ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sezen İNAN KARPUZ (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) da IN VIVO VE IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KARPUZ ( Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) DA IN VIVO VE IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ Sezen İNAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez 05/ 02 /2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza...... Prof.Dr. Nebahat SARI DANIŞMAN İmza...... Doç.Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ÜYE İmza...... Doç.Dr. Halit YETİŞİR ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç. Ü. Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2005 YL15 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KARPUZ ( Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) DA IN VIVO ve IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ Sezen İNAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Nebahat SARI Yıl : 2007, Sayfa : 80 Jüri : Prof. Dr. Nebahat SARI : Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ : Doç. Dr. Halit YETİŞİR Bu çalışma, çekirdeksiz karpuzun temel üretim materyali olan tetraploid karpuz bitkisi elde edilmesine yönelik olarak planlanmıştır. Çalışmada, Crimson Sweet karpuz çeşidi kullanılmış ve iki in vivo ile iki in vitro yöntemin tetraploid bitki elde edilmesine etkileri araştırılmıştır. In vivo yöntemlerin birincisinde 7 farklı dozda (% 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ve 0.6) hazırlanan kolhisin çözeltisi, ilk gerçek yaprak oluşumu aşamasında bitkinin büyüme ucuna damlatılmış; diğer yöntemde ise % 0.0, % 0.5 ve % 1.0 dozlarında hazırlanan kolhisin çözeltisine serada büyütülen diploid karpuz bitkilerinin büyüme ucu daldırılmıştır. In vitro da yapılan denemelerde 4 farklı BA dozu (0, 1, 2 ve 4 mg/l) içeren MS kültür ortamlarında kotiledon yapraklarından rejenerasyon sağlanmış, diğer yöntemde ise in vitro diploid mikro çeliklere kolhisinin 3 dozu (% 0.0, 0.5 ve 1.0) uygulanmıştır. Araştırma bulgularına göre Crimson Sweet karpuz çeşidinde tetraploid bitki elde edilmesine yönelik en başarılı uygulamanın in vitro da 4 mg/l BA içeren MS ortamından elde edilen rejenerasyon ile gerçekleştiği ve bu uygulamada katlama oranının % 60.4 olduğu tespit edilmiştir. İkinci başarılı metot olarak in vitro kolhisin uygulamasında (% 0.5 dozu) % 36.4 oranında tetraploid bitki elde edilmiştir. Denemede yer alan in vivo yöntemlerin katlanma başarısı % 5 oranında kalmış ve yeterli bulunmamıştır. In vivo ve in vitro yöntemler sonucu elde edilen bitkilerin ploidi seviyeleri flow sitometri analiz yöntemi ile belirlenmiştir. Tetraploid bitki teşhisinde morfolojik ve sitolojik gözlemlerden de yararlanılmıştır. Anahtar Kelimeler: Karpuz, Kolhisin, Benzyl Adenin, Stomatal özellikler, Flow Sitometri I

ABSTRACT MSc. THESIS THE OBTENTION OF TETRAPLOID WATERMELON (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) PLANTS BY IN VIVO and IN VITRO METHODS Sezen İNAN DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Nebahat SARI Year : 2007, Pages: 80 Jury : Prof. Dr. Nebahat SARI : Assoc. Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ : Assoc. Prof. Dr. Halit YETİŞİR This study was planned to produce tetraploid watermelon plant which is the main production material of seedless watermelon. In this study watermelon cultivar Crimson Sweet was used and the effects of 2 in vivo and 2 in vitro methods on the obtention of tetraploid plant were investigated. In the first in vivo method, 7 different colchine solutions (0.0 %, 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 % ve 0.6 %) were applied by droping to the apical growing point at the first true leaf stage in the other technique, the apical growing points of the greenhouse grown plants were immersed in to (0.0 %, 0.5 % and 1.0 %) colchine solution. In the first experiment of in vitro methods, the cotyledons were regenerated in MS medium containing 4 different concentrations (0, 1, 2, 4 mg/l) of BA were added. In the other technique, 3 different colchicine solution (0.0 %, 0.5 % and 1.0 %) were applied to the in vitro diploidmicrocuttings. According to the results, the most succesful method to obtain tetraploid plants of C. Sweet watermelon cultivar was the regeneration in MS medium containing 4 mg/l BA was added and the duplication rate was 60.4 %. The second successful method was the in vitro colchicine application (0.5 %) with rate of 36.4 % tetraploid plants. The duplication rate of in vivo methods was 5 % that was not found enough successful. The ploidy level of the plants which obtained by in vivo and in vitro methods was analysed with flow cytometry. Morphological and cytological observations were also done to determine tetraploid plants. Key words: Watermelon, Colchicine, Benzyl Adenin, Stomatal Characteristics, Flow Cytometry II

TEŞEKKÜR Yüksek Lisans öğrenimim boyunca tezimin planlanması, yürütülmesi ve sonuçların değerlendirilmesi sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Rejenerasyon çalışmalarım sırasında öneri ve deneyimlerinden yararlandığım değerli Hocam Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ye teşekkürü borç bilirim. Yüksek lisans öğrenimim boyunca desteğini esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Selim ÇETİNER e, Doç.Dr.Yıldız AKA KAÇAR a ve sitolojik çalışmalarım sırasında gösterdiği yakın ilgileri için sayın Prof. Dr. Sinan ETİ ye sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans öğrenimim boyunca yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye, Toros Tarım San. Tic. A.Ş. Genel Müdür Yardımcısı Sayın İskender İŞÇENER e, Genel Müdür Yardımcısı Sayın Necat HAKSAL a, Toros Agripark İşletme Şefi Sayın İhsan ÜNLÜ ye ve Toros Agripark Biyoteknoloji laboratuvarı mesai arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında yardımlarını benden esirgemeyen sevgili dostlarım Zir.Yük. Müh. İjlal EKEN ve Zir. Yük. Müh. Manolya YARIMOĞLU na, sevgili kardeşim ve meslektaşım Zir. Müh. Senem İNAN ve sevgili iş arkadaşım Zir. Müh. Belgin BİÇEN e teşekkür ederim. Arazi ve laboratuvar çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan arkadaşlarım Ar. Gör. İlknur SOLMAZ, Zir. Müh. Esma KESER e, Zir. Müh. Neslihan AYDINOĞLU na, iş arkadaşlarım Aynur BAĞRIYANIK, Hasan YASİN e ve daha ismini sayamadığım birçok arkadaşıma, tezimin yazılma aşamasındaki yardımlarından dolayı Zir. Müh. Hasan Alp İNAN a teşekkür ederim. Ploidi düzeyinin belirlenmesi için gönderdiğimiz örnekleri bedelsiz olarak analiz eden Enza Zaden (Hollanda) tohum firması yetkililerine ve bu projeyi finansal olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine teşekkür ederim. Son olarak da yaşamım boyunca bana göstermiş oldukları maddi-manevi fedakarlıklardan dolayı sevgili aileme teşekkürü bir borç bilirim. III

İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖZ. I ABSTRACT.. II TEŞEKKÜR.. III İÇİNDEKİLER. IV ÇİZELGELER DİZİNİ. VII ŞEKİLLER DİZİNİ... X KISALTMALAR.. XII 1. GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.. 5 2.1. In Vivo Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları... 5 2.2. In Vitro Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları.. 8 2.3. Triploid Bitkiler ve Ploidi Belirleme Çalışmaları 14 3. MATERYAL VE METOD. 18 3.1. Materyal... 18 3.2. Metod... 19 3.2.1. In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi...... 19 3.2.1.1. Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması 19 3.2.1.2. Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması... 22 3.2.2. In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi..... 24 3.2.2.1. Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı.... 24 3.2.2.1.(1). Tohumların Yüzey Dezenfeksiyonu... 25 3.2.2.1.(2). Tohumların Kültür Ortamına Ekimi.. 27 3.2.2.1.(3). Kültür Ortamı..... 27 3.2.2.1.(4). Kültür Koşulları. 27 3.2.2.1.(5). Rejenerasyon Ortamı ve Eksplantların Rejenerasyon Ortamına Aktarımı... 28 3.2.2.1.(6). Rejenerasyon Sonucu Elde Edilen Sürgünler 30 IV

3.2.2.1.(7). Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozları Kullanımı ile Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması... 31 3.2.2.1.(8). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi.. 32 3.2.2.2. In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması... 33 3.2.2.2.(1). Bitkilerin Kolhisin Çözeltisinde Bekletilmesi. 35 3.2.2.2.(2). Bitkilerin Çoğaltılması.... 36 3.2.2.2.(3). Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması.. 37 3.2.2.2.(4). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi.. 38 3.2.3. In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan Ölçüm ve Gözlemler... 38 3.2.3.1. Morfolojik Gözlemler. 38 3.2.3.1 (1). Yaprak Alanı... 38 3.2.3.1.(2). Yaprak Uzunluğu ve Eni.... 39 3.2.3.1.(3). Erkek Çiçek Çapı 39 3.2.3.1.(4). Erkek Çiçek Çevresi... 40 3.2.3.1.(5). Taç Yaprak Genişliği ve Uzunluğu... 40 3.2.3.1.(6). Yumurtalık Çapı ve Yüksekliği..... 40 3.2.3.1.(7). Çiçek Tozu Çapı..... 41 3.2.3.1 (8). Çiçek Tozu Kolpi (Çimlenme Pilesi) Sayısı... 41 3.2.3.2. Stomatal İncelemeler.. 41 3.2.3.2 (1). Stoma Çapı ve Uzunluğu... 41 3.2.3.2 (2). Stoma Yoğunluğu... 42 3.2.3.2.(3). Bekçi Hücrelerindeki Kloroplast Sayısı... 43 3.2.3.3. Flow Sitometri Analizi...... 43 3.2.4. In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan İstatiksel Analizler 43 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA... 44 4.1. In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi. 44 4.1.1. Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması. 44 V

4.1.2. Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması...... 56 4.2. In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi... 60 4.2.1. Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı... 60 4.2.2. In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması... 69 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 73 KAYNAKLAR... 75 ÖZGEÇMİŞ. 80 VI

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No Çizelge 3.1. MS ortamının içeriği (Murashige ve Skoog, 1962).. 26 Çizelge 3.2. E20A besi ortamının içeriği (Sauton, 1987; Sarı, 1994).. 34 Çizelge 4.1. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin, bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi. 44 Çizelge 4.2. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi. 45 Çizelge 4.3. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve boğum çapı gözlem ve ölçümleri. 47 Çizelge 4.4. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve boğum çapı gözlem ve ölçümleri. 48 Çizelge 4.5. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi etkisi... 50 Çizelge 4.6. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi etkisi... 50 Çizelge 4.7. 2005 yılında in vivo koşullardaki Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi... 51 VII

Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Çizelge 4.10. Çizelge 4.11. Çizelge 4.12. Çizelge 4.13. Çizelge 4.14. Çizelge 4.15. Çizelge 4.16. Çizelge 4.17. Çizelge 4.18. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özellliklerine etkisi... 52 2005 ve 2006 yıllarında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında kolhisin uygulamasından sonra seraya aktarılan bitkilerin serada yaşama oranları (%)... 53 2006 yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen meyve oranları (%)... 54 2006 yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen ploidi düzeyleri. 54 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi. 57 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi. 57 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi... 58 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi... 58 2006 yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün ucunun kolhisin çözeltisine daldırılması ile elde edilen meyve oranları (%)... 59 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine ait bitkilerinin kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması ile elde edilen ploidi oranı (%).. 59 Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürdeki kallus, sürgün ve tomurcuk oluşturma oranlarına etkileri 61 VIII

Çizelge 4.19. Çizelge 4.20. Çizelge 4.21. Çizelge 4.22. Çizelge 4.23. Çizelge 4.24. Çizelge 4.25. Çizelge 4.26. Çizelge 4.27. Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürlerdeki çoğalma kat sayısı ve bitki sayılarına etkisi 62 In vitro farklı BA dozları uygulamalarından elde edilen bitkilerde alıştırma serasına çıkarılan bitki sayısı, seraya çıkarılan bitki sayısı ile serada yaşama oranları (%) 64 In vitro da farklı BA dozları uygulamasının serada yetiştirilen bitkilerde yaprak ve stomatal özelliklere etkileri. 65 In vitro da farklı BA dozları uygulamsının serada yetiştirilen bitkilerde çiçek özelliklerine etkileri 66 In vitro da farklı BA dozları uygulamasının ploidi seviyesine etkileri... 66 In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra yaşayan bitki sayısı, yaşayan bitkilerdeki boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayısı. 69 In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde kolhisinin yaprak ve stomatal özellikler üzerine etkileri.. 70 In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde çiçek özellikleri. 71 In vitro diploid mikro çeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde ploidi düzeyleri (%) 72 IX

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 1.1. Triploid karpuz elde edilmesi (Mohr, 1986; Sarı, 1994). 3 Şekil 3.1. Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması... 20 Şekil 3.2. Kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış bitkilerin seradaki görünümü. 21 Şekil 3.3. a.anthesis döneminden bir gün önce pens yardımıyla kapatılmış dişi çiçek b. Kendileme sonucu meyve tutmuş dişi çiçek c. Bitkideki meyve gelişimi d. Seradan genel bir görünüm 22 Şekil 3.4. a.kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılmış bitki b. 2 saat kolhisin muamelesinden sonra kolhisin çözeltisinden sürgün ucunun çıkarılması c. Steril saf su ile kolhisinin dokuların üzerinden uzaklaştırılması d. Kolhisin ile muamele edilmiş sürgün ucunun kurdele ile bağlanarak belirtilmesi. 24 Şekil 3.5. Çimlendirme ortamına alınacak tohumların yüzey dezenfeksiyonu 27 Şekil 3.6. In vitro çalışmalarında kullanılan kültür odasından bir görünüm... 28 Şekil 3.7. a.beş gün çimlendirme ortamında tutulan tohumdan gelişen genç bitkicik b. Kotiledonların proksimal kısımlarının kesilmesi c. Kesilen eksplantların görünümü d. Eksplantların rejenerasyon ortamına yerleştirilmesi... 29 Şekil 3.8. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları kullanımı sonucu elde edilen bitkiler... 31 Şekil 3.9. a.in vitro bitkilerin besi ortamından çıkarılması b. In vitro bitkilerin viyollere dikimi c. In vitro bitkilerin alıştırma serasındaki görünümü d. In vitro bitkilerin seraya dikimi sonrası görünümü. 32 Şekil 3.10. Besi ortamına tohum ekilmesinden 10 gün sonra çimlenen tohumların görünümü.. 33 X

Şekil 3.11. a.in vitro bitkilere kolhisin uygulaması b. Bitkilerin kolhisin çözeltisinde bekletilmesi c. Bitkilerin mikroçeliklere ayrılması d. Mikroçeliklerin E20A besi ortamına yerleştirilmesi... 35 Şekil 3.12. In vitro mikro çeliklere kolhisin uygulaması sonrası E20A besi ortamına alınan bitkilerin görünümü... 36 Şekil 3.13. In vitro bitkilerin sera koşullarına alıştırılması 37 Şekil 3.14. Portable area meter 4-Cor Model-LI-3000A markalı yaprak alanı ölçümü yapan makine.. 39 Şekil 3.15. Serada morfolojik gözlem yapımı... 40 Şekil 3.16. 40x büyütmeli objektif ve 10x büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla fotoğrafı çekilmiş yaprak örneği... 42 Şekil 4.1. Kotiledon aşamasında farklı kolhisin dozları (% 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6) uygulanmış fidelerin seraya dikiminden önceki görünümü.. 46 Şekil 4.2. Farklı BA dozları içeren rejenerasyon ortamında bulunan eksplantların kültüre alımdan 25 gün sonraki görünümleri. 62 Şekil 4.3. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları ile elde edilmiş sürgünlerin kardeşlendirme ortamındaki görünümü. 63 Şekil 4.4. Kontrol bitkisinde flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü. 67 Şekil 4.5. 1 mg/l BA dozundan elde edilen tetraploid bitkinin ve flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü... 67 Şekil 4.6. a.farklı konsantrasyonlarda diploid mikro çeliklere kolhisin uygulamasından sonra E20A besi ortamına alınan bitkilerin ilk gözlem tarihindeki görünümleri b. Bitkilerin sera koşullarına çıkarılmadan önceki görünümü... 70 XI

KISALTMALAR % : Yüzde o C μm μm AgNO 3 BAP BA cm da DNA E20A GA 3 g ha HCl IAA IBA kg l LDL mg mm mm ml NAA MS rpm SÇKM TDZ UV : santigrad derece : Mikrometre : mikromolar : Gümüş nitrat : Benzylamino Purine : Benzile Adenin : santi metre : Dekar : Deoxyribonucleic acid : Çalışmada kullanılan E20A besi ortamı : Giberellic Acid : gram : Hektar : Hidroklorik asit : Indole Asetik Asit : Indole Butirik asit : Kilogram : Litre : Low density lipoprotein : miligram : milimolar : Milimetre : mililitre : Naphthalene acetic acid : Murashige and Skoog besi ortamı : revolutions per minute : Suda Çözünebilir Kuru Madde : Thidiazuran : Ultra Viyole XII

1. GİRİŞ Sezen İNAN 1. GİRİŞ Karpuz tarımı, dünyada ve ülkemizde oldukça geniş bir alana yayılmıştır. Dünya da 96 455 182 ton karpuz üretimi yapılmaktadır. Türkiye, 69 315 000 ton üretimi olan Çin den sonra 2. sırada yer almaktadır. Türkiye den sonra 3. sırada 2 150 000 ton üretimi ile İran, 4. sırada 1 718 920 ton üretimi ile ABD gelmektedir. Türkiye de 1 048 803 ha lık alanda 25 395 111 ton sebze üretimi yapılmaktadır. Bu üretimin yaklaşık % 33 ünü Cucurbitaceae familyasına ait sebze türleri oluşturmakta ve karpuz bu familya içerisinde 137 000 ha üretim alanı ve 3 800 000 tonluk üretimi ile 1. sırada yer almaktadır (Anonymous, 2005). Ülkemiz tarımında karpuzun oldukça önemli bir yeri vardır. Karpuz, ülkemizde domates ve patatesten sonra en fazla üretilen üçüncü sebzedir. Üretimin % 35 i Akdeniz Bölgesinde yapılmaktadır. Ege, Güneydoğu Anadolu ve Marmara karpuz üretiminin yapıldığı diğer bölgelerdir (Sarı, 2006). Karpuz meyvesinde oldukça yüksek oranda şeker bulunur. Bu şekerin büyük bir bölümü glikozdan oluşur. Karpuzun değerlendirilen kısmında % 7-10 arasında değişen oranda suda çözünebilir kuru madde (SÇKM) A, B ve C vitaminleri ile bir çok mineral madde bulunmaktadır (Vural ve ark., 2000). Karpuz, iştah açıcı, serinletici ve ferahlatıcı etkiye sahip yazlık bir sebzedir. İnsan sağlığı açısından bakıldığında göz ağrılarına, mide rahatsızlığına, baş ağrılarına iyi geldiği bilinmektedir (Sarı, 2006). Karpuzda antioksidant maddelerden karetenoidler (lycopen ve β-caroten) ile aminoasitlerden arginine ve citrulline bulunur. Likopen kanser riskini azaltır. LDL (low density lipoprotein) yi düşürür. Sperm kalitesini arttırır. Deriyi UV zararından korur (Perkins, 2005). Karpuz meyvesi besleyici özelliği dışında, sıcak havalarda ideal bir serinleticidir. Cucurbitaceae familyasına giren Citrullus cinsi, Afrika, Asya ve Akdeniz in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (2n=22) tür içermektedir (Jeffrey, 1975; Whitaker ve Davis, 1962; Robinson ve Decker-Walter, 1997). Dünya da tropik ve subtropik bölgelerde yetiştirilen Cirtullus lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai, kültür formu Citrullus lanatus var. lanatus ve Güney Afrika ya özgü yabani bir tür olan citron olarak da bilinen Citrullus lanatus var. citroides (Bailey) Mansf. alt 1

1. GİRİŞ Sezen İNAN türlerinden oluşmaktadır (Whitaker ve Bemis, 1976; Robinson ve Decker-Walter, 1997). Kabuklarından turşu ve konserve yapımından yararlanılan Citrullus lanatus var. citroides in beyaz veya açık yeşil olan meyve eti acıdır. Tohumları haşlanarak veya un haline getirilerek tüketilir (Robinson ve Decker-Walter, 1997). Karpuzda en önemli meyve kalite özelliklerinden birisi tohum iriliğidir. Ülkemizde yöresel olarak yetiştirilen karpuz genotiplerinin çoğunluğunda tohumlar iridir (Sarı ve ark., 2005). 10 yıl öncesine kadar ülkemizde yöresel çeşitlerin yetiştiriciliği ve tüketimi ağırlıklı iken, günümüzde tohum firmaları tarafından küçük tohumlu F 1 hibritler geliştirilerek piyasaya sürülmüştür. Karpuzda tohumlar meyve etine gömülü olarak veya dağınık bir şekilde bulunur. Kalite açısından en önemli özelliklerden birisi çeşitlerdeki tohum miktarı ve iriliğidir. Tüketim esnasında bu çekirdeklerin ağızdan çıkarılması tüketiciyi hoşnut bırakmamaktadır. Karpuz meyvesindeki aşırı tohum sayısı uluslararası marketlerde istenmeyen bir duruma gelmiştir. Çekirdeksiz karpuz çalışmalarına 1939 yılında Dr. Kihara başlamıştır. Araştırıcı 1951-1952 yıllarında triploid karpuz üretiminde başarılı olmuştur ve çekirdeksiz karpuz üretimi hızla yaygınlaşmaya devam etmektedir (Lucier ve Lin, 2001). Çekirdeksiz karpuz, çekirdeğinin olmamasından ve diploid karpuzlara göre tadının daha güzel olmasından dolayı bir çok tüketici tarafından tercih edilmektedir (Marr ve Gast, 1991). Çekirdeksiz karpuzlar triploid (3n=3x=33) hibritlerdir (Kihara, 1951). Triploid tohum elde edilmesi için tetraploid hatların ana ebeveyn olarak kullanılması gerekmektedir. Diploid hatların tetraploid polenlerle tozlanması sonucunda boş ve steril tohumlar meydana geldiği Mohr, (1986) tarafından bildirilmekle birlikte, bu boş tohumların içerisinde endospermsiz embriyo da oluşabildiği Sarı, (1994) tarafından tespit edilmiştir. Şekil 1.1 de triploid karpuz elde edilmesi şekilsel olarak gösterilmiştir. 2

1. GİRİŞ Sezen İNAN Şekil 1.1. Triploid karpuz elde edilmesi (Mohr, 1986; Sarı, 1994) Tohumsuz kültürler için, tetraploid (4x=44) dişi birey ile diploid (2x=22) erkek bireyin tozlanmasıyla hibritler oluşur. Oluşan tohumlar triploid (3x=33) dir. Triploid bitkide üç set kromozom vardır ve bu üç set kromozom bölünemediğinden dolayı triploid hibritlerin dişi bireyleri kısırdır ve meyveler tohumsuzdur. Triploid bitkilerin erkek organları kısırdır, üretim sırasında dişi çiçekte uyartım olması için triploid karpuz yetiştiriciliğinde arazinin 2/3 triploid - 1/3 diploid olacak şekilde bitki yetiştiriciliğinin yapılması gerekmektedir. Triploid karpuz kültürlerinin geliştirilmesi için yapılacak ıslah sürecinde, katlanacak tohum için ebeveyn seçimi, tetraploid hatların geliştirilmesi için ek zaman, meyve anormalliği ve kısırlık için ek seçim, 3

1. GİRİŞ Sezen İNAN diploid hatların eliminasyonu, hibrit üretimi ve test edilmesi, diploid tozlayıcı üretimi gibi problemler meydana getirmektedir. Diploid hatların belirlenmesi, tetraploid bitkilerin elde edilmesi (kolhisin, doku kültüründe rejenerasyon, sıcaklık şoku, X- ışınları yöntemleri kullanılarak), tetraploid hatların geliştirilmesi, hibritlerin üretimi ve test edilmesi triploid çeşit ıslahında kullanılan basamaklardır. İyi bir triploid çeşitte yüksek çimlenme oranı, hızlı ve güçlü büyüme, iyi meyve tutumu ve yüksek verim özelliklerinin bulunması gerekmektedir ( McCuistion ve Wehner, 2005). Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçıları tarafından en yaygın kullanılan kimyasal maddelerden biri kolhisindir. Bu madde güz çiğdeminin (Colchicum automnale L.) köklerinden elde edilen alkoloid yapısında kuvvetli bir zehir olup; renksiz, alkol, kloroform ve soğuk suda eriyen; sıcak suda ve eterde erimeyen bir maddedir. Kimyasal formülü C 22 H 25 O 6 olarak gösterilir. Kolhisin, uygulandığı dokuların hücrelerinde mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunu engeller ve dolayısı ile replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önleyerek, kromozom sayısının iki katına çıkmasını sağlar (Köksal, 1999). Türkiye, karpuz üretiminde Çin den sonra dünyada üretim bakımından ikinci sırada yer almasına ve karpuzun ikincil gen merkezlerinden biri olmasına rağmen, çekirdeksiz karpuz tohum üretimi bulunmamaktadır. İsrail, ABD ve İspanya gibi ülkelerde çekirdeksiz karpuz tohumluk üretimi yapılmaktadır. Çin, Avusturalya, ABD ve İsrail gibi ülkelerde toplam ekili karpuz alanlarının çoğunluğu çekirdeksiz karpuz olarak yetiştirilmektedir. Ülkemizde bazı ticari firmalarca çekirdeksiz karpuz çeşitleri piyasaya sunulmakta, fakat tohum fiyatının yüksekliği ve çıkış düzensizlikleri sebebiyle üretici tarafından fazla ilgi görmemektedir. Sadece ihracata yönelik bazı firmaların yapmış oldukları üretimler bulunmaktadır. Planlanan bu araştırma ile -ileride yerli çekirdeksiz karpuz çeşitleri geliştirme hedefiyle çekirdeksiz karpuz üretiminin ilk ve en önemli aşaması olan tetraploid ana ebeveyn geliştirilmesi için farklı in vivo ve in vitro yöntemler araştırılmış ve en etkili protokol belirlenmeye çalışılmıştır. 4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dr. Kihara tarafından çekirdeksiz karpuz çalışmalarına 1939 yılında başlanmış ve 1951 yılında ilk çalışma yayınlanmıştır. Daha sonra konuyla ilgili çalışmalar değişik ülkelerde devam etmiştir. Çekirdeksiz karpuz elde edilmesinin ana materyali tetraploid hat elde etmektir. Bu amaca ulaşmak için çalışmalar in vivo ya da in vitro koşullarda yürütülebilir. 2.1. In Vivo Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları Lower ve Johnson (1969), tetraploid karpuz hatları elde edebilmek için fidelerin büyüme noktalarına % 0.3 lük kolhisin uygulamasını 24 saat içinde 2 damla, 52 saat içinde 8 damla, 80 saat içinde 8 damla veya ekimden önce tohumları 6-24 saat (6 saat aralıklarla) % 0.1-% 0.2 kolhisin çözeltisine bandırmak suretiyle bir çalışma yürütmüşlerdir. Çalışmada, Charleston Gray 133 ve Princeton çeşitleri kullanılmış, araştırma sonucunda Princeton çeşidinin tetraploidiye Charleston Gray 133 e göre daha iyi yanıt verdiği tespit edilmiştir. Araştırıcılar, Princeton çeşidinde 8 damla kolhisin uygulamasının (52 ve 80 saatte) % 6 oranında tetraploid uyartımı sağladığı; C. Gray çeşidinde bu oranın % 4 düzeyinde bulunduğunu bildirmişlerdir. İki damla (24 saat) kolhisin uygulamasının C. Gray çeşidinde hiç yanıt vermediğini; Princeton çeşidinde ise % 3 düzeyinde tetraploidi oluşturduğu saptanmıştır. Tohumların 24 saat % 0.1 lik veya 18 saat % 0.2 lik kolhisin çözeltisinde bekletilmesinin % 0-20 oranlarında tetraploidi oluşturduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar tohum daldırma yönteminin, büyüme ucuna damlatma yöntemine göre daha etkili olduğunu belirtmişlerdir. Sugar Baby karpuz çeşidine kotiledon aşamasındayken kolhisin uygulaması ile Karchi ve ark. (1981), tetraploid "Alena" çeşidini geliştirmişlerdir. Araştırıcılar, Alena karpuz çeşidinin açık tozlanan, üstün kalitede, yoğun kültür şartlarına adapte olan özellikte olduğunu bildirmişlerdir. Sugar Baby e göre bu çeşidin yapraklarının daha geniş ve kalın, çiçeklerinin daha geniş, taç yapraklarının dip kısımlarının renkli, tohumlarının daha iri, meyve ağırlığının ortalama 4 kg ve meyve başına yaklaşık 70 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN tohum içerdiği, ayrıca meyve etinin koyu kırmızı, sert ve şeker oranının % 12.5 un üzerinde olduğu, kabuk renginin siyah-yeşil ve olgunlaşmanın "Sugar Baby" e göre 7-10 gün daha sonra olduğu tespit edilmiştir. Li ve ark. (2002), sarı meyve kabuğuna sahip 2608 (YPW) numaralı karpuz hattında tetraploid bitki elde etmek için kolhisin uygulamasının etkisini araştırmışlardır. Örtü altı koşullarında şubat ayında ekilen tohumlardan gelişen fidelere % 0.2 dozunda kolhisin, 1-2 gerçek yapraklı aşamada uygulanmıştır. Kolhisinin organlarda yaptığı mutasyon ve fizyolojik değişimlerin incelendiği araştırmada; morfolojik, mikroskopik ve hibridizasyon etkisi farklı ploidi belirleme metodları ile çalışılmıştır. Araştırma sonucunda tetraploidi oranı % 12.4 olarak saptanmış, tetraploidlerin diploidlerle melezlenmesi ile triploid bitkiler geliştirilmiştir. Koh (2002), yaptığı çalışmada tetraploid karpuz üretim metodları geliştirmeyi amaçladığını ve bu amaçla, antimitotik etmenler olan kolhisin (% 0.05, 0.10, 0.20 ve 0.50) ve oryzalini (5, 15, 30 ve 60 μm) genç fidelere uyguladığını bildirmiştir. Araştırmada, erken gelişme dönemlerinde eklenen değişik antimitotik etmenlerin, tetraploidleşme düzeyi üzerine etkileri ve diploid-tetraploid arasındaki farklılıklar araştırılmıştır. Genç fidelere 48 saat boyunca % 0.2 lik kolhisin ve 60 μm oryzalin uygulandığında, bitkilerin % 50 sinden fazlasında sürgün gelişiminin zayıfladığını, bitkilerin tetraploid olma düzeyinin fidelere 12-24 saat süreyle % 0.2 lik kolhisin uygulamasının, 24 saat 5-30 μm oryzalin uygulaması kadar yüksek olduğunu bildirmiştir. Diploid ve tetraploid bitkiler karşılaştırıldığında; bekçi hücrelerdeki kloroplast miktarı, anter şekli, erkek çiçekteki polen miktarı ve yaprak şekilleri arasında farklılıklar olduğu belirlenmiştir. Flow sitometri sonucu elde edilen analiz sonuçları birçok tetraploid bitkinin miksoploid olduğunu göstermiştir. Tetraploid bitkilerde her bir meyve başına düşen tohum miktarının diploidlere göre yaklaşık 1/10 u kadar daha az olduğunu ve bir çoğunun da boş embriyo oluşturduğunu bildirmiştir. Yetişir ve Sarı (2003), 9 farklı kavun geriye melezinden ışınlanmış polen tekniği ile geliştirilmiş haploidlerin dihaploidizasyon oranını yükseltmek için, in vivo sürgün ucu daldırma yöntemini denemişlerdir. Araştırma sonucunda haploid 6

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN kavunların dihaploid hale getirilmesi için in vivo sürgün ucu daldırma yöntemiyle kavunda % 90 ın üzerinde katlanma meydana geldiği tespit edilmiştir. Jaskani ve ark. (2004a), yaptıkları çalışmada diploid karpuz hatlarına kolhisin uygulayarak tetraploid hatları geliştirdiklerini bildirmişlerdir. Araştırıcılar 10 karpuz hattına ait fidelerin gerçek yapraklarına 3 gün boyunca günde 2 defa olmak üzere % 0.2, % 0.4 ve % 0.6 dozlarında kolhisin uygulaması yapmışlardır. Çalışma sonunda hatların kolhisin dozlarına farklı tepkiler verdiği bulunmuş, buna göre en yüksek ölüm oranının % 0.6 konsantrasyonda uygulanmış olan kolhisin miktarında olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar kolhisin uygulanmış fidelerin tetraploid olup olmadığını belirlemek için kloroplast sayısına, DNA içeriğine ve bitkilerin morfolojisine bakıldığını belirtmişlerdir. Stomadaki herbir bekçi hücresinin kloroplast sayısının diploid bitkilerde 5-7, tetraploid bitkilerde 10-12 olarak bulunduğunu bildirmişlerdir. Poliploidi miktarının % 0.2 lik kolhisin uygulamasında fazla bulunduğunu, bununla birlikte farklı hatlarda % 3.3 - % 5.5 arasında tetraploidi görüldüğünü bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerin, diploid bitkilere göre yapraklarının daha geniş ve erkek çiçeklerinin daha büyük olduğu bildirilmiştir. Polen morfolojisine bakıldığında diploid bitkilerde 3, tetraploidlerde 4 polen kolpisi (çimlenme pilesi) tespit edilmiştir. Zhang ve ark. (2005), Wuzihuangyu nın, M863 in T948 ile melezlenmesi ile geliştirilmiş yeni çekirdeksiz sarı-etli karpuz çeşidi olduğunu bildirmişlerdir. Ana ebeveyn olarak kullanılan M863 ün kolhisin ile katlanarak tetraploid olarak elde edildiği ve diploid T948 hattı ile tozlandığı bildirilmiştir. Geliştirilen F 1 hibrit çekirdeksiz karpuzda olgunlaşmanın ve meyve gelişiminin erken (28-30 gün) olduğu, tüm vejetasyon süresinin 85-90 gün olduğu, bitkilerin güçlü gelişim gösterdikleri ve meyve tutumunun iyi olduğu tespit edilmiştir. Kolhisin uygulaması ile geliştirilen tetraploid ebeveynle melezleme neticesinde oluşturulan bu çekirdeksiz hibritte; ortalama meyve ağırlığı 2.0-2.5 kg ve meyve şekli yuvarlak, ortalama sera verimi 5.25 ton/da ve ortalama tarla verimi 4.5 ton/da olarak belirlenmiştir. Araştırmacılar, Wuzihuangyu nın sarı meyve etli, gevrek sulu, az lifli içeriğe sahip olduğunu ve şeker içeriğinin kabuğa yakın kısımlarda az fark göstermekle beraber, aşağı yukarı % 12-13 olduğunu bildirmişlerdir. Bitkinin Fusarium solgunluğu, hastalıklar ve 7

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN antraknoza kontrol bitkilerine göre daha dayanıklı olduğunu ve bu çeşidin Çin in Auhui, Jiangsu, Shanghai ve Zhejiang bölgelerinde yetiştiriciliğe uygun olduğunu belirtmişlerdir. 2.2. In Vitro Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları Song ve ark. (1988); karpuzda triploid tohumlardan in vitro koşullarda ürettikleri fidelerden aldıkları kotiledon parçalarından geliştirilen tomurcukları, 2 mg/l BA eklenmiş MS ortamında kültüre almışlardır. Köklendirme ortamı olarak IBA içeren ¼ MS ortamının kullanıldığı çalışmada bitki in vivo koşullara aktarılmış, daha sonra aşılanmış ve tarla koşullarına dikilmiştir. In vivo koşullarda aşılanmış ve in vitro koşullarda geliştirilmiş triploid bitkilerin arazi koşullarında iyi geliştiği, yüksek şeker içeriği ile C vitamini içeriğine sahip, iyi kalitede meyve verdiği tespit edilmiştir. Helmle-Janosi ve ark. (1992), Citrullus lanatus cv. Erwyn F 1 de yaptıkları bir çalışmada, eksplant büyüklüğünün hızlı çoğaltımı etkilediğini tespit etmişlerdir. 0.5 cm den daha büyük eksplantların 0.1 mg/l NAA ve 1 mg/l BA eklenen MS ortamında en yüksek hızlı çoğaltım oranını verdiğini belirtmişlerdir. Kallus oluşumu 0.5 cm den küçük eksplantlarda daha fazla olmuştur. Büyüme düzenleyicilerden yoksun ½ oranında MS ortamında rejenerasyonda başarı elde edildiği araştırıcılar tarafından tespit edilmiştir. Compton ve ark. (1993b), aseptik koşullarda çimlenen karpuz fidelerinden alınan 21 günlük sürgün uçlarını, 8 hafta süresince BA, kinetin (0, 1, 5 veya 10 μm) ve thidiazuron (TDZ; 0, 0.1, 1 ya da 5 μm) içeren katı MS ortamında inkübe etmişlerdir. Araştırmada, optimum BA seviyesi (1 μm) içeren ortamlar, TDZ nin en iyi (0.1 μm) ve kinetinin 10 μm konsantrasyonuyla karşılaştırılmıştır. BA içeren ortamlarda yaklaşık 1.5-2.8 kat daha fazla aksiller sürgünlerin oluşumu gözlenmiştir. Çeşitli diploid ve tetraploid genotiplerin 1 μm BA içeren ortamda aksiller sürgünlerinin uzun süreli hızlı çoğaltma yeteneklerinin gözlendiği çalışmada, genotiplere göre aksiler sürgün sayısı açısından, Bush Jubilee ve Jubilee ΙΙ nin, Minilee, Dixielee ve tetraploid genotiplere göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir. 8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN Genotiplerin çoğunluğunda kültüre alındığı ilk dönemlerde, eksplant başına sürgün sayısının düşük olduğu (2.7-4.0), 2-3 ayda (5.3-12.5) en üst noktaya ulaştığı ve 6 ayda (3.7-7.7) ye düştüğü bildirilmiştir. Bunun tam tersi ise "Bush Jubilee" genotipinde eksplant başına sürgün sayısının, kültürün 1. ayında en yüksek değerde (11.7) olduğu, 6. alt kültürde ise 7.7 ye düştüğü ifade edilmiştir. Köklenen sürgünlerin oranının genotip ve kültür süresine bağlı olarak % 60 ile % 100 arasında olduğunu, dış koşullara alıştırılmış bitkilerin oranının ise % 21 - % 96 arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Bu prosedüre göre 250 fide kullanılarak 3 ayda 13200 bitki üretildiğini bildirmişlerdir. Compton ve Gray (1994a), yaptıkları çalışmada 4 karpuz hattında (F92U8, SP90-1, SP90-2, SP90-4) 2, 4, 6, 8, 10 günlük çimlenme (1 litresinde MS + 20 g şeker + 100 mg myo-inositol + 2 mg glycine + 0.5 mg pyridoxine HCl + 0.5 mg nicotinic asit + 0.1 mg thiamine HCl + 7 gram agar olan ortam içerisine tohum ekimi yapılmış) sürelerinden sonra aldıkları kotiledon eksplantlarını, 8 hafta rejenerasyon ortamında tuttuktan sonra gelişen sürgünleri 4 hafta sürgün geliştirme ortamında kültüre almışlardır. Burada rejenerasyon ortamı için MS + 30 gram şeker + 10 μm N- (phenylmethyl)-1 H purin-6 amine (BA), sürgün geliştirme ortamı için MS + 20 gram şeker kullanıldığını belirtmişlerdir. Bu çalışma sonunda elde edilen bulgularda en yüksek sürgün miktarı 2 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından ve F92U8 (% 66) ve SP90-2 (% 60) hatlarından elde edilmiştir. 4 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen SP90-4 genotipinde % 40 oranında sürgün bulunduğu bildirilmiştir. Araştırmacıların yaptıkları bu çalışmada 2 ve 4 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen sonuçlarda sürgün miktarının daha çok bulunduğu kaydedilmiştir. Compton ve ark. (1994b), diploid karpuz çeşidi Mickylee kotiledonlarının 6 hafta sürgün rejenerasyon ortamına alınması ile adventif sürgün elde edildiğini bildirmişlerdir. 1-2 cm lik sürgün uçlarının 1 μm IBA lı ortama transfer edilmesi ile bitkilerin elde edildiğini belirtmişlerdir. Rejenerasyon yolu ile elde edilmiş tetraploid ve diploid bitkileri, yapraklarındaki bekçi hücrelerinde bulunan kloroplast miktarı ile tanımlamışlardır. Her bitkide en az 30 bekçi hücresi çifti sayılarak yürütülen araştırmada, diploid bitkilerde ortalama 11.2, tetraploid rejenerantlarda 18.6 9

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN kloroplast sayılmıştır. Kendileme yapılan tetraploidlerde tohum elde edilmiş ve elde edilen bireylerin triploid hibrit üretimi için diploid tozlayıcılar ile melezlendiğini bildirmişlerdir. In vitro tetraploid bitki oluşumunun, triploid hibrit tohum üretiminde kullanılmak üzere yüksek kalitede tetraploid bitki üretimi için kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Tang ve ark. (1994), triploid karpuzları in vitro da çimlendirerek elde ettikleri kotiledon yapraklarından gelişen tomurcuk eksplantlarını 16 farklı ortam içerisinde kültüre almışlardır. Araştırmacılar MS ortamı içerisine 3 mg/l BA ilave edildiğinde yüksek rejenerasyon sağlandığını (% 93.33) ve çoğalma katsayısının da 8.71 olduğunu bulmuşlardır. Bu bitkileri, farklı BA ve IAA kombinasyonları içeren 9 değiştirilmiş MS ortamına alan araştırmacılar, 2 mg/l BA ve 1 mg/l IAA içeren MS ortamının iyi sonuç verdiğini ve ilk 20 generasyonda 5, 10 generasyonda ise 8 ortalama çoğalma katsayısı verdiğini bildirmişlerdir. Böylece, 6 ayda sekiz generasyon (80.000-100.000) üretilmiştir. Bu bitkilerin, Lagenaria siceraria var. clavata anacına aşılanmadan önce MS ortamına 2 mg/l BA + 1 mg/l IAA+2 mg/l GA 3 (gibberellik asit) eklenmesiyle geliştirildiğini belirtmişlerdir. Aşılanan bitkilerin % 90 ından fazlasının yaşadığı ve % 95 inden fazlasının da toprağa aktarıldıktan sonra yaşadığı gözlenmiştir. Compton ve ark. (1996), Dixielee, Jubilee II, Mickylee, Minilee ve Royal Sweet karpuz çeşitlerinin kotiledon eksplantlarının kullanımı ile 6 haftalık sürgün rejenerasyon ortamında adventif sürgünlerin elde edildiğini bildirmişlerdir. Araştırmada, rejenerasyon sonucunda elde edilen bitkilerin ploidi düzeyleri bekçi hücrelerindeki kloroplast miktarı sayılarak belirlenmiştir. Tetraploid rejenerasyonlarda kloroplast sayısının 19.1, diploidlerde 11.2 olduğu ve tetraploid olduğu belirlenen bitkilerin diploid tozlayıcı ile melezlenerek triploid tohum üretim etkisinin saptandığı bildirilmiştir. Rejenerasyon sonucu tetraploid sürgün elde etme oranı çeşitler arasında önemli bir farklılık göstermemekle birlikte, % 5-20 arasında değişmiş, Mickylee çeşidinden elde edilen tetraploid bitkiler kendilenmiş ve tohum oluşturmuşlardır. Araştırıcılar, bu çalışma ile doku kültürü yöntemiyle etkili fertil ve kimerik olmayan tetraploid bitkilerin elde edildiğini ve bu bitkilerin triploid hibrit ıslahında 10

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN yüksek kalitede kullanılabilecek materyal olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca kloroplast yoğunluğu, yumurtalık çapı, erkek çiçeklerin taç yaprak genişliği, anter çapı ve yaprak boy/genişlik oranlarının bitki ploidi belirlemede iyi göstergeler olduğunu bildirmişlerdir. Sarı ve Abak (1996), karpuzda yaptıkları çalışmada elde ettikleri haploid bitkileri katlamak için in vitro koşullarda farklı kolhisin dozları (% 0.5 ve % 1) ile dört farklı uygulama süresini (1, 2, 4 ve 6 saat) denemişlerdir. Uygulama, Sugar Baby, Halep Karası ve Crimson Sweet çeşitlerinin 3-4 haftalık in vitro haploid mikroçeliklerine yapılmıştır. Haploid bitkilerden dihaploid bitkilerin elde edilmesi için in vitro mikroçeliklerin % 0.5 lik kolhisin çözeltisinde 4 saat tutulması ile % 1 lik kolhisin çözeltisinde 2 saat tutulmasının en uygun yöntem olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar % 0.5 yoğunlukta kolhisin uygulanan bitkilerin % 64 ünün yaşadığını ve % 56 sının gelişerek yeni bir bitkiye dönüştüğünü bildirmişlerdir. % 1 kolhisin dozunda yaşama ve gelişme oranlarının % 40 olduğu belirtilmiş, kolhisin uygulama süreleri arasında 6 saat uygulamasının en fazla bitki ölümüne neden olduğu, düşük doz ve kısa sürelerde ise bitkilerin haploid kaldığı belirtilmiştir. Li ve ark. (1999), in vitro kromozom katlaması üzerine kolhisin, dinitroanilines ethalfluralin ve oryzalinin etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar, karpuzdan izole edilen tek tomurcukları sıvı MS ile % 3 şeker ve 10 μm BA içeren farklı kolhisin (100, 500, 1000 veya 1500 μm), dinitroaniline (5, 10, 50 veya 100 μm) ortamlarında kültüre almışlardır. Kültüre alınan bütün ortamlar karanlık koşullarda 3, 6 veya 9 gün çalkalayıcıda 100 rpm hızda çalkalanmışlardır. Uygulama görmüş tomurcuklar kolhisin ve dinitroaniline içermeyen fakat % 0.7 agar içeren aynı ortama tekrar transfer edilmişlerdir. Araştırıcılar, uygulama yapılan tüm sürgünlerin kromozom katlaması uygulamasında yaşadığını, fakat yaprak uçlarında küçük bazı kararmalar gözlendiğini belirtmişlerdir. Oryzaline yerine 9 gün 10 μm dinitroaniline kullanılmasının % 50 tetraploid bitki elde edilmesine neden olduğu ve kolhisin kullanımı ile birlikte, uygulamanın 30 gün daha etkili olarak ortaya çıktığı bildirilmiştir. Compton (2000), karpuz kotiledonlarının organogenik yetenekleri üzerine eksplant büyüklüğü ile çeşit etkilerini araştırdığı bir diğer çalışmada; kotiledonların 11

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN proksimal bölgelerinden hazırlanan eksplantlarda yaklaşık % 52 oranında organogenesis tespit edilirken, bu oranın kotiledonun distal bölgelerinde sadece % 6 oranında kaldığını saptamışlardır. Araştırıcılar, sürgün oluşumunun basal eksplantlar tarafından sınırlandırıldığını, fakat distal bölgelerde hiçbir spesifik bölgenin sürgün oluşumunu sınırlandırmadığını bildirmişlerdir. Sürgün oluşturan eksplant yüzdesinin Sweet Gem, Crimson Sweet ve Minilee de yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Eksplant büyüklüğünün Yellow Doll da adventif sürgün rejenerasyonunu etkilemediğini saptamışlardır. Bunun da çeşit ve eksplant büyüklüğü arasında önemli bir bağlantı olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar bu çalışma ile çeşitlerin çok azının in vitro prosedürlere yanıt verdiği ve sürgün rejenerasyonu için çok az miktarda etkili hücreye sahip olduğunu saptamışlardır. Guo ve ark. (2000), yaptıkları çalışmada in vitro kültürde eksplant kaynağı olarak 5 farklı diploid karpuz çeşidinde kotiledon kullandıklarını bildirmişlerdir. Adventif sürgün ayırt edilmesinde eksplantların sürgün oluşturma oranı çoğalma katsayısı, sürgün anormallik yüzdesi ve tetraploid çeşitlerde eksplantın alındığı yer ve ortam içeriğindeki hormon konsantrasyonunu etkilediğini belirtmişlerdir. Tetraploid bitkilerin, sürgünlerin apikal hücrelerindeki kromozom sayısının incelenmesi ile kolayca tespit edildiğini bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerin diploid bitkilere göre kültür ortamında besi stresine karşı adaptasyonunun daha iyi olduğunu yaptıkları çalışmada bildirmişlerdir. Çürük ve ark. (2003), kavunda transgenik bitki elde edilmesine yönelik yaptıkları bir çalışmada; Revigal, Topmark ve Kırkağaç kavun çeşitleri ile C. sativus. Lcv.Taoz hıyar çeşidinin hipokotil eksplantlarını kullanmışlardır. Araştırmada, 4.4 µm BA içeren MS ortamında hızlı ve direkt rejenere olan çoklu sürgün oluştuğunu gözlemişlerdir. Hipokotillerin rejenerasyonundan yaklaşık % 100 diploid sürgünler elde edilirken, kotiledon eksplantlarından oluşan rejenerasyonda % 40 dan % 70 e kadar değişen oranlarda poliploid bitki oluşumu saptanmıştır. Revigal kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının rejenerasyon için ışığa ihtiyaç duyduğu, bununla birlikte hipokotil eksplantlarının hem karanlık hem de aydınlıkta rejenerasyona uğradığını gözlemişlerdir. 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN Yalçın Mendi ve ark. (2003), Crimson Sweet karpuz çeşidinde yaptıkları çalışmada steril edilmiş tohumların MS ortamında çimlendirildiğini ve 5 günlük tohum kotiledonlarından alınmış eksplantların benzyl adenine (BA) (0, 5, 10, 20 μm) ve indole-3-acetic acid (IAA) (0, 0.5, 5 μm) kombinasyonları içeren MS rejenerasyon ortamında kültüre alındığını belirtmişlerdir. Araştırma sonucunda maksimum sürgün gelişimi, 10 μm BA + 0.5 μm IAA ve 20 μm BA (% 75 ve % 78) içeren rejenerasyon ortamında direkt organogenesis yoluyla oluşmuştur. Jaskani ve ark. (2004d), ploidi değişimini (özellikle tetraploid elde edilmesi için) teşvik etmek için karpuzlara in vitro kültürde antimitotik etmen olan kolhisin ile uygulama yapmışlardır. Araştırmada yöntem olarak; kotiledon eksplantı, tohumun embriyogenik ucu, epikotil ve hipokotil in enine kesitlerinin BA (1μM) ve kolhisin (% 0.01, % 0.05 ve % 0.1) içeren MS ortamında kültüre alınması seçilmiştir. 4-7 gün sonra eksplantlar kolhisinsiz ortamda kültüre alınmıştır. Araştırma sonucunda; kolhisinin in vitro rejenerasyona negatif etkisinin olduğu belirtilmiş, bununla birlikte, fidelerin hipokotil kısımlarının % 0.01 kolhisin içerisinde maksimum kallus oluşturduğu tespit edilmiştir. Kotiledon eksplantlarının % 0.01 konsantrasyonundaki kolhisinde 4 gün kültüre alınanlardan daha fazla ve hızlı sürgün oluşturduğu belirlenmiştir. Maksimum kök oluşumu ve kök sayısı embriyogenik eksplantlarda gözlenmiştir. Sonuçta, karpuz rejenerasyonunda eksplantların kotiledon ve embriyogenik uçları düşük kolhisin konsantrasyonunda (% 0.01) optimum olarak tespit edilmiştir. Krug ve ark. (2005), Citrullus lanatus da kültür ortamı içerisine sitokinin eklenmesi ile kotiledon parçalarından in vitro organogenesis yolu ile sürgün ucu elde edilmesini amaçladıkları bir çalışmada, eksplant olarak 1, 3 ve 5 günlük çimlenen tohumlardan distal ve proksimal kotiledon bölgelerini kullanmışlardır. Araştırma sonucunda in vitro organogenesisin karpuzda yüksek bulunduğu, üç günlük çimlenen tohumlardan alınan kotiledonların proksimal bölgelerini MS ortamı içerisine aldıklarını, bu ortam içerisine BAP (1 mg/l) ve hindistan cevizi suyu (% 10) eklediklerini belirtmişlerdir. Bu çalışmada, karpuzda organogenesisin, kallus oluşturmaksızın, eksplantın epidermal ve subepidermal katmanlarından meydana geldiği tespit edilmiştir. Ayrıca adventif sürgünlerin, sürgün ucu meristemleri ve 13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN yaprak primordiasının gelişmesiyle karakterize olduğu ve şişkinlik oluşumlarında adventif gözlerin gelişmediği gözlenmiştir. 2.3. Triploid Bitkiler ve Ploidi Belirleme Çalışmaları Gonzalez ve Ayuso (1991), triploid karpuz ıslahında meydana gelen son gelişmeler ışığında; geçmişte ticari karpuz yetiştiriciliğinde karşılaşılan ve istenmeyen; düzensiz meyve şekli, yüksek tohum fiyatı ve elverişsiz yetiştirme tekniği gibi bazı olumsuzlukların günümüzde bertaraf edildiğini bildirmişlerdir. Sarı ve ark. (1999b), karpuzda ploidi düzeyi belirlemede kromozom sayımı, flow sitometri, stoma boyu, bekçi hücrelerindeki kloroplast sayısı ve morfolojik gözlemlerin Sugar Baby ve Halep Karası çeşitlerine ait haploid ve dihaploid bitkilerinde karşılaştırmasını yapmışlardır. Sonuç olarak tüm yöntemlerin karpuzda haploid bitkilerin dihaploid bitkilerle ayrımında başarıyla kullanılabileceği belirtilmiştir. Kromozom sayımları ve morfolojik gözlemlerin uzun zaman alması, flow sitometri için pahalı bir cihaza gerek duyulması, diğer taraftan stoma ölçümlerinin ve kloroplast sayımlarının pratik bir alternatif yöntem olduğu bildirilmiştir. Yapılan incelemelerde; diploid bitkilerde stoma uzunluğunun 23-24 μm, stoma çapının 18 μm ve kloroplast sayısının 11-12 adet/stoma olduğu, haploid bitkilerin ise 17-18 μm stoma uzunluğuna, 10-12 μm stoma çapına ve 6-7 adet/stoma kloroplast sayısına sahip oldukları tespit edilmiştir. Sitometri yöntemine ait bulguların kromozom sayımları ile tam bir uyum gösterdiği bildirilmiştir Rhodes ve Zhang (1999), kontrollü tozlanmanın hibrit karpuz tohumu üretiminde temel rol aldığını ve erkek kısırlığının kullanımının çok büyük çaba gerektirdiğini bildirmişlerdir. Başarılı tohum üretiminin, iyi kültür koşulları ve zamanında hasat yapılmasına bağlı olduğunu, triploid tohum üretim miktarının, diploid hibrit tohum üretim miktarından çok olduğunu bildirmişlerdir. Tetraploid ebeveynlerin gelişiminin, kolhisin dışındaki kromozom katlayıcı etmenler ve doku kültürü kullanımı ile daha çok arttığını belirtmişlerdir. Triploid hibritlerin, dişi ebeveynden gelen iki kromozom ve bir tane de baba ebeveynden gelen kromozom ile tüketiciye daha fazla sayıda çeşit sunabildiği gibi hastalıklara dayanıklılık gibi yeni 14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN stratejiler de sunabildiğini belirtmişlerdir. Yeni triploidler, yeni bir hastalık sorunu karşısında hızlı bir şekilde çeşit geliştirmeye olanak sağladığı için pazar isteklerinin karşılanmasını sağlayabilirler. Liu ve Wang (2002), karpuz (Citrullus lanatus) ve kavun (Cucumis melo) un haploid ve poliploid (triploid ve tetraploid) lerinin geliştirilmesi için yapılan ıslah sürecinin kromozomal durumunu araştırmışlardır. Haploid bitkilerin geliştirilmesini kapsayan tekniklerde, haploidlerde kromozom katlaması, tetraploid bitkilerin regenerasyonuna in vitro ve in vivo etkenleri ve kavunda triploid ıslahı ve farklı ploidi seviyelerini araştırmışlardır. Jaskani ve ark. (2004b), çimlenme döneminde kolhisin uygulanmış tetraploid karpuz bitkilerinin DNA içeriklerinin belirlenmesinde kullanılan flow sitometrik analiz yöntemini, diğer ploidi belirleme metodları (bekçi hücrelerindeki kloroplast sayımı, kromozom sayımı, yaprak büyüklüğü, çiçek büyüklüğü, polen kolpi sayısı ve tohum özellikleri) ile karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar flow sitometrik analiz yönteminin, tetraploid bitkilerde kloroplast miktarının belirlenmesinden daha hızlı bir yöntem olduğunu bildirmişlerdir. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarının her bir hücrede diploid karpuzlarda 5-7, tetraploidlerde 10-12 olduğu bildirilmiş, kromozom sayım metodunun yorucu, fakat diğer metotlar gibi uygulanabilir olduğunu, bununla birlikte bu metodun tetraploidi belirlemede fazla yere ve zamana ihtiyaç duyacağı belirtilmiştir. Tetraploid bitkilerde, yaprak genişliğinin, çiçek büyüklüğünün ve polen kolpi sayısının da ayırt edici kriterler olduğu, bunun tohumların büyüklüğü, tohum kabuğunun kalınlığı ve dolgunluğunun da tetraploid bitkilerin diploidlerden ayrılabilmesi için önemli kriter olduğu bildirilmiştir. Jaskani ve ark. (2004c), triploid karpuz üretim programında, tetraploid karpuzların üretim hattı olarak kullanıldığını bildirmişlerdir. Araştırmada, kolhisin uygulaması ile elde edilmiş tetraploid bireyler, diploidlerle meyve karakteri, tohum morfolojisi ve çimlenme açısından karşılaştırılmışlardır. Araştırmacılar, tetraploidlerin, diploidlere göre kalın meyve kabuğuna sahip olduğunu (17.6 mm), fakat meyve başına düşük sayıda tohum verdiğini, diploid tohumlara göre tetraploid tohumların uzunluğunun (9.1 mm), eninin (6.3 mm) ve kalınlığının (2.8 mm) arttığını belirtmişlerdir. Tetraploid meyvelerin tohum kabuğunun uzunlamasına eksen 15

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN boyunca çatlak olduğunu gözlemişlerdir. Diploid tohumlar neredeyse tamamen dolu iken, tetraploid tohumların diploidlere göre boş, zayıf embriyolu ve düşük çimlenme özelliği gösterdiği tespit edilmiştir. Farklı tohum çimlendirme uygulamalarında, kabuk atıp tohum verme ve tohumun çimlenme değerlerini sırayla (% 84.3 ve % 77.1) bulmuşlardır. Tetraploid tohumların kotiledonlarının kalın ve tohum kabuğuna bağlı olmasından dolayı, tohumların 90º açı ile radisil bitim noktasının yukarı doğru olarak ekilmesinin zorunlu olduğu bildirilmiştir. Tetraploid bitkilerin kotiledon ve yapraklarının diploidlere göre daha hacimli (kalın) olduğu gözlenmiştir. Jaskani ve ark. (2005a), yaptıkları çalışmada fide döneminde kolhisin uygulanmış bitkilerde tetraploid elde edilip edilmediğini flow sitometrik analiz yöntemi ile aydınlatmaya çalışmışlar ve bu yöntemi, bekçi hücrelerindeki kloroplast miktarı, yaprak alanı, çiçek boyutu, polen kolpi sayısı ve tohum özellikleri ile karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar flow sitometri analiz yönteminin, tetraploid bitkilerin tespit edilmesinde kromozom sayım metoduna göre daha hızlı ve elverişli olduğunu belirtmişlerdir. DNA indekslerinin ve kloroplast miktarlarının da bunu doğrular nitelikte olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar, bekçi hücrelerindeki kloroplast miktarının diploid bitkilerde 5-7 arasında, tetraploid bitkilerde 10-12 arasında olduğunu, fakat kimeralı bitkilerde kloroplast miktarı ile ploidi düzeyini ayırt etmenin imkansız olduğunu belirtmişlerdir. Kromozom sayım metodu ile tetraploid bitki tanımlamasının diğer metotlara göre daha fazla zaman istediğini bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerde büyük yaprak alanı, büyük çiçek boyutu ve 4 polen kolpisinin olduğunu, diploid bitkilerde ise 3 polen kolpisi gözlendiğini bildirmişlerdir. Tetraploid tohumlar diploid tohumlar ile karşılaştırıldığında, geniş ebatlı, sert kabuklu ve kısmen dolu hacimli olup, beklenenden düşük kotiledonlara sahip olduğunu belirtilmiştir. Jaskani ve ark. (2005b), yaptıkları çalışmada kolhisin uygulaması ile tetraploid elde edilen yedi diploid karpuz hattını çiçek, meyve ve tohum özellikleri bakımından karşılaştırmışlardır. Tetraploid genotiplerden elde edilen istatiksel verilerde yaprak kalınlığı (8.04 mm), yaprak alanı (298.9 cm 2 ) ve klorofil içeriğinin (55.6) yüksek olduğunu; bununla beraber boğum arası uzunluk ve klorofil ışınımının diploidlerle benzer olduğunu bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerde dişi ve erkek 16

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN çiçeklerdeki organların (çiçek sapı, anter, yumurtalık, stigma, taç yaprak) diploidlere göre büyük olduğunu; bununla birlikte, tetraploid hatlarda çiçek içeriklerinin diploid hatlar karşısında değiştiğini tespit etmişlerdir. Meyve ağırlığı ve toplam şeker içeriğinin diploid ve tetraploid meyvelerde birbirine benzer olduğunu bildirmişlerdir. Diploid ve tetraploid meyvelerde, meyve kabuk kalınlığının 12.7 ve 17.2 mm arasında önemli bir fark gösterdiğini, tetraploid genotiplerin kısırlık gösterdiğini, tarlada tohumun meyveye dönüşme düzeyinin düşük ve tetraploid tohumların diploid tohumlara göre daha kalın ve büyük olduğunu belirtmişlerdir. Genelde tetraploid meyvelerde beta-caroten, lycopene, fructose (% 5.43) ve glucose (% 2.38) içeriğinin, diploid meyvelere göre daha yüksek olduğu bildirilmiştir. 17

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3. MATERYAL VE METOT Çalışma 2005 ve 2006 yıllarında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ile Toros Tarım A.Ş ye ait Toros Agripark Biyoteknoloji laboratuvarı ve seralarında yürütülmüştür. Çalışmada çekirdeksiz karpuz elde edilmesinin ana materyali olan tetraploid hat elde etmek için, iki in vivo ve iki in vitro yöntem karşılaştırılmıştır. Karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai) da in vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi amacıyla araştırma kapsamında yürütülen çalışmalar 4 farklı denemeden oluşmaktadır. Bu denemeler; In vivo kolhisin uygulamasıyla tetraploid bitki elde edilmesi; Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması Kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması In vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi; Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı In vitro diploid mikro çeliklere kolhisin uygulaması çalışmalarından meydana gelmektedir. In vivo çalışmalarının bir bölümü (2005 denemeleri) Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerinin seralarında, bir bölümü ise (2006 denemeleri) Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü seralarında gerçekleştirilmiştir. In vitro çalışmaları Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerindeki Biyoteknoloji laboratuvarı ve alıştırma seralarında gerçekleştirilmiştir. Her 4 denemenin de sitolojik incelemeleri Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü sitoloji laboratuvarında yapılırken, flow sitometri yöntemi ile ploidi düzeyini belirleme çalışmaları Hollanda da Enza-Zaden tohum firmasına ait laboratuvarda yaptırılmıştır. 3.1. Materyal 18

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Araştırmada bitkisel materyal olarak Toros Tarımsal Üretim ve Pazarlama A.Ş. ye ait olan açık tozlanan Crimson Sweet karpuz çeşidi kullanılmıştır. Crimson Sweet karpuz çeşidi, Türkiye'nin tüm karpuz bölgelerinde yetiştiriciler tarafından tercih edilen, adaptasyon kabiliyeti yüksek, standart bir çeşittir. Kabuğu açık yeşil üzerine koyu yeşil şeritlidir. Üreticiler tarafından "alacalı" veya "pijamalı karpuz" diye de adlandırılır. Meyve şekli yuvarlak ve normal şartlarda 8-10 kg ağırlığındadır. Meyve eti parlak kırmızı, tatlı, gevrek ve lezzetlidir. Orta erkenci ve verimli bir çeşit olup, ekimden hasada kadar geçen gün sayısı ortalama 85 gündür. Meyve kabuğu kalın, çatlamaya ve nakliyeye dayanıklıdır. 3.2. Metot 3.2.1. In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi 3.2.1.1. Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması Denemeler 2005 ve 2006 yıllarında iki kez planlanmıştır. 2005 yılında; 21 Şubat 2005 tarihinde 2:1 oranında torf:perlit karışımı doldurulmuş viyollere tohum ekimleri yapılmıştır. Çimlenmiş olan Crimson Sweet bitkilerinin ilk gerçek yapraklarının çıktığı dönemde, büyüme ucu meristem bölgesine 14 Mart 2005 tarihinde günde 2 defa olmak üzere (08:30 ve 18:00 saatlerinde) üç gün boyunca (Lower ve Johnson, 1969; Jaskani ve ark., 2004a) yedi farklı kolhisin dozu (% 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3, % 0.4, % 0.5, % 0.6) uygulanmıştır. % 0.0 dozunda da günün aynı saatlerinde büyüme uçlarına su damlatılmıştır. Uygulama her doz için 3 tekrarlama ve her tekrarlamada 10 bitki olacak şekilde yapılmıştır. Uygulamadan sonra 1 er hafta arayla üç kez bitkilerde yaşayan bitki sayısı ve farklılığa (yaprakta şekil bozukluğu, renk değişimi vb.) uğramış bitki sayısı gözlemleri yapılmıştır. Bu denemede kullanılan kolhisin Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü nden alınmıştır. Kolhisinin kullanım tarihinin geçmiş olması nedeni ve bitkilerde nekrotik etkiler gözlenmediği için, 21 Şubat 2005 de ekilen deneme iptal edilerek, 01 Nisan 2005 tarihinde aynı deneme için tekrar tohum ekimi yapılmıştır. 17 Nisan 2005 19

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN tarihinde çimlenmiş olan Crimson Sweet tohumlarına aynı şekilde kolhisin uygulaması tekrarlanmıştır. Çalışmalarda Sigma firması tarafından üretilen (C-9754 nolu % 95 lik) toz halde kolhisin (C 22 H 25 O 6 ) kullanılmıştır. 2005 yılında kurulan denemede kolhisin uygulamasından sonra 3-4 gerçek yapraklı aşamaya ulaşan bitkiler Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerindeki seraya 15 Mayıs 2005 tarihinde sıra arası 2 m ve sıra üzeri 0.5 m olacak şekilde dikilmiştir. Seraya dikimleri yapılan bitkilerde, dikimden itibaren 15 gün ara ile bitkilerde boğum sayısı, bitki uzunluğu, kök boğazı gözlem ve ölçümleri yapılmıştır. 2005 yılında kurulan denemede bitkiler askıya alınmamış olup, yerde yayılarak geliştirilmiştir. 2006 yılı denemelerinde, 2005 yılında yapılan deneme tekrarlanmıştır. 15 Şubat 2006 tarihinde tohumlar viyollere ekilmiş, 07 Mart 2006 tarihinde çimlenmiş olan Crimson Sweet bitkilerine aynı şekilde kolhisin uygulaması yapılmıştır (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması 2006 yılında kurulan denemede bitkiler 24 Nisan 2006 tarihinde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasına (1-0.5 m) x 0.5 m aralık mesafelerde dikilmiştir. 2006 yılında kurulan denemede de bitkilerde seraya dikimden itibaren 15 gün ara ile boğum sayısı, bitki uzunluğu, kök boğazı gözlem ve ölçümleri yapılmıştır. Bitkiler seraya dikildikten sonra ölçüm ve gözlemler ile kendilemelerin 20

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN daha iyi yapılabilmesi için askıya alınarak yetiştirilmiştir. Şekil 3.2 de ikinci yıl denemesinde seraya dikilen bitkiler görülmektedir. Şekil 3.2. Kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış bitkilerin seradaki görünümü 2005 ve 2006 yıllarında kotiledon aşamasında kolhisin uygulaması yapılmış bitkilerde ploidi belirleme çalışmalarına, bitkilerin seraya dikilmesinden sonra başlanmıştır. 2006 yılı denemesinde 6 (kontrol ile birlikte 7) farklı kolhisin dozu uygulanmış bitkilerden yaprak örnekleri alınarak Flow Sitometri (ploidi belirleme yöntemi) için hızlı kargo ile Hollanda da bulunan Enza-Zaden Tohum firmasına gönderilmiştir. 2006 yılı denemelerinde bitkilerde kendileme çalışmaları yapılarak tohum elde edilmiştir. Kendileme için dişi ve erkek çiçekler anthesis döneminden bir gün önce pens yardımıyla kapatılmıştır. İzole edilmiş olan erkek çiçeklerin tozları ile izole edilmiş dişi çiçek tozlanarak kendileme işi gerçekleştirilmiştir. Kendileme yapılan bitkilerde meyve tutma oranı hesaplanmıştır. Kendileme sonucu olgunlaşan meyvelerden elde edilen tohumlar çıkarılmış ve tohum veren bitki sayıları saptanmıştır. Şekil 3.3 de kendileme yapılan dişi çiçek, meyve tutumu ile kendileme aşamasındaki bitkinin seradaki görünümleri sunulmuştur. 21

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN a b c d Şekil 3.3. a. Anthesis döneminden bir gün önce pens yardımıyla kapatılmış dişi çiçek; b. Kendileme sonucu meyve tutmuş dişi çiçek; c. Bitkideki meyve gelişimi; d. Seradan genel bir görünüm 3.2.1.2. Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması Araştırmanın birinci yılında (2005), 21 Şubat 2005 tarihinde, 2:1 oranında torf:perlit içeren karışım doldurulmuş viyollere tohum ekimleri yapılmıştır. Dikim büyüklüğüne ulaşan fideler Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerindeki seraya sıra arası 2 m ve sıra üzeri 0.5 m olacak şekilde dikilmiş ve bitkiler yerde yayılarak geliştirilmiştir. 2006 yılında tekrarlanan denemede tohum ekimleri 15 Şubat 2006 tarihinde aynı harç karışımına yapılmış ve bitkilerin dikimi 10 Nisan 2006 tarihinde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait bir plastik seraya yapılmıştır. Sürgün uçlarının kolhisin çözeltisine daldırma 22

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN uygulamasından sonra ise bitkiler askıya alınmıştır. Denemede her doz için 3 tekrarlama ve her tekrarlamada 10 bitki olacak şekilde bitkiler seraya dikilmiştir. Bitkiler 60-70 cm boyuna gelince tüm yan sürgünleri temizlenmiştir. 15 cm boyundaki kültür tüplerine 6 ml olacak şekilde % 0, % 0.5 ve %1 konsantrasyonlarında kolhisin çözeltisi hazırlanmıştır. Büyüme uçları (Yetişir ve Sarı, 2003) 2 şer saat süreyle kolhisin çözeltisine daldırılmıştır. Bu işlem sırasında sıvı kolhisin çözeltisinin büyüme ucunu tam olarak örtmesine dikkat edilmiş ve uygulama mayıs ayındaki sera içi yüksek sıcaklığından dolayı akşam saatleri 17:00-19:00 arasında yapılmıştır. Bitkiler çözeltiden çıkarıldıktan sonra steril saf su ile dikkatlice yıkanarak kolhisinin dokuların yüzeyinden uzaklaştırılması sağlanmıştır. Kolhisin çözeltisine daldırılan tepe uçları kolhisin çözeltisinin temas ettiği yerin işaretlenmesi için bir kurdele ile bağlanmıştır (Şekil 3.4). 2005 ve 2006 deneme yıllarında, kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırma yönteminde ve bitkilerde ploidi belirleme çalışmalarına kurdele ile işaretlenmiş yerlerden itibaren başlanmıştır. 2006 yılında kurulan denemede bitkilerde kendilemeler yapılarak tohum elde edilmiştir. Kendileme için dişi ve erkek çiçekler anthesis döneminden bir gün önce pens yardımıyla kapatılmıştır. Ertesi gün sabah erken saatlerde dişi ve erkek çiçek kendilenmiştir. Kendileme yapılan bitkilerde meyve tutma oranı hesaplanmıştır. Kendileme sonucu olgunlaşan meyvelerden elde edilen tohumlar çıkarılmış ve tohum veren bitki sayıları saptanmıştır. 23

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN a b c d Şekil 3.4. a. Kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılmış bitki; b. 2 saat kolhisin muamelesinden sonra kolhisin çözeltisinden sürgün ucunun çıkarılması; c. Steril saf su ile kolhisinin dokuların üzerinden uzaklaştırılması; d. Kolhisin ile muamele edilmiş sürgün ucunun kurdele ile bağlanarak belirtilmesi 3.2.2. In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi 3.2.2.1. Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı Çalışmanın bu bölümü için, 11 Mart 2005 tarihinde Crimson Sweet karpuz çeşidine ait tohumların Çizelge 3.1 de içeriği verilen (çimlenme ortamında büyümeyi düzenleyici maddeler kullanılmamıştır) çimlendirme ortamına ekimi yapılmıştır. Denemede rejenerasyon ortamı içerisinde BA nın (0, 1, 2 ve 4 mg/l) dozları kullanılmış, bunun için 5 tekrarlama, her tekrarlama için 2 petri ve her petride 6 eksplant olacak şekilde deneme kurulmuştur. 5 gün çimlendirme ortamında tutulan 24

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN tohumların açılan kotiledonlarının proksimal kısımlarından alınan eksplantlar steril kabin içerisinde Çizelge 3.1 de içeriği verilen (4 farklı BA konsantrasyonları içeren) rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. Bu aktarma sırasında kotiledon eksplantlarının üst kısmı rejenerasyon ortamına temas edecek şekilde ortamlara yerleştirilmiştir. Rejenerasyon ortamındaki eksplantlarda oluşan sürgünler alınarak sürgün geliştirme ortamına (MS tuzları + 30 g/l sakkaroz + agar) (Compton ve Gray, 1993a; Yalçın Mendi ve ark., 2003) aktarılmıştır. Gelişimini tamamlamış olan sürgünler köklenme ortamına (MS tuzları + 20 g/l sakkaroz + 1 μm/l indole-3-butyric acid + agar) (Compton ve ark., 1996) alınmıştır. Köklenen bitkiler seraya viyoller içerisine dikilmiştir. Seraya dikilen bitkilerde ploidi belirleme çalışmalarına başlanmış ve yaşayan bitkilerden örnek alınarak ploidi analizi için Hollanda da bulunan Enza- Zaden tohum firmasının laboratuvarına gönderilmiştir. 3.2.2.1.(1). Tohumların Yüzey Dezenfeksiyonu Crimson Sweet karpuz çeşidine ait olan tohumlar steril kabin içerisinde kabukları çıkarılmadan % 20 lik hypo içerisinde 30 dakika bekletilmiştir (Şekil 3.5) ve daha sonra 3 kez steril saf su ile durulanmıştır. Tohumlar steril saf su içerisinde etrafı alüminyum folyo ile sarılı olarak 15 saat karanlıkta (Compton ve Gray, 1993a) bekletilmiştir. 15 saat karanlıkta bekletilen tohumlar 2 kez steril saf su ile durulandıktan sonra, steril pens yardımıyla tohum kabukları çıkarılmıştır. Kabukları çıkartılan tohumlar % 20 lik hypo içerisinde 10 dakika bekletilmiş, 3 kez steril saf su ile durulanmıştır. 25

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Çizelge 3.1. MS ortamının içeriği (Murashige ve Skoog, 1962) Makro elementler KNO 3 NH 4 NO 3 MgSO 4. 7H 2 O CaCl 2 KH 2 PO 4 Mikro Elementler MnSO 4. H 2 O ZnSO 4. 7H 2 O H 3 BO 3 KI Na 2 MoO 4. 2H 2 O CuSO 4. 5H 2 O CoCl 2. 6H 2 O FeNaEDTA Vitaminler Myo-inostol Pyridoxine-HCl Nicotinik Asit Thiamine-HCl Glycine (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l) 1900 1650 370 332.2 170 (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l) 16.9 8.6 6.20 0.83 0.25 0.025 0.025 36.72 (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l) 100 0.5 0.5 0.4 2.0 Büyümeyi Düzenleyiciler (mg/l) 6-Benzyladenin Indole-3-Butryric Acid 0, 1, 2 ve 4 ( 4 ayrı ortam için) 1 Diğer Sakkaroz (g/l) Agar (g/l) ph 30 7 5,7 26

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Şekil 3.5. Çimlendirme ortamına alınacak tohumların yüzey dezenfeksiyonu 3.2.2.1.(2). Tohumların Kültür Ortamına Ekimi Steril kabin içerisinde sterilizasyonu yapılan tohumların, steril filtre kağıtları üzerinde nemi alındıktan sonra, 2.5 cm çaplı ve 15 cm uzunluğunda olan kültür tüpleri içerisinde bulunan 5ml lik çimlendirme ortamlarına ekimleri yapılmıştır. 3.2.2.1.(3). Kültür Ortamı Karpuz tohumlarının çimlendirilmesinde içeriği Çizelge 3.1 de verilen % 3 sakkaroz, % 0.7 agar ve MS vitaminleri içeren MS ortamı kullanılmıştır (Compton ve Gray, 1993a; Yalçın-Mendi ve ark., 2003). 3.2.2.1.(4). Kültür Koşulları Kültüre alınan tohumlar 5 gün MS çimlendirme ortamında tutulup 5. gün sonunda rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. Rejenerasyon süresi ve rejenerasyon sonucunda elde edilen sürgünlerin çoğaltılması ve köklendirilmeleri sırasında da 27

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN iklim odasında tutulmuşlardır (Şekil 3.6). Büyütme odasının sıcaklığı gündüz 28±1 C, gece 22±1 C ve ışıklanması 16 saat 60-75 μm/m 2. sn ışıklanma düzeyine ayarlanmıştır. Şekil 3.6. In vitro çalışmalarında kullanılan kültür odasından bir görünüm 3.2.2.1.(5). Rejenerasyon Ortamı ve Eksplantların Rejenerasyon Ortamına Aktarımı Beş gün çimlendirme ortamında tutulan tohumların (Şekil 3.7.a) açılan kotiledonlarının proksimal kısımlarından (Compton ve Gray, 1993a; Yalçın-Mendi ve ark., 2003) eksplantlar alınmış (Şekil 3.7. b ve c) ve steril kabin içerisinde 4 farklı BA (0, 1, 2 ve 4 mg/l) içeren MS rejenerasyon ortamı bulunan 8 cm çapındaki plastik petrilere yerleştirilmiştir (Şekil 3.7.d). Bu yerleştirme sırasında kotiledon eksplantlarının üst kısmı rejenerasyon ortamına temas edecek şekilde ortam üzerine 28

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN yerleştirilmiştir. Şekil 3.7.d de kotiledon eksplantlarının üst kısmının rejenerasyon ortamına yerleştirilmesi gösterilmiştir. a b c d Şekil 3.7. a. Beş gün çimlendirme ortamında tutulan tohumdan gelişen genç bitkicik; b. Kotiledonların proksimal kısımlarının kesilmesi; c. Kesilen eksplantların görünümü; d. Eksplantların rejenerasyon ortamına yerleştirilmesi Rejenerasyon çalışmasında, her rejenerasyon ortamı için 5 tekrarlama, her tekrarlama için 2 petri ve her petride 6 eksplant olacak şekilde deneme kurulmuştur. Rejenerasyon ortamına alınan eksplantlar, 4 hafta boyunca rejenerasyon ortamında bekletilmiştir. Çalışmanın bu aşamasında haftada bir kez aşağıdaki gözlemler yapılmıştır (petri içerisindeki eksplantlar göz önüne alınarak % olarak ifade edilmiştir); Yeşil kallus oluşturan eksplant oranı (%) Tomurcuk oluşturan eksplant oranı (%) Sürgün oluşturan eksplant oranı (%) 29

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.2.1.(6). Rejenerasyon Sonucu Elde Edilen Sürgünler Dört farklı BA dozları içeren rejenerasyon ortamındaki eksplantlardan 4 hafta sonra meydana gelmiş olan sürgün veya tomurcuklar eksplanttan ayrılarak içerisinde MS besi ortamı (sürgün geliştirme) bulunan 2.5 cm çaplı ve 15 cm uzunluğunda olan kültür tüplerine transfer edilmiş ve büyütme odasında gelişmeye alınmıştır. Kardeşlenme ortamına transferi yapılan bitkiler, alınan rejenerasyon ortamına göre ayrı ayrı etiketlenerek her biri ileride ayrı bir genotip olarak çoğaltılıp kodlandırılmıştır. Sürgün ve/veya tomurcuk oluşturan eksplanttan geriye kalan şişmiş veya kallus oluşturmuş olan eksplant yeni hazırlanmış olan rejenerasyon ortamına alınarak 3 hafta süresince rejenerasyon ortamında bekletilmiş ve tekrar sürgün ve/veya tomurcuk oluşturması sağlanmıştır. Bu süre sonunda eksplantlarda oluşan sürgün veya tomurcuklar aynı şekilde sürgün geliştirme ortamına alınmışlardır. Bitkilerin ploidi seviyelerini belirleyebilmek, diğer morfolojik, sitolojik gözlemleri yapabilmek ve serada gerekli olan bitki sayısını sağlayabilmek için her genotipte ayrı vegetatif çoğaltma yapılmıştır. Çoğaltma işlemi sırasında, steril kabin içinde bitkiler bir yaprak ve bir koltuk gözü içeren mikro çeliklere ayrılıp besi ortamı içerisinde kök oluşumunu teşvik eden kültür tüplerine transfer edilmiş ve daha sonra mikroçelikler büyütme odasında gelişmeye alınmıştır. Bitkilerde 4 hafta arayla mikroçelikleme yapılarak bitkiler çoğaltılmış ve köklenme ortamına alınmıştır. Kök ortamına alınan bitkiler 4 hafta sonra alıştırma serası koşullarının hazır olmamasından dolayı tekrar kök ortamına alınmıştır. Şekil 3.8 de farklı BA ortamında rejenere edilen Crimson Sweet kotiledon yapraklarında sürgün/tomurcuk gelişimi ile bu sürgünlerin kardeş geliştirme ortamına aktarılması aşamaları verilmiştir. 30

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Şekil 3.8. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları kullanımı sonucu elde edilen bitkiler 3.2.2.1.(7). Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozları Kullanımı ile Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması Ağustos 2005 tarihinde rejenerasyon ortamında farklı BA dozları kullanımı ile elde edilen sürgünler sera koşullarına alıştırılarak Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerindeki alıştırma seralarına çıkartılmıştır. Bitkilerin dış ortama çıkarılmasında karşılaşılabilecek sorunlar nedeni ile in vitro koşullarda iken alıştırma işlemi kademeli olarak yapılmış, önce tüp kapakları 3 gün süre ile gevşetilmiş, daha sonra kapaklar tamamen açılarak bitkiler sera koşullarına çıkarılmaya hazır hale getirilmiştir (Sarı, 1994). Büyütme odasındaki alıştırmadan sonra bitkiler pens yardımı ile tüplerden çıkarılmış ve içerisinde su bulunan küvetlerde bitkilerin kökleri agarlı besi ortamından temizlenerek (Şekil 3.9.a), 1 g/l benlate çözeltisine bandırılmıştır. Daha sonra bitkiler 2:1 torf:perlit oranında hazırlanmış viyollere dikilmiştir (Şekil 3.9 b). Bitkiler pet fan sistemine sahip alıştırma serasında gündüz maksimum 28±1 C sıcaklık ve gece maksimum 31

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 24±1 C sıcakta 4 hafta bekletilmiştir (Şekil 3.9.c). Alıştırma serasında bitkiler % 90 nem içeren ortamdan, % 65 nem içeren ortama kademeli olarak alıştırılmıştır. Alıştırma serasında alüminyum gölge perdesi ve yeşil net kullanılmıştır. Bitkilerin dikimi sırasında etiketlemeye dikkat edilmiş ve serada da aynı etiket kodları kullanılmıştır. 3.2.2.1.(8). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi Dört hafta süresince alıştırma serasında gelişimini tamamlayan bitkiler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait plastik bir serada her biri ayrı etiketlenerek dikilmiştir (Şekil 3.9 d). a b B c d Şekil 3.9. a. In vitro bitkilerin besi ortamından çıkarılması; b. In vitro bitkilerin viyollere dikimi; c. In vitro bitkilerin alıştırma serasındaki görünümü; d. In vitro bitkilerin seraya dikimi sonrası görünümü 32

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.2.2. In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması Denemeye 2005 Mart ayında dezenfeksiyonu yapılan tohumların E20A besi ortamına (Sauton, 1987; Sarı, 1994) ekilmesi ile başlanmıştır. Çizelge 3.2 de E20A besi ortamının içeriği verilmiştir. Tohumların besi ortamına ekilmesinden 10 gün sonra çimlenen tohumlar (Şekil 3.10), kotiledon yaprakları üzerinden kesilerek E20A besi ortamı içerisine sürgünlerin gelişimini sağlamak için alınmıştır. Şekil 3.10. Besi ortamına tohum ekilmesinden 10 gün sonra çimlenen tohumların görünümü 33

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Çizelge 3.2. E20A besi ortamının içeriği (Sauton, 1987; Sarı, 1994) Makro elementler (mg/l) KNO 3 NH 4 NO 3 MgSO 4. 7H 2 O CaCl 2. 2H 2 O KH 2 PO 4 Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O NaH 2 PO 4. 4H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 KCl 1075.0 619.0 206.0 156.5 71.0 25.0 19.0 17.0 3.5 Mikro Elementler (mg/l) MnSO 4, H 2 O ZnSO 4, 7H 2 O H 3 BO 3 KI Na 2 MoO 4. 2H 2 O CuSO 4. 5H 2 O CoCl 2. 6H 2 O Na 2 EDTA FeSO 4. 7H 2 O 11.065 1.812 1.575 0.345 0.094 0.008 0.008 37.30 27.80 Organik Bileşikler (mg/l) Meso-inositol Pyridoxine-HCl Nicotinik Asit Thiamine-HCl Kalsiyum pantothenate Biotine Glisin 50.300 5.500 0.700 0.600 0.500 0.005 0.100 Büyümeyi Düzenleyiciler (mg/l) IAA 0.01 Diğer Sakkaroz (g/l) Agar (g/l) PH 20 8 5,9 34

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.2.2.(1). Bitkilerin Kolhisin Çözeltisinde Bekletilmesi Dört hafta süresince kültür koşullarında bekletilen 4-5 boğum gözü içeren sağlıklı bitkiler besi ortamından çıkarılıp kökleri kesilerek 100 ml lik steril beher içerisinde hazırlanan 3 farklı kolhisin çözeltisinde (% 0.0, % 0.5, % 1.0) 2 saat süresince bekletilmiştir (Şekil 3.11.a ve b). a b c d Şekil 3.11. a. In vitro bitkilere kolhisin uygulaması; b. Bitkilerin kolhisin çözeltisinde bekletilmesi; c. Bitkilerin mikro çeliklere ayrılması; d. Mikroçeliklerin E20A besi ortamına yerleştirilmesi Uygulama süresi sonunda kolhisin çözeltisi süzülüp bitkilerden uzaklaştırılmış ve sterilize edilmiş saf su ile bitkiler 3 kez durulanmıştır. Kaba filtre kağıtları üzerinde bitkilerin su kalıntıları alınmıştır (Şekil 3.11 c). Bitkiler her boğumda bir sürgün gözü olacak şekilde mikro çeliklere ayrılmış (Sarı ve Abak, 1996) ve E20A besi ortamı içerisine 3 tekrarlama her tekrarlamada 20 bitki olacak şekilde yerleştirilmiştir (Şekil 3.11.d). Bitkilerin E20A besi ortamına transferinden 3 35

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN hafta sonra, bitkilerde 1 er hafta arayla yaşayan bitki sayısı, yaşayan bitkilerdeki boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayısı gözlem ve ölçümleri yapılmıştır. Kolhisin uygulamasından sonra her bir mikroçelik bir genotip olarak kodlandırılmıştır. Şekil 3.12 de in vitro mikroçeliklerine farklı dozlarda kolhisin uygulanmış bitkilerin uygulamadan 30 gün sonraki durumu sunulmuştur. Şekil 3.12. In vitro mikro çeliklere kolhisin uygulaması sonrası E20A besi ortamına alınan bitkilerin görünümü 3.2.2.2.(2). Bitkilerin Çoğaltılması Kolhisin uygulamasından 6 hafta sonra yaşayan bitkiler boğumlarına ayrılarak, her bir boğum bir kültür tüpü içerisindeki E20A besi ortamına aktarılmıştır. Bitkilerin ploidi seviyelerini belirleyebilmek, diğer morfolojik ve sitolojik gözlemleri yapabilmek, serada gerekli olan bitki sayısını sağlayabilmek için her genotipte ayrı vegetatif çoğaltma yapılmıştır. Çoğaltma işlemi sırasında, steril kabin içinde bitkiler bir yaprak ve bir koltuk gözü içeren mikroçeliklere ayrılıp içerisinde E20A besi ortamı bulunan kültür tüplerine transfer edilmiş ve daha sonra mikroçelikler büyütme odasında gelişmeye alınmıştır. Bitkilerde 4 hafta arayla iki kez daha mikroçelikleme yapılarak bitkiler çoğaltılıp köklendirme ortamına alınmıştır. 36

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.2.2.(3). Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması Ağustos 2005 tarihinde in vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması ile elde edilen sürgünler sera koşullarına alıştırmak amacıyla Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye ait Toros Agripark tesislerindeki alıştırma seralarına çıkarılmıştır. Bitkilerin dış ortama çıkarılmasında karşılaşılabilecek sorunlar nedeni ile in vitro koşullarda iken alıştırma işlemi kademeli olarak yapılmış (Sarı, 1994), önce tüp kapakları 3 gün süre ile gevşetilmiş daha sonra kapaklar tamamen açılarak (Şekil 3.13) bitkiler sera koşullarına çıkarılmaya hazır hale getirilmiştir. Büyütme odasındaki alıştırmadan sonra bitkiler pens yardımı ile tüplerden çıkarılmış ve içerisinde su bulunan küvetlerde bitkilerin kökleri agarlı besi ortamından temizlenerek 1g/l benlate çözeltisine bandırılmıştır. Daha sonra bitkiler 2:1 oranında hazırlanmış torf:perlit içeren viyollere dikilmiştir. Bitkiler alıştırma serasında 4 hafta bekletilmiştir. Bitkilerin dikimi sırasında etiketlenmeye dikkat edilmiş ve serada da aynı etiket kodları kullanılmıştır. Şekil 3.13. In vitro bitkilerin sera koşullarına alıştırılması 37

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.2.2.(4). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi Dört hafta süresince alıştırma serasında gelişimini tamamlayan bitkiler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ne ait serada her biri ayrı etiketlenerek dikilmiştir. 3.2.3. In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan Ölçüm ve Gözlemler In vivo ve in vitro koşullarda yürütülen tetraploid bitki elde etme çalışmalarında; seraya bitkilerin dikiminden 4-5 hafta sonra bitkilerde yaşama oranları alınarak ve yaşayan bitkilerin tümünde katlanmayı tespit etmek için morfolojik gözlemler, sitolojik gözlemler ve flow sitometri yöntemiyle bitkilerin ploidi düzeyleri belirlenmiş ve sonuçlar diğer morfolojik gözlemlerle karşılaştırılmıştır. 3.2.3.1. Morfolojik Gözlemler 2005 ve 2006 yılı içerisinde seraya dikilen in vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen bitkilerde aşağıdaki morfolojik gözlemler yapılmıştır. Her uygulama yapılan bitkilerde ölçümler yapılmış ve sonuçların ortalamaları alınmıştır. 3.2.3.1 (1). Yaprak Alanı In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden alınan yaprak örneklerinde alan ölçümü yapılmıştır. Alan ölçümleri bitkilerin büyüme ucundan itibaren 8. yapraktan alınan örneklerde (Sarı, 1994) yapılmıştır. Yaprak alma işleminden sonra yaprakların fotokopisi çekilerek yaprağın iz düşümü çıkarılmıştır. İz düşümü hizasından kesilen yaprak fotokopisi Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Fizyoloji 38

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN Laboratuvarında bulunan Portable leaf area meter 4-Cor Model-LI-3000A markalı makina (Şekil 3.14) ile yaprak alanları cm 2 olarak ölçülmüştür. Şekil 3.14. Portable area meter 4-Cor Model-LI-3000A markalı yaprak alanı ölçümü yapan makina 3.2.3.1.(2). Yaprak Uzunluğu ve Eni In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden, bitkilerin büyüme ucundan itibaren 8. yapraktan alınan yaprak örneklerinde yaprak uzunluğu ve eni ölçümü ve cm olarak ifade edilmiştir. 3.2.3.1.(3). Erkek Çiçek Çapı In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden oluşan erkek çiçekler tam açtıkları dönemde kompas kullanılarak ölçümleri yapılmış ve mm olarak ifade edilmiştir. 39

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.3.1.(4). Erkek Çiçek Çevresi In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden oluşan erkek çiçekler tam açtıkları dönemde bir kağıt üzerine çiçek iz düşümü çizilerek şekilleri çıkarılmıştır. Kağıt üzerine alınan iz düşümü ölçülerek cm olarak ifade edilmiştir. 3.2.3.1.(5). Taç Yaprak Genişliği ve Uzunluğu In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden oluşan dişi çiçek taç yaprağı tam açtığı dönemde kompas kullanılarak taç yaprak genişliği ve uzunluğu ölçümleri yapılmış ve mm olarak ifade edilmiştir. 3.2.3.1.(6). Yumurtalık Çapı ve Yüksekliği In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden oluşan dişi çiçek taç yaprağı tam açtığı dönemde kompas kullanılarak yumurtalık çapı ve yüksekliği ölçülmüş ve mm olarak ifade edilmiştir. Şekil 3.15 de serada morfolojik gözlemlerin yapılışı gösterilmiştir. Şekil 3.15. Serada morfolojik gözlem yapımı 40

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.3.1.(7). Çiçek Tozu Çapı In vivo ve in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi uygulamaları sonrası gelişen her bir bitkiden anthesis gününden bir gün önce alınan erkek çiçeklerin çanak ve taç yaprakları anterlerden uzaklaştırılmış, daha sonra anterlerin patlaması amacıyla 25 C sıcaklıktaki ortamda 1 gece bekletilmiştir. Elde edilen çiçek tozlarının her biri için 1 lam hazırlanmış ve lamın bir tarafına bir damla saf su damlatılmıştır. Damlanın üzerine sulu boya fırçasıyla çiçek tozu ekimi yapılmıştır. Ekim yapıldıktan sonra damlanın üzeri lamelle kapatılmıştır. 40x büyütmeli objektif ve 10x büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla çiçek tozu çapı ölçülmüştür. Ölçümlerde her bir bitkiden alınan birer adet erkek çiçekde 2 şer sayım yapılmıştır. Daha sonra bu ölçülen ham değerler dönüştürme kat sayısı 2.435 ile çarpılıp, μm cinsinden çiçek tozu çapları hesaplanmıştır. 3.2.3.1 (8). Çiçek Tozu Kolpi (Çimlenme Pilesi) Sayısı Çiçek tozu çapı okumaları sırasında çiçek tozu kolpi sayısı ışık mikroskobunda incelenerek sayılmıştır. Sayımlarda 2 şer sayım yapılmıştır. 3.2.3.2. Stomatal İncelemeler Tüm bitkilerde büyüme ucundan itibaren 8. yaprak alınmış ve her yaprakta 1 preparat hazırlanarak iki sayım yapılmıştır. Hazırlanan preparatlarda stoma çapı, uzunluğu, yoğunluğu ve bekçi hücrelerdeki toplam kloroplast sayıları tespit edilmiştir. 3.2.3.2.(1). Stoma Çapı ve Uzunluğu Yaprağın alt kısmından bir miktar epidermis hücresi lam üzerine konulup, üzerine 2005 yılı denemelerinde elde edilen bitkilerden alınan örneklerde 1 damla saf su, 2006 yılı denemelerinden elde edilen bitkilerden alınan örneklerde 1 damla % 41

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 1 lik AgNO 3 (Rousselle, 1992; Sarı, 1994) damlatılarak lamel kapatılmıştır. 40 büyütmeli objektif ve 10 büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla stoma çapı ve uzunluğu ölçülmüştür. Ölçümlerde 2 şer sayım yapılmıştır. Daha sonra ölçülen bu ham değerler dönüştürme kat sayısı olan 2.435 ile çarpılıp, boyutlar μm cinsinden hesaplanmıştır. 3.2.3.2.(2). Stoma Yoğunluğu Stoma çapı ve uzunluğu ölçümü için hazırlanan preparatlarda 1 mm 2 lik alanda kaç adet stoma bulunduğu ağ mikrometre yardımıyla belirlenmiştir. Sayımlarda bir lamel bölgesinde 2 bölgeden ağ mikrometre ile okumalar gerçekleştirilmiştir. 40x büyütmeli objektif ve 10x büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla sayımlar yapılmıştır. Daha sonra ölçülen bu ham değerler dönüştürme katsayısı olan 0.058 ile çarpılarak hesaplanmıştır. Şekil 3.16 da ölçüm ve sayımı yapılan stomalar gösterilmiştir. Şekil 3.16. 40x büyütmeli objektif ve 10x büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla fotoğrafı çekilmiş yaprak örneği 42

3. MATERYAL VE METOT Sezen İNAN 3.2.3.2.(3). Bekçi Hücrelerindeki Kloroplast Sayısı Stoma ölçümlerinde belirlenen bekçi hücrelerinin içindeki kloroplast sayılarının toplamı alınmıştır. Ölçümlerde 2 şer sayım yapılmıştır. Ortalamaları alınarak hesaplanmıştır. 3.2.3.3. Flow Sitometri Analizi In vitro ve in vivo da elde edilen bitkilerde ploidi düzeylerinin belirlenmesi için Flow sitometri analizleri yapılmıştır. Bu amaçla, 2006 yılında tekrar kurulan in vivo tetraploid bitki elde edilmesi denemelerinden elde edilen bitkiler ile in vitro denemelerinde elde edilen bitkilerden alınan örnekler Hollanda nın Enza Zaden tohum firmasına gönderilerek burada Partec Cyflow ML marka bir cihazda analizleri yaptırılmıştır. Örnekler büyüme ucundan itibaren 3.-4. genç yapraklardan alınarak küçük plastik tüplere yerleştirilmiş ve ağızları alüminyum folyo ile kapatılarak etiketlenmiş ve hızlı kargo yöntemi ile gönderilmiştir. 3.2.4. In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan İstatiksel Analizler Araştırmada in vivo yöntemler ile tetraploid bitki elde edilmesi ile ilgili 2005 ve 2006 yıllarında yapılan çalışmalarda tekrarlamalı olarak tesadüf parselleri deneme deseni kullanıldığı; için yaprak özellikleri, stomatal özellikler ve çiçek özellikleri çalışmalarından elde edilen sonuçlar Costat istatistiksel programı kullanılarak varyans analizine tabi tutulmuştur. Elde edilen farklılıkların % 1 ve % 5 düzeyinde önemlilik durumları Tukey testi ile karşılaştırılmıştır. Sera koşullarında yapılan ve tekrarları bulunmayan diğer gözlemler için verilerin ortalamaları alınarak değerlendirmeler yapılmıştır. In vitro koşullarda tetraploid bitki elde edilmesi ile ilgili yapılan çalışmalarda, elde edilen değerlerin ortalamaları alınarak hesaplamalar yapılmıştır. Tüm yapılan çalışmalarda tetraploid bitki eldesi ile ilgili değerler % oranı şeklinde belirtilmiştir. 43

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi 4.1.1. Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması 2005 yılında yapılan denemede in vivo koşullarda Crimson Sweet karpuz çeşidine, kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin, bitkilerdeki yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkileri Çizelge 4.1 de sunulmuştur. Çizelge 4.1. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin, bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi Dozlar Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) 26.04.2005 03.05.2005 10.05.2005 Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) % 0.0 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.1 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.2 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.3 30 100 0 0 30 100 1 3 30 100 1 3 % 0.4 30 100 1 3 30 100 2 7 30 100 3 10 % 0.5 30 100 2 7 30 100 3 10 30 100 3 10 % 0.6 30 100 1 3 30 100 3 10 30 100 3 10 Çizelge 4.1 de de görüldüğü gibi 26 Nisan 2005 tarihinde yapılan ilk gözlemde, 7 farklı kolhisin uygulaması yapılan bitkilerde yaşama oranı değişmemiştir. Bitkilere uygulanan kolhisinin % 0.0, % 0.1, % 0.2 ve % 0.3 dozlarında morfolojik değişiklik meydana gelmezken, % 0.5 kolhisin dozunda % 7 oranında değişiklik olmuştur. 03 Mayıs 2005 tarihinde yapılan gözlemlerde ise hiçbir dozda kolhisinin toksik etkisi yine ölümcül olmamış ve yaşama oranı % 100 olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, en fazla morfolojik değişiklik % 0.5 ve % 0.6 44

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde % 10 olarak gözlenmiştir. 10 Mayıs 2005 tarihinde yapılan gözlemlerde ise yine yaşama oranı değişmemiş ve en fazla morfolojik değişiklik % 0.4, % 0.5 ve % 0.6 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde % 10 olarak gözlenmiştir. 2006 yılında tekrarlanan in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin, bitkilerde yaşama oranına ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi Çizelge 4.2 de gösterilmiştir. Çizelge 4.2. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi Dozlar Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) 17.03.2006 24.03.2006 31.03.2006 Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Bitki (%) Değişikliğe Uğrayan Bitki Sayısı % 0.0 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.1 24 80 0 0 24 80 0 0 24 80 0 0 % 0.2 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.3 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.4 30 100 0 0 30 100 0 0 30 100 0 0 % 0.5 23 77 1 4 21 70 2 9 20 67 2 9 % 0.6 30 100 2 7 30 100 2 7 30 100 2 7 Değişikliğe Uğrayan Bitki (%) Çizelge 4.2 incelendiğinde 17 Mart 2006 tarihinde yapılan ilk gözlemde % 0.0, % 0.2, % 0.3, % 0.4 ve % 0.6 kolhisin dozları uygulanan bitkilerde yaşama oranında bir değişiklik meydana gelmezken, % 0.5 kolhisin dozunda yaşama oranı % 77 e düşmüştür. Morfolojik olarak % 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3 ve % 0.4 kolhisin dozlarında hiç bir değişiklik meydana gelmezken, yüksek dozlarda (% 0.5 ve % 0.6) değişim tespit edilmştir. Bu değişim, % 0.5 dozunda % 4, % 0.6 kolhisin dozunda % 7 oranında saptanmıştır. 24 Mart 2006 tarihinde yapılan gözlemlerde ise yaşama oranı % 0.5 kolhisin dozunda % 70 e düşerken, diğer dozlarda değişiklik meydana gelmemiştir. Bitkilere uygulanan % 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3 ve % 0.4 kolhisin dozlarında morfolojik olarak değişiklik meydana gelmezken, % 0.5 kolhisin dozunda 45

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN % 9 oranında değişiklik meydana gelmiştir. 31 Mart 2006 tarihinde yapılan gözlemlerde ise yine yaşama oranı değişmemiş ve bitkilere uygulanan kolhisinin % 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3 ve % 0.4 dozlarında morfolojik olarak değişiklik meydana gelmezken, % 0.5 kolhisin dozunda % 9, % 0.6 dozunda % 7 oranlarında değişiklik saptanmıştır. 2005 ve 2006 yıllarında yapılan in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin bitkilerde yaşama oranına etkisi değerlendirildiğinde, 2005 yılında bitkilerdeki yaşama oranı kolhisinin tüm dozlarında % 100 olarak saptanırken, 2006 deneme yılında bu oran % 0.5 kolhisin dozunda % 67 oranında gözlenmiştir (Çizelge 4.1). 2006 deneme yılında meydana gelen bu kayıpların doğrudan kolhisinin toksik etkisinden dolayı olmadığı ve sera plastiğinin aşırı terlemesi sonucu oluşan su damlalarının ilgili bitkilerde yaptığı damla etkisinden kaynaklandığı tahmin edilmektedir. Şekil 4.1 de 2005 yılı denemesinde kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış bitkilerin sera koşullarına dikimi yapılmadan önce, uygulanan farklı kolhisin konsantrasyonlarının bitkiler üzerine yapmış olduğu etkiler gözlenmektedir. Şekil 4.1. Kotiledon aşamasında farklı kolhisin dozları (% 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6) uygulanmış fidelerin seraya dikiminden önceki görünümü 2005 ve 2006 yıllarında in vivo koşullarda gelişen Crimson Sweet bitkilerine kolhisin uygulamasının ardından, bitkilerin seraya dikiminden sonra 15 er gün 46

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök boğazı çapı gözlem ve ölçümleri Çizelge 4.3 ve 4.4 de verilmiştir. Çizelge 4.3. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök boğazı çapı gözlem ve ölçümleri Dozlar 14.05.2005 Boğum Sayısı (adet) Bitki Uzunluğu (cm) Kök Boğazı Çapı (mm) 28.05.2005 11.06.2005 26.06.2005 14.05.2005 % 0.0 3.3 ab 9.5 abc 13.5 ab 28.9 4.5 bc 40.8 ab 66.4 ab 144.4 2.9 4.2 5.0 b 6.5 % 0.1 3.9 a 11.3 a 16.8 a 31.7 8.7 a 54.9 a 97.4 a 195.8 3.3 4.4 4.9 b 7.2 % 0.2 3.5 ab 9.9 ab 15.4 ab 33.7 6.6 ab 42.4 ab 81.9 ab 176.3 3.0 4.2 4.7 b 6.4 % 0.3 2.9 abc 8.8 abcd 14.1 ab 36.9 4.1 bc 40.6 ab 74.2 ab 181.6 3.0 4.2 5.2 ab 7.3 % 0.4 2.6 bc 7.4 bcd 13.0 ab 32.8 3.7 bc 31.7 bc 66.9 ab 163.7 2.9 4.3 5.3 ab 7.2 % 0.5 2.5 bc 5.6 cd 11.7 ab 32.7 2.8 c 22.9 bc 63.3 b 160.2 3.0 4.2 5.3 ab 7.3 % 0.6 1.9 c 5.1 d 10.3 b 31.6 1.6 c 19.2 c 58.5 b 160.0 3.1 4.7 6.0 a 7.5 D (% 1) 1.11 (% 1) 3.88 (% 1) 6.34 (% 5) ÖD (% 1) 3.36 28.05.2005 (% 1) 21.33 11.06.2005 (% 1) 33.55 26.06.2005 (% 5) ÖD 14.05.2005 (% 5) ÖD 28.05.2005 (% 5) ÖD 11.06.2005 (% 1) 0.81 26.06.2005 (% 5) ÖD Çizelge 4.3 de görüldüğü gibi ilk gözlem tarihi olan 14 Mayıs 2005 de yapılan gözlemde en düşük boğum adedi 1.9 ile % 0.6 kolhisin dozu ve en yüksek boğum adedi 3.9 ile % 0.1 kolhisin dozunda bulunmuştur. 28 Mayıs 2005 tarihinde yapılan gözlemde en düşük boğum adedi bitki başına 5.1 adet ile % 0.6 kolhisin dozu ve en yüksek boğum adedi 11.3 adet ile % 0.1 kolhisin dozunda tespit edilmiştir. 11.06.2005 tarihinde yapılan 3. gözlemde en düşük boğum adedi 10.3 ile % 0.6 kolhisin dozu ve en yüksek boğum adedi 16.8 ile % 0.1 kolhisin dozunda saptanmıştır. 26 Haziran 2005 tarihinde yapılan son gözlemde ise en düşük boğum adedi 31.6 adet ile % 0.6 kolhisin dozu ve en yüksek boğum adedi 36.9 adet ile % 0.3 kolhisin dozunda belirlenmiştir. Bitki uzunluğu açısından; ilk ölçüm tarihi olan 14 Mayıs 2005 de yapılan gözlemde en düşük bitki uzunluğu 1.6 cm ile % 0.6 kolhisin dozunda, en yüksek bitki uzunluğu ise 8.7 cm ile % 0.1 kolhisin dozunda tespit edilmiştir. 28 Mayıs 2005 tarihinde yapılan ölçümde en düşük bitki uzunluğu 19.2 cm ile % 0.6 kolhisin dozunda ve en yüksek bitki uzunluğu 54.9 cm ile % 0.1 kolhisin dozunda belirlenmiştir. 11 Haziran 2005 tarihinde yapılan 3. ölçümde en düşük bitki uzunluğu 47

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN 58.5 cm ile % 0.6 kolhisin dozu ve en yüksek bitki uzunluğu 97.4 cm ile % 0.1 kolhisin dozunda saptanmıştır. 26 Mayıs 2005 tarihinde yapılan son ölçümde ise en düşük bitki uzunluğu 144.4 cm ile % 0.0 kolhisin dozunda ve en yüksek bitki uzunluğu 195.8 cm ile % 0.1 kolhisin dozunda tespit edilmiştir. Kök boğazı çapı açısından tüm kolhisin uygulamalarında bir birine yakın değerler elde edilmiştir. Kök boğazı çapı birinci ölçümde 2.9-3.3 mm, ikinci ölçüm tarihinde 4.2-4.7 mm, üçüncü ölçüm tarihinde 4.7-6.0 mm ve dördüncü ölçüm tarihinde 6.4-7.5 mm arasında değişmiştir. Çizelge 4.4. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök boğazı çapı gözlem ve ölçümleri Dozlar 24.04.2006 Boğum Sayısı (adet) Bitki Uzunluğu (cm) Kök Boğazı Çapı (mm) 09.05.2006 23.05.2006 06.06.2006 24.04.2006 09.05.2006 % 0.0 3.5 8.4 24.1 38.0 2.3 45.8 181.7 395.2 3.8 5.5 8.2 11.1 % 0.1 4.2 10.4 29.1 42.8 3.5 54.9 171.3 427.8 4.4 5.9 7.2 10.8 % 0.2 3.4 8.4 23.2 39.5 2.6 42.9 161.1 385.5 3.8 5.6 7.9 10.5 % 0.3 3.3 8.3 22.9 38.6 2.7 40.9 155.4 377.6 3.9 5.3 7.4 11.1 % 0.4 3.8 9.0 23.4 42.4 3.1 46.0 159.0 395.7 3.8 5.6 7.5 10.9 % 0.5 3.5 8.3 22.9 42.7 3.2 42.4 140.5 365.1 3.7 5.2 7.6 10.7 % 0.6 3.1 8.5 22.9 44.0 2.8 43.4 159.0 390.5 3.7 5.6 8.2 11.5 D (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD 23.05.2006 (% 5) ÖD 06.06.2006 (% 5) ÖD 24.04.2006 (% 5) ÖD 09.05.2006 (% 5) ÖD 23.05.2006 (% 5) ÖD 06.06.2006 (% 5) ÖD Çizelge 4.4 de ikinci yıl denemesine ait bitki ölçümü sonuçları sunulmuştur. Yapılan istatistiksel analizlerde hiçbir ölçüm tarihi ve uygulamada farklılık tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, ilk gözlem tarihi olan 24 Nisan 2006 da yapılan gözlemde en düşük boğum adedi 3.1 ile % 0.6 kolhisin dozunda ve en yüksek boğum adedi 4.2 ile % 0.1 kolhisin dozunda bulunmuştur. 09 Mayıs 2006 tarihinde yapılan gözlemde en düşük boğum adedi 8.3 ile % 0.3 ve % 0.5 kolhisin dozlarında, en yüksek boğum adedi 10.4 ile % 0.1 kolhisin dozunda gözlenmiştir. 23 Mayıs 2006 tarihinde yapılan üçüncü gözlemde en düşük boğum adedi 22.9 ile % 0.3, % 0.5, % 0.6 kolhisin dozlarında ve en yüksek boğum adedi ise 29.1 ile % 0.1 kolhisin 48

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN dozunda saptanmıştır. 06 Haziran 2006 tarihinde yapılan son gözlemde en düşük boğum adedi 38 ile kontrolde ve en yüksek boğum adedi 42.8 ile % 0.3 kolhisin dozunda elde edilmiştir. Kotiledon aşamasında kolhisin uygulanan ikinci yıl bitkilerinde bitki uzunluğu ilk ölçüm tarihinde 2.3-3.5 cm arasında; ikinci ölçüm tarihinde 40.9-54.9 cm arasında; üçüncü ölçüm tarihinde 140.5-181.7 cm arasında ve 4. ölçüm tarihinde 365.1-427.8 cm arasında değişmiştir. İkinci yıl denemesinde bitkinin daha iyi gelişimi (uzun boylu ve kalın gövdeli olması), yan gövdelerin alınması ve bitkinin tek dallı olarak yetiştirilmesine ve ikinci yıl denemelerinin daha erken dönemde yapılmasına bağlanabilir. Kök boğazı çapı; ilk gözlem tarihi olan 24.04.2006 de yapılan gözlemde 3.7 mm ile % 0.5 ve % 0.6 kolhisin dozlarında en düşük, 4.4 mm ile % 0.1 kolhisin dozunda en yüksek saptanmıştır. 09.05.2006 tarihinde yapılan gözlemde en düşük kök boğazı çapı 5.2 mm ile % 0.5 kolhisin dozunda ve en yüksek kök boğazı çapı 5.9 mm ile % 0.5 kolhisin dozunda gözlenmiştir. 23.05.2006 tarihinde yapılan 3. gözlemde en düşük kök boğazı çapı 7.2 mm ile % 0.1 kolhisin dozu ve en yüksek kök boğazı çapı 8.2 mm ile % 0.0 ve % 0.6 kolhisin dozlarında bulunmuştur. 06.06.2006 tarihinde yapılan son gözlemde en düşük kök boğazı çapı 10.5 mm ile % 0.2 kolhisin dozunda ve en yüksek kök boğazı çapı 11.5 mm ile % 0.6 kolhisin dozunda gözlenmiştir. In vivo koşullarda yetiştirilen Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında kolhisinin 7 farklı dozu (% 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6) uygulanmış bitkilerde, yaprak ve stomatal özelliklere etkileri Çizelge 4.5 ve Çizelge 4.6 da verilmiştir. 49

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.5. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi DOZLAR Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Özellikleri Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Stomatal Özellikler Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma (adet/mm 2 ) % 0.0 85.2 bc 12.4 8.4 17.9 a 25.4 8 382 % 0.1 89.6 ab 12.7 8.8 17.2 ab 24.4 8 358 % 0.2 69.2 d 11.2 8.1 16.4 ab 24.4 8 380 % 0.3 90.1 ab 12.5 9.1 16.1 ab 23.9 9 378 % 0.4 95.6 a 13.3 8.9 15.8 ab 25.6 9 353 % 0.5 86.6 bc 12.3 8.6 14.3 b 24.1 9 356 % 0.6 82.4 c 12.1 8.7 16.1 ab 24.6 9 338 D (%1) 6.38 (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) 2.98 (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD Çizelge 4.6. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi Dozlar Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Özellikleri Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Stomatal Özellikler Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) % 0.0 114.2 13.4 13.2 16.2 26.4 10 408 % 0.1 103.9 12.8 12.3 15.5 24.0 10 390 % 0.2 111.9 12.9 13.3 14.9 23.9 10 372 % 0.3 107.6 12.8 12.7 16.5 25.0 10 396 % 0.4 117.1 13.5 12.8 15.4 25.7 11 358 % 0.5 99.1 12.6 12.5 15.5 25.6 10 419 % 0.6 114.5 13.4 12.4 16.6 25.4 10 357 D (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD 2005 yılı denemelerinde kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış fidelerin seraya dikiminden sonra yapılan yaprak özellikleri ölçümünde, en düşük yaprak alanı 69.2 cm 2 ile % 0.2 kolhisin dozunda ve en yüksek yaprak alanı 95.6 cm 2 ile % 0.4 kolhisin dozunda bulunmuştur. Bu fark % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Çizelge 4.5). 2006 yılı denemesinde ise en düşük yaprak alanı 99.1 cm 2 ile % 0.5 kolhisin dozunda ve en yüksek yaprak alanı 117.1 cm 2 ile % 0.4 kolhisin dozunda gözlenmiştir. Ancak bu farklılık istatiksel olarak önemsiz bulunmuştur (Çizelge 4.6). 50

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Yaprak uzunluğu 11.2 cm ile % 0.2 kolhisin dozunda en düşük, 13.3 cm ile % 0.4 kolhisin dozunda en yüksek ölçülürken, 2006 yılı denemesinde en düşük yaprak uzunluğu 12.6 cm ile % 0.5 kolhisin dozunda, en yüksek yaprak uzunluğu 13.5 cm ile % 0.4 kolhisin dozunda kaydedilmiştir. Çizelge 4.5 de en düşük yaprak eni 8.1 cm ile % 0.2 kolhisin dozu ve en yüksek yaprak eni 9.1 cm ile % 0.3 kolhisin dozunda bulunurken, Çizelge 4.6 da en düşük yaprak eni 12.3 cm ile % 0.1 kolhisin dozu ve en yüksek yaprak eni 13.3 cm ile % 0.2 kolhisin dozunda bulunmuştur. 2005 yılında yapılan denemede yaprak stoma çapı değerlendirildiğinde en düşük stoma çapı 14.3 μm ile % 0.5 kolhisin dozundan elde edilirken, en yüksek stoma çapı 17.9 μm ile % 0.0 kolhisin dozunda tespit edilmiştir (Çizelge 4.5). 2006 yılında en düşük stoma çapı 14.9 μm ile % 0.2 kolhisin dozunda ve en yüksek stoma çapı 16.6 μm ile % 0.6 kolhisin dozunda belirlenmiştir (Çizelge 4.6). Bununla birlikte bu farklılıklar istatiksel olarak önemli bulunmamıştır. Stoma boyu, kloroplast sayısı ve birim alana düşen stoma sayısı açısından da her iki yılda da kolhisin uygulamalarının önemli bir etkisi belirlenmemiştir. 2005 ve 2006 yılı denemelerinde in vivo koşullardaki Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında uygulanan farklı kolhisin dozlarının çiçek özelliklerine etkileri Çizelge 4.7 ve Çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.7. 2005 yılında in vivo koşullardaki Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi DOZLAR Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak uzunluğu (mm) % 0.0 28.3 ab 9.3 ab 63.4 cd 3.0 8.7 13.0 23.0 12.5 % 0.1 25.8 b 8.6 b 62.3 d 3.0 9.5 12.2 24.0 11.8 % 0.2 26.1 b 8.8 b 70.0 ab 3.0 10.2 13.3 21.0 11.6 % 0.3 30.4 ab 9.9 ab 67.6 abc 3.0 10.1 13.9 22.9 12.5 % 0.4 30.7 ab 9.9 ab 66.3 bcd 3.0 9.6 14.3 22.2 13.0 % 0.5 30.5 ab 9.9 ab 69.7 ab 3.0 8.8 12.7 20.7 11.9 % 0.6 32.3 a 10.6 a 71.7 a 3.0 9.1 13.6 22.0 12.6 D (% 1) 6.02 (% 5) 1.72 (% 1) 4.50 (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD 51

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.8. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi DOZLAR Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak uzunluğu (mm) % 0.0 32.4 11.1 65.4 3.0 10.9 15.9 30.1 14.8 % 0.1 32.3 11.1 68.7 3.0 10.5 15.3 29.2 13.6 % 0.2 32.4 10.9 67.8 3.0 10.8 14.5 30.4 14.6 % 0.3 30.7 10.5 69.5 3.0 10.8 15.3 32.0 14.7 % 0.4 32.5 10.8 69.2 3.0 10.5 15.0 31.6 14.6 % 0.5 29.6 10.6 69.0 3.0 10.6 15.1 30.8 14.3 % 0.6 31.4 10.6 69.8 3.0 10.9 15.6 30.2 13.7 D (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD (% 5) ÖD Kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış Crimson Sweet fidelerinin seraya dikiminden sonra çiçek özellikleri değerlendirildiğinde, 2005 yılında erkek çiçek çapı, erkek çiçek çevresi ve çiçek tozu çapı değerleri kolhisin uygulamalarından önemli düzeyde etkilenerek farklı bulunmuştur. 2005 yılında en düşük erkek çiçek çapı 25.8 mm ile % 0.1 kolhisin dozunda elde edilirken, en yüksek erkek çiçek çapı % 0.6 kolhisin dozunda 32.3 mm olarak belirlenmiştir. 2005 yılında erkek çiçek çevresi ölçümlerinde en düşük değer % 0.1 kolhisin dozunda 8.6 cm olarak bulunurken, en yüksek değer 10.6 cm ile % 0.6 kolhisin dozunda belirlenmiştir. Çiçek tozu çapları karşılaştırıldığında 2005 yılında en düşük çiçek tozu çapı 62.3 µm ile % 0.1 kolhisin dozundan elde edilirken, en yüksek değer ise 71.7 µm ile % 0.6 kolhisin dozunda bulunmuştur. İkinci yıl denemesinde ise erkek çiçek çapı, çevresi ve çiçek tozu çapı değerleri önemlilik sınırlarına girmemiştir. Çiçek tozu kolpi sayısı 2005 ve 2006 deneme yıllarında tüm kolhisin dozlarında 3 adet olarak bulunmuştur. Yumurtalık çapı, yumurtalık yüksekliği, taç yaprak genişliği ve taç yaprak uzunluğu açısından ne denemenin birinci yılında ne de ikinci yılında kolhisin uygulamalarının önemli bir etkisi görülmüştür. 52

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN 2005 ve 2006 yıllarında in vivo koşullarda yetiştirilen Crimson sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında farklı dozlarda kolhisin uygulaması ile elde edilen bitkilerin seraya dikiminden sonra yaşama % leri Çizelge 4.9 da verilmiştir. Çizelge 4.9. 2005 ve 2006 yıllarında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında kolhisin uygulamasından sonra seraya aktarılan bitkilerin serada yaşama oranları (%) 2005 Yılı Denemesi 2006 Yılı Denemesi DOZLAR Seraya Dikilen Bitki Sayısı Serada Yaşayan Bitki Sayısı Seraya Dikimden Sonra Serada Yaşama (%) Seraya Dikilen Bitki Sayısı Serada Yaşayan Bitki Sayısı Seraya Dikimden Sonra Serada Yaşama (%) % 0.0 30 29 96.7 30 27 90.0 % 0.1 30 29 96.7 24 20 83.3 % 0.2 30 28 93.3 30 29 96.7 % 0.3 30 29 96.7 30 24 80.0 % 0.4 30 27 90.0 30 27 90.0 % 0.5 30 27 90.0 19 15 78.9 % 0.6 30 29 96.7 30 22 73.3 Çizelge 4.9 da görüldüğü gibi, 2005 yılı denemesinde en düşük yaşama oranı % 0.0 ile % 0.4 ve % 0.5 kolhisin dozlarında gözlenirken, en yüksek yaşama oranı % 96.7 ile % 0.0, % 0.1, % 0.3 ve % 0.6 kolhisin dozlarında gözlenmiştir. 2006 yılı denemesinde ise en düşük yaşama oranı % 73.3 ile % 0.6 kolhisin dozunda bulunurken, en yüksek yaşama oranı % 96.7 ile % 0.2 kolhisin dozunda bulunmuştur. 2006 yılında kotiledon aşamasında kolhisin uygulaması ile elde edilen bitkilerden kendileme yapılarak tohum elde edilmiştir. Çizelge 4.10. da uygulanan 7 farklı kolhisin dozuna göre, tohum elde edilen bitki oranları verilmiştir. Buna göre bitkinin % 76.5-92.9 undan kendilemelerle meyve elde edilmiştir. En yüksek tohum elde edilmesi ise % 92.9 ile % 0.5 kolhisin dozundan elde edilmiştir. 53

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.10. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen meyve oranları (%) DOZLAR Kendileme Yapılan Bitki Sayısı Tohumu Alınan Bitki Sayısı Meyve Tutma Oranı (%) % 0.0 22 17 77.3 % 0.1 17 13 76.5 % 0.2 24 20 83.3 % 0.3 19 16 84.2 % 0.4 20 17 85.0 % 0.5 14 13 92.9 % 0.6 20 17 85.0 2006 yılında kotiledon aşamasında kolhisin uygulaması ile elde edilen bitkilerden alınan örnekler Hollanda da bulunan Enza Zaden tohum firmasına gönderilerek ploidi analizleri yaptırılmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.11 de verilmiştir. En yüksek tetraploid eldesi % 5.0 ile % 0.1 kolhisin dozunda bulunurken, % 0.0, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6 kolhisin dozlarından elde edilen bitkilerin tamamında ploidi düzeyi 2n (diploid) olarak bulunmuştur. Çizelge 4.11. 2006 yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen ploidi düzeyleri DOZLAR Ploidi Analizine Gönderilen Bitki Sayısı (adet) 2n (Diploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) 4n (Tetraploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) Tetraploid Elde Edilme Oranı (%) % 0.0 6 6 0 0.0 % 0.1 20 19 1 5.0 % 0.2 29 28 1 3.4 % 0.3 24 24 0 0.0 % 0.4 27 27 0 0.0 % 0.5 15 15 0 0.0 % 0.6 22 22 0 0.0 Araştırmanın kolhisinin in vivo koşullarda kotiledon aşamasında uygulaması bölümünden elde edilen sonuçlar toplu olarak değerlendirildiğinde; farklı kolhisin dozlarının artışıyla birlikte bitkilerde gelişmenin zayıfladığı (2006 yılında farklılık olmamıştır) tespit edilmiştir. Bu farklılığın sebebi; 2005 yılındaki denemelerin serada 54

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN ve yerde yayılarak gelişmesidir. İkinci yıl denemesinde ise bitkiler askıda yetiştirilmiş ve dikim daha erken yapılmıştır. 2005 ve 2006 yıllarında 7 farklı kolhisin dozu uygulanmış in vivo dan elde edilen bitkilerde yapılan morfolojik ve sitolojik gözlem ve ölçüm sonuçları değerlendirildiğinde, kolhisin dozları arasında ve yıllar arasında önemli düzeyde farklılıklar gözlenmemiştir. Jaskani ve ark (2005a), yapmış oldukları çalışmada, tetraploid bitkilerde 4 polen kolpi sayıldığı, diploid bitkilerde ise 3 polen kolpi sayıldığını saptamışlardır. Bizim 2005 ve 2006 yıllarında yapmış olduğumuz gözlem ve ölçümlerde 7 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde polen kolpi sayısı 3 adet olarak tespit edilmiştir. Farklı dozlarda kolhisinin bitki yaşama oranı üzerine etkisi incelendiğinde, 2005 yılında uygulanan kolhisin dozlarının bitkilerdeki yaşama oranları % 90.0-96.7 arasında bulunurken, 2006 yılında % 73.3 yaşama oranı ile % 0.6 kolhisin dozunda en düşük olarak gözlenmiştir. 2006 yılı denemesinde flow sitometri sonuçlarına göre % 0.1 kolhisin dozunda % 5 oranında, % 0.2 kolhisin dozunda % 3.4 oranında tetraploid bitkiler elde edilirken % 0.0, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6 kolhisin dozlarında tetraploid bitki elde edilememiştir. Jaskani ve ark. (2004a), yapmış oldukları benzer bir çalışmada on karpuz hattına ait fidelerin gerçek yapraklarına 3 gün boyunca günde 2 defa olmak üzere % 0.2, % 0.4 ve % 0.6 dozlarında kolhisin uygulaması yapmışlardır. En yüksek ölüm oranın % 0.6 kolhisin konsantrasyonu uygulanmış bitkilerde olduğunu gözlemlemişlerdir. % 0.2 konsantrasyonunda kolhisin uygulamasında poliploidi miktarının fazla bulunduğunu, bununla birlikte farklı hatlarda % 3.3-% 5.5 arasında tetraploidi görüldüğünü bilirmişlerdir. Çalışma sonucunda elde etmiş oldukları değerler bizim çalışmamızda elde edilen sonuçlarla uyum içerisindedir. Charleston Gray 133 ve Princeton çeşitleri ile tetraploid karpuz hattı elde edebilmek için Lower ve Johnson (1969) ın yapmış olduğu çalışmada, fidelerin büyüme noktalarına % 0.3 lük kolhisin uygulamasının 24 saat içinde 2 damla, 52 saat içinde 8 damla olarak uygulamışlardır. Araştırıcılar, Princeton çeşidinde 8 damla kolhisin uygulamasının % 6 oranında tetraploid uyartımı sağlarken; C. Gray çeşidinde bu oranın % 4 düzeyinde bulunduğunu bildirmişlerdir. Bizim yaptığımız 55

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN çalışmada da kotiledon aşamasında kolhisin uygulaması ile tetraploid elde etme oranı Lower ve Johnson (1969) ile Jaskani ve ark. (2004a) nın buldukları değer olan % 5 ler seviyesinde kalmıştır. Buna karşılık; Li ve ark. (2002), yapmış oldukları benzer bir çalışmada 1-2 gerçek yapraklı aşamadaki YPW karpuz hattı fidelerine % 0.2 dozunda kolhisin uygulamışlardır. Araştırma sonucunda tetraploidi oranını % 12.4 olarak saptamışlardır. Bizim yapmış olduğumuz çalışmada ise % 0.2 kolhisin dozu ile % 3.4 oranında tetraploid bitki elde edilmiştir. Bu farklılığın denemelerde kullanılan farklı çeşitlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Tetraploid karpuz bitkilerinin DNA içeriklerini belirlemek amacı ile Jaskani ve ark. (2004b) kolhisin uygulaması çalışmalarında flow sitometrik analiz yöntemini, diğer ploidi belirleme metotları (bekçi hücrelerindeki kloroplast sayımı, kromozom sayımı, yaprak büyüklüğü, çiçek büyüklüğü, polen kolpi sayısı ve tohum özellikleri) ile karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar flow sitometrik analiz yönteminin tetraploid bitkilerde kloroplast miktarını belirlenmesinden daha hızlı bir yöntem olduğunu bildirmişlerdir. 4.1.2. Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması 2005 ve 2006 yıllarında, in vivo kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırması denemelerinde kolhisin uygulanan bölgenin üzerinde yapılan yaprak ve stomatal inceleme sonuçları Çizelge 4.12 ve 4.13 de sunulmuştur. İncelenen yaprak ve stomatal özellikler açısından her iki yılda birinci yıl yaprak özelliği parametresi hariç, uygulamalar kontrolden farksız bulunmuştur. Bir yaprağın alanı 1. yıl denemesinde 92.4-96.3 cm 2, ikinci yıl denemesinde 98.0-114.2 cm 2 ; yaprak uzunluğu 1. yıl denemesinde 9.0-14.3 cm, ikinci yıl denemesinde 12.4-14.5 cm; yaprak eni 1. yıl denemesinde 5.7-9.7 cm, ikinci yıl denemesinde 12.4-13.2 cm; stoma çapı birinci yıl denemesinde 17.8-19.0 μm, ikinci yıl denemesinde 16.1-17.6 μm; stoma boyu 1. yıl denemesinde 21.7-25.5 μm, ikinci yıl denemesinde 26.3 μm; kloroplast sayısı birinci yıl denemesinde 9-10 adet; ikinci yıl denemesinde 10-11 56

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN adet, ve birim alana düşen stoma sayısı birinci yıl denemesinde 341-377 adet/mm 2 ; ikinci yıl denemesinde 347-409 adet/mm 2 arasında değişmiştir. Çizelge 4.12. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi Yaprak Özellikleri Stomatal Özellikler DOZLAR Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) % 0.0 96.3 9.0 b 5.7 b 17.8 21.7 9 377 % 0.5 92.4 12.7 a 9.2 a 19.0 25.1 10 341 % 1.0 95.6 14.3 a 9.7 a 17.8 25.5 9 355 D (%5) ÖD (%1) 3.30 (%1) 2.69 (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD Çizelge 4.13. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi Yaprak Özellikleri Stomatal Özellikler DOZLAR Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) % 0.0 114.2 13.3 13.2 16.1 26.3 10 409 % 0.5 98.0 12.4 12.7 16.6 26.3 11 347 % 1.0 106.4 14.5 12.4 17.6 26.3 11 347 D (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD 2005 ve 2006 yıllarında in vivo sürgün ucu daldırma uygulamalarının çiçek özelliklerine etkileri Çizelge 4.14 ve Çizelge 4.15 de verilmiştir. 57

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.14. 2005 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi DOZLAR Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak Uzunluğu (mm) % 0.0 22.1 7.5 62.0 3.0 10.0 12.4 22.3 a 11.3 % 0.5 27.6 9.3 69.9 3.0 8.9 13.3 20.7 b 12.8 % 1.0 27.3 9.0 66.8 3.0 9.5 12.4 22.1a 11.8 D (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) ÖD (%5) 1.21 (%5) ÖD Çizelge 4.15. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi DOZLAR Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak Uzunluğu (mm) %0.0 32.3 11.1 65.5 b 3.0 10.9 ab 15.8 a 30.0 14.8 %0.5 31.4 10.6 69.6 ab 3.0 10.0 b 14.3 b 30.7 14.2 %1.0 32.3 11.2 70.1 a 3.0 12.0 a 16.5 a 31.9 15.5 D (%5) ÖD (%5) ÖD (%5)4.36 (%5) ÖD (%5) 1.99 (%5) 1.36 (%1) ÖD (%5) ÖD 2005 deneme yılında yapılan gözlemlerde en düşük erkek çiçek çapı 22.1 mm ile % 0.0 kolhisin dozunda elde edilirken, en yüksek değer 27.6 mm ile % 0.5 kolhisin dozundan elde edilmiştir. 2006 deneme yılında ise en düşük erkek çiçek çapı 31.4 mm ile % 0.5 kolhisin dozunda belirlenirken, en yüksek 32.3 mm ile % 0.0 ve % 1.0 kolhisin dozlarında belirlenmiştir (Çizelge 4.14 ve Çizelge 4.15). Erkek çiçek çevresi 2005 yılında 7.5-9.3, 2006 yılında 10.6-11.2 cm; çiçek tozu çapı 2005 yılında 62.0-69.9 μm, 2006 yılında 65.5-70.1 μm; yumurtalık çapı 2005 yılında 8.9-10.0 mm, 2006 yılında 10-12 mm; yumurtalık yüksekliği 2005 yılında 12.4-13.3 mm, 2006 yılında 14.3-16.5 mm; taç yaprak genişliği 20.7-22.3 mm, 2006 yılında 30.0-31.9 mm ve taç yaprak uzunluğu 2005 yılında 11.3-12.8 mm, 2006 yılında 14.2-15.5 mm arasında değişmiştir. 2005 ve 2006 yıllarında çiçek tozu kolpi sayısı 3 adet olarak tespit edilmiştir. 58

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN 2006 yılında kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması ile elde edilen bitkilerden de kendileme yapılarak tohum elde edilmiştir. Çizelge 4.16 da uygulanan 3 farklı kolhisin dozuna göre elde edilen meyve oranları verilmiştir. Buna göre % 0.0, % 0.5 ve % 1.0 dozlarında sürgün ucuna kolhisin uygulamasının meyve tutma oranı benzer (% 75-77) bulunmuştur. Çizelge 4.16. 2006 yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün ucunun kolhisin çözeltisine daldırılması ile elde edilen meyve tutma oranları (%) DOZLAR Kendileme Yapılan Bitki Sayısı Tohumu Alınan Bitki Sayısı Meyve Tutma Oranı (%) % 0.0 22 17 77.3 % 0.5 20 15 75.0 % 1.0 20 15 75.0 2006 yılında kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması ile elde edilen bitkilerden alınan örnekler de Hollanda da bulunan Enza Zaden tohum firmasına gönderilerek ploidi analizleri yaptırılmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.17 de verilmiştir. Yapılan flow sitometri analizlerine göre, tetraploid bitki eldesi % 4.2 ile % 0.5 kolhisin dozunda bulunurken, % 0.0 ve 1.0 kolhisin dozlarından elde edilen tüm bitkilerde ploidi düzeyi 2n (diploid) olarak bulunmuştur. Çizelge 4.17. 2006 yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine ait bitkilerinin kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması ile elde edilen ploidi oranı (%) DOZLAR Ploidi Analizine Gönderilen Bitki Sayısı (adet) 2n (Diploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) 4n (Tetraploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) Tetraploid Elde Oranı (%) % 0.0 6 6 0 0.0 % 0.5 24 23 1 4.2 % 1.0 23 23 0 0.0 Çalışmanın kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması bölümünde elde edilen sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde; 2005 ve 2006 yıllarında 3 farklı kolhisin dozu uygulanmış sürgün uçlarından elde edilen bitkilerde yapılan morfolojik 59

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN ve sitolojik gözlem ve ölçümler birbirine yakın sayılabilecek değerler ortaya koymuşlardır. 2006 yılında sürgün ucunun kolhisin çözeltisine daldırılması ile elde edilen bitkilerin flow sitometri sonuçlarına göre % 0.5 kolhisin dozunda % 4.2 oranında tetraploid bitki elde edilmiş % 0.0 ve % 1 kolhisin dozları uygulanmış bitkilerin diploid olduğu belirlenmiştir. Haploid kavun bitkilerinin dihaploid hale getirilmesinde dünyadaki in vitro yöntemlerle başarı oranı olan % 10-35 seviyesinde iken (Sauton, 1987; Abak ve ark., 1996; Sari ve ark., 1999b), in vivo kolhisin uygulaması ile Yetişir ve Sarı (2003) nın yaptıkları bir çalışmada bu oran % 90 ın üzerinde çıkmıştır. Diploid karpuzun tetraploid hale getirilmesi için yaptığımız bu çalışmada ise in vivo kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması uygulaması ile en fazla % 4.2 oranında katlama meydana gelebilmiştir. 4.2. In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi 4.2.1. Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı 2005 yılında in vitro koşullarda kurulan denemede, rejenerasyon ortamında 4 farklı BA dozunun kullanımı ile elde edilen eksplantlarda, 4 hafta boyunca haftada bir kez yeşil kallus oluşturan eksplant oranı, sürgün oluşturan eksplant oranı ve tomurcuk oluşturan eksplant oranı gözlemleri yapılmıştır. Yapılan bu gözlemler Çizelge 4.18 de verilmiştir. 60

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.18. Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürdeki kallus, sürgün ve tomurcuk oluşturma oranlarına etkileri BA konsantrasyonu Yeşil Kallus Oluşturan Eksplant Oranı (%) 24.03.2005 31.03.2005 07.04.2005 17.04.2005 Sürgün Oluşturan Eksplan Oranı (%) Tomurcuk Oluşturan Eksplant Oranı (%) Yeşil Kallus Oluşturan Eksplant Oranı (%) Sürgün Oluşturan Eksplan Oranı (%) Tomurcuk Oluşturan Eksplant Oranı (%) Yeşil Kallus Oluşturan Eksplant Oranı (%) Sürgün Oluşturan Eksplan Oranı (%) Tomurcuk Oluşturan Eksplant Oranı (%) Yeşil Kallus Oluşturan Eksplant Oranı (%) Sürgün Oluşturan Eksplan Oranı (%) Tomurcuk Oluşturan Eksplant Oranı (%) 0 mg/l 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1 mg/l 91.6 0.0 0.0 91.6 15.0 3.3 100.0 43.3 33.3 100.0 68.3 48.3 2 mg/l 93.3 0.0 0.0 95.0 5.0 3.3 98.3 8.3 55.0 98.3 21.6 66.6 4 mg/l 78.3 0.0 0.0 85.0 3.3 1.6 91.6 13.3 30.0 96.6 31.6 41.6 Çizelge 4.18 de görüldüğü gibi rejenerasyon ortamında 0 mg/l BA konsantrasyonu kullanılan bitkilerde (kontrol grubu) yapılan gözlemlerde yeşil kallus, sürgün ve tomurcuk eksplantı gözlenmemiştir. 24.03.2005 tarihinde yapılan ilk gözlemde en düşük yeşil kallus oranı % 78.3 ile 4mg/l BA konsantrasyonunda gözlenirken, en yüksek % 93.3 ile 2 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenmiştir. 24.03.2005 tarihinde hiçbir doz uygulamasında henüz sürgün ve tomurcuk oluşumu başlamadığı için sürgün ve tomurcuk oluşturan eksplant oluşturma oranları % 0 bulunmuştur. Daha sonra yapılan haftalık gözlemlerde kontrol (0 mg/l BA) hariç, tüm uygulamalarda kallus, sürgün ve tomurcuk oluşumları artmıştır. 17.04.2005 tarihinde yapılan son gözlemde; en düşük yeşil kallus oluşturma oranı % 96.6 ile 4 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenirken, en yüksek % 100 ile 1 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenmiştir. En düşük sürgün geliştirme oranı % 21.6 ile 2 mg/l BA konsantrasyonunda bulunurken, en yüksek % 68.3 ile 1 mg/l BA konsantrasyonunda bulunmuştur. En düşük tomurcuk geliştirme oranı % 41.6 ile 4 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenirken, en yüksek % 66.6 ile 2 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenmiştir. Şekil 4.2 de farklı BA dozları içeren rejenerasyon ortamındaki eksplantlar verilmiştir. 61

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Şekil 4.2. Farklı BA dozları içeren rejenerasyon ortamında bulunan eksplantların kültüre alımdan 25 gün sonraki görünümleri Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkilerin sürgün geliştirme ve köklendirme ortamındaki sayısı ve çoğalma katsayısı ile ilgili Çizelge 4.19 da verilmiştir. Çizelge 4.19. Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürlerdeki çoğalma katsayısı ve bitki sayılarına etkisi BA Konsantrasyonu Rejenerasyon Ortamından Elde Edilen Genotip Sayısı Bitki Sayısı Genotip Sayısı 1.Kök Ortamına Alınan Bitki Sayısı Çoğalma Kat Sayısı Yaşayan Genotip Oranı (%) Genotip Sayısı 2. Kök Ortamına Alınan Bitki Sayısı Çoğalma Kat Sayısı Yaşayan Genotip Oranı (%) 0 mg/l BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 mg/l BA 132 132 102 173 1.70 77 75 326 4.3 74 2 mg/l BA 120 120 66 100 1.52 55 38 136 3.6 58 4 mg/l BA 113 113 97 208 2.14 86 57 243 4.3 59 62

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.19 da görüldüğü gibi rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile en yüksek genotip eldesi 132 adet ile 1 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilmiştir. 1. köklendirme ortamında en yüksek çoğalma katsayısı 2.14 ile 4 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamında elde edilen bitkilerde bulunmuştur. 2. kök ortamında ise en yüksek çoğalma katsayısı 4.3 ile 1 mg/l ve 4 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamında elde edilen bitkilerde bulunmuştur. 1. kök ortamında yaşayan genotip oranı en yüksek % 86 ile 4 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamında elde edilen bitkilerde gözlenirken, 2. kök ortamında % 74 ile 1 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamından elde edilen bitkilerde gözlenmiştir. Şekil 4.3 de rejenerasyon ortamında 4 farklı BA dozunun kullanımı ile elde edilmiş bitkiler gösterilmiştir. Şekil 4.3. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları ile elde edilmiş sürgünlerin kardeşlendirme ortamındaki görünümü Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkiler köklendirildikten sonra alıştırma serasına çıkarılmıştır. Çizelge 4.20 de alıştırma serasına çıkarılan bitki sayıları ve yaşama oranları verilmiştir. 63

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.20. In vitro farklı BA dozları uygulamalarından elde edilen bitkilerde alıştırma serasına çıkarılan bitki sayısı, seraya çıkarılan bitki sayısı ile serada yaşama oranları (%) BA Konsantırasyonu Alıştırma Serasına Çıkarılan Genotip Sayısı Bitki Sayısı Yaşayan Genotip Oranı (%) Genotip Sayısı Seraya Aktarılan Bitki Sayısı Yaşayan Genotip Oranı (%) Genotip Sayısı Serada Yaşayan Bitki Sayısı Yaşayan Genotip Oranı (%) 0 mg/l BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 mg/l BA 58 139 77 23 45 40 19 33 83 2 mg/l BA 29 67 76 14 28 48 9 13 64 4 mg/l BA 43 114 75 19 38 44 15 26 79 Çizelge 4.20 de görüldüğü gibi 0 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamından hiç bitki elde edilememiştir. Alıştırma serasına en fazla 58 adet 1 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamından elde edilen bitkilerden çıkarılmış ve alıştırma serasında en fazla yaşama oranı % 77 ile olmuştur. Seraya en fazla 23 adet 1 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamından elde edilen bitkilerden çıkarılmıştır. Serada en fazla yaşama oranı % 48 ile 2 mg/l BA konsantrasyonlu rejenerasyon ortamından elde edilen bitkilerde gözlenmiştir. 19 adet ile 1 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkiler serada en fazla yaşayan bitkiler olarak gözlenmiştir. En yüksek yaşama oranı % 83 ile 1 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde gözlenmiştir. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkilerde yaprak ve stomatal özellikler incelenmiştir. Kontrol uygulamasından bitki elde edilemediği için ölçüm yapılmamıştır. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.21 de verilmiştir. 64

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.21. In vitro da farklı BA dozları uygulamasının serada yetiştirilen bitkilerde yaprak ve stomatal özelliklere etkileri BA Konsantrasyonu Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Özellikleri Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Stomatal Özellikler Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) 1 mg/l 110.1 13.7 12.7 16.6 25.6 10.0 241 2 mg/l 111.0 15.0 12.8 16.6 26.8 9.0 259 4 mg/l 133.2 15.7 14.4 17.0 26.8 9.0 276 Çizelge 4.21 de görüldüğü gibi rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkilerde yaprak ve stomatal özelliklerde önemli farklılıklar görülmüştür. Yaprak alanı en düşük 110.1 cm 2 ile1 mg/l BA bitkilerinde gözlenirken, en yüksek 133.2 cm 2 ile 4 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde ölçülmüştür. En düşük yaprak uzunluğu 13.7 cm ve en düşük yaprak eni 12.7 cm ile 1 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde tespit edilmiş, en yüksek yaprak uzunluğu 15.7 cm ile ve en yüksek yaprak eni 14.4 cm ile 4 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde bulunmuştur. Stomatal özellikler açısından, en yüksek birim alana düşen stoma sayısı 276 adet/mm 2 ile 4 mg/l BA bitkilerinden elde edilirken, en düşük 241 adet/mm 2 ile 1 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilmiştir. Çizelge 4.22 de rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkilerde seraya dikimden sonra ölçülen çiçek özellikleri sunulmuştur. Buna göre en düşük çiçek çapı 28 mm ile 2 mg/l BA bitkilerinde bulunurken, en yüksek çiçek çapı 31.1 mm ile 4 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilmiş bitkilerde bulunmuştur. Erkek çiçek çevresi ölçümlerinde birbirine yakın değerler tespit edilmiştir. Çiçek tozu çapı 1, 2 ve 4 mg/l BA konsantrasyonlarında 68.2 µm olarak bulunmuştur. Çiçek tozu kolpi sayısı 3 farklı BA dozundan elde edilmiş bitkilerinde 3 adet olarak sayılmıştır. Çizelge 4.22 de görüldüğü gibi diğer çiçek ölçümleri sonuçları (yumurtalık çapı, yumurtalık yüksekliği taç yaprak genişliği, taç yaprak uzunluğu) birbirine yakın değerler vermiştir. 65

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.22. In vitro da farklı BA dozları uygulamsının serada yetiştirilen bitkilerde çiçek özelliklerine etkileri BA Konsantrasyonu Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı (adet) Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak Uzunluğu (mm) 1 mg/l 29.2 10.1 68.2 3.0 9.9 13.0 23.8 13.6 2 mg/l 28.0 10.1 68.2 3.0 9.2 12.7 23.1 12.4 4 mg/l 31.1 11.0 68.2 3.0 10.4 13.9 23.4 14.1 Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen bitkilerden alınan yaprak örneklerinde yapılan ploidi analizi sonuçları Çizelge 4.23 de sunulmuştur. Tetraploid bitki eldesi % 60.4 gibi oldukça yüksek bir oranda 4 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde en fazla bulunurken, en az % 44.4 ile 2 mg/l BA konsantrasyonundan elde edilen bitkilerde bulunmuştur. Çizelge 4.23. In vitro da farklı BA dozları uygulamasının ploidi seviyesine etkileri BA Konsantrasyonu Plodi Analizine Gönderilen Bitki Sayısı (adet) 2n (Diploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) 4n (Tetraploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet9 Tetraploid Elde Etme Oranı (%) 1 mg/l BA 19 10 9 47.4 2 mg/l BA 9 5 4 44.4 4 mg/l BA 15 6 9 60.4 Şekil 4.4 de kontrol bitkisinde 2n (diploid) flow sitometri görüntüsü ile Şekil 4.5 de 1 mg/l BA dozundan elde edilen tetraploid bitkinin flow sitometri sonucuna göre bilgisayar ortamındaki görüntüsü sunulmuştur. 66

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Şekil 4.4. Kontrol bitkisinde flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü Şekil 4.5. 1 mg/l BA dozundan elde edilen tetraploid bitkinin ve flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü In vitro çalışmalardan rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, 0 mg/l BA dozu uygulanmış rejenerasyon ortamından bitki elde edilememiştir. 1 mg/l, 2 mg/l ve 4 mg/l BA dozlarında ise kallus, sürgün ve tomurcuk oluşturma oranları arasında birbirine yakın sayılabilecek değerler saptanmıştır. MS ortamında çimlendirilen 5 günlük Crimson 67

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Sweet karpuz tohumlarından elde edilen kotiledonlardan alınmış eksplantların Yalçın Mendi ve ark. (2003) bizim çalışmamızdan farklı olarak BA (0, 1, 2, 4 mg/l) ve IAA (0, 0.5, 5 µm) kombinasyonları içeren MS rejenerasyon ortamında kültüre almışlardır. Araştırma sonucunda, maksimum sürgün gelişimi 10 µm BA + 0.5 µm IAA ve 20 µm BA (% 75 ve % 78) içeren rejenerasyon ortamında direkt organogenesis yolu ile elde etmişlerdir. Çürük ve ark. (2003), kavun ve hıyar rejenerasyonu ile ilgili yaptıkları çalışmada 4.4 µm BA içeren MS ortamında hızlı ve direkt rejenere olan çoklu sürgün oluşumunu gözlemişlerdir. Dört karpuz hattında rejenerasyon ortamı kullanılarak 10 µm BA kullanımı ile Compton ve ark. (1994a), 2, 4, 6, 8 ve 10 günlük çimlenme süreleri sonucunda sürgün miktarını incelemişlerdir. Araştırmacıların yaptıkları çalışma sonucunda 2 ve 4 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından en yüksek sürgün miktarı elde edilmiştir. Compton ve ark. (1993b) ise elde ettikleri sürgün uçlarını köklendirerek dış koşullara alıştırılması sonucu % 21-96 arasında başarı sağlamışlardır. Bizim yapmış olduğumuz çalışmada ise bu oran % 64-83 arasında değişkenlik göstermiştir. In vitroda farklı BA dozları uygulaması ile elde edilen bitkilerde flow sitometri analizi sonuçları değerlendirildiğinde; 4 mg/l BA dozunda % 60.4 oranında tetraploid bitki elde edilmiştir. Compton ve ark. (1996), yaptıkları çalışmada beş karpuz çeşidinin kotiledon eksplantlarından rejenerasyon yolu ile elde ettikleri bitkilerde tetraploid oranının çeşitler arasında önemli bir farklılık gösterdiği ve % 5 ve % 20 arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Bizim yapmış olduğumuz çalışmada 1 mg/l, 2 mg/l ve 4 mg/l BA dozu uygulanmış bitkilerde tetraploid bitki eldesi % 44.4 - % 60.4 arasında bulunmuştur. Bu sonuç Çürük ve ark. (2003), ile uyum içerisindedir. Buradaki yüksek tetraploid oluşumu Çürük ve ark. (2003) nın belirttikleri gibi, karpuz kotiledonlarının proksimal kısımlarında bulunan poliploid hücrelerden kaynaklanabilir. In vitro da farklı BA dozları uygulaması ile elde edilen bitkilerde yapılan morfolojik ve sitolojik gözlem ve ölçüm sonuçları incelendiğinde, farklı BA konsantrasyonları arasında birbirine yakın sayılabilecek değerler bulunmuştur. Fakat birim alana düşen stoma sayısı değerlendirildiğinde 1 mg/l BA dozu uygulaması sonucu elde edilen bitkilerde 241 adet/mm 2 olarak sayılırken, diploid (kontrol) 68

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN bitkilerde 297 adet/mm 2 olarak sayılmıştır. Kloroplast yoğunluğu, yumurtalık çapı, erkek çiçeklerin taç yaprak-anter çapı ve yaprak boy/genişlik oranlarının bitki ploidi belirlemede iyi göstergeler olduğu Compton ve ark. (1996) tarafından bildirilmiştir. Bizim çalışmamızda ise morfolojik karekterler açısından doğrudan bir ayrım tespit edilememiştir. Bunun sebebi çok fazla sayıda bitkide çalışılması ve her bitkinin morfolojik karakterlerinin ölçülerek ortalamalara katılması olabilir. 4.2.2. In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra bitkiler E20A besi ortamına alınmış ve 3 hafta sonra bitkilerde 1 er hafta arayla yaşayan bitki sayısı, yaşayan bitkilerdeki boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayısı ölçüm ve sayımları yapılmış ve sonuçları Çizelge 4.24 de sunulmuştur. Çizelge 4.24 de görüldüğü gibi, kontrol uygulamasında yaşama oranı % 100 olmuş ve boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayıları da kolhisin uygulamasına göre daha yüksek olmuştur. Son gözlem tarihinde, boğum sayısı % 1 uygulamasında 1-7 adet, kontrolde 4-3 adet, bitki uzunluğu % 1 uygulamasında 1-2 cm, kontrolde 5-1 cm; kök sayısı ise % 1 uygulamasında 1-6 adet, kontrolde 3-0 adet olarak tespit edilmiştir. % 0.5 dozunda kolhisin uygulanan bitkilerde sözkonusu değerler % 0 ve % 1 dozunda uygulanan bitkilerin arasında yer almıştır. Diğer bir ifadeyle kolhisinin toksik etkisi görülmüş ve bu etki doz arttıkça bitkinin daha zayıf gelişmesiyle kendini göstermiştir (Çizelge 4.24). Çizelge 4.24. In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra yaşayan bitki sayısı, yaşayan bitkilerdeki boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayısı DOZLAR 10.05.2005 Yaşayan Bitki (%) Boğum Sayısı (adet) Bitki Uzunluğu (cm) Kök sayısı (adet) 17.05.2005 24.05.2005 10.05.2005 17.05.2005 24.05.2005 % 0.0 100 100 a 100 a 3.9 a 4.2 a 4.3 a 4.2 a 4.7 a 5.1 a 2.9 a 2.9 a 3.0 % 0.5 100 88.3 b 81.6 b 0.9 b 1.9 b 2.2 b 1.0 b 1.4 b 1.8 b 1.3 b 1.4 ab 1.8 % 1.0 100 81.6 c 61.6 c 0.6 b 1.4 b 1.7 b 0.6 b 0.7 b 1.2 b 0.9 b 1.1 b 1.6 D (% 5) ÖD (% 1) 2.93 (% 1) 2.70 (% 1) 0.70 (% 1) 1.23 (% 1) 1.51 10.05.2005 (% 1) 1.58 17.05.2005 (% 1) 1.66 24.05.2005 (% 1) 2.45 10.05.2005 (% 5) 1.38 17.05.2005 (% 5) 1.80 24.05.2005 (% 5) ÖD 69

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Şekil 4.6 da in vitro diploid mikro çeliklere farklı konsantrasyonlarda kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra E20A besi ortamına alınan bitkiler görülmektedir. a b Şekil 4.6.a. Farklı konsantrasyonlarda diploid mikro çeliklere kolhisin uygulamasından sonra E20A besi ortamına alınan bitkilerin ilk gözlem tarihindeki görünümleri. b. Bitkilerin sera koşullarına çıkarılmadan önceki görünümleri In vitro diploid mikro çeliklerde kolhisin uygulaması sonrası elde edilen bitkilerde incelenen yaprak ve stomatal özellik sonuçları Çizelge 4.25 de verilmiştir. Çizelge 4.25. In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde kolhisinin yaprak ve stomatal özellikler üzerine etkileri Kolhisin dozları Yaprak Alanı (cm 2 ) Yaprak Özellikleri Yaprak Uzunluğu (cm) Yaprak Eni (cm) Stoma Çapı (µm) Stoma Boyu (µm) Stomatal Özellikler Kloroplast Sayısı (adet/stoma) Birim Alana Düşen Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) % 0.0 108.9 14.2 13.3 17.8 25.1 10 297 % 0.5 83.2 13.0 10.8 17.0 26.8 9 259 % 1.0 90.4 13.1 11.0 14.6 26.8 9 293 Çizelge 4.25 de sunulduğu gibi, en düşük yaprak alanı 83.2 cm 2 ile % 0.5 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde, en yüksek yaprak alanı 108.9 cm 2 ile % 0.0 70

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde tespit edilmiştir. Yaprak uzunluğu ve yaprak eni en düşük % 0.5 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde bulunmuş, en yüksek ise % 0.0 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde belirlenmiştir. En düşük stoma çapı 14.6 μm ile % 1.0 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde kaydedilirken, en yüksek stoma çapı 17.8 μm ile % 0.0 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerde tespit edilmiştir. Stoma boyu 25.1 μm ile % 0.0 kolhisin dozunda en düşük bulunurken, % 0.5 ve % 1.0 kolhisin dozlarında 26.8 μm olarak bulunmuştur. Kloroplast sayısı 9-10 adet stoma arasında, birim alana düşen stoma sayısı ise 259-297 adet/mm 2 arasında değişmiştir. In vitro diploid mikroçeliklerde kolhisin uygulaması sonrası elde edilen bitkilerde yapılan çiçek özellikleri ölçüm sonuçları Çizelge 4.26 da sunulmuştur. Çizelge 4.26. In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde çiçek özellikleri Kolhisin dozları Erkek Çiçek Çapı (mm) Erkek Çiçek Çevresi (cm) Çiçek Tozu Çapı (µm) Çiçek Tozu Kolpi Sayısı (adet) Yumurtalık Çapı (mm) Yumurtalık Yüksekliği (mm) Taç Yaprak Genişliği (mm) Taç Yaprak Uzunluğu (mm) % 0.0 26.4 11.0 61.4 3.0 8.9 13.2 23.3 13.8 % 0.5 29.3 9.9 68.2 3.0 9.0 13.0 237 13.1 % 1.0 28.6 9.5 70.6 3.0 9.2 13.9 23.3 13.1 Çizelge 4.26 da sunulduğu gibi, diğer yaprak ve stoma incelemelerinde de olduğu gibi çiçek özellikleri de birbirine yakın bulunmuş ve kolhisin uygulamalarının kontrole göre belirgin bir farklılığı olmamıştır. In vitro diploid mikroçeliklere farklı kolhisin dozu uygulamasının bitkideki ploidi düzeylerine etkilerine ait sonuçlar Çizelge 4.27 de sunulmuştur. 71

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Sezen İNAN Çizelge 4.27. In vitro diploid mikro çeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde ploidi düzeyleri (%) Kolhisin Dozları Plodi Analizine Gönderilen Bitki Sayısı (adet) 2n (Diploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) 4n (Tetraploid) Elde Edilen Bitki Sayısı (adet) Tetraploid Elde Etme Oranı (%) % 0.0 9 9 0 0 % 0.5 11 7 4 36.4 % 1.0 10 7 3 30.0 Tetraploid bitki elde etme oranı % 0.5 dozunda kolhisin uygulaması ile % 36.4 oranında elde edilmiş, bu oran % 1 dozunda % 30.0 olarak bulunmuş ve kontrol bitkilerinin tamamı ise beklendiği gibi diploid bulunmuştur. In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması ile elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde 3 farklı (% 0.0, % 0.5 ve %1.0) kolhisin uygulaması yapılmış bitkilerde 1 er hafta arayla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu, kök sayısı ve yaşayan bitki oranı gözlem ve ölçümlerinde kolhisin dozu arttıkça bitkide toksik etkisinin görüldüğü ve bitkinin daha zayıf geliştiği gözlenmiştir. Haploid karpuz bitkilerini katlamak amacı ile in vitro koşullarda yapılan bir çalışmada (Sarı ve Abak, 1996), % 0.5 yoğunlukta kolhisin uygulanan bitkilerin % 64 ünün yaşadığını ve % 56 sının gelişerek yeni bitkiye dönüştüğü bildirilmiştir. Aynı çalışmada, % 1 kolhisin dozunda yaşama ve gelişme oranlarının % 40 olduğu, düşük doz ve kısa sürelerde ise bitkilerin haploid kaldığı belirtilmiştir. Kavunda haploid bitkilerin dihaploidileştirilmesi için in vitro kolhisin uygulaması ile ise % 10-35 oranında katlama meydana geldiği (Sauton, 1987; Abak ve ark., 1996; Sarı ve ark., 1999b) tespit edilmiştir. Bu çalışmadan in vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması sonucunda % 0.5 kolhisin dozunda % 36.4 oranında tetraploid bitki elde edilmiştir. Tetraploidi elde edilmesi için oldukça yüksek bir değer olan bu yöntem; karpuzda tetraploid bitki elde edilmesi için yeni yöntem olarak tespit edilmiştir. 72

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Sezen İNAN 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Karpuz tarımının dünyada ve ülkemizde oldukça önemli bir yeri vardır. Karpuz, iştah açıcı, serinletici ve ferahlatıcı bir etkiye sahip yazlık bir sebzedir. Karpuz meyvesindeki aşırı tohum sayısı uluslararası marketlerde istenmeyen bir duruma gelmiştir. Bu istenmeyen durumu bertaraf etmek için çekirdeksiz karpuz ıslahı çalışmalarına Dr. Kihara 1939 yılında başlamıştır. Ülkemizde çekirdeksiz karpuz tohum üretimi bulunmamaktadır. Yetiştiriciliği ise tohum fiyatlarının pahalılığından dolayı son derece kısıtlı alanlarda yapılmaktadır. Yapılan bu çalışmada tetraploid ana ebeveyn geliştirilmesi ile ileride yerli çekirdeksiz karpuz çeşitleri elde edilmesi hedeflenmiştir. In vivo ve in vitro yöntemler kullanılarak tetraploid ana ebeveyn geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla materyal olarak Crimson Sweet karpuz çeşidi kullanılmış ve iki in vivo ile iki in vitro yöntemi karşılaştırılmıştır. In vivo kolhisin uygulamasıyla tetraploid bitki elde edilmesi için; Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması Kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması In vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesi için; Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması çalışmaları yapılmıştır. Yapılan çalışmada, tetraploid bitki elde etmek için kullanılan dört farklı deneme sonucu elde edilen bitkilerden örnekler alınarak Hollanda da bulunan Enza Zaden tohum firmasına gönderilerek bitkilerin ploidi düzeylerine karar verilmiştir. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ile elde edilmiş bitkilerde; en yüksek tetraploid eldesi % 60.4 oranı ile 4 mg/l BA dozu uygulanmış rejenerasyon ortamından elde edilen bitkilerde bulunmuştur. Kavunda (Sauton, 1987; Abak ve ark., 1996; Sarı ve ark., 1999b) ve karpuzda (Sarı ve Abak, 1996) haploid bitkilerin dihaploidleştirilmesi için 73

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Sezen İNAN kullanılan yöntem; diploid karpuzun tetraploidleştirilmesi için de ilk kez kullanılmış ve çok başarılı sonuçlar elde edilmiştir. In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması sonucu elde edilen bu bitkilerde; en yüksek tetraploid oranı % 36.4 oranı ile % 0.5 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerden elde edilmiştir. Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması sonucunda; en yüksek tetraploid bitki eldesi % 5 oranı ile % 0.1 kolhisin dozundan elde edilmiştir. Kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması sonucunda elde edilen bitkilerde; en yüksek tetraploid eldesi % 4.2 oranı ile % 0.5 kolhisin dozu uygulanmış bitkilerden elde edilmiştir. Araştırmada elde edilen sonuçlar genel olarak değerlendirildiğinde; rejenerasyon ortamında farklı BA dozlarının kullanımı ve in vitro kolhisin uygulamaları ile elde edilmiş bitkilerde, tetraploid bitki elde edilme oranı daha fazla bulunmuştur. In vitro yöntemlerin tetraploid bitki elde edilmesinde, in vivo yöntemlere oranla daha başarılı ve uygulanabilir olduğu bu çalışma ile ortaya çıkartılmıştır. Yapılan çalışmada, tetraploid bitki elde edilmesi için, kullanılan dört farklı deneme sonucu elde edilen bitkilerde morfolojik ve sitolojik gözlem ve ölçümler yapılmıştır. Elde edilen sonuçlarda uygulanan dört denemede de önemli farklılıklar gözlenmemiştir. Flow sitometri yönteminin bitkilerin ploidi düzeylerini daha kolay ve kısa sürede belirlemede kullanılabilirliği söylenebilir. Diğer morfolojik ayrım kriterleri karpuzun da içinde bulunduğu çok sayıda türde ploidi belirlemede kullanılabilirken; bizim çalışmamızda çok sayıda bitki ile çalışılması, ploidi tespiti öncesinde bütün bitkilerde ölçüm yapılmış olması ve ortalama değerlerin verilmesi bu ayrımın yapılmasını güçleştirmiştir. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda in vitro da başarılı olan en iyi dozların değişik karpuz genotipleri için geçerli olup olmayacağının, diğer bir ifadeyle yöntemin genotip seçici olup olmadığının belirlenmesi ile yerli çekirdeksiz karpuz çeşitleri geliştirmek için tetraploid ebeveynlerin geliştirilmesi öncelikli çalışmalardan olmalıdır. 74

KAYNAKLAR ABAK, K., SARI, N., PAKSOY, M., YILMAZ, H., AKTAŞ, H., TUNALI, C., 1996. Genotype Response to Haploid Embryo Induction with Pollination by Irradiated in Melon, Obtaining of Dihaploid Lines, Determination of Haploid plants by Different Tecniques. Tr. J. Agric. For., 20, 425-430. ANONYMOUS, 2005. http://faostat.fao.org COMPTON, M.E., GRAY, D.J., 1993a. Shoot Organogenesis and Plant Regeneration From Cotyledons of Diploid, Triploid and Tetraploid Watermelon. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 118,151-157. COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1993b. A Simple Protocol for Micropropagating Diploid and Tetraploid Watermelon Using Shoot-Tip Explants. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 33, 211-217. COMPTON, M.E., GRAY, D.J., 1994a. Adventitious Shoot Organogenesis and Plant Regeneration from Cotyledons of Tetraploid Watermelon. HortScience, 29 (3), 211-213. COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1994b. Regeneration of Tetraploid Plants from Cotyledons of Diploid Watermelon. Proc. Fla. State Hort. Soc., 107, 107-109. COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1996. Identification of Tetraploid Regeneration From Cotyledons of Diploid Watermelon Cultured In Vitro. Euphytica, 87, 165-172. COMPTON, M.E., 2000. Interaction Between Eksplant Size and Cultivar Affects Shoot Organogenic Competence of Watermelon Cotyledons. HortScience, 35(4), 749-750. CURUK, S., ANANTHAKRISHNAN, G., SINGER, S., XIA, X., ELMAN, C., NESTEL, D., CETİNER, S., GABA, V., 2003. Regeneration in vitro From the Hypocotyl of Cucumis Species Produces Almost Exculsively Diploid Shoots and Does Not Require Light. HortScience, 38(1),105-109. GONZALEZ, C., AYUSO, M. C., 1991. A New Alternative: "Seedless" Watermelon. Agricultura, Revista Agropecuaria 60, (710), 804-805. 75

GUO, Q., SONG, M., YANG, T., LIANG, G., 2000. Regeneration and Identification of Tetraploids Originating From Cotyledons of Diploid Watermelon Cultured In Vitro. Journal of Southwest Agricultural University, 22 (4), 298-300. HELMLE-JANOSI, M., MATHE, A., MOZSAR, K., 1992. Contribution to The Micropropagation of Triploid Watermelon. Acta Horticulturae (No. 300), 163-168. JASKANI, M. J., KWON, S.W., KOH, G.C., HUH, Y.C., KO, B.R., 2004a. Induction and Characterization of Tetraploid Watermelon. J. Kor. Soc. Hort. Sci., 45, 60-65. JASKANI, M. J., KWON, S.W., KO, B.R., 2004b. Flow Cytometric Analysis of DNA Content in Watermelon Reveals Potential Over Other Ploidy Screening Methods. Scientia Horticulturae (in press). JASKANI, M. J., KWON, S.W., KİM, E.J., KO, B.R., 2004c. Polyploidy Affects Fruit Characteristics, Seed Morphology and Germination in Watermelon (Citrullus lanatus). Journal of The Korean Society for Horticultural Science, 45 (5), 233-237. JASKANI, M. J., RAZA, H., KHAN, M. M., KWON, S. W., 2004d. Effect of Antimititic Agent Colchicine on In Vitro Regeneration of Watermelon. J. Plant Biotechnology, 6(4), 247-252. JASKANI, M. J., KWON, S.W., DAE, H.K., 2005a. Flow Cytometry of DNA Contents of Colchicine Treated Watermelon As A Ploidy Screening Method At M1 Stage. Pakistan Journal Of Botany, 37 (3), 685-696. JASKANI, M. J., KWON, S.W., KİM, D. H., 2005b. Comparative Study On Vegetative, Reproductive And Qualitative Traits of Seven Diploid And Tetraploid Watermelon Lines. Euphytica, 145 (3) : 259-268. JEFFREY, C., 1975. Further Notes on Cucurbitaceae: III. Some African taxa. Kew Bu. 30,475-493. KARCHI, Z., GOVERS, A., NERSON, H., 1981. "Alena" Watermelon. HortScience, 16(4),573. 76

KIHARA, H., 1951. Triploid Watermelons. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 58,217-230. KOH, G., 2002. Tetraploid Production of Moodeungsan Watermelon. Korean Society for Horticultural Science 43 (6), 671-676. KÖKSAL, N., 1999. Haploid Kavun Bitkilerinde In Vivo ve In Vitro Yöntemlerle Dihaploidizasyon. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, 116 s. KRUG, M., STIPP, L., RODRIGUEZ, A., MENDES, B., 2005. In Vitro Organogenesis In Watermelon Cotyledons. Pesquisa Agropecuaria Brasileira 40 (9), 861-865. LI, Y., WHITESIDES, J. F., RHODES, B., 1999. In Vitro Generation of Tetraploid Watermelon With Two Dinitroanilines And Colchicine. Report - Cucurbit Genetics Cooperative (No. 22) : 38-40. LI, L., HE, Y., LU, K., 2002. Chemical Induction Mutation In Yellow Peel Watermelon (Citrullus lanatus) And its Application To Tetraploid Watermelon Breeding. Chne Vegetables (No.3), 8-11. LIU, W., WANG, M., 2002. Manipulation And Identification of Chromosomal Ploidy in Watermelon and Muskmelon Breeding. Journal of Fruit Science, 19 (2), 132-135. LOWER, R.L., JOHNSON, K.W., 1969. Observation on Sterility of Induce Autotetraploid Watermelon. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 94(4), 367-369. LUCIER, G., LIN, B.H., 2001. Factors Affecting Watermelon Consumption in The United States. In: Anonymous (eds) Vegetables and Specialties: Situation and Outlook, VGS-287/(pp. 23-29).USDAERS. MARR, C.W., GAST, K.L.B., 1991. Reactions by Consumers in a "Farmers" Market to Prices for Seedlees Watermelon and Ratings of Eating Quality. HortTechnology, 105-106. MCCUISTION, F., WEHNER. T.C., 2005. Seedless Watermelon Breeding, Watermelon Research Articles (Unpublished article, http://cuke.hort.ncsu.edu/cucurbit/wmelon/seedless.html). 77

MOHR, H.C., 1986. Watermelon Breeding. In: Breeding Vegetable Crops (Ed. M. J. Basset), Avi. Publ. Comp., Inc., Westpart, Connecticut, 37-66. MURASHIGE, T., SKOOG, F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassay with Tobacco Tissue Cultures. Physiol Plant., 15:473-497. PERKİNS, V. P., 2005. Watermelon and Human Health. 3 rd International Cucurbit Symposium, Townsville,-Australia, 66. RHODES, B., ZHANG, X., 1999. Hybrid Seed Production In Watermelon. Journal of New Seeds, 1 (3/4), 69-88. ROUSSELLE, F., 1992. Techniques d Estimation Nombre des Chloroplastes (J. Jahier). Techniques de Cytogénétique Végétale, INRA, Paris, 149-165. SARI, N., 1994. Karpuzda Işınlanmış Polen Uyartımıyla Haploid Bitki Eldesi Üzerine Genotipin ve Mevsimin Etkisi ile Işınlama Yerine Geçebilecek Uygulamalar Üzerinde Araştırmalar. Doktora Tezi, Ç. Ü. Fen Bil. Ens., Adana, 242 s. SARI, N., ABAK, K., 1996. Haploid Karpuzda In Vitro Kromozom Katlaması Amacıyla Değişik Doz ve Sürelerde Uygulanan Kolhisinin Etkisi. Türk Tarım ve Ormancılık Dergisi, 20, 555-559. SARI, N., EKİZ, H., YÜCEL, S., YETİŞİR, H., EKBİÇ, E., ABAK, K., 1999a. Investigation of New Protected Cultivation Melon Lines Resistant to Fusarium oxysporum f. Sp. Melonis Using Dihaploidization. In: Proceedings of the Third Turkish National Horticultural Congress, September 14-17, Ankara, Turkey, 498-503. SARI, N., ABAK, K., PITRAT, M., 1999b. Comparison of Ploidy Level Screening Methods in Watermelon: Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. and Nakai. Scientia Horticulturae, 82, 265-277. SARI. N., SOLMAZ, İ., YETİŞİR, H., ÜNLÜ, H., 2005. Watermelon (Citrullus lanatus L.) Genetic Resources in Turkey and Their Characteristics. 3 rd International Cucurbit Symposium. Townsville-Australia, 35. SARI, N., 2006. Yazlık Sebzeler Ders Notları, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü, Adana. 78

SAUTON, A., 1987. Recherce d Haploides Chez le Melon (Cucumis melo L.); Etude et Application à la Sélection de la Parthénogenése Induite par du Pollen Irradié. Thése (Docteur Nouveau Régime), Spécialité; Biologie et Physiologie Végétales, Université des Sciences et Techniques du Languedoc, Montpellier, 123 p. SONG, P. L., PEN, W. Z., YANG, Y. H.., 1988. In Vitro Propagation of Seedless Watermelon. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Normalis Hunanensis 11 (4) : 340-345. TANG, S., LİAO, Y., XU, R., 1994. Medium Selection and In Vitro Culture of Seedless Watermelon (Citrullus vulgaris Schrad.). Journal of Southwest Agricultural University, 16 (6), 540-542. VURAL, H., EŞİYOK, D., DUMAN, İ., 2000. Kültür Sebzeleri (Sebze Yetiştirme), Ege Üniv. Basımevi, Bornova-İzmir, 440 s. WHITAKER, T.W., DAVIS, G.N., 1962. Cucurbits: Botany, Cultivation and Utilization, WHITAKER, T.W. and Bemis, W.B., 1976. Cucurbits. In: Simmonds N.W. (ed.), Evolution of Crop Plants. Longman, London, p.64 69, YALÇIN-MENDI, N. Y., IPEK, M., KACAN, H., CURUK, S., SARI, N., CETINER, S., GABA, V., 2003. A Histological Analysis of Regeneration in Watermelon. J. Plant Biochemistry & Biotechnology, 12, 147-150. YETIŞIR, H., SARI, N., 2003. A New Method for Haploid Muskmelon (Cucumis melo L.) Dihaploidization. Scientia Horticulturae, 98: 277-283. ZHANG, O., FANO, L., DONG, Y., 2005. A New Yellow-Fresh Mini-Watermelon F1 Hybrid- Wuzihuangyu. Chine Vegetables (No.10/11) : 993. 79

ÖZGEÇMİŞ 1978 yılında Adana nın Kozan ilçesinde doğdum. İlk orta ve lise öğrenimimi Kozan da tamamladım. 1997 yılında girdiğim Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nden 2001 yılında mezun oldum. 2004 yılında Yüksek Lisans öğrenimime başladım. 2002-2004 yılları arasında Sapeksa A.Ş. de biyoteknoloji laboratuvarında çalıştım. 2004 yılından beri Toros Agripark Biyoteknoloji Laboratuvarında çalışmaktayım. Halen yüksek lisans öğrenimime devam etmekteyim. 80