN) testleri ile araştırılmıştır. Sf yaprak ekstraktının sitotoksik etkisi de mitotik indeks (MI), proliferasyon indeksi (PI) ve nükleer bölünme indeksinin (NBI) hesaplanması ile saptanmıştır. Bu amaçla Sf yaprak ekstraktının 1.5, 3.0 ve 6.0 µl/ml lik dozları 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde denenmiştir. S9mix yokluğunda Sf yaprak ekstraktı KKD sayısını sadece 48 saatlik muamele süresinde artırmıştır. Tüm muamele sürelerinde ise KA sayısını arttırmış, Mitomycin C (MMC) ile beraber uygulandığında da MMC nin etkisini sinerjik bir şekilde indüklemiş fakat en yüksek dozda KKD oluşumu üzerine MMC nin etkisini artırmamıştır. Bu sonuçlara paralel olarak Sf yaprak ekstraktı MN sayısını da artırmış, 24 saatlik muamele süresinde MMC nin etkisini indüklerken 48 saatlik muamele sürelerinde MMC nin etkisini azaltmıştır. S9mix varlığında Sf yaprak ekstraktı KKD sayısını sadece muamelesiz kontrole nazaran artırmış ama Cyclophosphamide (Cyp) nin etkisini azaltmıştır. Halbuki en yüksek dozda Sf yaprak ekstraktı KA sayısını ve anormal hücre yüzdesini indüklemiş fakat Cyp nin etkisini artırmamıştır. Sf yaprak ekstraktı tek başına MN oluşumunu artırırken Cyp ile beraber kullanıldığında MN oluşumunu indüklememiştir. S9mix yokluğunda Sf yaprak ekstraktı tek başına MI i düşürerek sitotoksik etki yapmış fakat PI ve NBI ni düşürmemiştir. S9mix varlığında ise sitotoksik olmadığı, yüksek dozlarda ise Cyp nin sitotoksik etkisini artırdığı saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Salvia fruticosa, insan periferal lenfositleri, kardeş kromatid değişimi, kromozom anormalliği, mikronükleus I

ABSTRACT MSc THESIS THE GENOTOXIC AND ANTI-GENOTOXIC EFFECTS OF SALVIA FRUTICOSA PLANT EXTRACT IN HUMAN LYMPHOCYTES IN THE ABSENCE AND PRESENCE OF METABOLIC ACTIVATOR ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY Supervisor : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Year : 2010, Pages: 84 Jury : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Assoc.Prof. Dr. Hasan Basri İLA Assist. Prof. Dr. Ahmet KAYRALDIZ In the present study, the genotoxic and anti-genotoxic effects of Salvia fruticosa (Sf) leaf extract were tested with absence and presence of S9 mix using sister chromatid exchange (SCE), chromosome aberration (CA) and micronucleus (MN) formation test systems. The cytotoxicity of Sf leaf extract was also investigated by calculating the mitotic index (MI), proliferation index (PI) and nuclear division index (NDI). For this reason, the lymphocytes were treated with 1.5, 3.0 and 6.0 µl/ml concentrations of Sf leaf extract for 24h and 48h treatment periods. In the absence of S9 mix, Sf leaf extract alone increased SCE frequency at 48 hours treatment period however it induced the CA at all concentrations and at all treatment periods. When Sf leaf extract applied with MMC, the SCE and CA were synergically induced except the highest concentration of Sf leaf extract and MMC on induction of SCE. In parallel with these results, Sf leaf extract increased the number of micronucleus. Sf leaf extract induced the effect of MMC on MN frequency 24h treatment period, but it decreased the effect of MMC on MN frequency at 48h treatment period. In the presence of S9 mix, Sf leaf extract increased the number of SCE when compared with untreated control only while it reduced the effect of Cyp.Whereas Sf leaf extract induced the number of CA and the percentage of abnormal cell at the highest concentration, but it could not increase the effect of Cyp. Sf leaf extract alone increased the micronucleus formation, however Sf leaf extract and Cyp as a mixture could not induce MN formation. In the absence of S9mix Sf leaf extract showed a cytotoxic effect via decreasing the MI, however it did not decrease the PI and NDI. In the presence of S9mix, Sf leaf extract had no cytotoxic effect, however it induced the cytotoxicity of Cyp. Key Words: Salvia fruticosa, human peripheral lymphocytes, sister chromatid exchange, chromosome aberration, micronucleus. II

TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve bütün çalışmalarım boyunca bana rehber olan, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Yardımlarından dolayı Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a ve Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, Biyolog Mehmet BÜYÜKLEYLA ya, Arş.Grv.Erman Salih İstifli ye, Biolog Fezel NİZAM a, Biolog Handan ERBOĞA ya, Biolog Mehmet AKGÖL e ve Biolog Ayşe Mine YILDIZ a ayrıca teşekkür ederim. Hayatımın her aşamasında olduğu gibi eğitim sürecinde de yardım ve desteklerini esirgemeyen aileme de teşekkürlerimi borç bilirim. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de teşekkür ederim (Proje no: FEF2009YL44). III

İÇİNDEKİLER..SAYFA ÖZ... I ABSTRACT....II TEŞEKKÜR....III ÇİZELGELER DİZİNİ...VIII ŞEKİLLER DİZİNİ...IX SİMGELER VE KISALTMALAR....XII 1.GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 6 2.1. Tıbbi ve Aromatik Bitki Ekstraktları İle Yapılan Genotoksisite ve Sitotoksisite Çalışmaları... 6 2.2. Salvia Cinsine Ait Bitkilerin Ekstraktları İle Yapılmış Olan Genotoksisite ve Sitotoksisite Çalışmaları..... 11 3. MATERYAL VE METOD..... 17 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları......17 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler...17 3.1.1.1. Salvia fruticosa...... 17 3.1.1.2. Metanol... 18 3.1.1.3. Kromozom Medyumu...18 3.1.1.4. Kolşisin (Kolkisin)....18 3.1.1.5. Hipotonik Eriyik... 19 3.1.1.6. Fiksatif... 19 3.1.1.7. 5'-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd)... 19 3.1.1.8. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer)...19 3.1.1.9. Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği... 20 3.1.1.10. Giemsa... 20 3.1.1.11. Entellan... 20 3.1.1.12. Nitrik Asit (HNO3)... 20 3.1.1.13. Mitomycin C (MMC)...... 21 3.1.1.14.Cyclophosphamide (Cyp)... 21 IV

3.1.1.15.RPMI1640 Besi Yeri... 21 3.1.1.16.Cytochalasin-B...21 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları... 21 3.1.2.1. Hassas Terazi... 21 3.1.2.2. Santrifüj... 22 3.1.2.3. Mikroskop... 22 3.1.2.4. İnkübatör... 22 3.1.2.5. Steril Kabin 22 3.1.2.6. Su Banyosu... 22 3.2. Lamların Temizlenmesi... 23 3.3. Ekstraksiyon... 23 3.4. Genotoksisite Çalışmaları... 23 3.4.1. Metabolik Aktivatör Yokluğunda Test Metodu... 23 3.4.1.1. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması... 23 3.4.1.1.(1) Hücre Kültürünün Yapılması ve Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi... 23 3.4.1.1.(2) Preparatların Boyanması... 25 3.4.1.1.(3) Mikroskobik İnceleme... 26 3.4.1.2. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması...32 3.4.1.2.(1) Hücre Kültürünün Yapılması ve Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi... 32 3.4.1.2.(2) Preparatların Boyanması... 34 3.4.1.2.(3) Mikroskobik İnceleme... 34 3.4.2. Metabolik Aktivatör Varlığında Test Metodu... 36 3.4.2.1.S9 ve S9mix'in Hazırlanması... 36 V

3.4.2.2.KKD ve KA Yöntemi... 37 3.4.2.3. MN Yöntemi... 38 3.5. Anti-genotoksisite Çalışmaları... 38 3.6. Mikroskopta Fotoğraf Çekme... 38 3.7.İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi... 39 4. BULGULAR...41 4.1. Metabolik Aktivatör Yokluğunda (S9mix) Yapılan Çalışmaların Sonuçları... 41 4.1.1. Metabolik Aktivatör Yokluğunda (S9mix) Salvia fruticosa (Sf) Yaprak Ekstraktının KKD Üzerindeki Etkisi.... 41 4.1. 2. S9mix Yokluğunda Sf Yaprak Ekstraktının Kromozom Anormalliği (KA) Oluşumu ve Anormal Hücre (AH) Sayısı Üzerindeki Etkisi... 44 4.1. 3. S9mix Yokluğunda Sf Yaprak Ekstraktının Mikronükleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkisi... 50 4.1.4. S9mix yokluğunda Sf Yaprak Ekstraktının DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkisi... 53 4.2. S9mix Varlığında Yapılan Çalışmaların Sonuçları...57 4.2.1. Metabolik Aktivatör (S9mix) Varlığında Salvia fruticosa (Sf) Yaprak Ekstraktının (KKD Üzerindeki Etkisi... 57 4.2.2. S9mix Varlığında Sf Yaprak Ekstraktının Kromozom Anormalliği (KA) ve Anormal Hücre (AH) Oluşumu Üzerindeki Etkisi... 58 4.2.3. S9mix Varlığında Sf Yaprak Ekstraktının Mikronükleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkisi... 61 4.2.4. S9mix Varlığında Sf Yaprak Ekstraktının DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkisi... 62 5.TARTIŞMA...65 5.1. Salvia fruticosa Yaprak Ekstraktının İnsan Periferal Lenfositlerinde KKD, KA ve MN Oluşumu Üzerine Etkisi... 65 5.2. Salvia fruticosa Yaprak Ekstraktının Hücre Bölünmesi VI

Üzerine Etkisi...68 6.SONUÇ VE ÖNERİLER... 71 KAYNAKLAR... 73 ÖZGEÇMİŞ... 84 VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. S9mix yokluğunda değişik dozlarda Salvia fruticosa (Sf) Yaprak ekstraktı veya Sfyaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde ortalama kardeş kromatid değişimi (KKD) sayısı...42 Çizelge 4.2. S9mix yokluğunda değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal kromozom anormalliği ve anormal hücre yüzdesi...45 Çizelge 4.3. S9mix yokluğunda değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan lenfositlerinde mikronükleuslu binukleus hücre yüzdesi. 51 Çizelge 4.4. S9mix yokluğunda değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde replikasyon indeksi (RI), mitotik indeks (MI) ve nukleus bölünme indeksi (NBI)...54 Çizelge 4.5. S9mix varlığında değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde ortalama kardeş kromatid değişimi (KKD) sayısı..57 Çizelge.4.6. S9mix varlığında değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal kromozom anormalliği (KA) ve anormal hücre yüzdesi (AH)... 59 Çizelge 4.7. S9mix varlığında değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu binukleus hücre yüzdesi... 61 Çizelge 4.8. S9mix varlığında değişik dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde proliferasyon indeksi (PI), mitotik indeks (MI) ve nükleus bölünme indeksi (NBI)... 63 VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Kardeş kromatid değişiminin olduğu ve olmadığı durumun şematik olarak gösterilmesi...26 Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in kimyasal yapıları...27 Şekil 3.3. BrdUrd in DNA yapısına girmesi ile 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin ayırt edilmesinin şematik olarak açıklanması...29 Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar...30 Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar...30 Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar...31 Şekil 3.7. Bir (a) ve iki (b) nükleus içeren hücreler...35 Şekil 3.8. Üç nükleus içeren hücre...35 Şekil 3.9. Dört nükleus içeren hücre 36 Şekil 4.1. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre...43 Şekil 4.2. Sf ile muamele edilen insan lenfositlerinde KKD sayısı (1.5 µl/ml Sf yaprak ekstraktı,24h ) 43 Şekil 4.3. MMC (0.2 µg/ml) ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde indüklenmiş KKD sayısı,...44 Şekil 4.4. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde hücre başına düşen yapısal kromozom anormalliği 46 Şekil 4.5. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde anormal hücre yüzdesi. 46 Şekil 4.6. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve IX

korelasyon katsayısı (P=0.05) 47 Şekil 4.7. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P=0.04).. 47 Şekil 4.8. Kromatid kırığı (1.5 µl/ml Sf yaprak ekstraktı+0.2 µg/ml MMC, 24 saat ).. 48 Şekil 4.9. Tek kol birleşmesi (1.5µl/ml Sf yaprak ekstraktı+0.2 µg/ml MMC, 48 saat ).. 49 Şekil 4.10. Kromozom kırığı (3.0µl/ml Sf yaprak ekstraktı+0.2 µg/ml MMC, 24 saat ).. 49 Şekil 4.11. Kardeş kromatid birleşmesi (3.0 µl/ml Sf yaprak ekstraktı+0.2 µg/ml MMC, 48 saat ).. 50 Şekil 4.12. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MN.. 52 Şekil 4.13. Farklı boyutlarda 3 mikronükleus içeren binükleer hücre(3.0 µl/ml Sf yaprak ekstraktı+0.2 µg/ml MMC, 48 saat ). 52 Şekil 4.14. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI 55 Şekil 4.15. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI.. 55 Şekil 4.16. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde NBI 56 Şekil 4.17. S9mix yokluğunda farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı+mmc karışımı ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksinin doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P=0.03) 56 X

Şekil 4.18. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/hücre. 58 Şekil 4.19. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde hücre başına düşen yapısal kromozom anormalliği. 59 Şekil 4.20. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde anormal hücre yüzdesi... 60 Şekil 4.21. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde hücre başına düşen KA sayısının doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P=0.01) 60 Şekil 4.22. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MN lu binükleer hücre yüzdesi.. 62 Şekil 4.23. S9mix varlığında farklı dozlarda Sf yaprak ekstraktı veya Sf yaprak ekstraktı+cyp karışımı ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI, MI ve NBI.. 63 XI

SİMGELER VE KISALTMALAR AH :Anormal Hücre Yüzdesi BrdUrd :5 -Bromo-2 -Deoxyuridine CA :Chromosome Aberration CE :Chromatid Exchange CMA :Klormadin Asetat Cyp :Cyclophosphamide DNA :Deoksiribonukleik Asit DPPH : 1,1-diphenyl 2-picryl hydrazyl ISCN : International System for Human Cytogenetic Nomenclature (Uluslararası İnsan Sitogenetik Adlandırma Sistemi) KA :Kromozomal Anormallikleri KCl :Potasyum klorür KKD :Kardeş Kromatid Değişimi LP :Lipid Peroxidation MGA :Minimal Glikoz Agar MI :Mitotik indeks MMC :Mitomycin C MN :Mikronükleus NaCl :Sodyum klorür NBI :Nukleus Bölünme İndeksi PI :Proliferasyon indeksi RA :Rosmarinik Asit rpm :Round (Rotor) Per Minute (devir/dakika) S9mix :Metabolik Aktivatör SCD :Sister Chromatid Differentiation SCE :Sister Chromatid Exchange Sf :Salvia fruticosa SL :Salvia lavandulifolia SO :Salvia officinalis XII

SSC :Standart Saline Citrate TAA :Total Antioksidant Aktivite WHO : World Health Organisation (Dünya Sağlık Örgütü) XIII

1.GİRİŞ 1.GİRİŞ İnsanoğlu tıbbi bitkileri, tarihin en karanlık devirlerinden beri bilmekte idi. Eski milletlerin tıbbi bitkiler hususundaki bilgilerini, yaşadıkları devirlerden kalma kitabelere ve arkeolojik materyallere istinaden anlamaktayız. Asurlar'dan kalma, kil tabakalara yazılmış, birçok hastalık ve bitki adları mevcuttur. İnsanlar yüzyıllardan beri hastalıklara karşı elde ettikleri bitkiler ile çare bulmaya çalışmışlardır. Bitkiler ile hastalıkları tedavi etme yöntemleri oldukça başarılı sonuçlar vermiştir. Bundan dolayı bitkilerin tedavide kullanımı günümüze kadar devam etmiştir. Birçoğu tesadüfen, birçoğu da merak sonucu denenerek etkileri anlaşılan doğal ilaçlar, kulaktan kulağa yayılarak herkes tarafından tanınmış ve yıllar geçtikçe daha farklı bitkilerin başka dertlere de deva oldukları anlaşılmıştır. Diğer bir gelişme de bu bitkilerin, beslenmede lezzet, koku, tad verici ve iştah açıcı özelliklerinin anlaşılması ve kullanımının yaygınlaşmasıdır. Şifalı bitkilerin özellikleri ve kullanımları hakkındaki ilk Avrupalı, bilimsel eser, De Materia Medika (Şifalı Bitkiler) Yunanlı hekim Dioscorides tarafından M.S. birinci yüzyılda derlenmiştir. Onyedinci yüzyıla kadar onun 500 den fazla kataloğu yetkin bir başvuru kaynağı olarak kalmıştır. Orta çağı takip eden yüzyıllarda şifalı bitkilerin öneminin devamı, onbeşinci yüzyılda matbaanın icadı ile yüzlerce şifalı bitkiler kitabının basılması ile gösterilmiştir. Theophrastus un Bitkiler Tarihi adlı kitabı bu devirde basılan kitaplardan birisidir. 20. yüzyılda tıp biliminin muazzam bir şekilde gelişmesine rağmen bitkilerin geleneksel tıpta kullanımı halen devam etmektedir (Jain ve ark.2007). Dünyanın gelişmiş ülkeleri özellikle tedavide bitkisel kaynaklara yönelmiş durumdadırlar. Tedavide kullanılan ilaçların önemli bir kısmını doğal kaynaklı ilaçlar oluşturmaktadır. Doğal kaynaklı ilaçların kullanım oranı gelişmiş ülkelerde %60, gelişmekte olan ülkelerde ise %4 civarındadır. Doğaya dönüşümün bir slogan haline geldiği günümüz dünyasında tıbbi ve aromatik bitkiler Türkiye'de de önemli bir yere gelmiştir. Türkiye pek çok bitkinin gen merkezi olmasının yanında, bazı endemik türlerin de bulunduğu coğrafik bölgeleri içermektedir. 1

1.GİRİŞ Geleneksel halk hekimliğinde kullanılan bitkiler bilimsel bir süzgeçten geçirilerek yeniden değerlendirilmiş ve fitoterapi bir bilim dalı haline gelmiştir. Bu bilim dalı giderek gelişmekte ve daha fazla önem kazanmaktadır. Dünya sağlık örgütü (WHO) verileri, gelişmekte olan ülkelerde insanların %80 nin bu terapi yöntemlerini kullandığını ve 3.3 milyar insanın da tıbbi bitkilerden terapi aracı olarak yararlandığını ortaya koymuştur (Çelik ve Çelik, 2007). Dünya Sağlık Örgütü nün (WHO) araştırmalarına göre tedavi amaçlı kullanılan tıbbi bitkilerin sayısı 20.000 civarındadır (Kalaycıoğlu ve Öner, 1994). Uçucu yağlar, farklı bileşenleri içeren kompleks karışımlar olduklarından biyolojik etkileri yönünden de farklılık göstermektedir (Bağcı ve Dığrak, 1997). Ayrıca aromatik bitkilerin uçucu yağlarının ki bunların çoğu Labiatae (Lamiaceae) familyasına ait olup, antimikrobiyal aktiviteye sahip oldukları gösterilmiştir (Elgayyar ve ark., 2001). Bitkiler gibi doğal kaynaklardan elde edilen antimikrobiyal maddelerin gıda güvenliğini yüksek oranlarda korumayı başardığı araştırılarak bulunmuştur (Alzoreky ve Nakahara, 2003). Kekik, karabiber, nane, sarımsak ve adaçayı hidrosollarının Bacillus subtilis ve Salmonella enteritidis üzerine etkileri araştırılmış ve antibakteriyel etki gösterdiği görülmüştür (Al-Turki, 2007). Bu bitkiler doğal yiyecek ya da içecek olarak insan ve hayvanlardaki gut hastalığını tedavi ettiği düşünülerek halk arasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca sarımsak, tarçın, köri, hardal, fesleğen, zencefil ve diğer bazı bitkilerin antimikrobiyal özellikler gösterdikleri belirtilmektedir (Marino ve ark., 1999). Biberiye (Rosemarinus officinalis L.), adaçayı (Salvia fruticosa), ve sumak (Rhus coriaria L.) ekstraktları fıstık yağına uygulanmış ve tüm ekstraktlar kontrole oranla antioksidan aktivite göstermişlerdir (Ozcan, 2003). Sodyum nitritin genotoksik etkisine karşı yeşil biber ekstraktının antimutajenik etki gösterdiği saptanmıştır (Ramirez ve ark.,2001). Fakat nane ve çam bitkisinden ekstrakte edilen bazı uçucu yağların genotoksik etkiye sahip olduğu SMART test ile tespit edilmiştir (Lazutka ve ark.,2001). Tüm bunlarla beraber uçucu yağların bazı yan etkileri de bulunmaktadır (Şarer, 1991; Leal-Cardoso ve Fonteles, 1999). Bu maddelerin en büyük tehlikeleri de mutasyon ve/veya kansere sebep olabilme riskleridir. Bitkilerin tedavi amaçlı 2

1.GİRİŞ kullanılmalarının yanısıra, bunların insan genomunda mutasyonlara sebep olup olmadıklarının ortaya çıkarılması da son derece önemlidir. Bir kimyasal maddenin böyle bir etkisinin olup olmadığının belirlenmesi, kısa süreli genotoksisite testleri ile mümkün olabilmektedir. Bugün kısa süreli genotoksisite testleri olarak bilinen ve bir kimyasal maddenin genotoksik veya anti-genotoksik olup olmadığının belirlenmesinde kullanılan metodlar; kardeş kromatid değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) (Tucker ve ark., 1993), kromozom aberasyonu (KA) (Chromosome Aberration=CA) (Carrano ve Natarajan, 1988; Anderson, 1988; Hagmar ve ark., 1994) ve mikronükleus (MN) (Heddle ve ark., 1991, Fenech, 2002) testleridir. Kardeş kromatid değişimi, DNA çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon yoluyla onarılmasını gösteren kardeş kromatidlerin homolog lokusları arasında DNA replikasyon ürünlerinin değişimidir (Sonoda ve ark., 1999, Helleday, 2003). Mutajen ve kanserojen olduğu bilinen maddelere maruz kalan insan ve hayvanların hücrelerinde KKD frekansının arttığı ve tek-gen mutasyonlarının artışı ile KKD frekansı arasında lineer bir ilişki olduğu saptanmıştır (Perry ve Evans, 1975; Carrano ve ark., 1978; Albertini ve ark., 2000). Benzer bir ilişkinin KKD nin artışıyla in vivo tümörlerin oluşumu arasında da olduğu Cheng ve ark. (1981) tarafından bildirilmiştir. KA nin aksine KKD tek başına genotoksik riski belirlemede yetersizdir. Fakat, KKD deneysel çalışmalarda, indikatör test olarak insanlarda genotoksik etkileri göstermede uygun bir yöntem olarak kullanılmaya devam etmektedir (Norppa ve ark., 2006). KA oluşum mekanizmasının farklı dokularda benzer olmasından dolayı, lenfositlerdeki anormallik seviyesinin, kansere eğilimli dokulardaki anormallik seviyesini gösterdiği ve böylece kanser riskinin de göstergesi olduğu düşünülmektedir (Bonassi ve ark., 2000; Albertini ve ark., 2000; Bonassi ve ark., 2004, 2005). Yüksek KA frekansı, KA artışını başlatan sebebe bakılmaksızın yüksek kanser riskinin bir göstergesi olabilir, çünkü KA oluşumu DNA daki zincir kırıklarının yanlış onarılmasından da kaynaklanabileceği bildirilmiştir (Savage, 1993). 3

1.GİRİŞ MN, asentrik kromozom ya da kromatid kırıklarından ve bir yada birkaç kromozom ya da kromatidin anafazda geri kalmasından dolayı (kalgın kromozom) telofazda oluşan esas nükleusun dışında rastlanan küçük nükleuslardır (Surrallés ve ark., 1995). Ayrıca multipolar anafaz ve telofaz da MN oluşumuna sebep olmaktadır (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010). MN oluşumuna neden olabilen kromozom kaybı ya da kromozomların ayrılamaması (non-disjunction) kanser ve yaşlanmada gözlenen önemli olaylardan biridir. Bu durum, muhtemelen iğ iplikçiklerinde ve sentromerde bozulma ya da metafazdan önce kromozom yapısının yoğunlaşması sonucu oluşmaktadır (Dellarco ve ark., 1985). Böylece, MN testi ile hem klastojenik hem de aneujenik etkiler belirlenebilmektedir (Kirsch-Volders ve ark., 1997; Norppa ve Falck, 2003). Yapılan çalışmalarda, kanser hastalarından alınan periferal kan lenfositlerindeki MN frekansında belirlenen artış, kanser oluşan hedef dokudaki MN frekansı kadar bulunmuştur (Cheng ve ark., 1996, Duffaud ve ark., 1997; Bonassi ve ark., 2007). Ayrıca, Fenech ve ark. (1999) nın uluslararası işbirliği ile yaptıkları bir araştırmada insanlarda MN ile kanser arasındaki ilişkiyi açıkça göstermişlerdir. Diş otu veya Meryemiye olarak da bilinen, ballıbabagiller (Lamiaceae) familyasından Salvia cinsi bitkilerin tüylü ve beyazımsı renkte olan yapraklarının kurusu çay gibi haşlanarak içildiği gibi, et yemeklerine koku ve lezzet vermek için de kullanılır. Akdeniz ülkelerinde doğal olarak yetişen bitki, Türkiye de özellikle Akdeniz ve Ege sahillerinde yaygındır ve her yıl doğadan toplanarak Almanya başta olmak üzere Avrupa ülkelerine ihraç edilmektedir. Türkiye de 86 Salvia türü (90 takson) doğal olarak yetişmektedir ve bunlardan 40 tanesi endemiktir. Türkiye de adaçayı olarak diğer Salvia türleri ile Sideritis türleri de kullanılmaktadır. Salvia cinsi yaprakları, %2-3 uçucu yağ, %5 rosmarinik asit, tanen bileşikleri, flavonlar (salvigenin luteolin, hispidulin) ile karnosol (pikrosalvin) gibi diterpenler, ursolik asit ve benzeri triterpenler içerir. Uçucu yağ, % 60-64 civarında ökaliptol ( 1,8-sineol), % 8.2 kafur ve % 5 in altında tuyon türevleri taşımaktadır. Birçok hastalığın tedavisinde kullanılan bu bitki özellikle gaz giderici, kan temizleyici, antimikrobiyal ve iştah açıcı olarak kullanılır. Ayrıca solunum rahatsızlıklarında, kanser tedavisinde, karaciğer rahatsızlıklarının tedavisinde de tercih edilen bir bitkidir. 4

1.GİRİŞ Çok eski devirlerden beri bilinen ve önemini bugüne kadar hiç kaybetmemiş olan faydalı bitkilerin önemli bir bölümünü Lamiaceae familyasında bulunan bitkiler oluşturmaktadır. Bu familyada bulunan bitkiler çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanıldığına ilişkin ilk kayıtlara eski çağlardan kalma mezar ve anıtların süslü yazı ve resimlerinde rastlanmaktadır (Baytop, 1999). Salvia cinsine ait bazı türlerin tümör hücrelerinin gelişimini azalttığı, antigenotoksik ve anti-mikrobiyal etkileri olduğu saptanmıştır (Vujosevik ve Blagojevic, 2004; Loizzo ve ark., 2007; Kaileh ve ark., 2007; Sivropoulou ve ark.,1997; Goze ve ark., 2009; Patenkovic ve ark., 2009). Bununla birlikte Al-Hamood ve ark. (1998) Sf bitkisinden elde edilen ekstraktların erkek ve dişi sıçanlarda fertilitede azalmaya neden olduğu, canlı fetus sayısını azalttığı ve gebe sıçanlarda nefes alma sıklığını artırdığını saptamışlardır. Halbuki, Domaracký ve ark. (2007) Lamiaceae familyasına ait bazı Salvia cinslerinden elde edilen yağın embriyo gelişimi üzerine hiçbir etkisinin olmadığını sadece hücre sayısını azalttıkları ve hücre ölümüne neden olduklarını saptamışlardır. Perfumi ve ark. (1991) Sf ekstraktının tavşanlarda glukozun intestinal absorbsiyonunu azaltarak hipoglisemiye neden olduğunu bildirmişlerdir. Bir başka araştırıcı grubu Salvia miltiorrhiza ekstraktının normal sıçan böbreği fibroblast hücrelerinde anti fibrotik aktivite gösterdiğini saptamışlardır (Hu ve ark., 2009). Bugüne kadar Salvia cinsi halk arasında birçok hastalık tedavisinde kullanılmış ve birçok çalışmayla da bu bitkinin insan sağlığına yararları olduğu anlaşılmıştır. Bu genusta yer alan Salvia fruticosa ile ilgili çalışmalar olmasına karşın planladığımız şekilde bir araştırma daha önce yapılmamıştır. Bu çalışmanın amacı Salvia fruticosa bitki ekstraktının insan periferal lenfositlerinde genotoksik veya antigenotoksik etkiye sahip olup olmadığı in vitro kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozomal aberasyon (KA) ve mikronukleus (MN) testleri ile araştırmaktır. 5

1.GİRİŞ 6

2.ÖNCEKİ 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1.Tıbbi ve Aromatik Bitki Ekstraktları ile Yapılan Genotoksisite ve Sitotoksisite Çalışmaları Küçük şalgam bitkisinden elde edilen yağın, bütil, hidrojen veya hidroksanolle muamele edildiği zaman mutajenik olmadığı fakat elde edilen yağın in vivo olarak oksitlenmesi sonrasında mutajeniteye sebep olabileceği saptanmıştır (Qu ve ark., 1992). Aynı araştırıcılar, Çin de kadınlarda görülen akciğer kanseri ile yaptıkları çalışmalarda sigaradan başka faktörlerin ve özellikle pişirme sırasında açığa çıkan yağların da etkili olabileceğini ortaya koymuşlardır. Özellikle pişme sırasında açığa çıkan yağların hava kirliliğine neden olabileceği üzerinde durulmuştur. Küçük şalgam ve soya fasulyesinden pişme sırasında açığa çıkan yağlar yoğunlaştırılarak, Salmonella mutasyon denemelerinde, SV50 ileri mutasyon denemelerinde ve fare kemik iliğinde kardeş kromatid değişimleri ve mikronükleus denemelerinde kullanılmış ve genotoksik oldukları bildirilmiştir. Nane ve çam bitkisinden ekstrakte edilen bazı uçucu yağların genotoksik etkiye sahip olduğu SMART test ile tespit edilmiştir (Lazutka ve ark., 2001). Sodyum nitridin genotoksik etkisine karşı yeşil biber ekstraktının antimutajenik etki gösterdiği saptanmıştır (Ramirez ve ark., 2001). Phyllanthus orbicularis HBK sulu ekstraktı viral hastalıklarda tedavi amaçlı kullanılan, Küba ya endemik bir bitkidir. Yapılan çalışma ekstraktın yüksek sitotoksik olduğunu göstermiştir (Sánchez ve ark., 2002). Kukić ve ark. (2006) Stachys ailesine ait dört endemik tür olan S. anisochila, S. beckeana, S. plumosa ve S. alpina L. ssp. dinarica türlerinin antioksidan aktivitelerini araştırmışlardır. Bitkilerden elde edilen ekstraktları toplam antioksidan (TAA) aktivitesi için, 1,1-diphenyl 2-picryl hydrazyl (DPPH) ve OH radikal aktivitesi ve lipid peroxidation (LP) aktivitesini birlikte kullanarak çalışmışlardır. Total fenolik bileşikler arasındaki karşılıklı ilişki TAA ve DPPH radikalleri polifenolerin ana anti-oksidanlar olduğu işaret edilmiştir. Bütün Stachys ekstraktları, (S. plumosa dışında) yüksek bir anti-dpph aktivitesi (IC50_50m g/ml) 7

2.ÖNCEKİ sergilemişlerdir. Bütün ekstraktlarda 6.25 ile 50 mg/ml arasında değişen oranlarda OH radikalini % 40 tan daha fazla oranlarda inhibisyona uğratmışlardır. Yalnızca S. plumosa ekstraktı % 60.67 lik bir oranla 100m g/ml de maksimum aktivite göstermiştir. Amirghofran ve ark. (2006) İran a özgü 6 tıbbi bitkinin (Galium mite, Ferulago angulata, Stachys obtusicrena, Cirsium bracteosum ve Echinophora cinerea) metanollü ekstraktlarının anti-neoplastik aktivitesini inceledikleri çalışmada, ekstarktlara maruz bıraktıkları farklı tümör hücrelerinin sitotoksik analizlerini MTT kolorimetrik yöntemle incelemişlerdir. Flow sitometri tarafından apoptotik değişimlere uğrayan hücrelerin yüzde miktarları ve DNA kırıklarının analizleri bu duruma hassas olan hücrelerde uygulanmıştır. Sonuçta ekstraktların tamamının tümör hücrelerinin artışını azalttığı gözlenmiştir. E. cinerea ve C. bracteosum bitkilerinin 20 µg/ml dozundaki ekstraktları K562 lösemi hücrelerinin bölünmesini en iyi şekilde inhibe ederken, Jurkat hücrelerinin proliferasyon inhibisyonunu ise 39.8 µg/ml dozlarında sırasıyla G. mite, F. angulata ve E. cinerea bitkilerin ekstraktları gerçekleştirmektedir. Çelik ve ark. (2006) yaptıkları çalışmada Thymus kotschyanus var. glabrescens in klastojenik ve Mitomycin C (MMC) ye karşı anti-klastojenik etkilerini incelemişlerdir. Bu bitkiden elde edilen ekstraktlar kardeş kromatid değişimini (10-2 µl/ml konsantrasyonu hariç) ve kromozom aberasyonlarını kontrol ve çözücü kontrolle karşılaştırıldığında artırmadığını bildirmişlerdir. Bununla birlikte bu bitkiden elde edilen ekstrakt kromozom aberasyonlarına neden olan MMC nin etkisini azaltmış olduğunu belirtmişlerdir. Diğer yandan bitki ekstraktı MMC ile birlikte kardeş kromatid değişimini pozitif kontrolle karşılaştırıldığında önemli derece artırdığını ileri sürmüşlerdir. Karioti ve ark. (2007) Marrubium cylleneum un toprak üstü kısımlarından elde edilen ve bugüne kadar doğal ürünler olarak kabul edilmeyen, diterpen olmayan bir labdan ile diterpen olan iki labdan ı NMR ve MS spektral analiz metotları ile izole etmişlerdir. M. cylleneum ve M. velutinum dan elde edilen çeşitli diterpenler çeşitli kanser hücre hatlarına sitotoksik etkileri ve insan periferal kanındaki tek nükleuslu hücrelere immunomodulasyon potansiyel etkileri in vitro olarak test 8

2.ÖNCEKİ edilmiştir. Sonuç olarak; bazı bileşiklerin lenfositlerde farklı sitotoksik etki gösterdikleri ortaya konulmuştur. Amirghofran ve ark. (2007) çeşitli tıbbi bitkilerin insan lenfositleri üzerinde apoptotik ve anti-proliferatif etki gösterdiklerini ileri sürerek, İran a özgü bir bitki olan Stachys obtusicrena nın apoptozise neden olan etkisi üzerinde çalışmışlardır. Aynı araştırıcıların in vivo olarak yaptıkları bu çalışmalarda antijenle bağışıklık kazandırılmış farelerde antikor üretimi ve hipersensitivite üzerine S. obtusicrena nın metanollü ekstraktlarının etkisini araştırmışlardır. Hipersensitivite ve antikordan elde edilen cevaplara göre hem muameleli farelerde hem de muamelesiz farelerde her iki parametrenin de doza bağlı olarak azaldığı tespit edilmiştir. Lenfositlerdeki in vitro çalışmalarda da ekstraktların ( 3 H)-timidin cevabında da doza bağlı olarak bir azalma olduğu kaydedilmiştir. Sonuçta araştırıcılar S. obtusicrena nın hem hücresel hem de humoral bağışıklık sistemini inhibe ettiği ve bu etkininde lenfositlerde apoptozise neden olduğunu bildirmişlerdir. Klormadinon asetat (CMA) sentetik bir progesteron analoğudur. Genellikle oral olarak gebeliği önleyici olarak kullanılmaktadır. Yapılan çalışmada Ocimum sanctum dan elde edilen çayın CMA nın insan lenfositlerinde neden olduğu genotoksik zararlarına karşı anti-genotoksik aktivitesi araştırılmıştır (Siddique ve ark., 2008). En yüksek dozda (40 µm) sadece CMA ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromozom aberasyonlarını arttığı, fakat 40 µm CMA ile birlikte ayrı ayrı 1.075x10-4, 2.125x10-4 ve 3.15x10-4 g/l bitki infüzyonuyla muamele edilen hücrelerde anormal metafaz sayısının sırasıyla % 2.67, % 2.00 ve % 1.67 oranlarına kadar azaldığı saptanmıştır. Kardeş kromatid değişimi de aynı şekilde 40 µm CMA ile muamele edilmiş hücrelerde 6.43 iken bitki infüzyonuyla ayrı ayrı 1.075x10-4, 2.125x10-4 ve 3.15x10-4 gm l -1 muamele edilen hücrelerde kardeş kromatid değişimi sayısı sırasıyla 3.76, 3.01 ve 2.94 oranlarında azalmıştır. Bitki infüzyonunun kullanılan dozları kromozom aberasyonlarını ve kardeş kromatid değişimlerini muamelesiz grupla karşılaştırıldığında artırmadığı belirtilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda bitki infüzyonunun genotoksik potansiyeli artırmadığı, fakat insan lenfosit hücrelerinde CMA nın genotoksisitesini düzenleyebileceğini ileri sürmüşlerdir. 9

2.ÖNCEKİ Punica granatum L. (Punicaceae) meyve ekstraktı Küba da solunum rahatsızlıklarında tedavi edici ilaç olarak kullanılmaktadır. Sánchez ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada P. granatum meyve ekstraktının genotoksisitesini farklı in-vitro ve in-vivo deneylerle test etmişlerdir. Mikroorganizmalardaki mikronukleus, kardeş kromatid değişim testleri ve faredeki sperm şekil bozukluğu testi P. granatum meyve ekstraktının in-vivo ve in-vitro olarak genotoksik etkisi olduğunu göstermiştir. Alkhatib ve ark. (2010) Marrubium peregrinum dan ladanein, scutellarein- 5,7,4 -trimethyl eter ve scutellarein-5,6,7,4 -tetramethyl eter olmak üzere üç metilenmiş flavon elde ederek, kemiricilerin lösemili hücrelerinde sitotoksik etkilerini incelemişlerdir. 20 yaygın Lamiaceae türleri arasında HPLC ile en aktif bileşenin ladanein olduğu görülmüştür. Ladanein 20 40 μm oranlarında K562, K562R ve 697 insan lösemi hücre hatlarına orta derecede bir aktivite gösterirken, ne MOLM13 ne de insan periferal kanında tek nükleuslu hücrelere karşı toksik etki göstermemiştir. Bu çalışma sonucunda ladanein lerin türevi olan flavonların antilösemik aktiviteye sahip olabileceği anlaşılmıştır. Coccoloba mollis stres, hafıza kaybı, anemi gibi birçok hastalığa karşı tedavi edici olarak kullanılmaktadır. Tsubay ve ark. (2010) bu bitkinin kök ve yaprak ethanolik ekstraktlarının sitotoksik, genotoksik ve apoptoz indüksyon etkilerini araştırmışlardır. Kök ekstraktının yaprak ekstraktına kıyasla daha fazla sitotoksik olduğu, her iki ekstraktın DNA hasarını azalttığı ve genotoksik olmadığını bildirmişlerdir. Mara ve ark. (2010) Miconia türüne ait bazı bitkilerle (M. stenostachya, M. cabucu ve M. albicans ) yaptıkları çalışmada bu bitki ekstraktlarının doxorubisine bağlı mutajeniteye karşı koruyucu etkilerinin olduğunu bildirmişlerdir. Hosseinnimehr ve ark. (2010) antioksidan aktiviteye sahip olduğu bilinen Zataria multiflora bitkisinin fare kemik iliği hücrelerinde siklofosfamide bağlı genotoksisiteyi ve oksidatif stresi azalttığını bildirmişlerdir. Abdel-Aziem ve ark. (2010) Aquilegia vulgaris ekstraktının kadmiumun yarattığı oksidatif stres ve genotoksisiteye karşı koruyucu bir ajan olabileceğini bildirmişlerdir. 10

2.ÖNCEKİ 2.2.Salvia Cinsine Ait Bitkilerin Ekstraktları İle Yapılmış Olan Genotoksisite ve Sitotoksisite Çalışmaları Başaran ve ark. (1996) yaptıkları çalışmada Türkiye ye özgü tıbbi bitkilerin genotoksik potansiyelleri Salmonella typhimurium mikrozom aktivasyon denemeleri ve alkalin tek hücre jel elektroforezi (COMET) testleri ile araştırmışlardır. Araştırıcılar Salvia ve başka tıbbi bitki cinslerine ait bitkilerden (Arctium minus, Ecballium elatterium, Momordica charantia, Plantago major, Urtica dioica, Viscum album, Salvia triloba, Euphorbia rigida, Stachys lavandulifotia, Acteoside, Abies nordmannia) elde ettikleri ekstraktların ve bu ekstraktların bazı bileşenlerinin TA98 ve TA100 suşlarında metabolik aktivasyonlu veya aktivasyonsuz olarak mutajenik olmadıklarını, COMET denemelerin de ise hepsininin negatif kontrol değerlerinin üstünde bir artışa neden olduklarını saptamışlardır. Sadece Urtica ve Euphorbia türlerinin varlığında DNA zincirlerinde daha az kırıklar oluştuğu bildirilmiştir. Salvia fruticosa uçucu yağı ve ondan izole edilen bileşenleri 8 bakteri ırkı üzerinde antimikrobiyal aktivite göstermiştir. S. fruticosa ve bileşenleri Yeşil Afrika Maymun unun böbrek hücreleri üzerinde çalışılmış ve Herpes simplex virüsüne (HSV-1) karşı yüksek derecede virütik aktivite göstermiştir (Sivropoulou ve ark., 1997). Al-Hamood ve ark. (1998) Sf bitkisinden elde edilen ekstraktların erkek ve dişi sıçanlarda fertilitede azalmaya neden olduğu, canlı fetus sayısını azalttığı ve gebe sıçanlarda nefes alma sıklığını artırdığını saptamışlardır. Karakaya ve Kavas (1999) beslenme alışkanlıklarında değişimler yaparak kanserden bireysel olarak korunma yollarının mümkün olduğunu belirtmişlerdir. Yaptıkları araştırmada Urtica sp, Stachys annula, adaçayı (Salvia officinalis), kuşburnunun işlenmemiş veya kaynatılmış özsuları, yaprak ve kurutulmuş tohumları, üzüm pekmezi ve tarhananın, S. typhimurium TA 100 suşunda mutajenik olmadığını hatta tüm bu yiyeceklerin S typhimurium daki sodyum azid in mutajenitesini azalttığını bildirmişlerdir. Test edilen yiyecekler arasında, işlenmemiş Urtica sp (46.32%) ve kuşburnu (44.03%) en yüksek anti-mutajenik etkiyi gösterirken, bu antimutajenik etki daha az olarak Urtica sp yaprakları (41.25%), ve Urtica sp nin 11

2.ÖNCEKİ kaynatılmış özsuyu (37.22%), Stachys annula (36.42%), üzüm pekmezi (33.03%) ve tarhana (28.60%) da gözlenmiştir. Couladis ve ark. (2003) oksijen radikallerinin ve hidrojen peroksidin neden olduğu sitotoksisite ve çeşitli insan hastalıklarındaki doku zararlarının önlenmesinde anti-oksidanların rolünün gittikçe artmakta olduğundan yola çıkarak, bu çalışmada Lamiaceae (Labiate) familyasına ait 21 aromatik bitkinin ethanollü ekstraktlarının antioksidan etkilerini in vitro olarak araştırmışlardır. Bu bitkiler arasında yer alan Salvia ringens, Salvia pomifera, Stachys spruneri, Origanum dictamnus, Phlomis lanata, Ballota pseudodictamnus, Ballota acetabulosa, Teucrium polium, Calamintha glandulosa ve Micromeria graeca bitkilerinden elde ettikleri ekstraktların α-tokoferolle aynı etkiye sahip olduklarını belirtmişlerdir. Biberiye (Rosemarinus officinalis L.), adaçayı (Salvia fruticosa), ve sumak (Rhus coriaria L.) ekstraktları fıstık yağına uygulanmış ve tüm ekstraktlar kontrole oranla antioksidan aktivite göstermişlerdir (Ozcan, M., 2003). Pavlidou ve ark. (2004) Salvia fruticosa ve Mentha pulegium un temel bileşenleri olan 1.8-cineole, thujone, camphor, pulegone, menthone ile birlikte Bactrocera oleae ve Drosophila melanogaster üzerine insektisit etkilerini görmek amacıyla çeşitli testler yapmıştır. Sonuçlara göre B.oleae üzerine M.pulegium ve bileşenleri en fazla insektisit etkiyi göstermiş, S.fruticosa ve bileşenlerinden 1.8- cineole ise en toksik etkiyi göstermiştir. Etkileri D.melanogaster de de aynı olmuştur. S.fruticosa uçucu yağlarından 1.8-cineole ve thujone negatif genotoksik etki gösterirken, camphor mutajenik aktivite göstermiştir. Savelev ve ark. (2004) S.fruticosa dan elde edilen yağın insanlarda kolinesteraz enzimini zamana ve doza bağlı olarak inhibe ettiğini ve nörotoksik etki oluşturduğunu saptamışlardır. Salvia officinalis in antimutajenik özelliği memelilerde in-vivo olarak test edilmiş ve tüm konsantrasyonlarda oluşan aberasyonları önemli derecede azalttığı görülmüştür (Vujosevic ve ark., 2004). Slamenova ve ark. (2004) Salvia officinalis L. in köklerinden elde ettikleri üç adet diterpen quinon ların (royleanone SAR 3, horminone SAR 26 ve acetyl horminone SAR 43) sitotoksik ve DNA üzerindeki zarar verici etkilerini tespit 12

2.ÖNCEKİ edebilmek amacıyla insan kolon kanseri (Caco-2) ve insan karaciğer hücrelerini (HepG2) in vitro koşullarda bu diterpen quinonlar ile muamele etmişlerdir. Çalışılan tüm quinonlar hücrelerde sitotoksik etki göstermelerine rağmen, 1.10a 4 mol/l SAR 26 veya SAR 43 ile muamele edilen HepG2 hücrelerinde topoizomeraz 1 in inhibisyonuna bağlı olarak apoptotik nükleus seviyelerinin arttığı gözlenmiştir. Araştırmacılar SAR 3 ile muamele edilen HepG2 hücreleri ve SAR 3, SAR 26 ve SAR 43 ile muamele edilen Caco-2 hücrelerinde ya hiç ya da çok az seviyelerde apoptotik nükleus artışı olduğunu ileri sürmüşlerdir. Badisa ve ark. (2005) tarafından farklı yerlerden alınan Salvia cinsine ait bazı ekstraktlarının 4 tür insan kanser hücresine (HCA, HepG2, MCF-7 ve HPC) karşı sitotoksik aktivitelerini, normal fare hücrelerini kontrol alarak araştırmışlar ve tüm S. fruticosa örnekleri kontrole kıyasla 0.1 mg/ml konsantrasyonda sitotoksik etki göstermiştir. Rózalski ve ark. (2006) Salvia sclarea köklerinden elde edilen diterpenlerden aethiopinon ve salvipison un kanser tedavisinde yararlı olabileceğini bildirmişlerdir. Domaracky ve ark. (2007) Lamiaceae familyasına ait bazı Salvia cinslerinden elde edilen yağın embriyo gelişimi üzerine hiçbir etkisinin olmadığını sadece hücre sayısını azalttıkları ve hücre ölümüne neden olduklarını saptamışlardır. Matkowski ve Piotrowska (2006) Avrupa da doğal olarak yetişen Lamiaceae türlerinden elde ettiği metanollü ekstraktların antioksidatif etkilerini in vitro olarak üç yöntemle incelemişlerdir. Araştırıcılar, test edilen bitkiler en güçlü antioksidan etkiye sahip olandan zayıf olana doğru Leonurus cardiaca, Lamium album, Marrubium vulgare, Stachys officinalis, Lamium purpureum, Galeopsis speciosa olarak sıralanmıştır. Lipid peroksidasyonu denemelerinde maksimum inhibisyon S. officinalis ve M. vulgare ile % 78 e ulaşırken, Lamium sp. ve L. cardiacas ile % 70 in çok az üstünde olduğu G. speciosa nın ise % 65 e ulaştığını bildirmişlerdir. Filistin de bazı hastalıkları tedavi etmek amacıyla kullanılan bitkilerden seçilen 24 türün anti-tumor (sitotoksik) ve anti-inflamatuar aktiviteleri farelerde fibroblast hücreleri (L929sA) ve insanda iyi huylu (MCF7) ve kötü huylu (MDA- MB231) göğüs kanseri hücreleri üzerinde test edilmiş ve yapılan çalışmalarda 24 tür 13

2.ÖNCEKİ içerisinden Salvia fruticosa en yüksek sitotoksik aktiviteye sahip olduğu görülmüştür (Kaileh ve ark., 2007). Salvia officinalis, Sideritis perfoliata, Satureia thymbra, Laurus nobilis ve Pistacia palestina türlerinin ekstraklarının insanda tümör hücrelerinin gelişmesini engellediği görülmüş ( Loizzo ve ark., 2007). Kekik, karabiber, nane, sarımsak ve adaçayı hidrosollarının Bacillus subtilis ve Salmonella enteritidis üzerine etkileri araştırılmış ve antibakteriyel etki gösterdiği görülmüştür (Al-Turkia, 2007 ). Loizzo ve ark. (2009) nın yapmış oldukları çalışmada Salvia leriifolia (Benth) nın uçucu yağlarının kimyasal kompozisyonu, kolinesterazı inhibe edici özellikleri ve anti-influmatuvar etkilerini incelemişlerdir. Uçucu yağlar GC ve GC- MS ile analiz edildiğinde ana komponent olarak camphor, 1,8 cineol, camphene ve α-pinene elde edilmiştir. S.leriifolia yağları DPPH denemeleriyle LC 50 seviyesi olan 2.26 µl/ml de anti-oksidan özelliğe sahip olduğu tespit edilirken, asetilkolinesteraz ve bütirilkolinesterazı sırasıyla 0.32 ve 0.29 µl/ml de inhibe edici etkisinin olduğu ileri sürülmüştür. Dahası bu bitkiden elde edilen yağ 165 µg/ml de LPS nin üretimini inhibe ettiği görülmüştür. Bu komponentlerin 1000 µg/ml de 142BR hücrelerinde sitotoksik etkiye sahip olmadıkları saptanmıştır. Astrositler, nöronları reaktif oksijen türlerine ve nöronu etkileyecek hasarlara karşı koruyan, beyinde en fazla bulunan sinir hücreleridir. Elmann ve ark. (2009) tarafından çeşitli esansiyel yağların kültürdeki astrositlerin H 2 O 2 e bağlı ölüme karşı koruma yeteneklerini test etmişler ve Salvia fruticosa nın güçlü bir koruma etkisi gösterdiğini bildirmişlerdir. Somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ile demlenmiş adaçayının (Salvia officinalis) antimutajenik aktivitesi olduğu gözlenmiştir (Patenkovic ve ark.,2009). Salvia staminea ve Salvia caespitosa nın ekstraktları kornea hücrelerinde sitotoksik aktivite göstermemişlerdir (Goze ve ark., 2009). Saraç ve ark. (2009) Muğla nın farklı yerlerinden toplanmış Salvia fruticosa ve çeşitli bitkilerden (Mentha longifolia (L.) Hudson ssp. longifolia, M. longifolia (L.) Hudson ssp. typhoides (Briq.), Mentha pulegium L., Salvia tomentosa Miller, 14

2.ÖNCEKİ Calamintha nepeta (L.) Savi ssp. glandulosa (Req.) P.W. Ball, Nepeta cadmea Boiss., Lavandula stoechas L. ssp. stoechas, and Ziziphora tenuior L.) elde edilen esansiyel yağların antimikrobik aktivitelerini araştırmışlar. S. fruticosa ve S. tomentosa dışındakiler Candida albicans a karşı yüksek antimikrobik aktivite göstermişlerdir. Bununla birlikte kullanılan tüm bitkilerin antimikrobik aktiviteleri aynı familyaya ait olsalar bile toplandıkları yere göre farklı seviyelerde antimikrobik aktivite göstermişlerdir. Epidemiyolojik çalışmalar kolorektal karsinoma (CRC) oluşum riskinin düzenlenmesinde beslenmenin önemli rolü olduğunu göstermiştir. Salvia genusuna ait aromatik bitkiler anti-kanser aktivite dahil olmak üzere birçok tedavi edici özelliğe sahiptir. Xavier ve ark. (2009) yaptıkları çalışmada Salvia fruticosa (Sf), Salvia officinalis (SO) ve temel bileşenleri olan rosmarinik asit (RA) in antiproliferatif ve proapoptik etkilerini araştırmak amacıyla MAPK/ERK ve PI3K/Akt metabolik yolunda farklı mutasyonlar meydana getiren iki insan kolon karsinoma hücre dizisine (HCT15 ve CO115) etkilerini değerlendirmişlerdir. Sonuç olarak Sf, So ve RA apoptozu her iki hücre dizisinde de düşürmüş, sadece HCT15 hücre dizisinde her iki bitki ekstraktı proliferasyonu engellemiştir. Ramos ve ark. (2010) Salvia officinalis (So), Salvia fruticosa (Sf), ve Salvia lavandulifolia (Sl) sulu ekstraktlarının ve bunların temel bileşenleri olan rosmarinik asit (RA) ve luteolin-7-glukozidin (L-7-G) oksidatif ajanlara maruz bırakılmış Caco- 2 ve HeLa hücre DNA larının korunması ve Caco-2 hücre DNA sının onarılması üzerine etkilerini araştırmışlardır. Sonuç olarak So, Sf ve bileşenleri (RA ve L-7-G) hücreleri oksidatif DNA hasarlarına karşı koruduğunu ve DNA onarımını uyardığını bildirmişlerdir. Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinoma (HNSCC) gelişimi inflamasyon ile yakından ilişkilidir. Cyclooxygenase-2 (COX-2) inflamasyonun önemli aracısıdır. Bundan dolayı COX-2 nin seçici inhibitörü olan celecoxib HNSCC için ümit veren kimyasal bir koruyucu olarak bilinir. Salvia miltiorrhiza dan izole edilen salvianolik asit B (Sal-B) etkili bir şekilde COX-2 expresyonunu baskılamış ve çeşitli kanser hücrelerinde apoptozu azaltmıştır. Yapılan çalışmada Sal-B nin düşük dozda celecoxib ile birlikte kombinasyonu HNSCC de ajanların tek başına olduğundan 15

2.ÖNCEKİ daha fazla anti-kanser etki gösterdiği rapor edilmiştir (Zhao ve ark.,2010). Kombinasyon etkisi 4 HNSCC hücre dizisinde (JHU-06, JHU-011, JHU-013 ve JHU-022) hücre yaşayabilirliği, proliferasyon ve tümör ksenograf büyümesi açısından incelenmiştir. Hücre yaşayabilirliği ve proliferasyon hem ajanlar birlikteyken hem de tek başınayken önemli derecede engellenmiştir. Bununla birlikte tek ajanla tedaviye nazaran her iki ajanın kombinasyonu ile yapılan tedavi JHU-013 ve JHU-013 hücre dizisinde önemli derecede etki göstermiştir. Sal-B (40 mg/kg/d) ve celecoxib in (2.5 mg/kg/d) günlük dozun yarısı ile tedavi edilen farenin, Sal-B ve celecoxib in tek başına günlük dozu ile tedavi edilen fareye nazaran önemli derecede JHU-013 ksenograf gelişimini inhibe ettiği görülmüştür. Kombinasyon COX-2 nin inhibisyonu ve apoptozun indüklenmesinin gelişimi ile ilişkilidir. Birbirleriyle karşılaştırıldığında bu sonuçlar multifonksiyonel anti-kanser ajanı Sal-B nin düşük dozda celecoxib ile kombinasyonu inflamasyon ile ilişkili tümör gelişimini hedef alan potansiyel yeni bir koruyucu tedavi olduğunu göstermiştir (Zhao ve ark., 2010). 16