Spermanın Saklanması ve Eritilmesi
Spermatozoonun baş, orta ve kuyruk olmak üzere üç ana bölümden oluşan özel bir yapısı vardır. Spermatogenezisin son aşamasında spermatozoon bölünme yeteneğini yitirir.
Spermanın saklanması, genelde spermatozoonun metabolizmasını yavaşlatarak veya durdurarak, hücrenin yaşam süresini uzatmakla olasıdır. Sperma saklama teknolojisi; kriyoprotektanların bulunması, sulandırıcıların geliştirilmesi ve üreme teknolojisindeki ilerlemelerle birlikte hızlı bir gelişim göstermiştir.
Kriyoprotektan: Gliserol, yumurta sarısı proteinleri vb. dondurma işlemi sırasında hücreleri düşük ısıların etkilerinden koruyan madde.
SPERMANIN SAKLANMASI Sperma soğutma, dondurma, porsiyonlara ayırma, hacmini artırma, metabolik artıklarını elimine etme, enerji gereksinimini karşılama vb. amaçlarlarla sulandırılmak zorundadır.
Günümüzde gamet hücrelerinin saklanması esasına dayanan iki yöntem kullanılmaktadır. Bunlar 5 C ısıda saklama ve dondurma yöntemleridir. Her iki yöntemde de spermanın yaşamsal işlevlerini saklama ısısı, soğutma hızı, sulandırıcının kimyasal bileşenleri ve kullanılan kriyoprotektif maddeler belirler.
Spermanın fizikokimyasal yapısı hem donma hem de eritme işlemleri sırasında şekillenen buz kristalleri nedeniyle zarar görür. Sıvı saklama yöntemi spermayı sulandırdıktan sonra 5 C gibi düşük ısılarda saklama esasına dayanan bir yöntemdir. Bu yöntem ile sperma yaşamsal aktivitesini ancak 2-3 gün koruyabilmektedir.
Donma yöntemi ise spermanın daha düşük ısılarda saklanması esasına dayanır. Hücreyi soğuk şokunun etkilerinden koruyan kriyoprotektif maddelerle sulandırılan sperma, ampul (etil alkol banyosunda), pellet ( 79 C kuru buzda) veya payet ( 110 C sıvı azot buharında) yöntemiyle dondurularak 196 C ısıdaki sıvı azot içerisinde saklanır.
Dondurarak saklama yönteminde, uygun saklama koşullarında sperma potansiyel fertilitesini yıllarca koruyabilir. Payet: Sperma dondurma amacıyla değişik renk ve hacimlerde olan plastik çubuklardır. Üzerinde, içinde sperması bulunan hayvanın adı, kulak numarası, dolum merkezi ve tarihi yazılıdır.
Sperma Sulandırıcıları Sperma sulandırıcıları ve bu sulandırıcılarda kullanılan kriyoprotektif maddeler, spermanın eritme sonrası yaşamsal aktivitesini sürdürerek, dölleme yeteneğini koruması üzerine büyük bir etkiye sahiptir.
Sperma dondurulmadan önce işlem gördüğü sulandırıcının bileşenleri, donma işlemlerinin başarısını belirler.
Kaliteli bir sperma sulandırıcısı; spermatozoitler için gerekli olan enerji gereksinimini karşılamalı, bakteriyel üremeyi kontrol etmeli, spermayı soğuk şokuna karşı korumalı ve ortamın ph değerini dengeleyebilmelidir.
Bunların yanı sıra sulandırıcılarda uygun bir ozmotik basınç ve elektrolit denge sağlanması, donma sırasında hücrelerin korunması için zorunludur.
Ayrıca sperma sulandırıcılarında enerji kaynağı olarak glikoz gibi basit şekerler, spermatozoonu soğuk şokuna karşı korumak için yumurta sarısı, süt ve bakteriyel üremeyi engellemek için ise penisilin, streptomisin gibi çeşitli antibiyotikler kullanılmaktadır.
Dondurulmuş memeli sperması, taze sperma ile karşılaştırıldığında, genelde daha düşük fertiliteye sahiptir. Bu da eritme sonrası hem canlı spermatozoon oranının düşüklüğünden, hem de canlı ama işlevsel kayba uğrayan hücrelerden ileri gelmektedir.
Soğuk şoku, donma hızı, sulandırıcı bileşenleri, ozmotik basınç farklılıkları gibi çok sayıda etmen spermada yaşam yeteneğinin kaybolmasına neden olur
Soğuk Şokunun Sperma Üzerine Etkisi Soğutma ve donma işlemleri sırasında çevresinde şekillenen birtakım fiziksel ve kimyasal değişikliklere maruz kalan spermatozoon, faz değişimin şekillendiği düşük ısılara karşı belirli bir direnç gösterir.
SPERMANIN SULANDIRILMASI Sperma, sulandırılmadan önce gerekli spermatolojik muayenelerden geçirilmelidir. Türe özgü, donmuş veya soğutulmuş sperma kullanılarak yapılan suni tohumlama sonrası kabul edilebilir gebelik için gerekli spermatozoa sayısının (tohumlama dozu) hesaplanması gereklidir.
Tohumlama Dozunun ve Sulandırma Oranının Belirlenmesi Gerek sıvı olarak saklamada, gerekse dondurma çalışmalarında spermanın sulandırılması gerekir. Günümüzde suni tohumlama laboratuarlarında sperma sulandırıcısı olarak yağsız süt, sodyum sitratyumurta sarısı, Laiciphos ve Tris kullanılmaktadır.
Ülkemizde sperma üretim laboratuvarlarında hazır sulandırıcılar tercih edilmekte, zorunlu hallerde Tris, sodyum sitrat-yumurta sarısı da kullanılmaktadır. Hazır sulandırıcılar genellikle antibiyotik içermektedir.
Laboratuarda hazırlanan sulandırıcılara penisilin, streptomisin vb. antibiyotikler katılarak bakteriyel üremenin önüne geçilir.
Bireye özgü ve ejakülatın kalitesine bağlı olarak taze sperma sulandırma, dondurma ve eritme aşamalarında %20-70 oranında motilitesini kaybeder.
Bir inek sürüsünde ilk üç tohumlama sonunda %90 ın üzerinde gebelik elde etmek için, bir tohumlama dozunda <7.000.000 motil spermatozoa olması gerekir. Spermaya katılacak sulandırıcı miktarı, tohumlama dozuna göre hesaplanmalıdır.
Günümüzde boğa spermasının dondurulması amacıyla sıklıkla 0,25 veya 0,5 ml lik payetler kullanılmaktadır.
Sulandırma Tekniği Sulandırıcı çeşidine bağlı olarak tek veya iki aşamalı sulandırma teknikleri kullanılmaktadır.
Tek aşamalı sulandırma tekniğinde, kriyoprotektan maddeleri içeren hazır sulandırıcılar kullanılmaktadır.
Bu teknikte, spermaya katılacak sulandırıcı miktarı hesaplandıktan sonra, sperma 27-30 C ısıda önce 1/1 oranında sulandırılarak spermanın sulandırıcıya alışımı sağlanır.
İki aşamalı sulandırma tekniğinde, sulandırıcıya kriyoprotektan madde katılmadan önce, Sulandırıcı A ve Sulandırıcı B olarak iki bölüme ayrılır. Sulandırıcı A, spermanın ilk sulandırılmasında kullanılır. Sulandırıcı B ye ise kriyoprotektan katılarak 5 C ısıya soğutulur.
Bu teknikte spermaya katılacak toplam sulandırıcı miktarı, Sperma + Sulandırıcı A = Sulandırıcı B olacak şekilde hesaplanır. Sperma 27-30 C ısıda sulandırıcı A ile aşamalı olarak sulandırılır. Daha sonra, buzdolabı içindeki su banyosuna yerleştirilip suya buz kalıpları atılarak 1-2 saat içinde 5 C ısıya soğutulur.
Daha sonra sulandırıcı B ile aşamalı olarak, her beş dakikada bir sulandırıcı B nin toplam miktarının 1/10 u kadar, aşamalı olarak gerçekleştirilir. Sulandırma işlemi yaklaşık 50 dakika içinde tamamlanır.
SPERMANIN DONDURULMASI Payetlere çekilmiş sperma, dondurma amacıyla geliştirilmiş taraklara, dizme rampası yardımı ile dizilir
Azot düzeyinden 5 cm yükseklikte (yaklaşık -80 ile -120 C arası) yerleştirilerek azot buharında 7 dakika süre ile dondurulur. Donmuş payetler sıvı azot ( 196 C) içine alınır.
Dondurulan spermanın, en az 1 hafta sonra 37 C ısıda 30 saniye süreyle eritilerek, eritme sonrası spermatozoa motilitesi (%) ve anormal spermatozoa oranı (%) değerlendirilir.
Değerlendirme sonrası tohumlama amacıyla kullanılacak özellikteki payetler geçici stok tankına aktarılır ve en az 1 ay bekletilir. Bu süre sonrasında, spermatolojik muayeneler yinelenerek, kullanıma uygun olan payetler daimi stok tankına aktarılır. Buradan da saha konteynerine aktarılmak üzere dağıtım tanklarına konulur.
Spermanın Kısa Süreli Saklanması Sperması başarılı bir şekilde donmayan türlerde, dondurma için gerekli alet ve donatının olmadığı durumlarda, değerli damızlıklardan daha fazla yararlanmak amacıyla, sperma 2-3 gün kısa süreli saklanır.
Bu uygulama ancak kızgınlıkları uyarılmış veya doğal kızgınlık döneminde olan sürülerin tohumlanmasında kullanılabilir. Bu amaçla, yağsız UHT (ultra high temperature; çok yüksek ısı) süt veya içinde kriyoprotektan bulunmayan sulandırıcılar kullanılabilir.
Spermaya katılacak sulandırıcı miktarı hesaplandıktan sonra, sperma 27-30 C ısıda önce 1/1 oranında sulandırılarak spermanın sulandırıcıya alışımı ağlanır ve 10 dk sonra geriye kalan sulandırıcının yarısı ve 10 dk sonra da diğer yarısı eklenerek 1-2 saat içinde 5 C ısıya soğutulur. Sperma, kullanılıncaya kadar, buzdolabı koşullarında saklanır.
KONTEYNER KULLANIMI VE SPERMAYA YAPILAN UYGULAMALAR Donmuş sperma kullanımında ortaya çıkan fertilite sorunlarının çoğu, suni tohumlamayı yapan uygulayıcının, saklama ve uygulama koşullarındaki teknik hatalarından kaynaklanmaktadır
Sıvı azot yaklaşık -196 C ısıda kaynayarak gaz haline geçer. İstenen -196 C ısıyı elde etmek için bir miktar buharlaşması zorunludur. Bu nedenle saha konteynerleri az da olsa sürekli azot kaybeder.
Seri üretime uygunluğu, saklama kolaylığı, yüksek gebelik oranları gibi birçok avantaja sahip olmasından dolayı, payet yöntemi ile dondurma tekniği tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır
Suni tohumlama konteyneri saha konteyneri, azot tankı vb. olarak da adlandırılır
Konteyner, sıvı azot haznesi (asıl tank), kanister, konteyner kapağı olmak üzere üç bölümden oluşur.konteyner iç içe olan iki kaptan oluşur. İç ve dış kaplar sadece boyun kısmından birbirine temas halindedir. Bu iki kap arasındaki boşluk vakumlanarak konteynerin izolasyonu artırılmıştır.
Konteyner kullanılmadığı zamanlarda, azot kaybını ve çevreden köken alan mikroorganizmaların bulaşmasını engellemek için, konteynerin ağzı sürekli kapalı tutulmalıdır.
Konteynerdeki azot miktarı ölçüm cetveli aracılığı ile sürekli olarak kontrol edilmelidir.bunun için ölçüm cetveli konteynere daldırılarak kaynama/buharlaşma durana kadar beklenir. Daha sonra cetvel azotun içinden alınarak havada birkaç kez sallanarak karlanmanın bittiği noktadaki değer okunur
Azot miktarında düşüş olması durumunda en kısa sürede tamamlanmalıdır. Eğer konteynerde bir hata söz konusu ise sperma hemen başka bir konteynere aktarılmalıdır.
Konteynerin iç ısısı 120 C ve üzerine çıkmadığı sürece spermanın fertilitesi etkilenmez. Böyle bir durumdan şüphe ediliyorsa, gerekli spermatolojik incelemeler yapılmalıdır.
Eğer sperma başka konteynere aktarılacaksa, içi azot dolu gobletler içinde taşınmalıdır. İçinde payet bulunan goblette azot olmaması durumunda kanisterin 1 dakikalık kaldırılması, spermada zararlı etkilerin oluşmasına neden olur.
Spermanın gobletten alınması sırasında uzun pens kullanılmalı ve kanister 30 saniyeden fazla yukarıda tutulmamalıdır. Ayrıca kanister konteynerin boyun bölümünde tutulmalı, daha yükseğe kaldırılmamalı ve payet kanisterden 10 sn içinde alınmalıdır.
konteynerdeki sıvı azot miktarının konteyner hacminin 2/3 ünden az olmamasına ve azot düzeyinin haftada iki kez denetlenmesine dikkat edilmelidir.
Konteyner alınırken günlük azot kayıp miktarına, konteyner hacmine, devrilmelere karşı yere değme yüzeyine dikkat edilmelidir.
Saha şartlarında kapağın açılması, çalkalanma, ortam sıcaklığı, payet alımı vb. nedenlerden dolayı azot kayıpları daha yüksek olmaktadır. Bu bilgiler ışığında konteynerin azot ikmal ve bakımına dikkat edilmelidir.
AZOT ÖLÇÜM CETVELİ
AZOT DÜZEYİNİN OKUNMASI
SPERMANIN ERİTİLMESİ Spermatozoonların yaşama yetenekleri ve morfolojik bütünlüklerinin korunmasında eritme işleminin ayrı bir yeri ve önemi vardır.
Tohumlama için payet eritileceği zaman, teknisyen eritilmiş payetin dış ortamın ısısından etkilenmesini engellemeli, eritme işlemini hayvanın yanında yapmalıdır.
Payet kanisterden alınırken, kanister konteynerin boyun kısmından daha yukarı kaldırılmamalı ve bu yükseklikte 30 sn.den fazla tutulmamalı, payet 10 sn gibi kısa sürede alınıp kanister yine sıvı azot içine daldırmalıdır.
Payet alınır alınmaz en kısa sürede eritme kabına aktarılmalıdır. Eğer bu süre içerisinde payet alınamazsa, kanister yine sıvı azot içine daldırılıp en az 5 dakika beklenerek payet alınmaya çalışılmadır. Bu uygulamalar, konteynerin en uygun (optimal) koşullarda dolu olduğu durumlar için geçerdir.
Eritme işlemi, spermanın dondurulduğu merkezin önerisi yok ise, rutinde kullanılan 37 C ısıdaki sıcak suda 30 sn.de yapılmalıdır. Payet eritildikten sonra güzelce kurulanmasına özen gösterilmelidir.
Suni Tohumlama Pistolesinin Hazırlanması Suni tohumlama setinde azot tankı, payeti almak için uzun, düz uçlu bir pens, spermayı eritmek için eritme kabı, termometre ve payeti kurulamak için peçete vb. bulunmalıdır.
Ayrıca payetin çeşidine uygun (0,25 ml veya 0,5 ml) pistole,payeti kesmek için makas, pistole kılıfı ve rektal muayene eldiveni olmalıdır.
Özellikle soğuk günlerde, eritilecek spermanın dış ortamın ısı farkından etkilenmesini engellemek için, sperma eritilmeden önce pistole koltuk altına konarak ılınması sağlanır.
Payet 37 C ısıdaki su banyosunda 30 sn.de yöntemine uygun eritildikten sonra sudan alınır ve hemen iyice kurulanır. Sonra koltuk altında ısıtılan pistoleye pamuklu kısmı alta gelecek şekilde yerleştirilir ve diğer ucundan yaklaşık 0,5 cm kesildikten sonra, üzerine pistole kılıfı geçirilir. Bu işlemden sonra suni tohumlama gerçekleştirilir.