MİKROTEKNİK DERS NOTLARI Mikroteknik (Mikro preparasyon yöntemleri): Mikroskopta incelenecek preparatların yapılma teknikleridir. 2 şekilde yapılır. 1) Canlı inceleme 2) Daimi (Sabit) preparat hazırlanması Hücre ve Dokuların İnceleme Metotları: Hücre ve dokuların incelenmesi iki ana yolla yapılır. a)taze (canlı veya henüz ölmüş): Taze hücre ve dokulardan mikroskobik preparatlar hazırlanması. Örneğin balığın kalbini çıkarıp inceleme b)hücre, doku ve organlardan boyanmış daimi preparatlar hazırlanması (Daimi preparat). A)Taze Preparatların Hazırlanması: Usulüne göre öldürülmüş bir hayvanın (Memeli, kanatlı veya soğukkanlı) yumuşak dokuların (deri altı bağ dokusu, epitel kazıntılar, kas ve sinir telleri, kan, lenf vs.) veya kültürde yetiştirilmiş dokular, küçük parçalar halinde kesilip lam üzerinde tiftiklendikten sonra üzerine hemen lamel kapatılarak mikroskop altında incelenir. İnceleme sırasında dokunun kuruyarak bozulmasını önlemek için incelemenin çabuk yapılması gerekir. Kuruma tehlikesi çabuk çalışma ile giderilemiyorsa izotonik sıvılardan faydalanılır. Bu amaç için kullanılan izotonik sıvılara birkaç örnek verecek olursak 1. Serum Fizyolojik (Fizyolojik Tuz Çözeltisi: NaCl): Yoğunluğu yaklaşık plazma yoğunluğunda olan sodyum klorürlü sudur. Memeliler için : % 0.9, Kanatlılar için: % 0.75, Kurbağa için: %0.64 lük çözelti kullanılır. 2. Ringer çözeltisi: Sodyum klorür (NaCl) Memeliler için.. 8 gr Kurbağa için 6,5 gr Kalsiyum klorür (Susuz). 0,2 gr Potasyum klorür 0,2 gr (Çıkmayacak) Sodyum bikarbonat 0,2 gr Glikoz (dekstroz).. 1 gr Saf su. 1000 ml Not: Laboratuarda su deyince saf su anlayacağız Not: Çözelti uzun müddet saklanamaz. Eğer bu çözelti kullanılmadan önce steril hale getirilecekse önce filtre edilir daha sonra otoklava konulur. 3. Locke Çözeltisi: NaCl. 9 gr KCI 0,42 gr CaCl 2 (Susuz). 0,24 gr (Çıkmayacak) NaHCO 3 0,2 gr Saf su 1000 ml Not: Çözelti çok iyi korunmalı ve kaynatılmamalıdır. Locke çözeltisi memeli ve kuş dokularının ve embriyolarının incelenmesinde ringer çözeltisinden daha kullanışlıdır. 4. Tyrode Çözeltisi: İki kısımdan oluşan bir çözeltidir. Çözelti A Çözelti B NaCl 8 gr NaHCO 3.0,5 gr CaCl 2.0,2 gr Saf su..250 ml NaH 2 PO 4..0,05 gr MgCl 2.0,1 gr (Çıkmayacak) Glukoz..1 gr Saf su.750 ml Gereksinim duyulduğu miktarda 3 kısım çözelti A ile 1 kısım çözelti B yi karıştırmak gerekir. (3:1) *Yukarıda verilen 4 çözeltide CaCl 2 ün çökmemesi için en son olarak katılması gerekir. Hücre ve dokuları öldürmeyen bu sıvılardan başka organizmaları öldüren tipte sıvılarda vardır. Bu sıvılar canlı halde inceleme ile tespit edilmiş inceleme oranı da geçit teşkil eder. Bu araç için kullanılan sıvılar; Potasyum Hidroksit (KOH), Asetik Asit (CH 3 OOH) tir. Bu sıvılar hücreleri saydamlaştırır ve çekirdeği görünür hale getirir. TAZE PREPARATLARI HAZIRLAMA ŞEKİLLERİ a) Lam ve lamel arasında yapılır. Materyal küçük ise direkt lam üzerine konur, materyal büyük ise lam üzerine kibrit çöpü koyup lamel bunun üzerine lamel kapatılır ve mikroskopta inceleme yapılır.
b) Frotis Yöntemi (Yayma): Lamın bir ucuna incelenmek istenen sıvıdan bir damla konup ikinci bir lam ile 45 o lik açı oluşturacak şekilde yavaşça sürerek yapılan bir yöntemdir. c) Canlı organizmalara çeşitli maddeler enjekte edilir. Bu işlem için çeşitli boyalar kullanılır. Bu boyalara vital boyalar denir. Vital Boyalar: Vital inceleme sıvı bir ortamda yaşayan serbest hücrelere, doku parçalarından ayrılmış hücrelere, saydam zarlara, hayvanların saydam bölgelerine veya apak organlarına uygulanabilir. Canlı halde boyamaya vital boyama denir. Vital boyalar asidik vital boyalar ve bazik vital boyalar olarak ikiye ayrılır. Her iki gruba giren boyalarda organizma ölmez. Bazik Vital Boyalar Asidik Vital Boyalar -Metilen mavisi (Vakuol boyar) -Trypan mavisi -Tolvidin mavisi (Vakuol boyar) -Pyrol mavisi -Metilen yeşili (Çekirdek boyar) -Kongo kırmızısı -Metilen azurin (Vakuol boyar) -Nil mavisi (Vakuol boyar, az toksittir) -Cresly mavisi (Vakuol boyar, az toksittir) -Cresly viole (Mitokondri boyar) -Nötr kırmızısı (Vakuol boyar) -Jaunus yeşili (Mitokondri boyar) Bazı Vital Boyaların Hazırlanması (Çıkmayacak) 1. Metilen Mavisi: 0,3 gr Alkol (%95, 30 ml). Alkolde çözünen metilen mavisine 100 ml saf su ilave edilir. Hazırlanan metilen mavisine Crustacea lere enjekte edilerek organizasyonu açığa çıkartmak için kullanılır. Canlı organizmaları incelemek için ; Metilen mavisi 1 gr, NaCl 2 0,6 gr ve saf su 100 ml 2. Metilen Yeşili: Metilen yeşili 1 gr, alkol (%70, 99 ml) %70 lik alkol materyali saklamak için kullanılır. 3. Nötr Kırmızısı: Nötr kırmızısı 0,1 gr, izotonik çözeltisi 1000 ml 4. Kongo Kırmızısı: Kongo kırmızısı 1 gr ile 1000 ml saf su karıştırılır. GEÇİCİ PREPARATLAR Mikroskopta incelenecek materyalin uzun süre saklanması gerekmiyorsa geçici preparat hazırlanır. Bir lam üzerine 1-2 damla su veya laktofenol çözeltisi damlatılarak inceleme ortamı hazırlanır. İncelenecek materyal kesiti ya da bir parçası olacak şekilde damlatılan bu sıvı içerisine konur. Materyal ışık mikroskobunda inceleneceğinden ışığı geçirebilmeli yani ince olmalıdır. Materyal üzerine 45 o lik açıyla lamel kapatılır. Sıvı lamelin kenarına taşmamalıdır. Şayet taşarsa kurutma kağıdıyla sıvının fazlasını almak gerekir. Örn: Mikrofungusların incelenmesi laktofenol kullanılırsa materyal çok iyi görünür. Laktofenol kullanılan preparatlar 5-6 ay bozulmadan kalabilir. Ayrıca % 10 luk gliserin çözeltiside kurumaya karşı dayanıklı preparat yapımında kullanılır. DAİMİ PREPARATLARIN HAZIRLANMASI Daimi preparatlar kesitlerin veya frotislerin (yayma) tespit edilip boyanması ile elde edilir. Bu işlemler; 1-Uyuşturma 2-Tespit etme (Fiksasyon) 3-Dehidrasyon (Suyunu alma) 4- Saydamlaştırma 5-Materyali parafine yatırma ve blok hazırlama 6-Parafin bloklarının kesilmesi ve kesitlerin lamlara aktarılması 7-Boyama 8-Preparatın monte edilmesi 1. Uyuşturma: Uyuşturma için kullanılan malzemeler. % 10 luk etil alkol: Tatlı su omurgasızları için kullanılır MgCl 2 : Deniz hayvanları için % 7,5 luk çözeltisi kullanılır. Ayrıca eşit hacimdeki deniz suyu ile seyreltilebilir. Eter Buharı: Böcekler, örümcekler ve kara omurgalıları için kullanılır. Kloroform: Eterin aynısıdır. Mentol: Mentol kristalleri su yüzeyine serpilir gece boyunca bekletilir. Bu madde tek başına yaşayan tatlı su hayvanları için kullanılır Düşük Sıcaklık: Yeterli miktarda anestezi verilmiş hayvanın buzdolabında saklanması ile kullanılır. 2. Tespit Etmek (Fiksasyon): Hayvanları veya hücre ve dokuları öldürmek için yapılır. Tespit sırasında hücrenin ve dokunun mümkün olduğu kadar bozulmamasına ve tespit edilen hücrede oluşabilecek değişikliklerin minimum düzeyde olmasına dikkat edilmelidir. Tespit işleminde kullanılan çözeltilere
fiksatif veya fiksatör denir. Fiksatifler etki sırasında sitoplazmayı pıhtılaştırır veya çökeltir. Her iki durumda da proteinler esas yapılarını korurlar. Fiksasyon: Anatomik elemanların yapı ve şekillerini değiştirmeye vakit bulamadan süratle öldürmek, hücre ve dokunun morfolojisini korumak ve bunların çeşitli boyalarla boyanmasına hazırlamak için yapılan çalışmalardır. Fiksasyonun yapılmasıyla; I. Doku ve hücreler arasındaki kırılma indisi arttırılmış olur. II. Hücre ve dokular sertleşir ve bundan sonraki işlemler kolaylaşır. III. Hücre ve doku elemanlarının dağılması önlenmiş olur. İyi fiksatif şu özellikleri taşımalıdır; Dokulara nüfus etme yeteneği iyi olmalıdır. Bu yetenek çeşitli fiksatiflere göre değişir. Asetik asitli fiksatifler çabuk etki ederler. Ozmik asitli fiksatiflerin etkisi daha yavaştır. Dokudaki proteinleri total olarak pıhtılaştırmalıdır. Pıhtılaştırma ani şiddetli olmalıdır. Aksi taktirde dokuda büzülme meydana gelir. Asetik asitli fiksatifler iyi sonuç verirler. Fiksatörün asitliği de önemlidir. Dokuların asitleştirilmesi ile pıhtılaşma ve çökme olur Tespit sırasında sıcaklıkta önemlidir. Genellikle histolojik fiksatifler oda sıcaklığında kullanılmalıdır Fiksatifin hacmi materyalin 15 ile 20 katı kadar olmalıdır. Yalnız başına kullanılan bir kimyasal madde iyi bir fiksatifin bütün üstünlüklerine sahip değildir. Tek başına kullanılan fiksatifler daha sınırlıdır. Fornolin, aseten, etil alkol tek başına en çok kullanılan fiksatiflere örnektir. Birbirleriyle karıştırılarak kullanılan fiksatiflerin birinin zararlı etkisini diğeri bertaraf eder. En çok kullanılan fiksatifler; formaldehit, etil alkol, asetik asit, pikrik asit, potasyum bi kromat vb. Uygun fiksatif seçimi yapılması istenen analize göre değişir. Örn: Suda hazırlanmış bir fiksatif dokudaki glikojeni, alkolde hazırlanmış bir fiksatif ise lipitleri eriteceğinden söz konusu maddelerin araştırılmasında kullanılamazlar. Nükleus ya da kromozomlar incelenecekse asit fiksatifler çok kullanılır. Aseton, fornolin ve glutaraldehit en az denaturasyona neden olduklarından ve enzimleri de iyi koruduklarından enzim etkinliğini araştırmada kullanılır. Yapılarına Göre Fiksatifler ***** 1. Fiziksel Fiksatifler: Bu fiksatifler hücre veya dokuya ya düşük ya da yüksek sıcaklıkta uygulanır. Düşük sıcaklıkta uygulanan fiksatör organizmayı dondurur. Bu suretle doku ve hücredeki proteinler çöker ve pıhtılaşmaya uğrar. Yüksek sıcaklıkta ise materyal su veya alkolde kaynatılır. Fiziksel fiksatiflere desikasyon (kurutma) da dahil edilebilir. Bu işlem genellikle protislerde yaygın olarak kullanılır. 2. Kimyasal Fiksatifler: I. Madensel Fiksatifler: Madensel Tuzlar (Bikarbonatlar): Genellikle Stronsiyum ve Çinko bikarbonatları kullanılır. Bu tuzlar bazik özellik gösterirler. Baryum, Kalsiyum, Bakır bikarbonatlarında mitoz bölünme için iyi bir tespit maddesidir. Bu çözeltilerin PH ı 4,2 nin üzerinde olursa sitoplazma iyi tespit edilir. PH ı 4,2 nin altında ise çekirdek daha iyi tespit edilir. Civa klorür, Platin klorür, Uranyum nitrat, Sodyum florür tespit özelliği olan diğer madensel tuzlardır. Madensel Asitler: Kromik Asit: Kırmızı kristaller halindedir. Dokuyu oldukça iyi sertleştirse de dokuda büzülmeye ve sitoplâzmada vakuolleşmeye neden olur. Saf suda % 1 lik çözeltiler halinde kullanılır. Başka maddelerle de kullanılabilir. Ozmik Asit (Ozmiyum tetra oksit): Sarımsı kristaller halindedir. Açıkta bırakıldığı zaman çabuk buharlaşır. Buharı toksik özellikte yani zehirleyici özelliktedir. Hücreleri çok hızlı bir şekilde öldürür. Sitoplâzmayı iyi tespit eder. Çekirdeği ise tespit etme özelliği yoktur. II. Organik Fiksatifler: Organik Asitler: Asetik Asit: Hücre içine çok çabuk girer ve nükleusu iyi tespit eder. Renksizdir. % 1 lik çözeltileri kullanılır. 17 O C nin altında katı olduğundan Glasiyal Asetik Asit adını alır. Tek başına kullanıldığı zaman sitoplazmayı iyi tespit etmez. Mitokondrileri çözer veya eritir. Dokularda şişmeye neden olur. Bunun içinde genellikle alkolle birlikte
kullanılır. Bu özelliği fiksatif olarak kullanılan diğer kimyasalın dokuda neden olduğu büzülmeyi önlemesi bakımından istenen bir durumdur. Pikrik Asit: Sarı renkli kristal halindedir. Su veya alkoldeki doymuş çözeltileri kullanılır. Çözeltileri genellikle soğuk suyla hazırlanır. Hücre içine geçişi yavaştır. Dokunun çok fazla büzülmesine neden olur. Bu yüzden tek başına ender kullanılır. Asetik Asitle kullanılırsa bu etki önlenebilir. Lipitleri eritmez, karbonhidratları tespit etmez, glikojen için çok iyi bir fiksatiftir. Organik İndirgeyiciler: Metil Alkol: Frotisler için iyi bir fiksatiftir. Buharı göz için zararlı etkiye sahiptir. Etil Alkol: Sadece saf halde iken iyi bir fiksatiftir. Dokuların fazla suyunu almak için kullanılır. Sinir sisteminde çok etkilidir. Frotisler için yaygın kullanılır. Yağları çözer, glikojeni çöktürür, sitoplazmayı çok iyi tespit eder. LABORATUVARDA MUTLAK (SAF) ALKOL HAZIRLANMASI Bunun için Bakır Sülfat (CuSO 4 5H 2 O) kullanılır. Rengi cam göbeği mavisi rengindedir. Bakır Sülfat kristallerinin buharlaşması için porselen bir kap içine konarak kristal suyun buharlaşması sağlanır. Buharlaştığında kil rengine döner. Bakır Sülfat tozu aynı kapalı bir cam kap içine konulup içine % 96 lık Etil Alkol ilave edilir. Bir süre bekletilerek mutlak alkol elde edilir. Elde edilen alkolün saflığı % 99 dur. Fiksatiflerle Çalışırken Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar 1-Parçanın fiksatifin yüzünde kalmamasına veya kaba yapışmamasına dikkat edilmelidir. 2-Parça arasıra fiksatif içinde çalkalanmalıdır. 3-Madeni araçların (Pens,bistüri,jilet...vb.) fiksatife batırılmaması gerekir. Çalışma sırasında camdan yapılmış bir spatula veya iğne kullanılmalı. Eğer yoksa madeni araçlar fiksatife batırıldıktan hemen sonra suyla yıkanmalıdır. 4-Tespit edilecek parçaların bulunduğu kaplar güneşte bırakılmamalıdır. Yıkama: Tespitten sonra materyalin hemen yıkanması gerekir. İyi yıkanmayan materyal, iyi kesilmez ve iyi boyanmaz. Yıkama işleminde Saf su tercih edilir. Yıkanacak olan materyal suyun rengini değiştirir. Yıkama suyun rengini değişmeyene kadar işlem devam eder. Bazı fiksatiflerden sonraki yıkama işlemi alkolle yapılır. Örnek: Bovin fiksatifi...gibi. 3. Dehidrasyon (Doku ve Hücredeki Fazla Suyu Alma): Suyunu alma işlemi; alkol serilerinden geçirilerek yapılır. Alkol banyolarının süresi materyalin büyüklüğüne göre değişir. 5 milim kadar olan materyaller için 20-30 dakika yeterlidir. Dehidrasyonda diğer önemli bir konu kullanılan fiksatife göre alkol serilerinin başlangıç derişimlerinin değişmesidir. ******* Sulu Fiksatif Alkollü Fiksatif Saklama Ortamı ı ı ı ı ı %35 %50 %70 %95 %100 Eğer fiksatif alkol ile hazırlanmış ise alkol serisi %95, su ile hazırlanmış ise %35-%50 lik alkolden başlayarak yapılmalıdır. *Dehidrasyon için en çok kullanılan etil alkoldür. Bundan başka metil alkol, butil alkol ve amil alkol de dehidrasyon işlerinde kullanılabilir. 4. Saydamlaştırma: Suyu tamamen alınmış materyal bir takım sıvılara konularak saydamlaştırılır. Mikroskopta daha iyi bir görüntü elde etmek için yapılır. Saydamlaştırma için sedir yağı, ksilol, toluol, metil benzoat ve kreazot kullanılır. Saydamlaştırma sırasında kullanılan bu maddeler bulanık bir renk oluyorsa dokuda su kalmış demektir. O zaman kesitlerimizi tekrar %100' lük alkole almamız gerekir. Ksilol: Mutlak alkolden alınan materyal ksilolde bekletilir. Saydamlaşan madde ksilol kabının dibine çöker. Bekleme süresi çok uzun olmamalıdır. Aksi takdirde materyal gevrekleşir, kolay kırılır ve kesit alınması zorlaşır. Toluol: Ksilol gibi kullanılır. Metil Benzoat: Çok iyi şeffaflaştırma yapar. Ksilol ile birlikte kullanılmamalıdır. Saydamlaştırma işlemi 12-24 saat arasında değişir.
Sedir Yağı: Ksilol ve Toluol' e oranla dokulara daha yavaş nüfus eder. Dokularda sertleşme meydana getirmez. Bu madde ile saydamlaştırma yaptıktan sonra materyale parafin emdirilmesinde başarılı sonuç elde edilmesi için sedir yağının dokudan tamamen uzaklaştırılması gerekir. 5. Materyalin Parafine Yatırılması ve Parafin Blokların Hazırlanması: Suyu alınmış ve saydamlaştırılmış materyallerin parafin bloklara alınmasından önce parafin banyolarından geçirilmeleri gerekir. Amacımız bu işlemler sonucunda parafinin dokuların içine iyice nüfus etmesi sağlanmış olur. Parafin banyoları küçük kaplar içinde etüvde yapılır. Kullanılacak aletlerin de etüvde sıcak bir durumda bulundurulması gerekir. Parafin banyoları aşağıdaki sıra dahilinde yapılır. a) Materyal eşit olarak hazırlanan ksilol + parafin karışımına konur. ( 1 saat bekletilir) b) I. parafin banyosu (hiç kullanılmamış parafinden hazırlanır) (1-2 saat bekletilir) c) II. parafin banyosu (1-2 saat bekletilir) d) III. Parafin banyosu (1-2 saat bekletilir) Materyal parafin banyolarından sonra bloklara alınır. Parafin blokları kesmeye yarayan alete mikrotom denir. Çeşitli amaçlara uygun mikrotomlar geliştirilmiştir. Örn: El mikrotomu, kızaklı, ultra, döner, dondurma mikrotomu...vb gibi. Mikrotom bıçakları; her iki yüzü düz, bir yüzü düz, bir yüzü düz bür yüzü iç bükey veya her iki yüzüde iç bükey olacak şekildedir.parafinli ve dondurma kesitleri için iki yüzü düz bıçaklar kullanılır. Blok almada madeni çerçeveler, kağıt kaplar veya porselen kaplar kullanılabilir.blok kabının dibine sıvı parafinden bir miktar dökülür. Hafifçe üflenerek donması sağlanır. Etüvden çıkarılan materyal bu yüzeye yavaşça yerleştirilir ve üzerine erimiş parafin dökülür. Bu işlemden sonra blokların soğutulması gerekir. Kendi haline donmaya bırakılan parafin kristalleşir ve kesilmez. Bu çabuk dondurma işlemini sağlamak için blok içinde parafin üst yüzeyi üflenerek hafifçe dondurulur. Daha sonra içinde soğuk su bulunan bir kaba dikkatli bir şekilde batırılır. Böylece parafinin kristalleşmesi engellenmiş olur. 6. Blokların Kesilmesi ve Kesitlerin Lamlara Aktarılması: Hazırlanan blok, jiletle parafinin fazlası alındıktan sonra mikrotomla kesilmeye hazır hale getirilir. Mikrotomun blok monte edilecek kısmına kesme ayarı 3-8 mikrom olacak şekilde ayarlanır ve kesmeye başlanır (1 mikron=10-6 metre). Mikrotom ile Kesmede Ortaya Çıkabilecek Bazı Problemler: I. Eğer parafin kesitler düz bir şekilde çıkmıyor ise; *Parafin blok yüzünün alt ve üst kenarları birbirine veya bıçak yüzüyle paralel değildir. *Bıçağın kesici yüzü düz değildir. Bıçak yüzünün başka bir kısmı denenir. II. Eğer parafin kesitler oluşmuyor ise ve her kesit teker teker kopuyorsa; *Bıçak körelmiş olabilir (Bıçak yenilenmeli veya bilenmeli) *Bıçak yanlış eğime sahiptir. Eğimi yeniden ayarlanmalı. III. Materyal kırılıyor veya kesit içinden çıkıyor ise; *Dehidrasyon veya saydamlaştırma iyi yapılmamıştır. (Parafin eritilerek yeniden suyu alınır veya şeffaflaştırılır.) *Materyal çok sert olabilir. Yumuşatmak için %70 alkol ve suda bir miktar bekletilir. Kesitleri lam üzerine aktarmadan önce lam üzerine yapıştırıcı sürmek gerekir. Daha sonra mikrotomdan elde edilen kesitler yumuşak bir fırça ile lamlara aktarılır. Lamlarda parafinin erime derecesinden etüve veya ısıtıcı plaka üzerine konur. Böylece parafin erir ve kesitlerin lam üzerine iyice yapışması sağlanır. (Parafinin erime sıcaklığı 55-65 o C dir) Yapıştırıcı Madde: Eşit hacimdeki gliserin ve yumurta akı karıştırılır ve filtre edilir. Bozulmaması için timol kristalleri konur. HAUPT Yapıştırıcı: Jelatin (1 gr), Saf su (100 ml) 30 o C de karıştırılır. Üzerine gliseril (15 ml) ve fenol kristalleri konarak filtre edilir. NOT: Fenol kristalleri toksik maddedir.
7. Kesitlerin Boyanması: Hücre ve dokuların incelenmesinde önemli bir konuma sahiptir. Tespit edilmemiş hücre ve dokular genellikle boya tutmazlar. Boyamanın amacı; hücrenin iç yapıları ile dokuların bünyesinde bulunan çeşitli yapıların özelliklerini açığa çıkarmaktır. Boyama sırasında fiziksel ve kimyasal reaksiyonlar birlikte cereyan eder. Hücrelerin bazı kısımları asit, bazı kısımları alkali gibi davranmakta, asit olan bölgeler katyonlarla, alkali olan bölgeler ise anyonlarla bağlanma özelliği gösterirler. Boyamanın özelliği şu üç etkene bağlıdır; a) Boyanın kuvveti b) Doku proteinlerinin ve boyanın iyonlarına ayrılma oranı c) Boya eriyiğinin ve doku proteinlerinin PH' ı Boyalar iki sınıfa ayrılır: A-Bitkisel kökenli boyalar: İkiye ayrılır a) Doğal Boyalar b)sentetik Boyalar Doğal Boyalar: 1-Bitkisel Kökenli Boyalar: Safran, Hematoksilin, İndigo, Orsein ve Turnusol 2-Hayvansal Kökenli Boyalar: Koşnil ve Karmin Doğal boyalar arasında koşnil, karmin, hematoksilin, safran, çivit (indigo), orsein ve turnusol sayılabilir *Koşnil: Boyası bazı bazı dikensiz kaktüs türleri üzerinde yaşayan Cococus cocti adlı kırmızı hemipter bir böceğin dişilerinden (yumurta ve yağ dokularından) elde edilir. *Karmin: Boyası koşnilin bir tuzla kaynatılması sonucu oluşturulan çökeltidir. Bu haliyle suda erimez, kullanılacağı zaman eriyebilecek bir bileşiğe dönüştürülür. Bu boya parafinli kesitlerde kullanılmaz. Küçük dokular ve embriyolojik total boyalarda çok kullanışlıdır. Karminin asetik asitle karışımı çizgili kası boyamada idealdir. *Hematoksilin: Histolojide en önce kullanılmaya başlanan ve en çok kullanılan boyaların başında gelir. Vatanı Güney ve Orta Amerika ile Batı Hindistan olan ve akasya ağacına çok benzeyen Bakkan ağacının sert gövdesinden elde edilir. Elde edilmesi çok zor ve uzun zaman aldığından en pahalı boyalar arasındadır. *Safran: Crocus sativus bitkisinin stigmalarından, İndigofera bitkisinden, orsein ve turnusol ise bazı likenlerden elde edilir. Boyaların Hazırlanması: *Aseto-karmin: (Karmin: 0,5 gr, Asetik asit glasiyal 45 ml, saf su 35 ml) Asetik asit saf su ile karıştırılır. Üzerine karmin ilave edilir. Karışımı ağzı dar boyunlu bir cam kap içine konur ve 1 saat çok hafif kaynatılır. Kaynama sırasında taşmanın önlenmesi için cam kaba bir mantar aracılığıyla uzun bir cam boru takılarak boruyu devamlı soğutmak gerekir. Karmin soğuduktan sonra süzülür. Süzgeç kağıdında kalan kalıntılar yeniden kullanılabilir. *Alkollü Hematoksilen: (Hematoksilen 1 gr, %100' lük alkolden 70 ml, saf su 30ml) Hepsi birbirine karıştırılarak yapılır. Mordanlama: Bazı boyaların dokuyu boyaması güç olduğundan bu dokulara boya karşısında kimyasal olarak bir aktiflik kazandırmak gerekir. Bu işleme Mordanlama denir. Bu işlem için kullanılan maddelere de Mordanlayıcı denir. Genel olarak mordanlayıcı madde olarak Amonyum ferri sülfat kullanılır. Bu tuzlar boyanın dokuya sıkıca tutunmasını sağlar. Boya sabitleşir ve ve dehidrasyon sırasında rengi açılmaz. Sentetik Boyalar: Sentetik boyalarda boyanın kimyasal yapısı bilindiğinden herhangi bir organele veya hücresel yapıya özel olan boya seçilerek aynı lam üzerinde iki veya daha fazla boyanın peşpeşe kullanılmasıyla çeşitli hücre kısımları farklı renklerde boyanabilir. Metakromazi: Tiazin grubundan bazı bazik boyalar bazı hücre yapı taşlarını boyanın asıl renginden farklı boyarlar. Bu özelliğe metakromazi denir. En çok kullanılan metakromazi boyalar; metilen mavisi, metil moru, kristal moru, touluidin mavisi, selestin mavisidir. Bunlardan her biri dokuyu kırmızıya çalan erguman rengine boyar. *Giemsa Boyası: (Giemsa boyası:1 gr, Gliserol:66 ml, Metil alkol:66 ml) Önce giemsa boyası ile gliserolü 60 O C deki etüvde 2 saat karıştırılmalıdır. Sonra üzerine metil alkol ileve edilir. Kullanılacağı zaman ana çözeltiden (ana çözelti:10 ml, saf su:90ml) ilave edilerek giemsa boyası elde edilir.
8. Preparatın Monte Edilmesi: Boyama işlemi bittikten sonra kesitler alkol serilerinden geçirilir. Seriler düşük konsantrasyonda başlayıp mutlak alkole kadar çıkmalıdır. Alkol serilerinden geçen preparat son olarak ksilole konur. Lamdaki kesitler üzerine 1 damla yapıştırıcı damlatılır. 45 O C' lik açıyla hava kabarcığının kalmamasına dikkat edilerek kapatılır. Kapatılan preparat 30 O C' deki ısıtıcı bir plak (hot-plate) veya etüvde bekletilerek yapıştırıcının kuruması sağlanır. Lamelle Kapatma Ortamları: Lamellerin kapatılması doğal bir reçine veya sentetik bir ortamda yapılır. Doğal reçineler içinde en çok Kanada Balzamı kullanılır.(abies balzamea adı verien çamdan elde edilir.). Sentetik yapıştırıcılar ise; Depex, distren,coedax sayılabilir. Lam Buzlandırma Eriyiğinin Hazırlanması (Piza Eriyiği): BaSO 4...15 mg NH 4 F...15 mg (NH 4 )SO 4...10 mg oksalik Asit...8 mg Gliserin...32 ml Saf su...12 ml Başka bir kapta giliserin ve saf suyu karıştırıp sonra plastik şişeye ilave ederek katı maddelerin karıştırılarak erimesi sağlanır. Hazırlanan karışım bir hafta bekletilir. Bir hafta sonra fırça ile lamın ucuna sürüp oda sıcaklığında 1 saat bekletip çeşme suyunda yıkanır. Böyleve lamın bir ucunun buzlu olması sağlanır.