ESAT-6/CFP-10 BAZLI ELISPOT TEKN N N TUBERKÜLOZ TANISINDAK YER Prof. Dr. Ayflegül YA CI Marmara Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dal, stanbul Dünya Sa l k Örgütü 2002 y l raporunda, 2000 y l için tuberküloz basiliyle infekte 3.6 milyon yeni olgu bildirmektedir ve olgular n 1.5 milyonu yayma pozitiftir, yani çevrelerindeki di er kiflileri infekte etme ihtimalleri yüksektir(1). Dünyada tüberküloz hastalar n n %80 i 22 ülkede bar nmaktad r ve insidans n en yüksek oldu u ülkeler Hindistan, Çin, Bangladefl, Filipinler ve Güney Afrika d r (2). Dünya nüfüsunun üçte birini infekte eden bu bakteri, y lda yaklafl k 2 milyon insan n ölümüne neden olmaktad r. Hastal k insidans Avrupa ülkelerinin ço unda yüzbinde 20 den az iken, Türkiye deki hastal k insidans 2000 y l nda Verem Savafl Dispanserlerine kay tl hastalara göre hesaplan ld nda yüzbinde 27 dir(2). Tüberkülozla infekte hastadan sa lam kiflilere M. tuberculosis hava arac l yla yay lmaktad r ve hasta ile yak n ve uzun süreli temas olanlarda daha yüksek oranda bulaflma görülmektedir. Kesin tan için uygun mikrobiyolojik yöntemlerle etkeni saptamak gerekir. Tan da en h zl, en ucuz yöntem basilin mikroskop ile saptanmas, alt n standart ise kültürde üretilmesidir. M. tuberculosis ile infekte bireylerin ço unda infeksiyonun latent kald ve bu bireylerin %10 unda aktif hastal k geliflebilece i bilinmektedir(3). Dünya nüfusunun üçte birinin latent olarak infekte oldu u düflünülürse, bu durumun yeni olgular için ne büyüklükte bir kaynak oluflturabilece i tahmin edilebilir. Bu bireylerin hangilerinin ve ne zaman hastal k gelifltirece inin tahmini ise güçtür. Robert Koch un 1800 lü y llarda M. tuberculosis kültür filtrat n s ile inaktive ederek elde etti i tuberkülini deri içine uygulayarak gelifltirdi i PPD(purified protein derivatives) deri testi halen infeksiyonun belirlenmesinde yayg n olarak kullan lan tek testtir. PPD içinde yer alan proteinler molekül a rl 10.000 daltonu geçmeyen düflük molekül a rl kl proteinler olup, mikobakteri ile infekte olmayan bireylerde reaksiyon oluflmamaktad r. PPD antijenlerinin verilmesi gecikmifl tipte afl r duyarl l k reaksiyonuna neden olmaktad r. Yo unlu u 0.1mg / 0.1 ml, 5 standart tuberkülin ünitesinin deri içine injeksiyonu sonras, önceden duyarl laflm fl T lenfositleri varl nda enjeksiyon yerinde sal nan lenfokinler, antijen enjekte 91
edilmesinden en erken 24 saat sonra zirve yapan endürasyon, vezikülasyon ile karakterize deri reaksiyonuna neden olurlar. Deri testi e itimli sa l k çal flanlar taraf ndan 48-72 saat sonra de erlendirilerek reaksiyon yerinde oluflan endürasyon ölçülür. Maliyetin düflüklü ü ve özel ekipman gerektirmemesi nedeniyle PPD testi epidemiyolojik olarak latent M. tuberculosis infeksiyonunun taranmas ve kliniklerde aktif tuberküloz infeksiyonunun tan s nda kullan lmaktad r. PPD testinin en büyük dezavantaj PPD antijenlerinin M. tuberculosis, M. bovis BCG ve tuberküloz d fl mikobakterilerle ortak antijenler içermesi ve BCG afl uygulamas n n ve tuberküloz d fl mikobakteri enfeksiyonlar n n yayg n oldu u yerlerde özgüllü ünün azalmas d r(3,4). Aktif tuberkülozlu hastalarda %75-90 duyarl l k gösteren testin duyarl l yayg n hastal kta %50 ye inmektedir. Dünya nüfüsunun ço u BCG ile afl l d r ve BCG etkisi afl dan 15 y l sonra devam edebilmektedir (5). Bu nedenlerle BCG ile çapraz reaksiyon vermeyecek antijenlerin aray fl na gidilmifltir. Latent M. tuberculosis infeksiyonunda humoral immun cevap genellikle zay f oldu undan, hücresel immun cevab n hedefi olabilecek antijenler araflt r lm flt r. M. tuberculosis H37Rv,M. bovis ve BCG sufllar n n genomlar n n k yaslanmas yla region of difference(rd) ad yla tan mlanan 16 ayr bölge belirlenmifltir. M. bovis derd1 bölgesi 1921 de in vitro kültürlerde kaybolmufl olup, BCG afl sufllar nda ve çevresel mikobakterilerde bulunmamakta, M. tuberculosis kompleksinde bulunmaktad r(6). Andersen ve ark taraf ndan tan mlanan iki düflük molekül a rl kl antijen ESAT-6 (eary secretory antigenic target) ve CFP-10(culture filtrate protein) RD1 bölgesinde kodlanmaktad r. Bu antijenler M. tuberculosis kültür filtratlar ndan saflaflt r lm fl olup M. tuberculosis kompleksi (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) ve baz atipik mikobakterilerde (M. kansasii, M. szulgai, M. flavescens, M. marinum) sufllar nda eksprese edilmekte, ancak M. bovis BCG sufllar nda ve çevreden izole edilen mikobakterilerin ço unda bulunmamaktad r (7,8). Tuberküloz oluflturulmufl hayvan modellerinde interferon - salg layan CD4+ T hücrelerinin hedefinin ESAT-6 proteini oldu u gösterilmifl ve tuberkülozlu hastalar n periferik kan mononükleer hücrelerinin ESAT-6 ile uyar lmas ile ELISA ile saptanabilen interferon - düzeyleri tespit edilmifltir(9-11). Bu veriler kanda dolaflan ESAT-6 ya özgül T hücrelerinin M. tuberculosis infeksiyonunu iflaret edebilece ini düflündürmüfl ve ELISPOT ( enzim-ba l immunospot) yöntemi ile perifer kan ndan interferon - salg layan T hücrelerinin say s n n belirlenmesinin tuberkülozda tan koydurucu olabilece i hipotezi 92
gelifltirilmifltir. Dr. Lalvani ve ekibinin gerçeklefltirdi i bu öncü çal flmada aktif tuberkülozlu hastalar n %96 s nda ELISPOT pozitif bulunurken, kontrol gurubunun %92 sinde negatif bulunmufl ve BCG ile afl l kontrol gurubunda ELISPOT pozitifli i gösterilmedi inden M. tuberculosis infeksiyonu ile BCG afl lanmas n ay rdetmek için kullan labilecek bir yöntem oldu u bildirilmifltir(12). Ticari olarak 2 interferon - testi bulunmaktad r; Quantiferon- TB testi(cellestis Limited, Victoria, Avusturalya) ve T SPOT-TB testi (Oxford Immunotec, Oxford, ngiltere). Bu yöntemlerde ELISA ve ELISPOT ( enzim-ba l immunospot) teknikleriyle T hücrelerinden sal nan interferon - ölçülerek hücresel ba fl kl k de erlendirilmektedir. Yeni kuflak Quantiferon-TB gold testi ile tam kanda ESAT- 6 ve CFP-10 antijenleri kullan larak interferon - yan t ölçülmekte, ELISPOT testinde de ayn antijenler kullan lmakta, ancak test için tam kan de il periferik kan mononükleer hücreleri gerekmekte ve interferon - üreten T hücrelerinin say s belirlenmektedir. T-SPOT testi flu sekilde gerçeklefltirilmektedir: a. Hasta kan santrifüj edilerek periferik kan mononükleer hücreler ayr l r. b. S v besiyerinde y kanan mononükleer hücreler (2.5x105/çukur) 96- çukurlu plaklara da t l r. Plaklar efektör T hücrelerinin özgül antijenle temas nda sal nacak olan interferon - ya karfl antikorla kapl d r. c. Çukurlara ESAT-6, CFP-10, fitohemaglütinin(pozitif kontrol), ve 6 ayr peptid, eklenir ve plak bir gece 37C de CO2 li etüvde inkübe edilir. Negatif kontrol çukuruna antijen eklenmez. d. Ertesi gün plaklar iyice y kan r ve enzim-iflaretli ikinci antikor eklenir. e. Takiben kolorimetrik substrat eklenir ve oluflan noktalar say l r. Gözle görülen her nokta antijenle etkileflen bir T hücresi anlam na gelmektedir.negatif kontrol kuyucu una k yasla >6 nokta say lmas NFEKS YON olarak de erlendirilir. nterferon - yan t ölçen testler invitro ortamda gerçeklefltirilmektedir, derideki endürasyonun ölçümü gibi subjektif de ildir ve hastan n bir kez gelmesi yeterli olmaktad r. Bu testlerin kullan m amaçlar n inceleyen çal flmalar de erlendirildi inde testin kullan m alanlar flöyle s ralanabilir: 93
1. Aktif tuberkuloz tan s nda ve M. tuberculosis infeksiyonunun BCG afl lamas ndan ay rt edilmesinde Aktif tuberkülozlu (yayma veya kültürle bakteriyolojik olarak do rulanan) hastalarda duyarl l k yani aktif hastal olup da interferon - testi pozitif olan hastalar de erlendirildi inde testin duyarl l n n %66 ile %96 aras nda de iflti i gözlenmektedir(12,13). PPD nin antigen olarak kullan ld testlerde duyarl l k ESAT-6 ve CFP-10 un tek bafl na kullan ld testlere göre yüksek iken bu iki antijenin birlikte kullan lmas durumunda duyarl l k daha da yükselmektedir. Tedavi alt ndaki hastalarda duyarl l k tedavi görmeyenlerden yüksektir. Aktif tuberkulozu olmayanlarda testin özgüllü ü yani hasta olmay p, interferon - testi negatif olanlar araflt r ld nda genellikle düflük tuberküloz insidans olan bölgelerde yaflayan,tuberküloz öyküsü ya da tuberküloz temas olmayan sa l kl bireyler de erlendirilmifl olup özgüllü ün %95-100 oran nda seyretti i görülmektedir. Endemik bölgelerdeki sa l kl bireylerde latent infeksiyonun takibi aç s ndan de erlendirildi inde Hindistan gibi 1 milyar nüfüsu olan ve her y l yaklafl k 2 milyon yeni tüberküloz olgusu bildirilen bir ülkede ELISPOT testi 100 bireyin 80 inde pozitif bulunmufl olup, popülasyonun %80 inin latent olarak infekte oldu u bildirilmifltir(14). ELISPOT testinin PPD ile karfl laflt r ld çal flmalarda iki test aras ndaki uyumun %66-82 oran nda oldu u görülmektedir. ngiltere de bir indeks olgudan kaynaklanan okul salg n çerçevesinde 535 ö renci taranm fl ve BCG ile afl lanm fl çocuklarda PPD testi pozitifli inin daha yüksek oldu u, ELISPOT test sonuçlar n n ise BCG uygulanmas ndan etkilenmedi i, ELISPOT testinin tek bafl na pozitifli inin M. tuberculosis ile temas gösterirken, tek bafl na PPD pozitifli inin ayn flekilde yorumlanamayaca saptanm flt r (15). stanbul da gerçeklefltirilen bir çal flmada ise yayma pozitif 414 eriflkin tüberküloz hastas yla temas eden 979 çocuk takip edilmifl ve PPD testi ile EL SPOT testi aras nda %84 uyum bulunmufltur(16). Bu çal flman n en çarp c bulgusu BCG afl s n n çocuklar tüberküloz infeksiyonundan korudu unun gösterilmesidir. 2. Tuberkuloz d fl mikobakteri infeksiyonlar n n M. tuberculosis infeksiyonlar ndan ay rt edilmesi: M. avium ile infekte hastalarda ESAT-6 testinin özgüllü ü %100 iken(hiçbir hastada pozitif sonuç saptanmam flt r), PPD testinin özgüllü ü %60 larda kalm flt r(17). M marinum ve M. kansasii ile infekte hastalarda ise 94
ESAT-6, CFP-10 testi pozitifli i %70 lere inerken, PPD pozitifli i %90 a ç km flt r(18). Bu antijenlerin M. tuberculosis kültür filtratlar ndan saflaflt r lm fl olup M. tuberculosis kompleksi (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) ve baz atipik mikobakterilerde (M. kansasii, M. szulgai, M. flavescens, M. marinum) sufllar nda eksprese edilmesi nedeniyle baz atipik mikobakteri infeksiyonlar nda özgüllü ünün düfltü ü söylenebilirse de bu infeksiyonlar n insidans n n çok düflük oldu u da bilinmektedir. 3. Latent tuberküloz tan s M. tuberculosis ile temasl, PPD testi pozitif, normal gö üs filmi olan, aktif hastal k belirtileri göstermeyen, semptomsuz bireylerde (ev temas, ya da salg n s ras nda temas,vb) duyarl l k %80 lerde seyretmektedir(12, 14). Tuberküloz hastalar yla temas olan 24 sa l kl kiflinin 2 y l boyunca takip edildi i bir çal flmada aktif tuberkuloz geliflen 7 kiflinin 6 s (%86) ESAT-6 testi pozitif bulunurken, tuberkuloz geliflmeyenlerde bu oran (%18) olarak saptanm flt r(19). Bu çal flmada, hasta say s az olmas na ra men, ESAT-6 testi pozitifli inin aktif tuberküloz geliflmesiyle iliflkili oldu u savunulmaktad r. 4. Tedaviye yan t n takibi ESAT-6 pozitifli inin tedaviyle iliflkisini inceleyen çal flmalar çeliflkili sonuçlar ortaya koymufl olup tedavinin test pozitifli ini artt rd, azaltt ya da etkilemedi ini bildiren sonuçlar bulunmaktad r(11,14,20). Sonuç olarak BCG afl l larda ve çevresel mikobakterilerle temas edenlerde yanl fl pozitif ç kabilen, de erlendirmesi kifliye ba l olup, aktif hastal kta negatif ç kabilen, yayg n hastal kta olgular n sadece yar s n tan yabilen PPD deri testine karfl l k, ELISPOT testi duyarl l ve özgüllü ü yüksek, aktif hastal kta yanl fl negatif sonuç vermeyen bir testtir. De erlendirme için ikinci kez gelinmesine gerek kalmamakta, BCG afl lamas na ba l yalanc negatif sonuçlar görülmemekte, gereksiz profilaksi ve buna ba l toksisiteden hastalar korumaktad r. Latent infeksiyonun yayg n oldu u yüksek endemik ülkelerde, BCG afl lamas n n yayg n oldu u ülkelerde ve tüberküloz d fl mikobakteri infeksiyonlar n n yayg n oldu u ülkelerde yap lacak daha çok say da çal flmaya ihtiyac n oldu u da bir gerçektir. 95
mmün sistemi bask lanm fl hastalarda, çocuklarda, akci er d fl ve çoklu ilaca dirençli tuberküloz olgular nda, sa l k personeli gibi s k temas öyküsü olanlarda testin kullan labilirli inin detaylar yla tan mlanmas gerekmektedir. PPD deri testine göre ELISPOT testinin maliyeti yüksektir ve laboratuvar deneyimi gerektirmektedir. Ancak testin referans laboratuvarlar nda çal fl lmas durumunda daha h zl ve güvenilir sonuç al nmas mümkün oldu u gibi, yanl fl pozitif veya yanl fl negatiflikleri ortadan kald ran bir test tuberküloz gibi çok önemli bir sa l k probleminin tan s na büyük katk da bulunacakt r. KAYNAKLAR 1. WHO. Global Tuberculosis Control. Surveillance, planning,financing. Communicable diseases, World Healh organization, Geneva, 2002. WHO/CDS/TB/2002.295 2. WHO. Global DOTS plan. Progress in TB control in high burden countries, 2001. World Health Organization. WHO/CDS/TB/2001.11 3. Jasmer RM, Nahid P, Hopewell PC. Clinical practice. Latent tuberculosis infection. N Eng J Med 2002; 347: 1860-1866. 4. Huebner RE, Schein MF, Bass JB. The tuberculin skin test. Clin Infect Dis 1993; 17: 968-965. 5. Wang L, Turner M, Elwood R, Sculzer M, Fitzgerald J. A meta- analysis of the effect of Bacille Calmette Guerin vaccination on tuberculin skin test mesurements. Thorax 2002; 57: 804-809. 6. Behr M, Wilson M, Gill W, Salamon H, et al. Comperative genomics of BCG vaccines by whole genome DNA microarray. Science 1999, 284; 1520-1523. 7. Sorensen AL, Nagai S, Houen G, Andersen P, Andersen AB. Purification and characterization of low molecular mass T cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 1995; 63: 1710-1717. 8. Harboe M, Oettinger T, Wiker HG, Rosenkrands I, Andersen P. Evidence for occurence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun 1996; 64: 16-22. 9. Pollock JM, Andersen P. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. J Infect Dis 1997; 175:1251-1254. 96
10. Brant L, Ottinger T, Holm A, Andersen AB, Andersen P. Key epitopes on ESAT- 6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol 1996; 157: 3527-3533. 11. Ravn P, Demissie A, Eguale T, et al. Human T cell responses to the ESAT-6 antigen from Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1999; 179: 637-645. 12. Lalvani A, Pathan A, McShane H. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen specific T cells. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 824-828. 13. Cardoso FL, Antas PR, Milagres AS, et al. T- cell specific responses to Mycobacterium tuberculosis specific antigen ESAT-6 in Brazilian tuberculosis patients. Infect Immun 2002; 70: 6707-14. 14. Lalvani A, Nagvenkar P, Udwadia Z, et al. Enumeration of T cells specific for RD1 encoded antigen suggests a high prevalence of latent Mycobacterium tuberculosis infection in healthy urban indians. J Infect Dis 2001; 183: 469-477. 15. Eweer K, Deeks J, Alvarez L, et al. Comparison of T-cell based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a scholl tuberculosis outbreak. Lancet 2003; 361: 1168-1173. 16. Soysal A, Millington K, Bakir M, et al. Effect of BCG vaccination on risk of Mycobacterium tuberculosis infection in children with household tuberculosis contact: a prospective community based story. Lancet 2005; 366: 1443-1451. 17. Mazurek GH, LaBue PA, Daley Cl,et al. Comparison of a whole blood interferon gama assay with tuberculin skin testing for detecting latent Mycobacterium tuberculosis infection. JAMA 2001; 286: 1740-1747. 18. Arend SM, van Mejgaarden KE, de Boer K, et al. Tuberculin skin testing and invitro T cell responses to ESAT-6 and culture filtrate protein 10 after infection with Mycobacterium marinum or M. kansaii. J Infect Dis 2002; 186: 1797-1807. 19. Doherty TM, Demissie A, Olobo J, et al. Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among contact of tuberculosis patients. J Clin Microbiol 2002; 40: 704-706. 20. Tulrichs T, Anding R, Kaufmann SH, Munk ME. Number of IFN-gamma producing cells against ESAT-6 increase in tuberculosis patients during chemotherapy. Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4: 1181-1183. 97