ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TAVUK ETİNDEN TERMOFİLİK CAMPYLOBACTER TÜRLERİNİN İZOLASYONU VE TANIMLANMASI GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TAVUK ETİNDEN TERMOFİLİK CAMPYLOBACTER TÜRLERİNİN İZOLASYONU ve TANIMLANMASI SEVGİ ERGELDİ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 16/04/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir.... Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR Prof.Dr. Fatih KÖKSAL Prof.Dr. Aydın ÖZTAN Danışman Üye Üye.. Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Üye.. Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009YL26 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ TAVUK ETİNDEN TERMOFİLİK CAMPYLOBACTER TÜRLERİNİN İZOLASYONU ve TANIMLANMASI ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Yrd. Doç. Dr. IŞIL VAR Yıl: 2010, Sayfa: 85 Jüri : Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR Prof.Dr. Fatih KÖKSAL Prof.Dr.Aydın ÖZTAN Prof.Dr.Mehmet GÜVEN Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Termofilik Campylobacter türleri kümes hayvanları bağırsak sıcaklıklarının 42 C olması ve kendileri için ideal bir üreme ortamı oluşturması nedeniyle özellikle tavuk işletmelerinde ciddi sıkıntılar yaratmaktadır. Bu çalışmada Adana ilinde paketlenmiş şekilde satışa sunulan 6 farklı firmanın kendi satış noktalarından ve/veya süpermarketlerden, 1 firmanın ise işletmesinden temin edilen 7 farklı firmaya ait toplam 35 adet tüm tavuk karkası kullanılmıştır. Bu örnekler. toplam aerobik mezofilik bakteri, koliform-escherichia coli ve Campylobacter türleri bakımından incelenmiştir. Toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı 65x10 2-32x10 3 kob/g değerleri arasında bulunmuştur. E. coli ve toplam koliform sayımı sonuçlarına göre 35 adet örneğinin 33 ünde koliform grubu bakterilere rastlanılmış olup, E. coli ise 35 adet örneğin 14 ünde bulunmuştur. İncelenen örneklerde tespit edilen koliform grubu bakteri EMS yöntemine göre 25 45 EMS/g aralığında olup VRB agarda koloni sayımı sonucu ise 20x10 1-55x10 1 kob/g aralığında bulunmuştur. EMS sayım yöntemine göre E. coli ise <3-45 EMS/g aralığında bulunmuştur. KlasikToplam 35 adet piliç örneğinin 21 adedinden termofilik Campylobacter türleri izole edilmiştir. Klasik yöntemle izole edilen 21 izolatın yalnızca 3 adedi Campylobacter spp. olarak moleküler tanımlamada doğrulanamamıştır. Moleküler olarak tanımlanan 18 izolatın 9 adedi Campylobacter jejuni, 7 adedi Campylobacter coli, 1 adedi Campylobacter upsaliensis ve 1 adedi Campyloabcter lari olarak tanımlanmıştır. Termofilik Campylobacter türlerinin izolasyonunda ön zenginleştirmenin önemli olduğu görülmüştür. Ayrıca, izolasyon için Campylobacter Blood-Free Agar (mccda) ve Campylobacter selective Agar (CSA) katı besiyerlerinin birlikte kullanımının tek başlarına kullanımına göre daha iyi sonuç verdiği bulunmuştur. Campylobacter türlerinin izolasyonu ve tanımlanmasında klasik yöntem ile moleküler yöntemin birlikte çalışılmasının etkisi daha başarılı bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Tavuk eti, Campylobacter, İzolasyon, PCR I

ABSTRACT MSc. THESIS ISOLATION AND DETERMINATION OF THERMOPHILIC CAMPYLOBACTER SPP. FROM BROILER CHICKEN DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Asist.Prof. Işıl VAR Year: 2010, Pages: 85 Jury : Asist.Prof. Işıl VAR Prof.Dr. Fatih KÖKSAL Prof.Dr. Aydın ÖZTAN Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Assoc.Prof. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Thermotolerant Campylobacter spp. cause of the problems especially in poultry industry because of the poultrys intestinal temperature is 42 0 C which means of the ideal medium of their growth. In this study, a total of 35 broiler chicken samples belong to different 7 brands were obtained in their original package from retail markets and 1 plant in Adana,. These samples were examined for total aerobic mesophilic bacteria, coliform group bacteria -Escherichia coli and Campylobacter spp. Total aerobic mesophilic bacteria was found to range from 65x10 2 to 32x10 3 cfu/g. Coliforms were found between 20 x10 1-55x10 1 cfu/g by cultural method and 25-45MPN/g by MPN method. E. coli was detected between <3-45 MPN/g by MPN method. Thermophilic Campylobacter spp. were isolated from 21 of total 35 broiler chicken samples by conventional method. However, only 3 of the 21 isolates which was isolated by the conventional methods were not confirmed as Campylobacter spp. by molecular identification. For molecular identification 9 of these 18 isolates were determined as Campylobacter jejuni, 7 of them were Campylobacter coli, 1 of them were Campylobacter upsaliensis and 1 of them were Campylobacter lari. It was showed that the pre-enrichment stage was important to isolation of thermophilic Campylobacter spp. In addition, the results of this study was suggested that using Campylobacter Blood-Free Agar (mccda) and Campylobacter Selective Agar (CSA) medias together for isolation was better than using alone. Moreover, it was found that to study with both molecular and conventional methods together for isolation and identification of Campylobacter spp. was more successful. KeyWords: Broiler Chicken, Campylobacter, Isolation, PCR II

TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince hep yanımda olan, bana inanan, her konuda yakın ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, tezimin her aşamasında benimle birlikte çabalayan, motive eden ve imkansızları imkanlı hale getiren, yol göstericiliğiyle örnek aldığım sevgili büyüğüm ve değerli danışmanım Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında her türlü ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, tezimin çok daha iyi uygulanabilmesi için kendi laboratuar imkanlarından faydalanmama olanak sağlayan, gerek uygulama gerekse yazım aşamasında bilgi ve tecrübelerini hiç tereddüt etmeden paylaşan sevgili büyüğüm ve değerli hocam Prof.Dr. Fatih KÖKSAL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tezim süresince aynı laboratuarı paylaştığım ve bununla gurur duyduğum, tezimin uygulama aşamasında tecrübeleri ve emeği ile bana büyük destek olan sevgili arkadaşım Uzm. Diş Hekimi Arzu ŞAHAN KİPALEV e teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans eğitimim süresinde her konuda desteklerini gördüğüm Yrd.Doç.Dr. Bülent KABAK a ve Yrd.Doç.Dr. Bülent ZORLUGENÇ e teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans eğitimim süresince her konuda desteklerini gördüğüm sevgili arkadaşlarım Biyolog Nur Fidan KOÇ a, Biyolog Fatih DEĞİRMENCİ ye, doktora öğrencisi Gıda Müh. Sinan UZUNLU ya ve Veteriner Hekim Ayben SOYAL a ve Gıda Müh. Ali TEKİN e teşekkürlerimi sunarım. Beni iyi yetiştirebilmek için çabalayan, yaşamım süresince her zaman yanımda olan, tecrübeleriyle büyüdüğüm ve güçlü kişilikleriyle örnek aldığım, maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili annem Ayşe ERGELDİ ye ve sevgili babam Sabahattin ERGELDİ ye sonsuz teşekkürlerimi borç bilirim. Yüksek lisans eğitimim süresince ve öncesinde her konuda desteğini esirgemeyen sevgili eşim Meriç Samet ERDOĞAN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ......I ABSTRACT......II TEŞEKKÜR......III İÇİNDEKİLER.....IV ÇİZELGELER DİZİNİ...VII ŞEKİLLER DİZİNİ......VIII RESİMLER DİZİNİ.......... IX SİMGELER ve KISALTMALAR....X 1.GİRİŞ......1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR......15 2.1.Tavuk Etinin Mikroflorası...........15 2.2.Tavuk İşletmelerinde Campylobacter spp. Sorunu......16 2.3.Tavuk Etinde ve Gıdalarda Campylobacter spp. Sorunu.....17 2.4.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu ve Tanımlanması...19 2.4.1.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu....19 2.4.2.Termofilik Campylobacter Türlerinin Tanımlanmas.... 23 3.MATERYAL ve YÖNTEM.......27 3.1.Materyal......27 3.1.1.Tavuk Eti......27 3.1.2.Termofilik Campylobacter Suşlar........ 27 3.2. Yöntem....27 3.2.1. Örneklerin Analize Hazırlanması....27 3.2.2. Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri Sayımı.... 28 3.2.3. Koliform Grup Bakteri ve Escherichia coli Sayımı...28 3.2.4. Termofilik Campylobacter Türlerinin Klasik Yöntemle İzolasyonu...29 3.2.4.1.Seçici Ön Zenginleştirme... 30 3.2.4.2. Seçici Zenginleştirme......31 3.2.4.3. Saflaştırma.....32 IV

3.2.4.4. Üreme Gerçekleşmeyen Örneklerin 5. Gün İnokülasyonları...33 3.2.5. Tavuk Dokularından Direkt Moleküler Yöntemle Termofilik Campylobacter spp. İzolasyonu.. 33 3.2.5.1. QiaGen Doku Ekstraksiyon Kiti (QiaGen) ile Tavuk Etinden Direkt Termofilik Campylobacter spp. İzolasyonu. 34 3.2.5.2. E.Z.N.A. Doku Ekztraksiyon Kiti ile Tavuk Etinden Direkt Termofilik Campylobacter spp. İzolasyonu........35 3.2.6. Klasik Kültürel Yöntem İle İzole Edilen Koloni Örneklerinden DNA Ekstraksiyonu.......38 3.2.6.1. Dondur Çöz Yöntemi ile Kolonilerden DNA İzolasyonu..38 3.2.6.1.(1)1xPCR Buffer.....39 3.2.6.1.(2)1xTE Buffer....39 3.2.6.2.. DNA İzolatlarının Moleküler Olarak Tanımlanması.. 40 3.2.6.3. Agaroz Jel Elektroforezi Uygulaması..... 42 3.2.6.4. RFLP Uygulamaları........43 3.2.6.4.(1) Alu I Restriksiyon Endonükleazı ile Amplikonların Kesimi...44 3.2.6.4.(2) Tsp 5091 Restriksiyon Endonükleazı İle Amplikonların Kesimi 45 3.2.7. Şüpheli Kolonilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Olarak Tanımlanması...46 3.2.7.1. Morfolojik Tanımlama.....46 3.2.7.1.(1)Bakteri Koloni Morfolojisinin İncelenmesi......46 3.2.7.1.(2)Bakteri Hücre Morfolojisinin İncelenmesi...46 3.2.7.1.(3)Hareketlilik Testi.. 47 3.2.7.2. Biyokimyasal Tanımlama.....48 3.2.7.2.(1)Oksidaz Testi 48 3.2.7.2.(2)Katalaz Testi.49 3.2.7.2.(3)H 2 S Oluşumu ve Karbonhidrat Fermentasyon Testi.49 3.2.7.2.(4)Hippürat Hidrolizi Testi 49 4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA.....53 4.1. Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri (TMAB) Sayımı......53 V

4.2. E. coli ve Toplam Koliform Sayımı..... 55 4.3.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu ve Tanımlanması.....57 4.3.1.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu...57 4.3.1.1. Termofilik Campylobacter Türlerinin Klasik Yöntemle İzolasyonu......57 4.3.1.2. Termofilik Campylobacter Türlerinin Moleküler Yöntemle İzolasyonu.61 4.3.2. Termofilik Campylobacter Türlerinin Tanımlanması.. 61 4.3.2.1. Termofilik Campylobacter Türlerinin Biyokimyasal Tanımlaması...61 4.3.2.2. Termofilik Campylobacter Türlerinin Moleküler Tanımlaması.......64 5.SONUÇ VE ÖNERİLER.........69 KAYNAKLAR......75 ÖZGEÇMİŞ......85 VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Tip Bazında Moleküler Tanımlamada Kullanılan Kriterler...12 Çizelge 2.1. Bazı Campylobacter Türlerinin Tanımlanmasında Kullanılan Bazı Testler...25 Çizelge 2.2. Termofilik Campylobacter Türlerinin Biyotiplendirilmesi.... 26 Çizelge 3.1. Tavuk Eti Örneklerinin Alındığı Firmalar ve Örnek Sayıları.....27 Çizelge 4.1. Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri Sayım Sonuçları....53 Çizelge 4.2. Tavuk Eti Örneklerinin Toplam Koliform ve E. coli Sayım Sonuçları...56 Çizelge 4.3. Örneklerin Şüpheli Termofilik Campylobacter spp. İzolasyon Sonuçları...59 Çizelge 4.4. Şüpheli Termofilik Campylobacter İzolatlarına Uygulanmış Biyokimyasal Tanımlama Testleri ve Sonuçları......62 Çizelge 4.5. Firmalara Göre İncelenen Örnek Miktarı, Pozitif Örnek Miktarı ve Toplamdaki Yüzdeleri. 63 Çizelge 4.6. Şüpheli Termofilik Campylobacter Türlerinin Moleküler Yöntemle Tanımlanması...64 VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Campylobacter genusu ve filogenetik olarak yakın olan genuslar; Arcobacter (A), Sulfurospirillum (S), jenerik olarak yanlış sınıflandırılan türlerden Bacteroides (Ba) ureolyticus ile bazı Helicobacter, (H), Burkholderia (Bu), Wolinella (W) ve Vibrio (V) türlerinin 16S rdna gen analizine göre filogenetik ilişkisi.. 5 Şekil 4.1. 1,2,3,4,7,8,9,10,11,16,17,20,22,25 ve 34 Nolu Koloni örneklerinden ekstrakte edilmiş DNA örneklerine uygulanan PCR sonucu elektorforezdeki DNA bant görüntüleri Şekil 4.2. AluI restriksiyon enzimi ile kesilmiş amplikonların elektroforez jel görüntüsü....65 Şekil 4.2. 1,2,9,10,16,17,18,22 ve 34 Nolu Amplikonların AluI restriksiyon enzimi ile kesilmiş elektroforez jel görüntüsü...66 Şekil1 4.3. 1,2,7,9,10,11,16,17,18,20,22 ve 34 Nolu Alu I restriksiyon enzimiyle kesilmiş amplikonların Tsp 5091 restriksiyon enzimi ile kesilmiş elektroforez jel görüntüsü..66 VIII

RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 3.1. mccda Besiyerinde Üremiş Şüpheli Termofilik Campylobacter spp. Koloni Görüntüsü......33 Resim 3.2. Hücre Parçalanmasının Sağlanması İçin Isı Bloğunda İnkübasyona Bırakılan Doku Örnekleri....35 Resim 3.3. Doku Ekstraksiyonunda Kullanılan Toplama Tüpü İçerisine Yerleştirilmiş HiBind Spin Kolonu.....37 Resim 3.4. Ependorf Tüpleri İçerisinde 55 o C de Doku Paraçalanmasını Sağlamak İçin Bir Gece Su Banyosunda İnkübasyona Bırakılan Doku Örnekleri...37 Resim 3.5. Şüpheli Kolonilerin Hippürat Hidorolizasyon Testi Sonucu....51 IX

SİMGELER ve KISALTMALAR CDC : Centers for Disease Control (Hastalık Kontrol Merkezi) cfu : Colony Forming Units (Koloni Oluşturma Birimi) WHO : World Health Organization (Dünya Sağlık Örgütü) GBS : Guillain-Barre Sendromu mccda : Modified Charcoal Cefoperazon Deoxycholate Agar NAA : Nükleik Asit Amplifikasyon PCR : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PFGE : Pulsed-field Gel Elektroforez (Vurgulu Jel Elektroforez Alanı) RE : Restriction Endonuclease (Restriksiyon endonükleazı). RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RSHM : Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi SSA : Skirrow Selektif Agar. TSI : Triple Sugar Iron Agar X

1.GİRİŞ 1. GİRİŞ Tüm dünyada yaygın olarak görülen bir zoonoz olan campylobacteriosis başta kanatlılar olmak üzere, kedi ve köpek gibi evcil hayvanlar da dahil pek çok hayvanın gastrointestinal ve genital sistemlerinde hastalık etkeni olmadan da bulunabilen ve bu hayvanların çıkartıları ile kontamine olmuş et, süt ve içme sularının tüketilmesi ile veya kontamine ürünlerle direkt temas sonucu insanlara bulaşabilen bir enfeksiyondur (Skirrow, 1994; Vliet van ve Ketley, 2001; Stanley ve Jones, 2003). İnsanlarda asemptomik enfeksiyonlara da yol açabilen Campylobacter ler enfekte kişilerlerden fekal kaynaklı olarak insandan insana da bulaşabilir. Kontamine olmuş gıdalarda kontaminasyonu tanımlayacak koku ve renk değişikliği gibi makroskobik bulgular olmadığı için gıda yoluyla enfeksiyon daha kolay yayılmaktadır. Genellikle 8 yaş altı çocuklarda, hasta ve yaşlılarda daha sık görülen campylobacteriosis hastanın yaşına ve suşun virulansına göre değişmek üzere özellikle, 2-5 yaş arası çocuklarda ve yaşlılarda periferal sinirlerde miyelin kaybına bağlı olarak ortaya çıkan ve güç kaybı ile seyreden Guillain-Barre sendromu ile reaktif artrit gibi hastalıkların ortaya çıkışına yol açmaktadır (Blaser ve ark., 1986). İnsanlarda campylobacteriosise yol açan Campylobacter cinsine ait türlerin tespitine yönelik son 20 yılda yapılan araştırmalar, 42 o C de üreyebilen termofilik türlerinin gastro-intestinal bulguların ortaya çıkışına yol açtığını ortaya koymuştur (Yılmaz ve Tuğrul, 2005). Bu nedenle insanlara patojen kabul edilen Campylobacter türlerine Termofilik türler denilmektedir (Darka ve Yılmaz, 2004). Bu termofilik türler Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari ve Campylobacter upsaliensis olarak bildirilmiştir (Anonim, 2008a). Özellikle C. jejuni ile C. coli nin dünyada insanlarda akut diareye neden olduğu yapılan çalışmalar sonucu ortaya konmuştur (Yılmaz ve Tuğrul, 2005). Campylobacter türlerinin özellikle insanlarda ciddi enfeksiyonlarda kullanılan kinolonlar, beta-laktam gurubu antibiyotikler ve makrolidler gibi birçok antibiyotiğe karşı çoklu ilaç direnci gösteren suşlarının giderek artması nedeniyle de 1

1.GİRİŞ campylobacteriosis önemli bir enfeksiyon olarak görülmektedir (Aarestrub ve Engberg, 2001). Campylobacteriosisin dünyada görülme sıklığının 90 lı yıllardan itibaren giderek arttığı ve bu sıklığın % 1-35 oranında olduğu yapılan çok sayıdaki çalışma ile gösterilmiştir. Özellikle gelişmiş ülkelerde Campylobacter enfeksiyonlarına Salmonella ve Shigella enfeksiyonlarından daha sık rastlanmaktadır. Yapılan çalışmalarda gelişmiş ülkelerde Campylobacter türlerinin neden olduğu gastroenteritlerin % 90 ından C. jejuni, %5-10 undan da C. coli nin sorumlu bulunduğu bildirilmektedir (Yılmaz ve Tuğrul, 2005). Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) 2001 yılı verilerinde 4740 campylobacteriosis vakasına rastlandığı, her yıl iki buçuk milyon kişide campylobacteriosise bağlı ishal geliştiği, bunların 2.4 milyonunun C. jejuni enfeksiyonları nedeniyle oluştuğu, enfeksiyonun bulaşı yolunun % 80 oranında gıda kaynaklı olduğu ve on bin kişinin campylobacteriosise bağlı hastaneye yattığı ayrıca bu sebeple hayatını kaybeden hasta sayısının 100 ün üzerinde olduğu bildirilmiştir (Mead ve ark., 1999; CDC, 2001). İngiltere-Galler de her yıl yaklaşık 2.4 milyon kişide gıda kaynaklı zoonozun görüldüğü ve Campylobacter lerin en sık karşılaşılan patojenler olduğu bildirilmiştir (Miller ve Dunn, 2005). Ülkemizde 1986-2002 yılları arasında ishalli hastalarla yapılan dışkı kültür çalışmalarına göre Campylobacter türlerinin izolasyon sıklığının % 1-13 arasında değişmekte olduğu bildirilmiştir (Öngen, 2007). Bölgemizde ise Campylobacter türlerinin insan dışkı örneklerinden izolasyon oranının % 2.94 7.8 olarak tespit edilmiştir (Köksal, 1984; Kılıç, 1992). Gelişmiş ülkelerde campylobacteriosis görülme sıklığının mevsimsel farklılıklar gösterdiği de belirlenmiştir. Bu ülkelerde özellikle yaz ve sonbahar aylarında vakaların daha sık görüldüğü bildirilmiştir. Gelişmekte olan ülkelerde ise bu ülkelerin pek çoğunun tropikal bölgelerde bulunuyor olması nedeniyle campylobacteriosis görülme sıklığının mevsimsel olarak belirgin bir farklılık göstermediği belirtilmiştir (Blaser, 1997). 2

1.GİRİŞ Bağırsak sıcaklıkları 42 C olduğu ve bu etkene ideal bir üreme ortamı oluşturduğu için kümes hayvanları özellikle termofilik Campylobacter türleri için en uygun rezervuardır. Termofilik türler içerisinde ise bağırsak mukozasında özellikle C. jejuni kolonizasyonuna rastlanmaktadır (Beery ve ark., 1988). Kümes hayvanlarında 3. haftadan itibaren kolonizasyonun hızla arttığı ve kesime gelen broiler cinsi tavuklarda bu oranın % 95 e ulaştığı, bu dönemdeki tavukların dışkılarındaki C. jejuni yoğunluğunun ise 10 9 cfu/g a kadar yükseldiği bildirilmektedir. Doğal beslenen ev tipi ve özel çiftliklerde yetiştirilen kümes hayvanlarında kolonizasyonun başlama yaşı ve sıklığı arasında fark gösterilememiş ve kolonizasyonun süresinin konağa ve suşa göre değişiklik gösterdiği bildirilmiştir (Pearson ve ark., 1996; Newell ve Fearnley, 2003). Sağlıklı hayvanların etlerinin iç kısımları steril kabul edilmektedir. Fakat etler; kesim, yüzme, parçalama ve depolama sırasında kontaminasyona maruz kalmaktadır (Acar, 1996). Tavuk eti de kesimhanelerde gerek proses gerekse muhafaza sırasında; alet, ekipman, hava, yıkama suyu, ambalaj malzemesi, uygun olmayan şartlarda taşıma, depolama ve personel kaynaklı çapraz ve direkt kontaminasyonlara uğramaktadır (Prachasitthisa ve ark., 1996; Elmalı ve Yaman, 2004; Efe ve Gümüşsoy, 2005; Ös ve Karaboz, 2005; Keskin, 2007; Tang ve ark., 2009; http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702050601.pdf, 20 Ekim 2008). Türkiye de tavuk eti üretiminde özellikle son yıllarda büyük ilerleme sağlanmasına karşın, üretimde istenilen hijyenik kaliteye ulaşılamamıştır. İyi bir besin kaynağı olan tavuk eti ile yapılan çalışmalar, tavuk etlerinin başta Salmonella, Campylobacter, enterotoksijenik stafilokoklar ve Listeria monocytogenes olmak üzere çeşitli patojen bakterilerle kontamine olduğunu ortaya koymaktadır (Şireli ve ark., 2002). Dünya da tavuk eti tüketimiyle bulaşan patojenler arasında insanlarda akut ishale yol açan Campylobacter türleri diğer diyare etkeni patojenlerden daha yüksek sıklıkla izole edilmektedir (Akan ve ark., 2002). Termofilik Campylobacter türlerinin minimal enfeksiyon dozu, konağın hassasiyetine, çevresel stresin bakteri hücresinde oluşturduğu zarara ve türe bağlı olarak değişmektedir. Gıda enfeksiyonuna neden olan bakterilerin çoğunun aksine campylobacteriosis ortamda oldukça düşük populasyonda bakteri bulunsa dahi 3

1.GİRİŞ gerçekleşebilmektedir (Anonymous, 2008a). Tavuk etinde termofilik Campylobacter türleriyle kontaminasyon düzeyi 10 2-10 5 olarak bildirilmektedir. Termofilik Campylobacter türlerinin insanda enfeksiyon etmeni olabilmesi için 500 canlı bakteri hücresi bile yeterli gelmektedir. Bu nedenle tavuk eti temel enfeksiyon kaynağı olarak gösterilmektedir (Darka ve Yılmaz, 2004). Tavuk etinin yanı sıra çiğ sütün ve klorlanmamış suların da kontaminasyon kaynağı olabileceği bildirilmiştir (Anonymous, 2008a). Termofilik Campylobacter türleri içinde özellikle hayvanlarda enfeksiyon oluşturan C. jejuni ve C. coli ve bunların yanı sıra C. lari tavuk etinden sıklıkla izole edilmektedir (Doğan ve Tükel, 2000; Gürtürk ve ark., 2000). 1886 yılında Theodor Escherich tarafından ishal olan çocukların dışkı örneklerinden Campylobacter benzeri organizmaların gözlenmesinden bu yana Campylobacter enfeksiyonlarının toplum sağlığı bakımından bir risk oluşturduğunun farkındalığı bir yüzyılı aşan bir süreçte değişime uğramıştır. 1913 yılında McFaydean ve Stockman düşük yapmış koyunların üreme dokularından ve 1957 yılında King, ishalli çocukların kan örneklerinden elde ettikleri Campylobacter izolatlarını Vibrio ile ilişkilendirerek tanımlamışlardır. 1972 yılında ilk olarak Belçika da bir klinik mikrobiyoloğu ishalli hastaların dışkı örneklerinden Campylobacter leri izole ettiğini bildirmiştir (Altekruse ve ark.,1999). Campylobacter cinsi bakteriler Campylobacteraceae ailesine aittir. Campylobacter ler bu familyada Arcobacter cinsleri, Sulfurospirillum cinsleri ve kendi cinsine ait özellikleri taşıma açısından yanlış sınıflandırılmış Bacteroides ureolyticus türü ile birlikte bulunmaktadır. Bacteroides ureolyticus türü Campylobacter cinslerine ait olarak gösterilmiştir ancak henüz ismi değiştirilmemiştir(vandamme,2000;http://www.bacterio.cict.fr/classifgenerafamilies. html#camplobacteraceae, 14.04.2008). Mevcut bilgiler doğrultusunda Campylobacter cinsine ait bilinen 17 tür olduğu ve bu türlerden dördünün 8 alt türe bölündüğü bildirilmiştir (http://www.bacterio.cict.fr/classifgenerafamilies.html #Camplobacteraceae, 14.04.2008). Taksonomi (Hansson, 2007) : Alem : Bacteria 4

1.GİRİŞ Bölüm : Proteobacteria Sınıf : Epsilonproteobacteria Takım : Campylobacterales Aile : Campylobacteraceae Cins : Campylobacter Şekil 1.1. Campylobacter genusu ve filogenetik olarak yakın olan genuslar; Arcobacter (A), Sulfurospirillum (S), gene ait olarak yanlış sınıflandırılan türlerden Bacteroides (Ba) ureolyticus ile bazı Helicobacter, (H), Burkholderia (Bu), Wolinella (W) ve Vibrio (V) türlerinin 16S rdna gen analizine göre filogenetik ilişkisi (Hansson, 2007). Campylobacter cinsine ait bakteriler her ne kadar çevresel strese hassasiyet göstermekte olsalar bile pek çok bakteri gibi kendilerini bu stres faktörlerinin öldürücü ya da gelişmeyi engelleyici etkilerinden korumayı başaracak farklı formlara dönüşebilmektedirler. Bu formların başında sıklıkla yüksek oksijen ya da ışık ortamında rastlanılan kültüre edilemeyen canlı formları olan VBNC (Viable But Non Culturable) formu gelmektedir. Bu forma dönüşen Campylobacter ler genellikle hücresel morfolojilerini de değiştirmektedirler. Hücresel yapılarını kokoid olarak tanımlanmış Dormant şekle dönüştürerek kendilerini korumayı 5

1.GİRİŞ başarabilmektedirler (Ayaz ve Erol, 2004). Ayrıca Campylobacter ler çeşitli nedenlere bağlı olarak planktonik hücresel yapıdan çıkıp mikrobiyal olarak değişime uğramış, birbirlerine ya da bir yüzeye tutunarak bir araya gelmiş ve matriks ya da polimerik madde (EPS) içine gömülmüş halde farklı biyolojik yapılar da oluşturabilmektedirler (Joshua ve ark., 2006). Bu biyolojik yapılar ise 17. Yüzyıldan bu yana yapılan çeşitli araştırmalar sonunda ilk olarak 1978 yılında tanımlanabilmiştir. Bugün de kabul gören Biyofilm adıyla tanımlanmaktadırlar. Biyofilmleri oluşturan ekstraselüler polimerler biyofilm çevresindeki besin ve iyon değişimini kontrol etmektedir. Bu değişiklikler bakteriye antibiyotik dirençliliği, biyosid ve immün sistemden korunma yeteneği kazandırmaktadır (Öztürk ve ark., 2008). Pek çok mikroorganizma savunma, adezyon ve kolonizasyon oluşturma, yaşanabilir çevre geliştirme ve topluluk oluşturabilme amacıyla biyofilm yapmaktadır. Biyofilm yapan mikroorganizmaların büyük bir çoğunluğu insanda hastalık etkeni olan patojenlerden oluşmaktadır. Gıdanın yapısındaki su ve içeriğindeki besin maddeleri, optium ph değeri ve ideal sıcaklık gibi faktörler mikroorganizmalar için en uygun ortamı sağladığından, özellikle gıdalar ve gıda işletmeleri, birçok mikroorganizma için potansiyel biyofilm geliştirme merkezleridir. Özellikle taze ve işlenmiş, bitkisel, et, tavuk, balık, süt ve süt ürünleri gibi hayvansal orijinli gıda işleyen işletmelerde rastlanmaktadır. Kanatlı et işletmelerinde karkas kontaminasyonun daha çok haşlama ve soğutma tankından kaynaklandığı bildirilmektedir. Soğutma ve haşlama tankların ise biyofilm oluşumu için ideal ortamlar olup bu biyofilmlerden sıklıkla C. jejuni, Salmonella spp., S. aureus ve E. coli izole edilmektedir (Floyd ve ark., 2003). Laboratuar testleri Campylobacter lerin optimum koşullarda paslanmaz çelik ve cam yüzeylerde 2 gün içerisinde biyofilm yapabilme yeteneğinde olduklarını göstermiştir (Wirtanen ve Salo, 2005). Biyofilm içerisindeki canlı C. jejuni miktarı; bu bakterinin biyofilm oluştururken tekrar kültüre edilemeyen canlı formlara (VBNC) dönüşebildiğini ortaya koyan, kültür tekniğinden ziyade direkt canlı sayım tekniği kullanılarak daha iyi belirlenebilmektedir. Biyofilm oluşturarak C. jejuni nin 12-23 o C sıcaklık aralığında 7 günlük bir periyot boyunca hayatta kalabilme 6

1.GİRİŞ yeteneğini arttırabildiği bildirilmektedir. Campylobacter lerin bulunduğu yüzeyde gıda kalıntısı ya da rutubet olması yaşama şanslarını arttırmaktadır. Odunsu yüzeylerdeki girinti çıkıntılar C. jejuni hücrelerini O 2 nin öldürücü etkisinden koruduğu için odun ve benzeri yüzeylerde de oldukça iyi biyofilm oluşturarak hayatta kalabilmektedirler (Wirtanen ve Salo, 2005). Biyofilm içerisindeki Campylobacter türleri planktonik hallerine göre antimikrobiyal maddelere daha çok direnç gösterebilmektedir. Bu nedenle temas ettikleri yüzeyden uzaklaştırılmaları çok kolay olmamaktadır. Gıda güvenliği ve insan sağlığı bakımından Campylobacter lerin biyofilm oluşturmalarına olanak sağlamadan engellenmeleri ve ortamdan uzaklaştırılmaları gerekmektedir. Campylobacter ler 0.2 0,5 µm ende ve 0.5 5.0 µm boyunda, ince ve genellikle kıvrımlı olmakla beraber genç hücrelerde tirbuşon ve kıvrık, yaşlı hücrelerde sferik ya da kokoid şeklindeki bakterilerdir (Gürtürk ve ark., 2000; Anonim a, 2008). Birden çok bakterinin yan yana gelmesi sonucu oluşan uçan martı şeklinde de görülebilirler. Katı besiyerinde üretilen genç kolonilerden hazırlanan taze preparatlarda spiral veya flemantöz şekil daha belirgin iken, yaşlı kültürde veya yüksek oksijenli ortamda Dormant formlara dönüşebilirler (Blaser, 2000; Smibert, 2005). Kültür plağındaki Campylobacter lerin tümü kokoidal forma dönüşürse pasajlandıklarında tekrar üretilememektedir. Ancak VBNC formunda alınan C.jejuni nin intestinal fazdan sonra tekrar kültüre edilebilir hale geldiği, adezyon ve enteropatojenite özelliğini yeniden kazandığı hayvanlar üzerinde deneysel çalışmalarda gösterilmiştir (Cappelier ve ark, 1999). C. jejuni C. coli ye göre dormant forma daha hızlı dönüşmekte ve bu formda yüzey sularında uzun süre bulunabilmektedir. Gram negatif, sporsuz bu bakteriler polar veya bazı türlerde bipolar olabilen kılıfsız flajellaları ile oldukça hızlı hareket ederler. Faz-kontrast veya karanlık alan mikroskobunda genç hücrelerden yeni hazırlanan preparatlarda tirbüşon tarzında hızlı hareketleri çok tipik olarak gözlenmektedir (Blaser, 2000; Smibert, 2005). C. gracilis hariç Campylobacter lerin tamamı oksidaz pozitif, C. upsaliensis hariç tamamı katalaz pozitiftir. C. upsaliensis katalaz negatif ya da zayıf katalaz reaksiyonu göstermektedir. Campylobacter ler jelatini ve üreyi hidrolize edemezler. 7

1.GİRİŞ Lipaz aktiviteleri yoktur. Karbonhidratları kullanamadıkları için Voges proskauer ve metil red testleri negatiftir. Diğer enterik bakterilerin çoğunda olduğu gibi nitratları redükte ederler. Pigment üretmezler (Smibert, 2005). Campylobacter ler üreyebilmek için mikroaerofilik ortama (oksijen seviyesi düşük ortam) gereksinim duyarlar. Ayrıca Campylobacter ler kapnofilik yani CO 2 içeren ortamda iyi üreme yeteneğine sahip mikroorganizmalardır. Atmosferdeki CO 2 miktarı türler arasında üremenin optimizasyonu için önemlidir (Smibert, 2005). Optimum gelişme koşulları ortamdaki %3-5 oranında Oksijen, %2-10 oranında CO 2 varlığı ile ilişkili olup Campylobacter türlerinin gelişebilmeleri için gerekli olan mikroaerofilik ortam % 5 O 2, % 10 CO 2, % 85 N 2 gazı olarak bildirilmiştir (Gürtürk ve ark., 2000; Anonim, 2008). Campylobacter türleri içerisinde özellikle C. jejuni ile yapılan oksijen ihtiyacının ve toleransının belirlenmesi çalışması düşünülenin aksine aerop ortamlarda bile bakterinin canlılığını koruyabildiğini göstermektedir. Ortamda % 19 oranında O 2 bulunması durumunda dahi bakterinin canlı kalabildiğini ve hatta gelişim gösterebildiğini ortaya koymaktadır (Kaakoush ve ark., 2007). C. jejuni, DNA sentezinde görevli oksijene bağımlı ribonükleotid redüktaz enziminin aktivasyonu için % 5-15 O 2 gazı konsantrasyonuna ihtiyaç duyar, ortamdaki yüksek oksijen yoğunluğunda ya da strik anaerop şartlarda üreyemez. Buna karşılık bazı Campylobacter türleri; C. fetus, C. sputorum C. concisu ve C. mucosalis gibi, fumarat, aspartat veya nitrat gibi elektron akseptörlerinin varlığında anaerop ortamda da üreyebilirler (Smibert, 2005). Campylobacter cinsine ait 2 türün dışındaki türlerin katalaz ve oksidazları pozitiftir, üreme sıcaklıkları 30 o 42 o C arasında değişmektedir (Doğan ve Tükel, 2000). Genel olarak tüm Campylobacter türleri 37 o C de iyi üremektedir. C. jejuni, C. coli, C. lari ve C. upsaliensis 42 o - 43 o C sıcaklıklarda optimal gelişim gösterdiklerinden dolayı bu dört tür termofilik Campylobacter ler olarak anılmaktadırlar (Hansson, 2007). Bu dört türün 35ºC altında üremeleri oldukça yavaşlamaktadır. Örneğin C. jejuni logaritmik üreme fazını 34ºC de 12 saatte, 30-34ºC de ise 48 saatte tamamlamaktadır (Hazeleger ve ark., 1998). Kültür plaklarının 42 C de inkübasyonu termofilik türlerin diğer Campylobacter türlerinden ayırt edilmesini sağlar ve termofilik türlerin izolasyonunu 8

1.GİRİŞ kolaylaştıır (Corry ve ark., 1995). Termofilik olmayan türlerin de izolasyonu isteniyorsa, örnekler iki besiyerine ekilip biri 37 C de, diğeri 42 C de mikroaerofilik ortamda inkübe edilmelidir (Corry ve ark., 1995). Campylobacter lerin genomu diğer bakterilere oranla daha küçüktür. Bundan dolayı metabolik aktiviteleri daha yavaş ve seçicidir. Campylobacter güçlü oksidaz aktivitesi gösterirler. Ancak hegzoz şekerlerinin glikolizinde görev alan 6- fosfofruktokinaz enzimine sahip olmadıkları için karbonhidratları oksidatif veya fermentatif yolla metabolize edemezler. Üremeleri için gerekli olan enerjiyi trikarboksilik asit siklusundan elde ederler. Enerji üretimi için ihtiyaç duydukları karbon ve nitrojeni aminoasitlerden ve atmosferdeki CO 2 den karşılarlar. Karbon metabolizmalarının son ürünleri olarak asetat, format ve laktat oluştururlar (Kelly ve ark.,2001). Campylobacter türleri trikarboksilik asit siklusunu tam ya da kısmi olarak gerçekleştirmeleri bakımından farklılıklar gösterirler. Metabolik eksiklik sebebi ile in vitro şartlarda adi besiyerlerinde üretilmeleri son derece zordur. Üremenin optimizasyonunu sağlamak için besiyerine protein, yağ ve eser element kaynağı olarak % 7-10 oranında defibrine at, koyun veya insan kanı ilave edilmektedir. Besiyerlerine defibrine kan metabolik ihtiyaçların giderilmesinin yanı sıra besiyerinde biriken toksik oksijen radikallerinin parçalanması için de ilave edilmektedir. Toksik oksijen radikallerinin parçalanması ise defibrine kanda doğal olarak bulunan katalaz, peroksidaz ve süperoksit dismutaz enzimleri ile gerçekleşmektedir. Campylobacter için toksik olduğu bilinen süper oksit anyonları ve hidrojen peroksit gibi oksijen radikallerini nötralize etmek için de şarkoal, hemin, hematin, ferröz sülfat, sodyum metabisulfit ve sodium pürivat kombinasyonundan oluşan suplementler ve ayrıca B vitamin kompleksleri ilave edilmektedir. Ek olarak besiyerine kazein ilavesi C. lari nin üremesini arttırmaktadır (Hutchinson ve Bolton, 1984; Gun ve ark., 1987). Campylobacter ler 0.65 μm ve 0.45 μm lik membran filtrelerden geçebilirler. Aside dirençsizdirler, alkalen-metilen mavisi, kristal viyole ve karbol fuksinle iyi boyanırlar. DNA larının G+C oranı termofilik türlerde % 30-36 diğer türlerde % 29 46 dır (Vandamme, 1991; Blaser, 2000). 9

1.GİRİŞ Tavuk etinde sıklıkla karşılaşılan termofilik bir tür olan C. jejuni nin +4 o C de nemli ve düşük oksijenli ortamda 2-4 hafta, -20 o C 'da 2-5 ay, oda sıcaklığında ise ancak birkaç gün canlılığını koruyabildiği bildirilmektedir. Yapılan araştırmalar sonucu açık hava basıncı, kuruluk, düşük ph değerleri, yüksek sıcaklık, donma sıcaklığı ve uzun süre depolama koşulları gibi çevresel stres faktörlerinin artması durumunda bu bakteri hücrelerinin zarar gördüğü ve hücrelerdeki iyileşmenin engellendiği belirtilmektedir (Anonymous, 2008a). Metabolik faaliyetler yönünden diğer mikroorganizmalara göre düşük aktivite gösterdiği ve çevresel stres faktörlerine çok hassas olduğu için in-vitro şartlarda üreme güçlüğü göstermektedir (Russel ve ark., 1993). Termofilik Campylobacter türlerinin atmosferdeki % 21 oksijen oranı, kuruluk, ısıtma, antiseptik ve asidik koşullar gibi çevresel koşullara karşı diğer patojen bakterilere göre daha kırılgan ve hassas oldukları bildirilmektedir (Gürtürk ve ark., 2000; Anonymous, 2008a). Buna rağmen yapılan bazı araştırmalar Campylobacter türlerinin gelişme ortamlarındaki belirli bir oranda O 2 miktarına tolerans gösterebildiklerini ortaya koymaktadır (Kaakoush ve ark., 2007). Hastalığa neden olan suşların enterotoksin, sitotoksin ve adhezyonu olanaklı kılan adhesin oluşturarak yaptıkları hastalıklar saptanmıştır (Tunail, 2000). Örneğin C. jejuni nin neden olduğu enfeksiyonda enterotoksinlerin büyük rolü olduğu bildirilmektedir. Toksinlerin eksudatif (terletici) ve hemorajik (kanamalı) enteritise (bağırsak iltihabı), mukozal atrofiye (organ iç zarlarının erimesi hastalığı), mukozal ülserasyona (mukozalarda iltihaplı yara), bunun yanısıra pankreatite (pankreas iltihabı), obstrüktif hepatite (karaciğer iltihabı), peritonite (karınzarı iltihabı), artrite (eklem iltihabı) ve meninjite (beyin zarı iltihabı) neden olduğu bildirilmiştir (Elmalı, 2004). Gıda kaynaklı enfeksiyonlarda inkübasyon süresi kontamine gıda ya da suyun kana karışmasının ardından 2-5 gün kadardır. Hastalık süresi ise 7-10 gündür (Anonymous, 2008a). Campylobacteriosis vakalarının başlıca semptomlarının zaman zaman 40 o C yi bulan yüksek ateş, mide bulantısı, kusma, bazen kanla karışık ishal, şiddetli karın ağrısı olduğu bildirilmiştir (Hobbs ve Roberts, 1987; Frazier ve Westhoff, 10

1.GİRİŞ 1988). C. jejuni enfeksiyonları sonucu ölüm oranının % 0.1 olduğu belirtilmiştir (Doğan ve Tükel, 2000). C. jejuni izolasyon ve tanımlamasında yaşanan güçlüklerin giderilmesi için seçici kültür tekniklerinin yanı sıra, son yıllarda mikroorganizmanın genomundaki 16S rdna, 23S rdna, GroEl, GTPase, CadF, Asp, CeuE, HipO ve GlyA proteinlerini kodlayan spesifik gen bölgelerinin amplifiye edildiği Nükleik Asit Amplifikasyon (NAA) teknikleri ile spesifik gen bölgelerinin restriksiyon enzimleri ile kesilmesi sonucu elde edilen DNA fragmentlerinin sayı ve büyüklüklerini esas alan PCR-RFLP yöntemleri gibi moleküler yöntemler de denenmiştir (Wang ve Cliffort, 2002). Buna rağmen mikroorganizma son derece değişken bir genetik yapıya sahip olduğu için moleküler yöntemlerin standardizasyonu, istenen duyarlılık ve özgüllükte sonuçların elde edilmesi pek mümkün olamamıştır. Ancak insanlarda ishalle seyreden hastalıklara yol açan 4 major tip olan C. jejuni, C. coli, C. lari ve C. upsaliensis in tanımlanmasında 23S rdna bazlı PCR-RFLP yönteminin, C. jejuni ve C. coli yi diğer Campylobacter türlerinden ayırt edebilen tek tüp multiplex-pcr a göre ayrım gücünün, özgüllük ve duyarlılığının daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Engvall ve Fermer, 1999). Moleküler tanımlama bakterinin spesifik bilgileri göz önünde bulundurularak yapılmaktadır. Campylobacter türlerinin moleküler tanımlanmasındaaşağıdaki bilgilerden faydalanılmaktadır: Termofilik Campylobacter türlerinin 23S rdna geni Bu gende 43. ve 69. heliksler arasında yer alan 491bp uzunluğundaki spesifik bölge Alu I ve Tsp 5091 restriksiyon enzimleriyle kesim sonucu elde edilen DNA fragmentlerinin polimorfizmi Tip bazında moleküler tanımlamada kullanılan kriterler Çizelge 1.1 de her tür için ayrıntılı biçimde yer almaktadır. 11

1.GİRİŞ Çizelge 1.1. Tip Bazında Moleküler Tanımlamada Kullanılan Kriterler (Engvall ve Fermer, 1999) Tip Alu I Tsp 5091 C.jejuni 202bp /166 bp/ 124 bp 491 bp C.coli 290bp/ 202bp 491 bp C.upseliensis 290 bp/ 202bp 339 bp/126 bp C.upseliensis var.i 290 bp/115 bp/87 bp 339 bp/126 bp C.lari 290 bp/115 bp/ 51 bp 177 bp/162 bp/126 bp Tavuk gibi mikrobiyal florası zengin örneklerden Campylobacter türlerinin izolasyonunda üretme besiyerlerinin sadece metabolik yönden optimizasyonu yeterli olmaz. Çünkü metabolik faaliyetleri yüksek olan ve bu nedenle daha hızlı ve çok miktarda üreyebilecek olan diğer bağırsak bakterilerinin Campylobacter türlerinin gelişimini engelleyebilme riski mevcuttur. Bu riski minimize etmek için örnekdeki istenmeyen flora bakterilerinin üremesini baskılayacak antimikrobik madde karışımlarının besiyerine ilave edilmesi veya örneğin 0.45 μm ve 0.25 μm çaplı membran filtrelerden süzülmesi gerekmektedir. Bu amaçla Basitrasin, Sefalothin, Sefazolin, Kolistin, Novobiosin, Polymiksin, Rifampisin, Trimethoprim ve Vankomisin gibi Campylobacter lerin dirençli, diğer bağırsak bakterilerin ise duyarlı oldukları antimikrobik veya antimikrobik karışımları ilave edilmektedir (Corry ve ark., 1995). Örnekler uygun besiyerlerine ekildikten sonra besiyerleri 24 48 saat mikroaerofilik atmosferde inkübasyona bırakıldıklarında, süre sonunda mukoid, saydam, hemoliz yapmayan, birbirine karışma eğilimindeki Campylobacter kolonileri gözle görülür hale gelmektedir Ancak, besiyerlerinin özellikleri koloni morfolojisini etkilemektedir. Nem oranı düşük besiyerlerinde 1 2 mm çapında, düzgün, granüler tarzda, gri veya kahverengi renkte, parlak koloniler oluşurken, nem oranı yüksek besiyerlerinde, çapı 10 mm ye kadar ulaşabilen, basık, yaygın, düzensiz kenarlı ve gri renkte koloniler oluşmaktadır (Wang ve Blaser, 1986; Smibert, 2005). Campylobacter lerin tanımlanmasında % 1 glisin ve % 3.5 NaCl varlığında üreyebilme, TSI agarda H 2 S oluşturma, nitrat redüksiyonu, hippuratın hidrolizi ve ısı tölerans testleri gibi fenotipik özelliklerden yararlanılmaktadır (Hebert ve ark, 1982). 12

1.GİRİŞ C. coli ve C. jejuni birbirinden Na-hippurat ın hidrolizasyonu özelliği ile ayrılabilmektedir ancak bu da her zaman doğru sonuç vermemektedir (Ertaş ve ark., 2002). Bu nedenle biyokimyasal ve serolojik analizlerin tamamlayıcısı olarak moleküler analizlere gereksinim duyulmaktadır. Bu amaçla polimeraz zincir reaksiyonlarından (PCR) faydalanılarak geliştirilmiş çeşitli moleküler ayrım yöntemleri uygulanmaktadır (Ertaş ve ark., 2002). Bu uygulama; klonlanmış DNA parçaları, spesifik hibridizasyon probları ve 16S ya da 23S rrna genlerine spesifik PCR uygulamaları gibi birçok moleküler identifikasyon ve ayrım metodları ile yapılmaktadır. Bu çalışmada tavuk etinin, C. jejuni ve diğer termofilik Campylobacter türlerinin gıda güvenliği ve hijyeni açısından bölgemizdeki görülme sıklığının araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla et örneklerinden termofilik Campylobacter türlerinin izolasyonu ve tanımlanmasında, geleneksel kültür yöntemleri ile ileri teknolojik yöntemlerden biri olan moleküler izolasyon ve tanımlama yöntemleri birlikte kullanılmıştır ve 23S rdna bazlı PCR-RFLP yönteminin tanımlamadaki duyarlılığının tespiti yapılmıştır. 13

1.GİRİŞ 14

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1.Tavuk Etinin Mikroflorası Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği Et Ürünleri Tebliği ne göre kanatlı karkası; tekniğine uygun olarak kesilmiş, kanı akıtılmış, tüyleri yolunmuş, içi boşaltılıp baş ve ayakları kesilmiş, yıkama ve soğutma işlemi görmüş, suyu sızdırılmış bütün haldeki kasaplık kanatlı hayvan gövdesi olarak tanımlanmaktadır (Anonymous, 2000a). Bir çeşit kanatlı karkası olan tavuk eti; diğer etlere göre proteini yüksek, yağı az ve kalorisi düşük bir gıdadır. 100 gr tavuk etinde 18.15 g protein, 12.12 g yağ, 1.01 g demir bulunmaktadır. Değerli bir mineral madde olan selenyum bakımından zengin, iyi bir B grubu vitamini ve demir kaynağıdır. Yağ asidi içeriği ise diğer etlere oranla yüksektir. Oleik, linoleik, palmitik asit gibi doymuş ve doymamış yağ içeriği bakımından 100 g tavuk eti 3.3 g doymuş yağ asidi, 4.84 g tekli doymamış yağ asidi, 2.59 g çoklu doymamış yağ asidi ve 57 mg kolesterol içermektedir. Tavuk eti ph sı 6.5-6.7 arasındadır. Su aktivitesi (aw) ise 0.985 değerindedir (Anonymous, 2006). Tavuk eti zengin bileşimi nedeniyle pek çok mikroorganizma için çok uygun bir besiyeridir. Yapılan pek çok araştırma sonucunda tavuk etinin insanda gıda kaynaklı enfeksiyonlar ve intoksikasyonlar bakımından; Salmonella spp., Staphylococcus spp.; özellikle S. aureus, Enterobacter spp., Shigella spp., Corynebacterium spp., Bacillus spp., E. coli, Pseudomonas spp., koliform grubu bakteriler, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. ve sülfit indirgeyen anerob bakteriler (Clostridia) açısından sıklıkla kontamine olduğunu göstermektedir (Mullerat ve ark., 1994; Adams ve Moss, 1995; Prachasitthisa ve ark., 1996; Ünlütürk ve Turantaş, 1998; Mead, 1999; Conner ve ark., 2001; Elmalı ve Yaman, 2004; Efe ve Gümüşsoy, 2005; Ös ve Karaboz, 2005; Keskin, 2007; Tang ve ark., 2009; http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702050601.pdf, 20.10.2008). Efe ve Gümüşsoy (2005) Ankara Garnizonu nda tüketime sunulan tavuk etleri üzerine yaptıkları bir araştırmada; 50 adet örneğin but, deri ve göğüs 15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR kısımlarında toplam aerobik mezofilik genel canlı; psikrofilik bakteri; Pseudomonas spp.; S. aureus; koagulaz (+) S. aureus; Enterobakter; koliform grubu bakteri, E. coli ve Salmonella spp. yönünden kontaminasyon düzeylerini tespit etmişlerdir. Analiz ettikleri tavuk but, deri ve göğüs numunelerinde sırasıyla; toplam aerobik mezofilik genel canlı tüm numunelerin %100 ünde, psikrofilik bakteri; %100, %98 ve %100 ünde, Pseudomonas spp.; %96, %98 ve %96 sında, S. aureus; %66, %100 ve %74 ünde, koagulaz (+) S. aureus; %28, %82 ve %38 inde, Enterobakter; %62, %98 ve %58 inde, koliform grubu bakteri; %26, %96 ve %22 sinde, E. coli; %12, %64 ve %4 ünde ve Salmonella spp.; %18, %26 ve %16 sında saptamışlardır. Kozačinski ve ark., (2006) Hırvatistan marketlerinde satılan kanatlı etlerinin mikrobiyolojik kalitelerini inceledikleri çalışmada toplam 66 tavuk eti örneğinde Salmonella spp. (% 10.60), S. aureus (% 30.30), L. monocytogenes (% 3.03), Enterobacter (% 34.84) ve sülfit indirgeyen Clostridia (% 1.50) varlığını tespit etmişlerdir. Örneklerin hiçbirinde Campylobacter spp. varlığına rastlamadıklarını bildirmişlerdir. 06 Şubat 2009 tarihli resmi gazetede yayımlanmış Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Tebliğ verilerine göre 25 gram et ve et ürünleri içerisinde (karkasta, parça ette ve kıymada) L. monocytogenes, Salmonella spp. ve E. coli O157:H7 hiç bulunmamalıdır (Türk Gıda Kodeksi, 2009). Çiğ tavuk karkasında termofilik Campylobacter türlerinin varlığına ilişkin TGK Mikrobiyolojik Kriterler Tebliğinde henüz bir yasal limit belirlenmemiştir. Ancak tüketime hazır gıdaların hiç birinin 25 g örneğinde bulunmaması gerektiği bildirilmiştir (Anonymous, 2009). 2.2. Tavuk İşletmelerinde Campylobacter spp. Sorunu Tavuk işletmelerinde proses sırasında Campylobacter türlerinin canlılıklarını sürdürerek çapraz kontaminasyona neden olmaları üzerine yapılan epidemiyolojik çalışmalarda haşlama tankı, tüy yolma makinesi ve soğutma tankı gibi noktaların C. jejuni kontaminasyonunda en önemli odak noktalarını oluşturduğu belirlenmiştir. Bu konuda yapılan bir çalışmada işlem başlangıcında tavuklarda C. jejuni ye rastlanma oranının %20 olmasına karşın, soğutma suyuna daldırma işlemi sonrası 16

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR karkaslarda bu mikroorganizmaya rastlanma oranının %52 ye çıktığı saptanmıştır (Turantaş, 2000). Beckers ın (1988) Hollanda'da yaptığı bir incelemede 1979'da 202, 1980'de 531, 1981'de 1496, 1982'de ise 1728 gıda kaynaklı hastalık vakasının C. jejuni'ye bağlı olarak oluştuğunu ve sayı olarak Salmonella kaynaklı enfeksiyonların ardından ikinci sırada yer aldığını bildirmiştir. Yıldırım ve ark. (2001), Campylobacter türlerinin civciv bağırsaklarına kolonizasyonunu etkileyen faktörler üzerine yaptıkları bir çalışmada Minimal İnfektif Doz 100 (MID 100 ) ile oral yolla enfekte edilen civcivlerde, C. jejuni ve C. coli nin inokulasyonunu takip eden 3 haftada bağırsaklarda kolonizasyonunun %100 e ulaştığını gözlemişlerdir. 2.3. Tavuk Etinde ve Gıdalarda Campylobacter spp. Sorunu Campylobacter türleri üzerine ülkemizde 1990 lı yıllardan günümüze kadar yapılan çalışmalar daha çok kan ve dışkı örneklerine yönelik olmuştur. Tavuk etleri ve gıdalarla yapılan çalışmalar oldukça sınırlı kalmıştır. Ülkemizde 2004 yılı itibariyle tavuk eti tüketiminin kişi başına yıllık 13 kg olarak hesaplandığı ve bu nedenle insanda bakteriyel enfeksiyonda tavuk eti ve tavuk eti ürünlerinin tüketiminin önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir (Aydın, 2005). Yapılan tarama çalışmalarında marketlerde satışa sunulan çiğ tavuk etlerinin % 20-100 nün C. jejuni ile kontamine olduğunu ve dolayısıyla çok sayıda sağlıklı tavuğun bağırsaklarında bu bakterinin varlığına rastlanılmasının pek de şaşırtıcı olmadığını göstermiştir (Anonymous, 2008a). Blaser ve Reller (1981), gönüllü kişiler üzerinde yaptıkları çalışmada oral yolla alınan 500 canlı bakterinin klinik belirtilere yol açtığını bildirmişlerdir. Doyle nin, (1984) tavuk yumurtası üzerinde yaptığı bir çalışmada 226 örnekten sadece 2 sinin kabuğundan C. jejuni izole edildiğini ancak hiçbir yumurta içeriğinde etkene rastlanmadığını bildirmiştir. 17

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Kwiatek ve ark. (1990), Polonya da yaptıkları çalışmada tavuk karkaslarında % 80.3, ördek karkaslarında % 48, kaz karkaslarında % 38 ve hindi karkaslarında % 3 oranında C. jejuni saptadıklarını belirtmişlerdir. Palmer (1992), 1991 yılında Galler'de meydana gelen gıda kaynaklı enfeksiyonlarda Salmonella spp. ile birlikte Campylobacter cinsi mikroorganizmaların en yaygın etken olduğunu; Temmuz, Ağustos, Eylül ve Ekim ayları dışındaki aylarda da campylobacteriosis vakalarının Salmonella dan daha sık görüldüğünü bildirmiştir. Sharp ve ark. (1992) ise 1980-1991 yılları arasında İskoçya'da meydana gelen gıda kaynaklı 2511 olgunun 236'sının Campylobacter spp. tarafından oluşturulduğunu saptamışlardır. Florin ve Antillon (1992) un kanatlı hayvanlar ve hasta çocuklardan izole ettikleri C. jejuni suşlarının bir kısmının enterotoksin bir kısmının sitotoksin bazılarının da hem enterotoksin hem de sitotoksin oluşturduğunu bildirmişlerdir. Flynn ve ark. (1994) İrlanda da inceledikleri tavuk karkaslarının % 64.7 sinde C. jejuni ve C. coli tespit etmişlerdir. Yıldırım (1995), İstanbul bölgesinde perakende olarak satılan 236 tavuk karkasının % 81.7 sinden, tabakta satılan 17 tavuk karkasının % 88.2 sinden, dondurulmuş olarak satılan 32 tavuk karkasının ise % 6.25 inden termofilik Campylobacter türlerini izole etmiştir. Dizgah (1995), İstanbul piyasasında satışa sunulan kanatlı eti ve kanatlı eti ürünleri üzerine yaptığı bir çalışmada incelediği çiğ tavuk karkaslarının 48 inde (%96), çiğ bıldırcın karkaslarının 11 inde (% 22), işlenmiş çiğ tavuk eti örneklerinin 26 sında (% 65), sakatatların 9 unda (% 90) termofilik Campylobacter türlerini saptamış ve elde ettiği izolatların % 53 ünü C. jejuni, % 19 unu C. coli ve %28 ini C. lari olarak tanımlamıştır. Willis ve Murray (1997) bir yıl boyunca piyasadan temin ettikleri broiler karkaslarında %69 oranında C. jejuni izole ettiklerini, pozitif örnek sayısının Haziran ve Temmuz aylarında en yüksek (%97), Aralık ayında en düşük (%7) olduğunu bildirmişlerdir. 18

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Uyttendaele ve ark. (1999) Belçika daki çeşitli satış noktalarından temin ettikleri 772 kanatlı eti ve kanatlı eti ürünlerinde %28.5 oranında C. jejuni ve C. coli tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Atanassova ve Ring (1999), Almanya da inceledikleri broiler karkaslarının % 45.9 oranında Campylobacter türleri ile kontamine olduklarını bulmuşlardır. Harrison ve ark. (2001), Güney Galler de tavuk etlerinin kasap dükkanlarında ve süpermarketlerde satılmasının ve aynı zamanda ambalajın Campylobacter ve Salmonella varlığı üzerine etkisini araştırdıkları bir çalışmada tüm tavuk, derisi üzerinde bırakılmış tavuk göğsü ve tavuk parçalarından oluşan 300 çiğ tavuk eti örneğinde % 68 oranında Campylobacter, % 29 oranında ise Salmonella varlığına rastlamışlardır. Süpermarketlerde satışa sunulan örneklerin % 75 inde, kasap dükkanlarında satılan örneklerin ise % 59 unda Campylobacter tespit etmişlerdir. Coker ve ark. (2002), yaptıkları moleküler çalışmalarda, tavuklardan ve insanlardan izole edilen Campylobacter suşlarının genotipik benzerliğini araştırarak campylobacteriosis vakaları ile tavuk eti tüketimi arasındaki ilişkiyi ortaya koymuşlardır. 2.4.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu ve Tanımlanması 2.4.1.Termofilik Campylobacter Türlerinin İzolasyonu 1970 li yıllardan itibaren seçici besiyerlerindeki gelişmeler Campylobacter lerin dışkı örneklerinden pek çok farklı laboratuarda test edilmelerine olanak sağlamıştır (Altekruse ve ark.,1999). Termofilik Campylobacter türlerinin tavuk etinden izolasyonu ve tanımlanmasında (identifikasyon) klasik yöntemler ve ileri teknolojik yöntemler (moleküler) kullanılmaktadır. Tanımlamada her iki yöntem de tek başlarına yetersiz gelmekte ve bu nedenle daha iyi bir sonuç için her iki yöntemin birlikte kullanıldığı çalışmalar önerilmektedir (Ertaş ve ark., 2002). Yapılan araştırmalar Camplobacter türlerinin rutin izolasyonu için tek bir standart olmadığını ortaya koymaktadır. Campylobacter türleri çevresel koşullara 19