EKMEK MAYASI ÜRETİLEN KESİKLİ BİR BİYOREAKTÖRDE KÜTLE AKTARIM KATSAYISININ BELİRLENMESİ H. BOYACIOĞLU, B. AKAY, S. ERTUNÇ, H. HAPOĞLU, M. ALPBAZ Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 0600, Tandoğan, ANKARA ÖZET Çözünmüş oksijen derişimi biyorektörlerde mikroorganizma çoğalmasını etkileyen en önemli parametrelerden birisidir. Çözünmüş oksijen derişimine bağlı olarak biyoreaktörlerde aynı mikroorganizmadan değişik ürünler elde etmek mümkündür. Çalışmada kullanılan Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması havalı ortamda çoğaltılırsa maya hücreleri, havasız ortamda çoğaltılırsa etanol elde edilir. Amaç maya üretmekse çoğalma ortamındaki oksijen derişiminin, kritik değeri olan 0.7 mg/l nin altına düşmesi engellenmelidir. Bu amaçla oksijen kontroluna yönelik olarak, Monod Modeli ne göre çoğalan S. cerevisiae nın, besi ortamındaki kütle aktarımı incelenmiştir. Dinamik yöntem ile yapılan deneyler sonucunda kütle aktarım katsayısının hava akış hızı ve karıştırma hızıyla orantılı olarak arttığı bulunmuştur. Optimum işletme koşulları olarak karıştırma hızı ve hava akış hızı sırasıyla 600 devir/dk ve 3.4 L/dk belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Kesikli biyoreaktör; Çözünmüş oksijen derişimi; Dinamik yöntem; Kütle aktarımı; Saccharomyces cerevisia. GİRİŞ Havalı fermentasyonlarda mikroorganizmaların besinleri kullanabilmeleri ve metabolik faaliyetlerini devam ettirilebilmeleri için gerekli olan temel substratlardan biri de oksijendir. Yüksek mikroorganizma derişimlerinde, oksijen tüketim hızının oksijen sağlama hızından fazla olması durumunda oksijen kısıtlayıcı substrat olabilir. Kritik oksijen derişiminin üzerinde çoğalma hızı, çözünmüş oksijen derişiminden bağımsızdır. Böyle bir durumda diğer bir ortam bileşeni çoğalma ortamı kısıtlayıcı bileşeni olur. Çalışmada kullanılan S. cerevisiae mikroorganizması Monod Modeli ne göre çoğalır[]. için kritik oksijen derişimi, doygunluk derişim değerinin %5-0 udur[2]. Çoğaltılan mikroorganizma, çalışmada kullanılan S. cerevisiae mikroorganizması gibi farklı koşullarda farklı ürünler (havalı koşullarda, maya; havasız koşullarda, etanol) üreten bir mikroorganizma ise çözünmüş oksijen derişiminin önemi daha da artmaktadır. Çözünmüş oksijen derişiminin düşük olması substrat tüketimini ve karbondioksit oluşum hızını azaltmakta ve bu durum Pasteur Etkisi olarak adlandırılmaktadır[3]. Yani çözünmüş oksijen derişiminin düşük olması havasız koşullarda çoğalma oluyormuş gibi etanol üretimine neden olmaktadır. Amaç mikroorganizma üretmekse bu durum istenmez. Çünkü etanol mayalar için inhibe edici özelliktedir. Genel olarak ortamdaki etanol derişimi %2 olursa maya çoğalması yavaşlar, %0 olduğunda ise durur. Bu bilgiler ışığında amaç maya üretmek ise biyotepkime ortamındaki çözünmüş oksijen derişiminin önemi ortaya çıkmaktadır. S. cerevisiae mikroorganizmasının çoğaltıldığı kesikli bir biyoreaktörde sıvı tarafı hacimsel kütle aktarım katsayısının (K L a) işletim koşullarındaki değerinin belirlenmesi, dinamik ve kontrol çalışmaları açısından literatürde önemli bir yer teşkil etmektedir. Amaç eğer maya üretmek ise, S. cerevisiae mikroorganizması ile gerçekleştirilen biyotepkime süresince çözünmüş oksijen derişiminin belirli işletim şartlarında kritik oksijen derişimi değeri
olan 0.7 mg/l nin üzerinde tutulması gerekmektedir. Uygun işletim şartlarını oluşturabilmek için oksijenin sıvı besi ortamında çözünmesi de göz önüne alınmalıdır. Bu amaçla, oksijenin sıvı besi ortamında çözünmesini incelemek için önemli bir parametre olan K L a nın bulunması gerekmektedir. Biyoproseslerde sıvı tarafı oksijen aktarım katsayısı K L a nın belirlenmesi için üç yöntem geliştirilmiştir[4]. Bu çalışmada K L a nın belirlenmesinde Dinamik Yöntem kullanılmıştır. K L a nın belirlenmesi kütle aktarımı hakkında bilgi verirken işletme parametrelerinden karıştırma hızı ve hava akış hızının optimum değerlerinin deneysel olarak bulunması konusunda da yardımcı olmaktadır. 2. KURAMSAL TEMELLER 2.. Oksijen Aktarımı Besi ortamı içerisindeki gaz aktarımı iki film teorisi ile analiz edilmektedir. Gaz kabarcığı ile sıvı ortam ara yüzeyinin her iki tarafında oksijen aktarımına karşı direnç gösteren gaz ve sıvı film tabakaları bulunmaktadır. Oksijenin hücreye ulaşması için, önce hava kabarcığından sıvı faza geçmesi bunun için de gaz ve sıvı filmlerini aşması sonra sıvı fazda konvektif ve moleküler yayınması, mikroorganizma çevresindeki sıvı filminden geçerek mikroorganizma çeperinden hücre içine yayınması gerekmektedir. Etkin bir karıştırma ile sıvı fazda yayınmanın ve mikroorganizma çevresindeki filmden geçişin kütle aktarımına karşı direnci ortadan kaldırılabilir. Gaz ve sıvı filmlerinden geçişin, kütle aktarımına etkisi ise; havalandırma, karıştırma ve oksijenin sıvı ortamda çözünürlük derecesi ile ilgilidir. Oksijenin sudaki çözünürlüğünün az olması nedeniyle gaz filmin direnci, sıvı filmi direncine oranla çok daha az olacağından ihmal edilebilmektedir. Bu durumda toplam fiziksel kütle aktarım hızı sıvı film direnci tarafından kontrol edilmektedir[]. Yatışkın koşulda gaz fazdan sıvı faza oksijen aktarım hızı, gaz-sıvı ara yüzeyindeki oksijen aktarım hızına eşittir. Ayrıca ara yüzeydeki şartlar genel olarak denge ilişkisi POİ = f (COİ ) ile verilebilir ve buradaki derişimler yığın derişimlerinden farklıdır. P OG ve P Oİ sırasıyla oksijenin gaz fazdaki ve ara yüzeydeki kısmi basınçları, C Oİ ve COL sırasıyla ara yüzey ve sıvı yığınında oksijen derişimini göstermek üzere N O molar oksijen akısıdır. N OG = k G (P OG P Oİ ) () N OL = k L (C Oİ C OL ) (2) N OG = N OL =N O (3) Ara yüzey derişimleri belirlenemeyeceğinden bunların yerine denge değerleri kullanır ve denklemler toplam kütle aktarım katsayısı cinsinden ifade edilebilir. N OG = K G (P OG P O *) (4) N OL = K L (C O * C OL ) (5) Oksijenin sudaki çözünürlüğü düşük olduğundan gaz-sıvı ara yüzeyinde Henry Kanunu geçerlidir. P Oİ =HC Oİ (6) Böylece itici kuvvet; * C O COL = POG POİ H + ( COİ COL ) (7) olarak elde edilir. Eşitlik, 2 ve 5 ten yararlanarak NOL NOG N = + OL K H.k k (8) L KL G + H.k G L k L = (9) elde edilir. Eşitlik 9 film kütle aktarım katsayıları arasındaki ilişkiyi vermektedir. Gaz fazdan sıvı faza aktarılacak olan oksijenin suda çözürlüğünün az olması nedeniyle Henry Sabiti çok
büyük ve k L ile k G nin sayısal değerleri birbirine yakındır. Bu durumda ikinci terim önemsiz olacak ve kütle aktarımına asıl direnç /k L ile ifade edilerek kütle aktarım hızı sıvı faz kontrollu olacaktır. Böylece oksijen için ara yüzeydeki aktarım hızı Eşitlik 0 gibi olacaktır. N O = K L (C * O - C OL ) (0) Genelde gaz-sıvı ara yüzey alanı bilinemez. Bu durumda biyoreaktörde oksijen aktarımı birim hacim başına tanımlanır [4]. OAH oksijen aktarım hızı olmak üzere; NO a = OAH = K La(CO * COL ) () K L a, besi ortamının özelliklerine (viskozite, yoğunluk, sıcaklık, vb.) biyoreaktör ve karıştırıcı boyutlarına, karıştırma ve havalandırma hızlarına bağlıdır. 2.2. Dinamik Yöntem ile K L a nın belirlenmesi Bu metod uygulanması kolay ve sonuçlarının güvenilir olması nedeniyle biyoreaktörlerde K L a nın belirlenmesinde oldukça sık kullanılan yöntemlerden biridir. Yöntem biyoreaktöre gönderilen havanın kısa bir süre için kesilip bir çözünmüş oksijen probu ile çözünmüş oksijen derişimindeki azalmanın; havanın tekrar beslenmeye başlanması ile de çözünmüş oksijen derişimindeki artmanın incelenmesine dayanmaktadır. Sıvı besi ortamında izoterm koşulların sağlandığı ve oksijenin sadece mikroorganizma tarafından tüketildiği varsayılarak oksijen için yazılan kütle dengesi, r O mikroorganizma özgül oksijen aktarım hızı ve OHH, oksijen harcanma hızı olmak üzere dcol * = OAH OHH = KLa(CO COL) rocx (2) dt Havalı sistemlerde gerçekleştirilen oksijen aktarımında hava kesildiğinde sıvıya oksijen aktarımı olmayacağından Eşitlik 2 deki OAH terimi ortadan kalkacak ve kütle korunum denklemi Eşitlik 3 teki şeklini alacaktır. Böylece çözünmüş oksijen derişiminin zamanla doğrusal olarak azaldığı bölgedeki doğrunun eğiminden r O C X bulunabilir. Biyoreaktöre oksijen tekrar beslendiğinde oksijen derişiminin zamanla artışı gözlenir. Bu bölgedeki derişimden dc OL dt bulunabilir ve Eşitlik 2 geçerli olacağından denklem ortamda çözünmüş oksijen derişimini verecek şekilde düzenlendiğinde Eşitlik 4 elde edilir. Böylece dc OL dt + rocx ye karşı C OL değerleri grafiğe geçirilerek elde edilen doğrunun eğiminden K L a bulunabilir dcol = OHH = rocx (6) dt COL * C OL = + r O C X + C O (7) K a dt L 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada liyofilize halde Agricultural Research Service Culture Collection, USA den temin edilen NRRL Y-567 Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması kullanılmıştır. Liyofilize haldeki mikroorganizma öncelikle canlandırma ortamında çoğaltılmıştır. Daha sonra çoğalma ortamından alınan mikroorganizma periyodik olarak uygun katı ortamına ve deneysel çalışmalarda da /0 ölçek büyütme oranı ile sıvı ortama aktarılmıştır. 3.. Besi Ortamları Mikroorganizmalar için hazırlanacak katı ve sıvı besi ortamlarının bileşimi, belirli bir mikroorganizmanın gelişmesi, üremesi ve fizyolojik yaşamını sürdürebilmesine yetecek miktarda gerekli maddeleri içermesi gerekmektedir. Buna göre S. cerevisiae mikroorganizmasının optimum çoğalması için gerekli olan sıvı besi ortamı bileşimi, 20 g/l glukoz, 6 g/l maya özütü, 3 g/l K 2 HPO 4, 3.35 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 3.76 NaH 2 PO 4, 0.52
MgSO 4.7H 2 O, 0.07 CaCl 2.4H 2 O; katı besi ortamı bileşimi ise sıvı besi ortamında kullanılan maddelere ek olarak 20 g/l agardan meydana gelmektedir. Besi ortamları, sterilizasyon sırasında glukozun mineral tuzları ile olacak etkileşimini önlemek amacıyla, glukoz çözeltisi ve tuz çözeltisi olarak hazırlanmıştır. Sterilizasyon işlemi 2 atm basınç altında ve 20 0 C deki doygun buharda 20 dakika bekletilerek gerçekleştirilmiştir. 3.2. Deney Sistemi Çalışmada kullanılan biyoreaktör 2 L. hacminde soğutma ceketli pyrex camdan yapılmıştır. Karıştırma 4 bıçaklı türbin tipte mekanik karıştırıcı ile sağlanmaktadır. Sisteme gönderilen hava, rotametreden geçtikten sonra bir mikrobiyolojik filtreden geçtikten sonra dağıtıcı ile biyoreaktör içine gönderilmektedir. Deney sisteminde, on-line bağlı oksijenmetre, ph metre, iki adet termoçift, soğutma suyu pompası bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan deney düzeneği Şekil de verilmiştir. Deneylerde, reaktör sıcaklığı 32 o C de, soğutma suyu sıcaklığını 20 o C de, soğutma suyu akış hızı 55 ml/dk da ve ph 5 te sabit tutulmuştur. Mikroorganizma analizleri, Shimadzu UV spektrofotometrede 580 nm de yapılmıştır. Şekil. Deney Sistemi 4. SONUÇLAR S. cerevisae mikroorganizmasının çoğaltıldığı kesikli bir biyoreaktörde gerçekleştirilen bu çalışmada K L a nın belirlenmesi amacıyla farklı karıştırma hızlarında ve farklı hava akış hızlarında deneyler gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk bölümünde, K L a nın 0.5 L/dk sabit hava akış hızında karıştırma hızı ile değişimi incelenmiştir. Biyoreaktöre sabit akışta hava beslenirken, 600 devir/dk ve 800 devir/dk olmak üzere iki farklı karıştırma hızı uygulanmış ve K L a değerleri hesaplanmıştır. Bunun için sistem yatışkın haldeyken hava akış hızı kesilmiş ve biyoreaktör içindeki çözünmüş oksijenin mikroorganizma tarafından zamanla tüketilmesi gözlenmiştir. Sonuçta, hava beslemesinin kesilmesiyle çözünmüş oksijen derişiminin zamanla azaldığı gözlenmiştir. Sisteme tekrar 0.5 L/dk akış hızında hava gönderilmeye başlanmış ve çözünmüş oksijen derişiminin zamanla arttığı görülmüştür. Deney süresince belirli zaman aralıklarında çözünmüş oksijen derişimleri ölçülmüş ve grafiğe geçirilmiştir. Bu şartlar için çözünmüş oksijen derişiminin zamanla değişimi Şekil 2 de verilmiştir. Bu deneyler sonucunda, 0.5 L/dk sabit hava akış hızında 600 devir/dk çalışma koşulu için K L a değeri 0.26 dk -, 800 devir/dk çalışma koşulu için ise 0.285 dk - olarak hesaplanmıştır.
6 Çözünmüþ Oksijen Deriþimi, mg/l 5 4 3 2 Şekil 2. 0.5 L/dk sabit hava akış hızında ve farklı karıştırma hızlarında deney sonuçları Çalışmanın ikinci bölümü üstel çoğalma fazının başlangıcında ve sonunda, 600 devir/dk sabit karıştırma hızında farklı hava akış hızlarında gerçekleştirilmiştir. Farklı hava akış hızlarında gerçekleştirilen deneylerde önce hava beslemesi kesilmiş sonra tekrar sisteme hava beslenerek çözünmüş oksijen derişiminin değişimi gözlenmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4). Deneyler sonucunda, 600 devir/dk sabit karıştırma hızında üstel çoğalma fazının başlangıcında K L a değeri 2.8 ve 3.4 L/dk hava akış hızlarında sırasıyla 0.2 ve 0.24 dk -, üstel çoğalma fazının sonunda K L a değeri 0.5,.0, 2.3 ve 3.4 L/dk hava akış hızlarında sırasıyla 0.285, 0.4, 0.43 ve 0.5 dk - olarak hesaplanmıştır. 5 0 0 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2 3 4 Zaman,dk Çözünmüþ oksijen deriþimi, mg/l 4 3 2 0 0 2 4 6 8 0 2 4 Zaman, dk Şekil 3. 600 devir/dk sabit karıştırma hızında ve farklı hava akış hızlarında üstel çoğalma fazının başlangıcında deney sonuçları 6 Çözünmüþ oksijen deriþimi, mg/l 5 4 3 2 0 0 2 4 6 8 0 2 4 Zaman, dk Şekil 4. 600 devir/dk sabit karıştırma hızında ve farklı hava akış hızlarında üstel çoğalma fazının sonunda deney sonuçları
Oksijenin besi ortamında çözünmesinde karıştırma hızının ve hava akış hızının etkili olduğu ve bunların optimum değerlerinin deneysel olarak tespit edilerek işletim şartlarının oluşturulması gerekliliğinden yola çıkılarak, çeşitli karıştırma ve hava akış hızlarında K L a belirlenmiş ve değişimi incelenmiştir. Şekil 5 te hava akış hızının ve karıştırma hızının, üstel çoğalma fazının başlangıcında ve sonunda K L a üzerine etkileri gösterilmiştir. Şekil 5 ten görüleceği gibi K L a, karıştırma hızıyla ve hava akış hızıyla doğru orantılı olarak değişmektedir. Biyoreaktör içinde vortekslerin oluşması nedeniyle 600 devir/dk nın işletim şartları için daha uygun olduğu bulunmuştur. Optimum hava akış hızı 3.4 L/dk tespit edilmiştir. K L a, dk - 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 Karýþtýrma Hýzý, rpm 600 700 800 Üstel fazýn baþlangýcý Üstel fazýn sonu Karýþtýrma hýzý 0.5 0.0 0.5.0.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Hava Akýþ Hýzý, L/dk Şekil 5. Hava akış hızının ve karıştırma hızının K L a nın üzerine etkileri 5. SEMBOLLER C o * Gaz fazdaki oksijen derişimi ile dengede olan oksijen derişimi, mg/l C OL Sıvı fazdaki oksijen derişimi, mg/l K G Gaz tarafı toplam kütle aktarım katsayısı, Ns - O C oi Ara yüzeydeki oksijen derişimi ile dengede olan oksijen derişimi, mg/l k G Gaz film kütle aktarım katsayısı, Ns - N OG Gaz fazdan ara yüzeye oksijen molar akısı, mol/m 2 /s C x Mikroorganizma derişimi, gkh/l r o Mikroorganizma özgül oksijen aktarım hızı, mol O 2 /kg/s k L Sıvı film kütle aktarım katsayısı, ms - K L a Sıvı tarafı hacimsel kütle aktarım katsayısı, s - P Oİ Oksijenin ara yüzeydeki kısmı basıncı, Pa 6. KAYNAKLAR. Bailey, J.N. and Ollis, D.F., 986. Biochemical Engineering Fundamentals 2 nd ed.mc Graw Hill, s.-984, New York. 2. Shuler, M.L. and Kargı, F., 992. Biyoproses Engineering Basic Concepts, Prentice Hall, New Jersey. 3. Furukawa, K., Heinzle, E. and Dunn, I.J., 983. Influence of Oxygen on the Growth of Saccharomyces cerevisiae in Continuous Culture. Biotechnology and Bioengineering, 25, 2293-237. 4. Rainer, B.W., 990. Determination Methods of Volumetric Oxygen Transfer Cofficient k L a in Bioreactors, Chem. Biochemical Engineering, 4, 85-96. Bu çalışma Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. (Proje No:29)