DR. MESUT YETGİN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF. DR. FATİH KÖKSAL

T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI MİDE DUEDENUM HASTALIKLARINDA İZOLE EDİLEN HELİCOBACTER SUŞLARINDA AMOKSİSİLİN, KLARİTROMİSİN, TETRASİKLİN, METRANİDAZOL VE RİFAMPİSİN DİRENCİNİN AGAR DİLÜSYON YÖNTEMİYLE ARAŞTIRILMASI DR. MESUT YETGİN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF. DR. FATİH KÖKSAL ADANA 2006

TEŞEKKÜR Mikrobiyoloji uzmanlık eğitimim ve tez çalışmalarım süresince ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, bilgi ve becerilerimin artması için eğitimimi sabırla sürdüren değerli hocam, Prof. Dr. Fatih Köksal a, çalışmalarım esnasında bana önemli katkılar sağlayan asistan arkadaşım Dr. Esra Polat a; biyopsi materyallerinin alınması aşamasında son derece değerli katkılarını aldığım, sayın Prof. Dr. Salih Çolakoğlu ve endoskopi ünitesi çalışanlarına, Mikrobiyoloji Anabilim dalında geçen eğitim sürem içerisinde her zaman destek ve yardımlarını gördüğüm bütün Mikrobiyoloji Anabilim dalı çalışanlarına teşekkürü bir borç bilirim. I

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR I İÇİNDEKİLER II TABLO LİSTESİ V ŞEKİL LİSTESİ VI KISALTMALAR VII ÖZET VIII ABSTRACT IX 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 4 2.1. Tarihçe 4 2.2. Yapı Özellikleri ve Sınıflandırma 5 2.3. Kültür ve Üreme Özellikleri 6 2.4. Epidemiyoloji 8 2.4.1. Prevalans 8 2.4.2. İnfeksiyonun Bulaşması 9 2.5. Hücre Duvarı ve Antijenik Yapı 10 2.6. Helicobacter pylori Virülans Faktörleri 12 2.6.1. Kolonizasyon Faktörleri 14 2.6.2. Konak Savunmasından Korunma Faktörleri 14 2.6.2.1. Hareket 14 2.6.2.2. Üreaz 15 2.6.2.3. Adherens 15 2.6.2.4.Katalaz ve Superoksid Dismutaz 16 2.6.3. Doku Hasarı Oluşturan Faktörler 16 2.6.3.1. cag Patojenik Ada (cagpi) Genleri 16 2.6.3.2. caga 17 2.6.3.3. cage 18 II

2.6.3.4. VirB11 18 2.6.3.5. OipA 18 2.6.3.6. VacA Toksini 18 2.6.3.7. Thioredoxin (CD-59) 19 2.6.3.8. Lipopolisakkaritler 20 2.6.3.9. H.Pylori ye Konağın İmmün Cevabı 20 2.7. H.pylori İnfeksiyonları 22 2.8. H.pylori İnfeksiyonlarının Tanısı 22 2.8.1.İnvaziv Olmayan Testler 25 2.8.1.1. Serolojik Testler 25 2.8.1.2.Üre Nefes Testi (ÜNT) 25 2.8.1.3.Dışkıda Antijen Arayan Testler (HpSA) 26 2.8.2.İnvaziv Testler 27 2.8.2.1.Histopatolojik İnceleme 27 2.8.2.2.Kültürde İzolasyon 27 2.8.2.3.Hızlı Üreaz Testi 28 2.8.2.4.Moleküler Tanı Yöntemleri 29 2.9.Tedavi 30 2.9.1.H.pylori eradikasyonunda kullanılan antibiyotikler 32 2.9.1.1.Amoksisilin 32 2.9.1.2.Metranidazol 33 2.9.1.3.Klaritromisin 34 2.9.1.4.Tetrasiklin 35 2.9.2.Tedavi Kombinasyonları 36 2.9.2.1.Bir antibiyotik + Bir yardımcı (ikili tedavi) 36 2.9.2.2.İki antibiyotik + Bir yardımcı ajan (üçlü tedavi) 36 2.9.2.3.İki antibiyotik + İki yardımcı tedavi (dörtlü tedavi) 36 2.9.3.Antimikrobik Duyarlılık Testleri 36 2.9.3.1.Klasik Direnç Tespit Yöntemleri 36 III

2.9.3.1.1.Besiyeri 37 2.9.3.1.2.İnokülüm Miktarı 38 2.9.3.1.3.İnkübasyon Şartları 38 2.9.3.1.4.Kantitasyon Standartları 39 2.9.3.2.Moleküler Yöntemler 40 3-GEREÇ VE YÖNTEM 42 3.1. Hasta: 42 3.2. Kültür 42 3.3. Antibiyotik Duyarlılık Testleri: 42 3.4. Kullanılan Besiyerleri 43 3.4.1. Columbia Blood Agar Base 43 3.4.2. Brucella Broth 44 3.4.3. Müller Hinton Agar 44 3.5.Antibiyotik Solüsyonlarının Hazırlanması 45 3.6.Biyokimyasal Testler 45 3.6.1. Oksidaz Testi 45 3.6.2. Üre Agar 45 3.7.Klaritromisin Direncinin PCR-RFLP ile Tespiti 45 3.7.1.PCR-RFLP nin Uygulanışı 46 3.7.2.PCR Amplifikasyonu 47 3.7.3.Agaroz Jel Elektroforezi 48 3.7.3.1.10X TBE Tamponu 48 3.7.4.RFLP ile Klaritromisin Direncinin Belirlenmesi 49 4-BULGULAR 51 5-TARTIŞMA 60 6-SONUÇ 66 7-KAYNAKLAR 67 8-ÖZGEÇMİŞ 75 IV

TABLO LİSTESİ Tablo no Sayfa no Tablo 1: Helicobacter türleri ve konak tropizmi 7 Tablo 2: H.pylori Hsp ile insan hücre Hsp benzerliği 12 Tablo 3: H.pylori nin patogenezinde rol oynayan virulans faktörleri 13 Tablo 4: H.pylori nin tanısında kullanılan yöntemler 24 Tablo 5: Mide biyopsi örnekleri ve H.pylori izole edilen örnek sayılarının yıl ve cinsiyet gruplarına göre dağılımı 51 Tablo 6. H.pylori izole edilen örnek sayılarının cinsiyet ve yıllara göre analizi 51 Tablo.7 H.pylori izolatlarının amoksisilin duyarlılıklarının cinsiyet ve yıllara göre dağılımı 52 Tablo 8. Amoksisilin direncinin yıllara göre sayısal ve yüzde dağılımı 52 Tablo 9. H.pylori suşlarında metranidazol duyarlılıklarının cinsiyet ve yıllara göre dağılımı 53 Tablo 10. Metranidazol dirençli H.pylori suşlarının cinsiyet ve yıllara göre dağılımı 54 Tablo 11. Metranidazol direncinin yıllara göre sayısal ve oransal dağılımı 54 Tablo 12. Metranidazol direncinin yıllara göre Ki-Kare testi ile analizi 55 Tablo 13. H.pylori izolatlarının klaritromisin duyarlılıklarının cinsiyet ve yıllara göre dağılımı. 55 Tablo 14. Klaritromisin e dirençli H.pylori izolatlarının cinsiyet grupları ve yıllara göre dağılımları 56 Tablo 15. Klaritromisin direncinin yıllara göre sayısal ve oransal dağılımı 57 Tablo 16. Klaritromisin direncinin yıllara göre Ki-Kare testi ile analizi 57 V

ŞEKİL LİSTESİ Şekil no Sayfa no Şekil 1: Hızlı Üreaz Testleri 28 Şekil 2: PCR-RFLP yöntemi ile amplifiye edilen 23S rrna fragmenti ve enzimlerin hedef dizileri 45 Şekil 3. Metranidazol direncinin yıl ve cinsiyet gruplarına göre dağılımı 53 Şekil 4: Metranidazol dirençli (MİK 8) hemolizsiz H.pylori kolonileri 54 Şekil 5. Klaritromisin direncinin yıl ve cinsiyet gruplarına göre dağılımı 55 Şekil 6: Klaritromisin dirençli (MİK 1) hemolizsiz H.pylori kolonileri 56 Şekil 7: MboII enzimi ile kesim sonrası elde edilen bandlar 57 Şekil 8: 360 bp uzunluğundaki fragmentin BsaI ile hazmı sonucu oluşan bandlar 59 VI

HP RFLP AD DD E-test PCR PPI DNA BHIA Ph H 2 S WHO HPSA LPS caga vaca Hsp PMNL SOD ORF CagPAI TNF MHC CD4 CD8 ÜNT NAAT MIK CLSİ MHA PBS KH 2 PO 4 Na 2 PO 4 ma UV rdxa frxa CLO PBP RBC KISALTMALAR LİSTESİ Helicobacter pylori Restriction Fragment Length Polymorphism Agar Dilüsyon Disk Difüzyon Epsilometrik test Polimerase chain reaction Proton pompa inhibitörü Deoksinükleik asit Beyin Kalp İnfüzyon Agar Asidite Değeri Hidrojen sülfid Dünya sağlık örgütü Helicobacter pylori stool antijen Lipopolisakkarit Sitotoksik ilişkili protein Vakuolize edici protein Heat shock protein Polimorfo nükleer lökosit Süperoksit dismutaz Open Reading Frame Sitotoksik ilişkili patojenik adacıklar Tümör Nekrozis Faktör Majör Histokompatibilite Antijen Helper T-lenfosit Supressör T-lenfosit Üre Nefes Testi Nükleik Asit Amplifikasyon Teknikleri Minimum İnhibitör Konsantrasyon Klinik ve Labaratuvar Standartları Enstitüsü Müller Hinton Agar Fosfat Buffer Solüsyon Kalsiyum Dihidrojen Fosfat Sodyum Dihidrojen Fosfat Mili Amper Ultraviyole Nitroredüktaz Flavin Oksidoredüktaz Hızlı Üreaz Testi Penisilin Bağlayan Protein Ranitidin Bizmut Sitrat VII

ÖZET Mide Duedenum Hastalıklarında İzole Edilen Helicobacter Suşlarında Amoksisilin, Klaritromisin, Tetrasiklin, Metranidazol ve Rifampisin Direncinin Agar Dilüsyon Yöntemiyle Araştırılması H.pylori insanlarda gastrik mukozaya kolonize olarak, nonülser dispepsiden, gastrik adenokarsinomalara kadar değişen gastroduedenal hastalıklarına yol açan spiral şeklinde, gram negatif bir bakteridir. H.pylori ile ilişkili gastroduedenal yakınması olan hastalarda asit sekresyonunun kontrolü ve etkili antibiyotik kombinasyonları ile yüksek oranlarda klinik ve bakteriyolojik başarı sağlanmıştır. Ancak, son yıllarda özellikle ilk seçenek antibiyotiklere karşı primer ve sekonder direnç nedeniyle tedavide başarının düştüğü görülmüştür. Bu nedenle tedavi protokollerinin oluşturulmasında direnç tayini önem kazanmıştır. Bu amaçla Üniversitemiz hastanesi Gastroenteroloji polikliniklerine Nisan2002- Nisan2005 tarihleri arasındaki gastroduedenal yakınmayla başvuran ve endoskopi endikasyonu alan 427 hastanın biyopsi örneklerinden izole edilen 386(%90.4) suş klaritromisin, metranidazol, tetrasiklin, rifampisin ve amoksisilin dirençleri, agar dilüsyon(ad) yöntemi ile incelenmiştir. Ayrıca tüm izolatlar klaritromisin direncinden sorumlu 23S rrna daki A2142G-C ve A2143G-C mutasyonlarını PCR-RFLP yöntemiyle araştırıldı. Amoksisilin, tetrasiklin ve rifampisine karşı AD yöntemi ile direnç görülmezken, metranidazole karşı 2002 izolatlarından 34/114(%34), 2003 te 54/145(%37.24) ve 2004 te de 43/127(%33.8) ünde direnç belirlendi. Klaritromisin e dirençli izolatların sayısı da sırasıyla; 17/114(%14.9), 26/145(%17.9) ve 23/127(%18.1) olarak tespit edildi. Klaritromisin direncine yol açan mutasyonları tespit için PCR-RFLP ile yaptığımız çalışmada 2002 izolatlarının 12(%70.5) inde A2142G mutasyonu, 3(%17.6) ünde A2143G mutasyonlarını belirledik. Bu oranlar 2003 te sırasıyla; 21(%80.8), 3(%11.5) ve 2004 te 20(%86.9) ve 3(%13) olarak belirlendi. PCR-RFLP sonuçları ile AD sonuçları kıyaslandığında 2002 yılında 2(%11.7) izolat ile 2003 yılındaki 2(%7.26) izolatta bilinen mutasyonların dışında başka nedene bağlı direnç geliştiğini tespit ettik. Bu çalışmayla H.pylori izolatlarında, ilk seçenek antibiyotiklere karşı direnç görüldüğü, klaritromisin direncinin bilinen mutasyonlardan başka nedenlerle de ortaya çıkabileceği, bu nedenle de PCR-RFLP ile direnç tayininde, direkt dokudan ekstrakte edilen DNA yerine, kültürdeki mikroorganizmadan izole edilen DNA ile çalışılması ve sonuçların AD yöntemi ile karşılaştırılmasının yararlı olacağı kanısına varıldı. VIII

ABSTRACT An İnvestigation Of Amoxicillin, Clarithromycin, Tetracycline, Metranidazole And Rifampin Resistance Of H.pylori Species İsolated From Gastro-Duedenal Diseases By Agar Dilution Method Helicobacter pylori is a spiral gram negative bacteria which cause gastroduodenal diseases varying from non-ulcer dyspepsia to gastric adenocarcinoma by colonisation of human gastric mucosa. High clinical and bacteriological success has been achieved in patients having gastroduodenal complaints by acid secretion controls and effective antibiotic combinations. However, in recent years, it has been observed that success in treatments have decreased due to primary and secondary resistance to first propose antibiotics. Thus, determination of resistance became significant in developing new treatment protocols. In this study, 386(%90.4) isolates was isolated from gastric biopsy samples of 427 patients who applied to our university policlinics with gastroduodenal complaints between the years 2002 and 2005, have been investigated by agar dilution methods(ad) for clarithromycine, rifampin, tetracycline, metranidazole and amoxicillin resistances. Besides, A2142G-C and A2143G-C mutations in 23SrDNA which cause resistance to clarithromycine had been investigated via the application of PCR-RFLP method. While no resistance to tetracycline, rifampin and amoxicillin had been observed, resistance to metranidazole had been detected from 2002, 2003 and 2004 isolates in the ratios of respectively 34/114(%34), 54/145(%37.24) and 43/124(%33.8). The ratios of isolates resistant to clarithromycin had been detected respectively as 17/114(14.9%), 26/145(17.9%) and 23/127(18.1%). All of the isolates was conducted through the application of PCR-RFLP method in order to detect mutations that cause to clarithromycin resistance. We identified A2142G and A2143G mutations in 2002 isolates in the ratios respectively 12(70.5%) and 3(17.6%). These ratios had been identified respectively as 21(80.8%) and 3(11.5%) in 2003 isolates, and 20(86.9%) and 3(13%) in 2004 isolates. When AD and PCR-RFLP results had been compared, we have detected that resistance developed in the 2002 isolate which is resistant in the ratio of 2(11.7%), and in the 2003 isolate which is resistant in the ratio of 2(7.26%) with other reasons than the previously known mutations. In conclusion, our results show that, there is a resistance to first propose antibiotics in H.pylori isolates, and clarithromycin resistance may develop due to other reasons than the previously known mutations. Thus, we considered that the DNA isolated from the microorganism in the culture is more useful the DNA extracted from the tissue for PCR-RFLP and compare it with AD method results can be more effective for to detect clarithromycin resistance. IX

1.GİRİŞ H pylori; insanlarda midenin özellikle antrum ve korpus bölgeleri başta olmak üzere, gastrik hücre metaplazisi görülen bütün bölgelerinde kolonize olabilen konak ve doku tropizmi gösteren bir mikroorganizmadır. Bütün dünyada insanların ortalama %50 sinin midesinde kolonize olduğu tahmin edilen H.pylori nin prevalansı semptomatik ve asemptomatik gruplar arasında farklılıklar gösterse de, gelişmekte olan ülkelerde bu oran %60-85 arasında değişmektedir. 1 Ancak, gelişmekte olan ülkelerde kişisel hijyene verilen önem ve yapılan başarılı eradikasyon çalışmaları ile prevalans %10-30 lara kadar geriletilmiştir. 1,2 Benzer şekilde insidans oranı da gelişmekte olan ülkelerde %3-10/yıl gibi yüksek oranlarda iken, gelişmiş ülkelerde insidans oranıda %0.5'lere kadar düşmüştür. 1,2 Bildirilen bu oranlar, H.pylori infeksiyonları ve komplikasyonlarının öncelikli olarak gelişmekte olan ülkelerin problemi olduğu gerçeğini ortaya koymaktadır. 1,2 Problemlerin boyutlarını kavramak için retrospektif çalışmaların değerlendirilmesi gereklidir. 3 Bu çalışmalar asemptomatik kolonize kişilerin en az %20 sinde, kolonizasyonu takip eden 10 yıl içerisinde tedaviyi gerektirecek klinik bulguların ortaya çıkabileceğini göstermektedir. 3,4 Bu tahminler ile ülkemizdeki prevalansı %80-86 arasında olan H.pylori infeksiyonları nedeni ile önümüzdeki 10 yıl içerisinde en az 10 milyon hastanın tedaviye ihtiyaç duyacağı görülmektedir. 4 Tedavi başarısızlığı halinde dirençli suşların gelişimi riskinin yanısıra, kronik infeksiyonlular veya hiç tedavi edilmeyen olgularda %2-4 oranında gastrik karsinoma gelişme riskinin olması, tedavide etkili politikaların oluşturulmasını zorunlu kılmaktadır. Mevcut tedavi protokolleri prensipte gastrik asidin inhibisyonu ve etkenin etkili antibiyotiklerle eradikasyonu esasına oturtulmuştur. Bir proton pompa inhibitörü veya + H 2 reseptör blokörü ile tek başına asit sekresyonunun inhibisyonu geçici olarak klinik kürü sağlamasına rağmen bakteriyolojik eradikasyonu sağlamadığı için kısa süreli remisyondan sonra reaktivasyonlar görülmüştür. 5 Bu sebeple, asit inhibisyonu ile birlikte bakteri eradikasyonunu hedef alan kombine protokoller tedavinin temelini oluşturmuştur. Bugüne kadarki klinik gözlemler, H.pylori suşlarının da, diğer Gram negatif bakterilerde olduğu gibi, enzimatik yıkım veya hedef genlerde nokta mutasyonları yolu ile ilk seçenek antibiyotiklere karşı kısa sürede direnç gelişebildiğini ortaya koymuştur. 4 Bu 1

bağlamda metranidazol direnci, Avrupa ülkelerinde %6.4-41.9, klaritromisin direnci ise %1-19 gibi oranlarda iken, gelişmekte olan ülkelerde bu antibiyotiklere karşı direnç sırası ile %35-90 ve %9-33 gibi yüksek oranlara çıkmıştır. 4,6 Sekonder direnç halinde tedavi başarısızlıklarının, çok daha yüksek olduğu da klinik olarak ispatlanmıştır. 6 H.pylori infeksiyonlarında kullanılan ilk seçenek antibiyotiklerin başta anaerop intraabdominal infeksiyonlar, solunum yolu infeksiyonları ve gastroenteritler gibi hayati öneme sahip geniş bir endikasyonda yaygın olarak kullanılması, hastanın yaşı ve cinsiyeti gibi faktörler bu antibiyotiklere karşı primer direncin nedenidir. Hastanın antibiyotiğe uyumsuzluğu ve uygunsuz kullanımda sekonder dirence yol açmaktadır. Bu nedenle, gerek antibiyotiklerin akılcı kullanımının sağlanması, gerekse toplumda antibiyotik dirençli suşların ortaya çıkış ve dağılımının engellenmesi için H.pylori tedavi protokollerinde yer alan amoksisilin, metranidazol, tetrasiklin, rifampisin ve klaritromisin gibi ilk seçenek antibiyotiklere karşı direncin takibi ve yeni tedavi protokollerinin direnç kalıpları dikkate alınarak düzenlenmesi şarttır. Son yıllarda primer ve/veya sekonder direnç gelişimi karşısında içerisinde klaritromisin ve metranidazolün yer almadığı, amoksisilinin yanına tetrasiklin, rifampisin veya metranidazol dışındaki diğer 5- nitroimidazol veya nitrofuran grubu antibiyotiklerden birisinin eklendiği, PPI ve ranitidin bizmut subsitrat bileşiklerinin birlikte kullanıldığı 4 lü kısa süreli tedavi rejimleri önerilmeye başlanmıştır. 7,8 Yine bir glikopeptid olan laktoferrin'in antibakteriyel etkinliğinden faydalanılan 4 lü tedavi rejimleride denenmiştir. 8 Ancak, bakterinin invitro şartlarda üretilmesindeki güçlük nedeni ile birçok merkezde kültür-antibiyogram testleri yapılamamakta, ortaya çıkan boşluk, ya Maastricht konsensusu gibi uluslararası gözlemlere dayanılarak yaratılan protokoller veya lokal klinik çalışmaların sonuçlarına dayanılarak doldurulmaktadır. 9 Oysa bu protokolleri oluşturan ülkelerde prevalans ve insidansın düşük olması nedeni ile tedavide ciddi anlamda direnç ve rekürrens sorunu yaşanmamakta, yaratılan tedavi protokolleri de yüksek prevalans ve insidansa sahip ülkelerde başarılı olamamaktadır. 10 H.pylori izolatlarında antibiyotik duyarlılığının belirlenmesi için AD, DD ve E-Testi gibi klasik yöntemlerin yanısıra özellikle klaritromisin direncinin tayininde 2142 ve 2143 kodonlardaki A-G/C mutasyonlarının tespiti için PCR- RFLP yöntemi kullanılmıştır. 10,11 2

Bu çalışmanın amacı, farklı coğrafik özelliklerinin yanısıra farklı beslenme alışkanlıklarına sahip bölgemizde gastroduedenal yakınması olan hastalardan izole edilen H.pylori suşlarındaki ilk seçenek ilaçlardan amoksisilin, tetrasiklin, rifampisin, klaritromisin ve metranidazole karşı, yıllara bağlı olarak gelişmesi beklenen primer direnci AD yöntemi ile tespit etmek ve klaritromisin direncini tespitte PCR-RFLP yönteminin duyarlılığını göstermektir 3

2.GENEL BİLGİLER 2.1.Tarihçe H.pylori, Gastroenteroloji ve Mikrobiyoloji bilim dallarının multidisipliner çalışma ile keşfettikleri, 20 yy. tıbbına damgasını vuran en önemli buluşlardan birisidir. Dr.Blaser ve arkadaşları 2 tarafından en az 11.000 yıldır insanların mide mukozasında kolonize olduğu gösterilen H.pylori, 1983 yılında kendisini Tıp alemine tanıtan Avustralya lı Patolog Robin Warren ve Mikrobiyolog Barry Marshall a ekim 2005 tarihinde Fizyoloji ve Tıp bilimleri alanında Nobel ödülü kazandırmıştır. 12 Hipokrat ın epigastrik yanma ve şişlik olarak tanımladığı mide-duedenum patolojisinin etiyolojisi ile tarih içerisinde birçok etken ilişkilendirilmiştir. 2,12 İbn-i Sina yemek-gastrik ağrı ilişkisinden bahsetmiş, Alman bakteriyolog G.Bottcher ve arkadaşı Fransız M.Letulla, ilk kez ülser tabanında ve kenarında bakteri kolonilerini göstererek, kültür ortamında üretemedikleri bu bakterilerin ülsere neden olduğunu ileri sürmüşlerdir (1875). 2,12 Dr W.Jarowski (1889) insandan aldığı mide yıkama suyu sedimentlerini incelemiş, sıvı içerisinde çomak şeklindeki bakterilerin yanısıra spiral şekilli basillerin varlığını göstererek, bunlara Vibrio regula adını vermiştir. 2,12 Bu araştırıcı tarihe spiral bakteriler gastrit etkenidir iddiasını ilk ileri süren araştırmacı olarak geçmiştir. 2,12 Neuberger sağlıklı kişilerin mide suyu ve mide mukozasında da spiral bakterinin varlığını göstermiştir. 2,12 Sir Berkeley Moynihan, aşırı mide asidinin duodenum mukozasını dijesyona uğratarak ülser oluşturduğunu ileri sürmüştür. 2,12 Schwartz (1910) "No acid, no ulcer" aforizmasını ortaya atarak ülserle asit arasındaki ilişkiyi kurumsallaştırmıştır. 2,12 H.W. Steer (1975) ve Colin Jones gastrik biyopsi örneklerinde epitele yakın konumda bakterilerin varlığını gösterirken Rollasan ve arkadaşları da (1981) gastrik spiral bakteriyi göstermişler, ancak midenin yüksek asiditesi nedeniyle burada bir mikroorganizmanın yaşayabilmesine ve hastalık yapabilmesine ihtimal vermemişlerdir. 2,12 Yapılan araştırmaların çoğunlukla postmortem çalışmalar olması, hastalık etkeni olabileceği bildirilen mikroorganizmaların genellikle bulaş kaynaklı olabileceği şüphesine yol açmıştır. 2,12 4

H.pylori ile gastroduedenal hastalıkları arasındaki ilişki, bilimsel anlamda, Tıp dünyasına ilk olarak Marshall ve Warren'ın 12 1981 yılında başlayan ve sonuçlarını 1984 yılında Lancet dergisinde yayınladıkları çalışmaları ile duyurulmuştur. Patolog R.Warren yıllardır gastritli olgularda gözlemlediği bakteriyel yapıları gastroenteroloji asistanı B.Marshall ile birlikte değerlendirmeye başlayarak gastrit-bakteri ilişkisi konusundaki çalışmaların ilk adımını atmışlardır. Dr.Marshall bu bakteri ile gönüllü olarak kendisini infekte etmiş ve bir süre sonra kendisinde gastrit tablosunun geliştiğini görmüştür. Bu gözlemlere dayanan Dr.Marshall, bu bakterinin sadece mideyi infekte etmekle kalmayıp mide dokusunda inflamasyonu arttırdığını da deneysel olarak ispatlamıştır. 12 Bu gelişmeleri takiben Marshall ve Warren 12 14 Nisan 1983 tarihinde, yüzyılın en önemli keşiflerinden biri olarak kabul edilen H.pylori yi kültürde izole etmişler ve ilk bulgular Marshall 12 tarafından 1984 yılında Lancet dergisinde yayınlanmıştır. Bakteri, yapısal olarak "Campylobacter jejuni"ye benzemesi nedeni ile önce "Campylobacter-like organism" olarak adlandırılmış, yapılan çalışmalar sonucunda yağ asitleri, DNA zincir yapısı ve enzimlerinde birçok farklılıklar olduğu anlaşılmış ve bakterinin Campylobacter cinsine ait olmadığı gösterilmiştir. 2,13 İnvivo helikal görüntüsü ve sıklıkla midenin pilor bölgesinden izole edilmesinden dolayı 1989 da uluslararası uzlaşma ile bu bakteriye Helicobacter olarak tanımlanan yeni bir cins içerisinde yer verilmiş ve Helicobacter pylori olarak isimlendirilmiştir. 10,13 2.2.Yapı özellikleri ve sınıflandırma H.pylori; virgül, S veya spiral şeklinde görülebilen, 2,5-5,0 x 0,5-1,0µm boyutlarında, sporsuz, bir uçta bulunan 4-6 adet arasında değişen sayıdaki kılıflı flagellaları ile son derece hareketli, mikroaerofilik, gram negatif mikroorganizmalardır. Dışkıdan yapılan boyalı preparasyonlar veya eskimiş kültürlerden hazırlanan preparatlarda, hücre duvarı degrade olmuş koklar şeklinde görülebilirler. Bu şekil, uzun süreli antibiyotik kullanan hastalardan alınan biyopsi örneklerinde de görülmektedir. Hayvan deneyli çalışmalarda hücre duvarındaki hasarın Th1 cevabı ile de ilişkili olduğu gösterilmiştir. Dormand form olarak tanımlanan bu şeklin tekrar çoğalma ve infeksiyon yapma yetenekleri yoktur. Doğada, kontamine su 5

kaynaklarında da görülen "Helicobacter ailesinin tek cinsi "Helicobacter" olup 20 türü saptanmıştır (Tablo1). Bu cinste yer alan H.pylori ve diğer mikroorganizmaların konak ile ilişkilerinin tümünde sindirim sistemi doku ve organlarına karşı tropizm görülür. Doğada kedi, köpek, domuz ve kemiriciler gibi birçok farklı hayvan türünde farklı intestinal "Helicobacter türü tanımlanmış olmasına rağmen insanlara en iyi uyum sağlamış, gastroduedenal patolojisine neden olan tür "Helicobacter pylori dir. 2.3.Kültür ve üreme özellikleri H.pylori müşkülpesent bir mikroorganizmadır. Optimize edilmiş besiyerlerinde bile son derece yavaş ürer. Helicobakterler mikroaerofilik mikroorganizmalar olup, metabolizmaları için oksijene ihtiyaç duyarlar. İnvitro koşullarda üretilmeleri için %5 oksijen (O2), %75 nitrojen (N2), %10 hidrojen (H2) ve %5-10 karbondioksit (CO 2 ) içeren nemli atmosfer (%98) gereklidir. Bekletilmiş at, koyun veya insan kanı ilaveli (%5 lik) Beyin kalp infüzyon agar (BHIA), Brucella agar, Columbia agar ve Skirrow agar gibi zenginleştirilmiş besiyerleri H.pylori için ideal besiyeridir. Son yıllarda kan içermeyen zenginleştirilmiş besiyerlerinde de ürediği gösterilmiştir. 10,13 Besiyerlerine vankomisin, amfoterisin-b, trimetoprim ve kolistin gibi antibiyotikler eklenerek seçicilik özelliği sağlanır. Mezofilik bir bakteri olan H.pylori 30 C ve 37 C ısıda ve 7-10 günlük inkübasyon süresinden sonra üreyebilirken, 25 C de üreyemez. İnkübasyon süresinin 7 günden az tutulmaması ve transport şartlarına dikkat edilmesi halinde optimal üreme sonuçları elde edilebilir. İnkübasyon süresi sonunda 0.5-2mm çapında renksiz veya gri renkli, saydam görünümlü koloniler oluşmaktadır. H.pylori midenin asit ortamında üremesine rağmen asidofilik bakterilerden değildir. Buna karşılık ph aralığı oldukça geniştir (5.5-8.5). Fakat optimal üreme 6.9-8.0 ph aralığında gerçekleşir. H.pylori uzamış inkübasyon süresi, düşük ph derecesi ve oksijen ile temas gibi çevresel faktörlere son derece duyarlıdır. Safralı ortamlardan olumsuz etkilenir. Subkültürlerinde üretilmesi zor olan bir bakteridir. Metabolizmaları için gerekli enerjiyi aminoasitlerden, üreden ve CO 2 'den sağlarlar. Klasik besiyerlerinde genellikle dört pasajdan sonra canlılığını kaybederler. 2,13 6

Tablo 1. Helicobacter türleri ve konak tropizmi Tür Konak Doku İlk bildirim H.pylori İnsan Mide 1985 H.mustelue İnsan GİS 1988 H.cinaedi İnsan GİS 1988 H. felis Kedi GİS 1991 H.fennelliae Kedi GlS 1991 H.nemestriane M.nemestrina GfS 1991 H. maridarum Rodent GİS 1992 H.acinonychis Domuz GİS 1993 H. bilis İmbret fare GİS 1993 H.hepaticus Fare Karaciğer 1994 H.pametensis Kuş, domuz GİS 1994 H.pullorum İnsan GİS 1995 H.bizzozeronii Köpek GİS 1996 H.trogontum Rat GlS 1996 H.cholecystus Suriye hamster GİS 1 997 H.rodentium Laboratuvar faresi GİS 1997 H.rappini Fare GİS 1997 H.salomonis Köpek GİS 1997 H.bovis Sığır GİS 1999 7

H.pylori laboratuvarda; oksidaz, katalaz ve güçlü üreaz aktivitesi, nitrat redüksiyon yeteneği, sülfürlü bileşikleri kullanarak H 2 S oluşturabilmesi, hippuratı hidrolize edememesi, nalidiksik aside dirençli, sefalotine duyarlı olması ile ayırdedilebilir. 13,14 2.4.Epidemiyoloji: 2.4.1.Prevalans H.pylori infeksiyonu, dünya nüfusunun %50 sinden fazlasını etkileyen bakteri hastalıklarından biridir. 9,15 İnsidansı az gelişmiş ülkelerde %60-80 lere ulaşırken; gelişmiş ülkelerde beslenme, hijyen ve antibiyotik kullanımına bağlı olarak %5-10'a kadar düşebilmektedir. 16 Bu oran Asya da %70-80, Afrika da %70-90, Kuzey Amerika da %30-40, Güney Amerika da %80-90 ve Avrupa da %30-70 dir. 1,3,13,15,16 H.pylori amoksisilin, metranidazol, tetrasiklin ve klaritromisin gibi antibiyotikler ile kombine edilmiş anti-asitlerin ve/veya proton pompa inhibitörlerinin kullanıldığı kombine eradikasyon tedavilerine cevap vermektedir. 8,17 Ancak, gelişmiş ülkelerde eradikasyon tedavilerinden sonra tekrarlayan infeksiyon oranı yıllık %1'den daha az olmasına rağmen gelişmekte olan ülkelerde bu oran %15-50 lere kadar ulaşmıştır. 17 Tedavi başarısızlıkları nedeni ile ortaya çıkan sekonder direnç gelişimi halinde tedavide başarı şansı iyice azalmaktadır. 1,17 Ülkemizde H.pylori prevalansının araştırıldığı bir çalışmada bu oran %67 olarak bildirilmiştir. 18 Bunun duodenum ülserinde %96, mide ülserinde %45 ve nonülser dispepsilerde %88 olarak tespit edildiğini rapor etmişlerdir. 18 Birçok merkezde gerçekleştirilen ve dispeptik hastalardaki H.pylori dağılımını ortaya koyan çalışmalarda, ülkemizde bu oran %60-81 arasında değişkenlik göstermektedir. 18-20 Bölgemizde semptomatik ve asemptomatik kişilerde H.pylori nin midedeki kolonizasyon prevalansını tespit amacı ile Sandıkçı ve arkadaşlarının 20 biyopsi materyallerinden H.pylori izolasyonunu esas alan bir çalışmalarında; gastroduedenal patolojisi 8

olan, histopatolojik olarak tanı almış hasta gruplarında H.pylori insidansını %86 olarak tespit etmişlerdir. Ülkemizdeki H.pylori infeksiyonlarının sıklığını tespit amacı yapılan başka çalışmalarda ise endoskopi bulguları ile H.pylori stool antijen (HpSA) testi sonuçları birlikte değerlendirilmiş, ve çalışmada, endoskopik olarak gastrit saptanan olguların %61 inde, gastrik ülserlilerin %100 ünde ve duodenal ülserli hastaların %90 ında H.pylori pozitifliği bildirmişlerdir. 15,21 H.pylori nin yaş gruplarına göre dağılımı gelişmekte olan ülkeler ile gelişmiş batı ülkeleri arasında farklılıklar göstermektedir. Gelişmekte olan ülkelerde infeksiyon çocukluk çağında hızla kazanılmakta ve adölesan çağa gelmeden toplumun büyük bir kısmı infekte olmaktadır. 22,23 Batı ülkelerinde ise erişkinlerin %80-90 ı infekte durumdayken, çocuklarda bu oran %5-10 civarındadır. 23 2.4.2.İnfeksiyonun bulaşması: H.pylori infeksiyonlarında, düşük sosyo-ekonomik şartlar, kalabalık aile ortamı, sanitasyon yetersizliği, anne-babanın bu bakteri ile infekte olması gibi ailesel faktörlerin etkili olduğu gösterilmiştir. 16,24 H.pylori nin insan ve yüksek primatlar dışında doğal kaynağı veya taşıyıcısı bulunmamaktadır. İnsanlar arasında bulaşımda fekal-oral ve oral-oral yol önemlidir. H.pylori nin cinsel yolla geçtiğini gösteren hiçbir epidemiyolojik veri yoktur. 16,24 H.pylori infeksiyonu sıklıkla çocukluk döneminde kazanılır ve çocuklar en savunmasız gruptur. Çocuklar yetişkinler arasında infeksiyon için bir vektör olarakta rol oynarlar. Çocuklar arasındaki infeksiyon sıklığı, özellikle diğer aile bireyleri infekteyse daha yüksektir. İnfekte annelerin çocuklarında, infekte olmayanlara göre beş kat daha fazla H.pylori infeksiyonu görülmüştür. 25 Çocukluk döneminde birden fazla suş midede kolonize olabilir, ancak suşların çoğu spontan olarak eradike olurken, mide mukozasına ve konağın immün sistemine direnç gösterebilen genotipler konakta kalıcı kolonizasyon oluşturabilir. 26 Kişi ve çevre hijyeni bozuk toplumlarda hayatın her döneminde yeniden infeksiyon riski miks infeksiyon ihtimalini artırmaktadır. 26 H.pylori nin insanlar arasında oral-oral geçiş ile ilgili en önemli bulgu oral kavitedeki, özellikle dişeti ve diş taşlarındaki mikroorganizmanın 9

kolonizasyonunun gösterilmesidir. Oral-oral geçişte öpüşmenin bir bulaş yolu olabileceği gibi oral kaviteden sürekli olarak mideye bakteri geçişi olabileceği de ileri sürülmüştür. 16,27 Ağız içerisindeki H.pylori nin, kötü diş sağlığı ve diş plağı oluşumu ile birlikte, özefagus ve üst gastrointestinal sistem kanserleri arasında bir ilişkisinin olduğu, araştırmalarda gösterilmiştir. 19,27 H.pylori, 1994 yılında WHO a bağlı Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı tarafından birinci sınıf kanserojen olarak bildirilmiştir. 27 Gastrik kanser, dünyada 700 bin ölü/yıl ile kanser nedenli ölümler arasında üçüncü sırada yer almaktadır. 19,27 H.pylori ile infekte hastalarda kullanılan ve yeterli dezenfeksiyon işlemi uygulanmamış endoskopların kullanılması ile görülen bulaşda oral-oral geçişe örnek olarak gösterilmektedir. H.pylori suşlarının spiral ve dormant formlarının gaitada gösterilmesi, fare modelli çalışmalarda, gaitadaki dormant formlarla fekal-oral bulaşın mümkün olduğunun gösterilmesi, özellikle gelişmekte olan ülkelerde insanlarda da fekal-oral bulaşmanın önemli olabileceğini düşündürmektedir. 24,27 Bu şekilde bulaşda gaita ile kontamine suların, kontamine sebze ve meyvelerin rol oynayabileceği ileri sürülmüştür. 24,28 Peru da yapılan bir çalışmada içme suyunu evin dışından taşınarak içen çocuklarda, ev içi su kaynağını içen çocuklara göre üç kat daha fazla H.pylori infeksiyonu riski görülmüştür. 29 2.5.Hücre duvarı ve antijenik yapı H.pylori hücre duvarı kimyasal özellikleri yönünden A1 grubuna uygun olmasına rağmen muropeptid yapısal özellikleri ile aynı grupta yer alan gram negatif çomakların çoğundan önemli farklılıklar gösterir. Örneğin NAMA-NAGA arasındaki pentapeptit yan zincirin miktarı ve zincirin C-terminal ucunda yer alan glisin rezidü noksandır. Yine H.pylori suşlarında murene bağlı lipoprotein, trimerik muropeptidler ve çapraz bağlarda daha azdır. Bu değişimler bakterinin dış zar ile ilişkili antijenik özelliklerini de etkilemektedir. H.pylori hücre duvarında birbirinden farklı 20'den fazla protein bulunmasına karşılık majör yapı elemanı lipopolisakkarittir. H.pylori lipopolisakkariti, diğer Gram negatif bakterilerinkinden bazı farklılıklar gösterir. H.pylori, lipit A içermediğinden antijenik gücü E.coli ve diğer önemli Gram negatif patojenlerin 1/1000 i kadardır. Ayrıca H.pylori LPS de yüzeyde eksprese edilen polisakkarit yapıda, diğer Gram negatif bakterilerde 6 olan zincir sayısının 4 olması, buna 10

karşılık zincirdeki karbon sayısının daha fazla olması, polisakkaritlerin antijenik özelliğini zayıflatmaktadır. 30 H.pylori lipopolisakkarit-o yan zincirinde yer alan Lewis tipi karbonhidrat antijenleri (Lewis x ve Lewis y) ile insan eritrosit ve gastrik mukoza hücrelerinin yüzeyinde yer alan Lewis antijenleri (Lewis a ve Lewis b) ve O grubu insan eritrositlerindeki H-1 antijenleri (Bab) ile yapısal olarak benzerdir. 30 Bu özellikler kronik kolonizasyonu, immun toleransı veya kronik infeksiyonlara bağlı otoimmun patolojiyi yaratır. H.pylori suşları gastrik mukozaya kolonize olabilme, canlılığını devam ettirebilme, konağın immün cevabından kaçabilme ve kronik infeksiyonu provoke edebilme yeteneğine sahip olan, yüksek oranda genetik polimorfizm gösterebilen bir mikroorganizmadır. Bu yetenek, intrakromozomal shift olarak tanımlanan büyük mutasyonlar, insersiyon dizilerindeki yerleşim farklılıkları, vaca gen dizisindekine benzer mozaik genlerin varlığı, caga patojenik adasındaki mutasyonlar ve aynı konağı infekte eden suşlar arasındaki rekombinasyonlar ile kazanılmaktadır. 30 İlginç olan kolonizasyon esnasında Lewis antijenlerinde meydana gelen mutasyonlardır. H.pylori suşları konağın immun cevabından kurtulabilmek için infeksiyon esnasında kendi antijenik yapısını konağın Lewis antijenine uydururlar. 30 H.pylori hücre yüzeyinde eksprese edilen proteinlerden; 25 kda ağırlığındaki sialize epitopların gastrik hücreye bağlanmada, 63 kda ağırlığındaki glukokonjugatların da epitel hücre yüzeyi ile epitel hücre arası bağ dokuya bağlanmada etkili olduğu gösterilmiştir. 30 Yukarıda bahsedilen yaklaşık 74 kda ağırlığında olan ve antijenik olarak polimorfizm gösteren kan grubu antijenleri de (baba ve babb) konakta güçlü immün cevaba yol açmazlar. Kaldı ki mikroorganizma tarafından eksprese edilen Thioredoksin(11;18) ve güçlü üreazın proteinleri sülfidril bağlarından keserek degrade edebilmesi, mikroorganizma etrafında spesifik antikorlara ve protein yapıdaki sitokinlere karşı koruyucu bir bariyer oluşturarak antikorların mikroorganizmaya ait hedef antijenler ile ilişkilenmesini engellemektedir. 31 H.pylori yüzeyinde eksprese edilen GroEl ve DNAk ailesine mensup şeparon proteinler veya Isı şok proteinler (Hsp) büyük moleküler ağırlığa sahip şeparon proteinlerdir. Bu proteinler insanlardaki birçok hücre Hsp leri ile homolog olmaları nedeni ile konak immün sistemi tarafından algılanmazlar. Ancak, kronik infeksiyonlarda konak immün sistemi 11

tarafından algılanırlar ki bu patolojik otoimmun cevaba dönüşür. Sonuç olarak, gastrik karsinomalara kadar giden irreversibl doku hasarı tetiklenir. 32 Tablo2. H.pylori Hsp ile insan hücre Hsp benzerliği H.pylori HpCopA ve HpCopB 686 Aminoasit P-tipi ATPaz VacA Üreaz β zinciri HspB,Hsp 60 Hemağlütinin proteazlar Konak H + K + ATPaz H + K + ATPaz H + K + ATPaz H + K + ATPaz Hsp 60 Karbonik anhidraz 2.6.H.pylori Virülans Faktörleri H.pylori nin neden olduğu gastroduedenal patolojide mikroorganizmaya ait çok sayıdaki virulans faktörünün yanısıra konak ve çevreye ait faktörlerinde birlikte etkili olduğu bilinmektedir. Bugüne kadar hiçbir virülans faktörü veya predispozan faktörün tek başına spesifikl bir patoloji ile ilişkisi fizyopatolojik olarak açıklanamamıştır. 33 Ancak mikroorganizmanın konağın immüncevabından kaçışı ve kaçışta etkili olan faktörlerle konak mukozası arasındaki ilişki virulansa yönelik çalışmaların temelini oluşturmaktadır. Muhtemelen konakta oluşan cevap, çoğu kez konağa minimal zarar verirken, bazı olgularda uzun süreçte denge, iyice konak aleyhine bozularak, çeşitli mide hastalıklarına neden olmaktadır. 33 H.pylori infeksiyonları patogenezinde; A-kolonizasyon, adezyon ve konak savunmasından kaçış faktörleri, B-gastrik mukozada hasara neden olan virulans faktörleri rol oynarlar (Tablo 3). 12

Tablo 3. H.pylori nin patogenezinde rol oynayan virulans faktörleri Özellik Etki Spiral şekil Flagella Mukus içinde hareketi sağlar Hareketin etkin oluşunu sağlar Fosfatidiletanolamin Mide mukusu salgılayan hücrelerde seçici kolonizasyon. GM3 gangliozid ve Lewis B antijenlerine spesifik bağlanma Üreaz Katalaz Fosfolipaz (A ve B) Mide ortamında yaşam sürdürme (bazı hayvan modellerinde amonyağın epitel hücresine toksik olduğu gösterilmiştir) Mide ortamında ve muhtemelen de fagositik vakuolde (H 2 O 2 'den korunarak) yaşama Mukusun ve epitel hücre zarının sindirimi, mukus ıslaklığının artışı Proteaz Mukusun ve epiteliyal hücre zarının sindirimi, mukusun eriyebilirliğinin artışı Vakuol yapıcı sitotoksin (vac A) Düşük molekül ağırlıklı kemotrtif proteinler (porinler) cag A (Cytotoxin Associated Gen A) Isı şok proteinleri (Hsp A ve B) Epitel hücresinin zarar görmesi Nötrofil ve mononükleer hücreleri kendine çekerek reaktif oksijen bileşikleri ve interlökinlerin salınması Sitotoksin oluşumu ve peptik ülserle ilişkili olduğu düşünülüyor Otoimmünitede rol oynarlar 13

2.6.1. Kolonizasyon faktörleri Asidofilik bir bakteri olmamasına rağmen H.pylori midedeki asit sekresyonu, hareketlilik ve kalın musin tabakasının yarattığı olumsuz şartlara rağmen mukus içerisinde kolonize olmayı başarır. 33 Midede kardia ve antrum ile duodenumdaki gastrik hücre metaplazisi görülen alanlarında kolonize olan H.pylori, %80-98 oranında lümende ve oksintik kanallarda mukus içerisinde, %2-20 oranında ise gastrik hücrelerin üzerinde yerleşirler. Mikroorganizma mide mukozasında epitel hücreler dışında nöroendokrin hücreler ve nötrofillere karşı da tropizm gösterir. 33 H.pylori gastrik hücrelerde protein kinazları uyararak, nükleer faktör kappayı aktive eder. Uyarılan epitel hücre nükleusunda IL-1, IL-6 ve IL-8 başta olmak üzere proinflamatuvar sitokinlerin sekresyonu ile ilgili gen transkripsiyonu başlar ve bu sitokinler salgılanır. Sonuçta inflamatuvar cevap başlar. PMNL, makrofaj ve lenfositlerden oluşan inflamasyonu provake eder. Kronik inflamasyonla eş zamanlı olarak lokal ve sistemik spesifik antikor cevabı ortaya çıkar ancak bunlara rağmen bakteri eradikasyonu sağlanamaz ve kolonizasyon kronik hale dönüşür. 33 2.6.2.Konak Savunmasından Korunma Faktörleri H.pylori; midede kolonizasyonu engelleyici faktörlere karşı koyabilecek birçok yapı elemanları, enzim ve toksinlere sahiptir. Bu elemanlar; flagellalarla sağlanan güçlü hareket yeteneği, üreaz enzimi, bağlanmadan sorumlu proteinler (adezinler), musinaz gibi suda çözünür extraselüler mediyatör proteinler, katalaz enzimi, proliferasyonu inhibe eden proteinler, VacA ve CagA toksini ile Thioredoxin (11;18) dir. 34,35 2.6.2.1. Hareket Midede lümen ve mukoza arasında viskoelastik bir mukus tabakası yer almaktadır. H.pylori nin bu mukus tabakası içindeki hareketi, bir tarafında bulunan 6 adet kılıflı flagellaları sayesinde son derece hızlı bir şekilde olmaktadır. 36 Spiral yapı da hareketini 14

son derece kolaylaştırmaktadır. Bu üstün hareket kabiliyeti sayesinde asidik bir ortam olan lümenden, nötr bir ortam olan mukus tabakasına hızlı bir şekilde ulaşmasını sağlar. Bu ortam H.pylori nin çoğalması için mükemmel bir ortamdır. 36 2.6.2.2.Üreaz H.pylori total proteinlerinin yaklaşık olarak % 6 sından fazlasını oluşturan ve yapısında nikel bulunduran bir metalloenzim olan üreaz, bakterinin midenin asidik ortamında yaşaması için gereklidir. Üreaz enziminin eksprese edilebilmesi için kofaktör olarak nikele ihtiyaç duyulur. H.pylori 1338 proteini E.coli deki nikel düzenleyici nikr geni gibi çalışarak nikele bağlı üreaz enzim sekresyonunu düzenlemektedir. 37 Üreaz enzimi mide hücrelerinden salınan üreyi parçalar. Ürenin parçalanması esnasında açığa çıkan CO 2 ve amonyağın bakteriyi koruduğu gibi, aynı zamanda mide epitelinde hasar yaptığı gösterilmiştir. 37 Üreaz aktivitesi ile üreden oluşturulan amonyak ve karbondioksit invivo şartlarda bakterinin yaşaması için gereklidir. Bu nedenle de, H.pylori karbondioksit ve bikarbonattan zengin ortamlara çabuk adapte olmakta ve invitro çoğalabilmesi için de yüksek karbondioksitli ortam gerekmektedir. 37,38 2.6.2.3.Adherens H.pylori nin mide epiteline spesifik olarak yapışmasında Lewis antijenleri, özellikle Lewis b ile kan grubu antijenlerinden BabA2 nin etkili olduğu gösterilmiştir. 30,39 Özellikle BabA2 ile atrofik gastrit, artmış epitel proliferasyonu ve gastrik karsinomalar arasındaki ilişki birçok çalışmada gösterilmiştir. 35,39 Bu iki temel adezin dışında, N asetil nöraminil-laktoz yapıda fibriler hemaglutinin tanımlanmıştır. 39 Bu hemaglutinin gastrik mukoza hücreleri üzerinde özel gastrik gliserolipid reseptörlere sahiptir. H.pylori üzerindeki fibriler adezinlerin mukoza hücreleri üzerindeki karbonhidrat reseptörlerine sıkı tutunmalar yapması aktin polimerizasyonu yapması ile gerçekleşir ve bu da epitel hücrelerinin harabiyetini beraberinde getirir. Adherens yetersizliği konağın inflamatuar cevabını pek etkilemez, ancak epitel hücre hasarının az olmasını sağlar. 35,39 15

2.6.2.4.Katalaz ve Superoksid Dismutaz H.pylori nin kendini savunma amacı ile geliştirdiği uyum mekanizmalarından en önemlisi, süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz üretmesidir. Bu iki enzim, H.pylori nin, nötrofillerin fagositik vakuolünde yok edilmesini önlemektedir. SOD, süperoksiti hidrojen peroksite dönüştürür, katalaz da hidrojen peroksiti, oksijen ve suya parçalar. H.pylori nin oksidaz aktivitesi de vardır. Bu enzim, H.pylori için yaşamsal önem taşımaktadır. İnfekte bireylerin, lamina propriasında görülen kronik inflamasyonlu alanda, H.pylori ye karşı IgM, IgA, IgG, lenfosit ve plazma hücrelerinin bulunmasına rağmen, H.pylori korunma özellikleri ve yaşam koşulları nedeni ile konağın savunma sisteminden kaçmaktadır. Bu nedenle, kronikleşen inflamasyonun yanısıra, H.pylori de yaşamına devam etmektedir. 33,39 2.6.3.Doku Hasarı Oluşturan Faktörler H.pylori nin konak dokuda oluşturduğu hasar ve derecesi ile ilişkili olarak çok sayıda virulans faktörü suçlantır. Yapılan epidemiyolojik çalışmalarda, bu faktörlerden hiç birisinin tek başına bir klinik tablonun oluşumunu izah için yeterli olmadığı görülmüştür. 40 Bu virulans faktörleri içerisinde en önemlileri; CagA ve VacA toksinleri, dış inflamatuvar protein OipA ve epitelle temas ile indüklenen protein İceA dır. 34,40 2.6.3.1.cag patojenik ada (cagpi) genleri cag patojenite adası (cagpai), 40kb büyüklüğünde ve caga, cage, cagg, cagh, cagl, cagl, cagm, ve virb11 gibi 30'dan fazla genden oluşan bir ORF (open reading frame) bölgesidir. caga bu adanın en önemli proteini olan ve ada ile özdeşleşen CagA yı kodlar. Bu gen adası, diğer bakterilerde olduğu gibi virulansla ilgili ve özellikle de tiplv sekresyon sisteminde rol alan bir dizi proteinleri kodlar. 40 cagpai de bulunan virb11 geni, konak epitel hücrelerine bir ya da daha fazla etkili proteinin iletimini sağlayan bir tip IV sekresyon sistemini kodlar. 40 cagpai'de bulunan cage, konakta IL-8 gibi proinflamatuvar kemokinlerin sekresyonunu artırarak immunopatolojiyi tetikler. cagpai, epidemiyolojik olarak ülser hastalığı ve gastrik kanser ile ilişkilendirilen immunolojik proteinleri kodlar. Bu proteinler nötrofil ve monositleri infeksiyon bölgesine çeker ve subepitelyal bölge lenfosit ve plazma 16

hücreleri tarafından infiltre edilerek, inflamasyonun giderek şiddetlenmesine neden olurlar. cagpai taşıyan suşlar tip1 suşlar olarak tanımlanırlar ve bu suşlar ülser ve gastrik karsinomalar gibi ciddi klinik tablolarla ilişkilendirilirler. 40,41 cagpai taşımayan suşlar ise tip 2 suşlar olarak tanımlanıp, daha çok nonülser dispepsi gibi benign gastrointestinal rahatsızlığı olan hastalardan izole edilirler. H.pylori suşlarına bilinmeyen bir bakteriden aktarıldığı düşünülen bu gen adası suşlar arasında horizontal olarak aktarılmaktadır. 39,41 2.6.3.2.cagA Bu gen Tip 1 suşlarında CagA olarak tanımlanan, 120 ila 140kDa molekül ağırlığında, 1147-1181 amino asit uzunluğunda, güçlü immunojenik aktiviteye sahip olan sitotoksik bir dış membran proteinini kodlar. Etnik, bölgesel ve klinik farklılıklar göstermekle birlikte H.pylori suşlarının %50-90'ında CagA proteini üretilir. 42 IL-8, IL-6 ve tümör nekrozis faktör (TNF) gibi proinflamatuvar kemokinlerin sekresyonunu uyaran CagA proteini sitotoksik özelliğinin yanısıra epitele bağlanmada da rol oynar. CagA proteini Tip lv sekresyon sistemi yardımı ile hücredışı ortama salınır. 40,42 Gastrik hücrelere transloke olduktan sonra konak hücre kinazlarını uyarır. Yapısındaki fosforillenmiş tirozin rezidüleri mide epitelinde bakterinin bağlanma alanlarındaki proteinlerin fosforilasyonuna neden olarak sitokinlerin salınımını indükler. caga negatif mutant suşlarla yapılan çalışmalarda epitel yüzeyindeki adeziv proteinlerin fosforillenmesi gerçekleşmez. Yapılan gen mutasyon çalışmalarında cagpai'de yer alan caga dışındaki diğer bazı genlerin de bağımsız olarak IL-8 sekresyonunu indüklediği gösterilmiştir. 42 Batı toplumlarından izole edilen suşlarda CagA üreten Tip 1 suşları virulansla ilişkili olarak bulunmuşken, Asya suşlarının %90'ından fazlası Tip 1 suşları olarak belirlenmiştir. 43 Bu bulgular nedeni ile caga varlığı dışında caga allellerinin virulans yönünden daha önemli olabileceği düşünülmektedir. 43 Bu virulans faktörünün ekspresyonu, bir başka virulans faktörü olan VacA ekspresyonu ile yakından alakalıdır. cag PAI negatif suşlar nadiren vaca pozitiftir. 43 17

2.6.3.3.cagE Mide epitel hücrelerindeki IL-8 yapımında görev alan bir proteini kodlar 43. 2.6.3.4.virB11 cag PAI de bulunan bu gen, konak epitel hücrelerine bir ya da daha fazla etkili proteinin iletimini sağlayan bir tip IV sekresyon sistemini kodlar. 40,43 2.6.3.5.oipA Dış inflamatuvar protein A nın ekspresyonundan sorumlu gendir. Bu protein IL-8 gibi proinflamatuvar sitokinlerin salgılanmasını sağlamaktadır. 43 2.6.3.6.VacA Toksini: Epitel hücrelerinde vakuolizasyon ve hücre ölümüne neden olan toksindir. H.pylori suşlarının yaklaşık yarısında pozitif olan CagA dan farklı olarak, tüm H.pylori suşlarınca salgılanır. VacA ekspresyonu mozayik bir yapı göstererek, sinyal sırası (s1a, s1b, s1c ve s2) ve orta bölge (m1 ve m2) varyasyonlarıyla belirlenir. 43 Örnegin, s1 alele sahip suşlar fonksiyonel VacA toksini salgılarken, s2 alele sahip olanlar daha az sitotoksik aktivite gösterirler. Bir başka ifade ile s1/m1 suşları, s1m2 suşlarına göre daha toksiktir ve daha ağır gastrit formları ve intestinal metaplazi ile ilişkilidir. 43 caga, H.pylori kromozomunun farklı gen lokusunda yer almasına karşın, VacA sitotoksik aktivitesi ile güçlü ilişkilidir. Ancak caga daki mutasyonlar, VacA ekspresyonunu etkilemezler. Bu nedenle, VacA sekresyonu için caga ya ihtiyaç bulunmamaktadır. BabA, mide epitel hücrelerinde Lewis kan grubu antijeni ile reaksiyona giren bir H.pylori adezin molekülüdür. BabA sekresyonuna neden olan BabA1 ve BabA2 genleri on adet nükleotid eksiği veya fazlalığı dışında identik yapıda olmalarına rağmen, Lewis B antijeni ile sadece BabA2 birleşir. BabA2 geno-pozitif H.pylori suşları, virülansla ilgili olan diğer genleri (vaca ve caga)da taşır. Üç özellikli suşlar (caga +, vaca s1 ve BabA2 ) gastroduedenal ülser ve gastrik kanser riskini arttırmaktadır 43,44. caga, vaca s1m1 veya BabA2+ genlerindeki iki veya daha fazlasının birlikte bulunması durumunda, mide mukozasındaki değişmelerde artış olmaktadır ve bu hastalarda intestinal metaplazi oranı 18

%48 e ulaşmaktadır. Bu oran, caga, vaca s2/m2, BabA2- olanlarda ise %10 un altında bulunmuştur. 44,45 Almanya da yapılan bu çalışma, H.pylori kromozomunun değişik genomik lokuslarındaki değişik bakteriye ait faktörlerin, kolonize konaktaki zararlı etki için kompleks bir mekanizma ile ilişki içerisinde olduklarını göstermektedir. 44,45 Avrupa da yapılan çalışmalardan farklı olarak Japonya da yapılan bir çalışmada; BabA2+ ve caga genotipi ve BabA2 genotipi ile klinik tablo arasında herhangi bir ilişki bulunamamıştır. 46 Genotip-fenotip uyumunun Asya populasyonunda farklı olması, H.pylori virülansı ile klinik sonuç arasındaki ilişkinin çevre ve konak faktörleri ile düzenlendiğini düşündürmektedir. 46 2.6.3.7.Thioredoxin (CD 59) H.pylori suşları proteinlerin disülfit bağlarını keserek denatüre edebilen Thioredoxin enzimine sahiptir. Bu enzim sayesinde mukus tabakasındaki musinleri ve daha da önemlisi konak tarafından sekrete edilen nonspesifik ve spesifik immunoglobulinleri (IgA, IgG ve IgM) denatüre edip vücut savunmasından korunarak patogenezde rol oynarlar. 46 Epitel hücre yüzeyindeki reseptör yapılar ve interepitelyal aralıklardaki bağ doku reseptörlerine tutunan H.pylori, cag PAI tarafından kodlanan proteinler ve üreazında yardımı ile hücre yüzeyinde ve bağ dokusunda hasar oluşturmaya başlar. H.pylori nin indüklediği serbest oksijen ve nitrik oksit radikalleri epitel hücrelerde apoptozisi uyarır. Yapılan çalışmalar, özellikle de caga geni taşıyan suşlarla meydana gelmiş gastritlerde serbest oksijen radikallerinin arttığı bildirilmiştir. 46,47 Buna bağlı olarak epitel hücre zarında ve DNA sında hasar oluşmakta, oluşan hasarda gastrik kanser gelişimine yardım etmektedir. 40,47 Mide hücrelerinde VacA/CagA ya bağlı olarak tetiklenen apopitoz ve H.pylori nin hücre yüzeyinde bulunan 57 ve 42 kda luk iki yüzey proteini katkısı ile mukoza bütünlüğü bozulur. Bakteriler, bütünlüğün bozulduğu alanlardan fagositik hücrelerin de yardımı ile submukozaya kadar inebilirler. Mide mukozasında meydana gelen bu bozukluk, lamina propriadaki nötrofillerin epitel göçünü arttırarak nötrofillerin invaziv olmayan H.pylori ile direkt ilişkisini ve Lewis antijenleri ile daha güçlü temasını sağlayarak, T ve B hücrelerinin de 19

katıldığı spesifik patolojik immün cevabı başlatır. 30,49 Uyarılmış gastrik epitel hücrelerinden sekrete edilen IL-8, nötrofîl infiltrasyonunun yanısıra lipopolisakkarit antijenler ile birlikte gastrin sekrete eden G hücrelerinden sekresyonu artırıp D hücrelerinden gastrin inhibitörü olan somatostatinlerin sekresyonunu azaltarak hipergastrinemiye, dolayısı ile aşırı asit sekresyonuna neden olur. Bazen de tam tersi bir mekanizma ile asit sekresyonunda azalma, hatta durmaya yol açabilir. Asit sekresyonundaki artış, antral gastrit ve bağlı olarak duodenal ülserin habercisi iken asit üretimindeki azalma mide korpusundaki gastrite işarettir. Mide korpusuna yayılan bakteri, epitel hücrelerinde IL-1 sekresyonunu uyararak pariyetal hücrelerde atrofiye, dolayısıyla asit salgılanmasıda inhibisyona neden olur. Sonuçta ph yükselir ve gastrik hücrelerde atrofi, gastrik ülser ve neoplastik transformasyonlar başlar. 39,48 2.6.3.8.Lipopolisakkaritler Lipopolisakkarit özellikle lipid-a komponenti sitokin sekresyonunu uyarır ve endotoksik etkilerin ortaya çıkmasını sağlar. Lipopolisakkaritin diğer aktivasyonları mide hücre tabakaları ile etkileşmeyi de içerir ve bu etkileşim mukozal bariyerin bozulmasına neden olabilir. Musin sentezini inhibe eder ve pepsinojen sekresyonunu uyarır. H.pylori lipopolisakkaritinin O zinciri yapı olarak Lewis kan grubu antijenlerini taklit etmektedir. Bu moleküler benzerlik, bakterinin kamuflajını ve böylelikle mide ortamında yaşamasını sağlamaktadır. 30,48 2.6.3.9.H.pylori ye Konağın İmmün Cevabı H.pylori, hem direkt bakteri ürünleri aracılığı ile hem de mide epitel hücreleriyle etkileşime girerek konakta spesifik ve nonspesifik birtakım cevaplar oluşturur. İnvaziv olmayan bu bakteri, lüminal yüzey infeksiyonu oluşturmasına rağmen, mukozada yoğun inflamasyona neden olmaktadır. Bakteriye karşı nonspesifik savunma mekanizmaları; mukus, sindirim enzimleri, lizozim, laktoferrin ve oral kavite ile midedeki diğer antimikrobik komponentlerdir. Mukus bariyeri ise bakterinin mide mukozasına ulaşmasını engelleyen son bariyerdir. Mukus glikoproteinleri bakterinin penetrasyonunu engelleyecek bir ağ yapısı oluştururlar. Ancak, H.pylori nin spiral yapısı ve flagellası bakteriye glikoprotein jel yapısından geçip mide mukozasına ulaşma olanağı sağlar. Bu bakteri bir kez mukus tabakısını 20