Histolojik inceleme teknikleri Hemşirelik Agnes.A. A- Omon

Transkript

1 Histolojik inceleme teknikleri Hemşirelik Agnes.A. A- Omon

2 Ders İçeriği Histolojinin ve Embriyolojinin tanımı ve amacı. Histolojinin kullanımı ve uygulamaları. histolojinin uygulandığı bazı teknikler Dokuların kesit için hazırlanması. Boyama ve boyamanın kimyasal temeli. Boya türleri. Özel boyalar ve sonuçları. Histolojik örneklerin kimyasal kompozisyonu. Mikroskopi.

3 Histoloji ve Embriyoloji Nedir? Histoloji hücrelerin mikroanatomisini anlamayı ve hücre fonksiyonu ile hücre yapısını ilişkilendirmeyi amaçlamaktadır. Embriyoloji embriyo oluşumunu, gelişimini, yapısını, anomalisini ve fonksiyonel akgvitelerini inceleyen bir bilimdır. Alveol Epitel hbp:// Derinin Epitel hbps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/84/epidermis- delimited.jpg

4 Down Sendromu. Doğan her 700 bebekten birinin down sendromu vardır. hbp:// content/uploads/2013/12/down- sendromu- 43.jpg Yarık dudak ve damak. Doğan her 10,000 bebekten ~ 7-8 yarık dudak ve damak vardır. hop://stagc1.squarespace.com/stagc/52e2f77de4b063a62ace2a64/t/ 551a396ce4b01fce / /

5 Histolojinin Kullanımı EğiXm Arkeoloji AraşYrma Adli soruşturma Histoloji Kullanımı Otopsi Diyagnoz

6 Hücre / doku mikroanatomisini incelemek için çok küçük hücresel maddeleri mikroskopla büyütmek gereklidir. RuGn histoloji için Işık ve Sanal mikroskopi sık kullanılır fakat diğer mikroskobik yöntemler mevcuour edilir. hbp:// hbp://vmscope.com/img/virtuelle- mikroskopie/workflow.jpg Işık mikroskobu Sanal mikroskopi

7 Bazı histolojinin uygulandığı teknikler:. Histokimya ve sitokimya. Otoradyografi. Organ ve Doku kültürü. Diferansiyel santrifüj ile hücre ve organel ayrımı. Agnes A.A- O Üç boyutlu (3D) endometriyal kanseri hücre kültürü. Agnes A.A- O Immünsitokimya

8 Dokuların kesit için hazırlanması Fiksasyon Dehidrasyon Şeffaflaştırma Gömülme Doku kesit, Boyama ve Monte

9 Fiksasyon Fiksasyon uygulanırken mümkün olduğu kadar dokunun doğal durumunun korunması hedeflenir. Sonraki doku işlemleri fiksasyondan sonra gerçekleşir. Hücre metabolizmasının sonlandırması Doku sertleşmesi Fiksasyonun amaçları Otolisis önlemek Patojenlerin öldürülmesi

10 FiksaXf En yaygın olarak kullanılan fiksagf formalin dir (% 37 formaldehid çözelgsi). % 10 Formalin ışık mikroskobunda dokuları korumak için kullanılanılır. Formaldehit, proteinlerin amino asit gruplarıyla (özellikle lisin) reaksiyona girerek hücreleri ve ekstraselüler bileşenleri korur. Formaldehit etkili ama yavaş dokuya nüfuz eder. Formaldehit lipidler ile reaksiyona girmez.

11 Dehidrasyon Fiksasyondan sonra, dokulardan ince kesitler alabilmek için dokuyu sertleşgren bir maddeyle dokunun gömülü olması gerekir. Bununla birlikte gömme maddesinin su ile karışmayan bir özelliği vardır. Sonuç olarak, doku sırayla yoğunluğu artmış alkol/su karışımlarıyla dehidre edilir. Dehidrasyon karışımı Etanol, MeGl alkol, Metanol, Aseton içerir. Doku %50 %70 %90 %95 %100 %100 Doku Su giderme Dehidratlanmış doku

12 Şeffaflaştırma Şeffaflaştırma sırasında dehidrasyonda kullanılan dehidrasyon ajanının kaldırılması hedefleniyor. Dokuda kalan alkolü çıkarmak organik çözelgler için kullanılır. Bu çözelgler, genellikle, hem alkol hem de gömme maddede çözünür. Şeffaflaştırma ajanlarının bazıları şunlardır: Ksilen Tolüen Kloroform Benzen Doku Dehidratlanmış doku Tol. Tol. Doku Şeffaflaştırılmış doku

13 Gömme RuGn histoloji için Parafin mumu en sık kullanılan gömme ajanıdır. Ince kesitler sağlamak için dokunun kesilebilir sert doku haline gegrilmesi gerekiyor. Bunun gerçekleşmesi için sıvı halde olan gömme ajanı dokuya nüfuz eder ve doku sertleşir. Parafin ᵒC arasında erir. Doku örneği erimiş parafin mumu içerisine istenen şekilde yerleşgrilir. Parafin mumu sertleşene kadar soğumaya bırakılır. Diğer gömme maddeleri: Ester mumu, Polyester mumu, PolieGlen ve glikol. hbp://

14 Doku kesit Doku sertleşmesi sonrasında parafin blok istenen boyutta küçültülüp mikrotoma monte edilir. İnce bir kesit elde etmek için parafin bloğu mikrotomdaki çelik bıçak ile kesilir. Ince kesit (5-15μm) bir cam lam üzerine yerleşgrilir.

15 Boyama ve Monte Hematoksilen ve Eosin (H & E) rugn histolojik doku hazırlanması için en sık kullanılan boyalardır. Hematoksilen doğal bir boyadır. Tamamen bir bazik boya değildir. Hematoksilen koyu mavi- mor renkgr ve çekirdekleri mavi boyar. Eosin negagf yüklü olan bir asidik boyadir. Eosin dokudaki pozigf yüklü bileşenler ile reaksiyona girer. Sitoplazmayı pembe boyar.

16 Kesilmiş parafin kesitleri renksizdir. Işık mikroskobunda görüntülemek için kesitlerin boyanması gereklidir. Kesitleri boyamak için, dokudaki parafinin organik çözelgler ile çözülmesi gerekmektedir (Deparafinizasyon). Deparafinizasyon dan sonra doku sırayla yoğunluğu azalmış alkol/su karışımlarından geçirilerek sulandırılıp boyanir. Tol Tol %100 %90 %70 %50 Parafin edilmiş doku Deparafinize doku

17 Kesitlerin korunması ve kalıcı bir preparasyon elde etmek için, boyanmış kesitler cam lam üzerine monte edilip ince cam lamel ile kapaolır. ÇözelGlmemiş monte medyum dokuya damlaolır ve bu lamelin cam lama yapışmasını sağlar. hbp://

18 Boyamanın kimyasal temeli Bazik boya PoziGf bir yük taşır. Dokuda anyonik bileşenler ile reaksiyona girer (bazofilya). ph spesifikgr. Doku anyonik bileşenleri: Nükleik asitlerin fosfat grupları (heterochromagn ve nükleol) Glikozaminoglikanların Sülfat grupları. Proteinlerin karboksil grubudur. Asidik boya NegaGf bir yük taşır Dokuda bazik bileşenler ile reaksiyona girer (Acidofilya). ph bazik boyalar gibi spesifik değildir Doku bazik bileşenleri: Sitoplazmik filamanlar. Örn kaslardaki filamanlar. Hücre içi membran bileşenleri. Ekstraselüler lifler.

19 Bazik ve Asidik boyalar Bazik boyalar Renk Asidik boyalar Renk MeGl yeşil Yeşil Asit Fuchsin Kırmızı MeGlen mavisi Mavi Aniline mavisi Mavi Pyronin G Kırmızı Eosin Kırmızı Toluidin mavisi Mavi Turuncu G Turuncu

20 Periyodik asit Schiff karbonhidrat ve karbonhidrat bakımından zengin moleküller. Masson trikrom bağ dokusu. Giemsa Kan. Boyaları ve hedef hücresel bileşenler Toluidin mavisi hücrelerin asidik bileşenler. Nissyl ve MeXlen mavisi nöronların kaba endoplazmik regkulum. Sudan, Osmium Lipid içeren yapılar örneğin miyelin, bazal membran. Gümüş ve alyn yöntemleri Nöronların uzanoları

21 Metakromazi Normalde mavi rengi olan bazı bazik boyalar berlirli doku bileşenleri ile reaksiyona girdiğinde kırmızı veya mora dönüşür. Metakromazi bu dokulardaki polianyonlar dan dolayi meydana gelir. Konsantre edilmiş bir bazik boya, örneğin Toluidin mavisi ile doku boyandiğinda renk kayması meydana gelir. Metakromazi gösteren dokular: Kıkırdak zemin madde. Heparin içeren Mast hücrelerinin granülleri Plazma hücrelerinin kaba endoplazmik regkulumu

22 A B hbp://cache3.asset- cache.net/gc/ details- of- epithelial- cells- of- small- gebyimages.jpg?v=1&c=iwsasset&k=2&d=k0mmc%2fj %2F9v13HeaYP9o7DWjKJ5%2FHxRAxWDpeiYEgm6h %2FyvD3mI5nmKSHWOcCqWuU hbp:// /histo/porvolios06/lizmariel/p2i2.jpg C A. Ince bağırsak dokusu (Toluidin mavisi boya) B. Kıkırdak dokusu (Toluidin mavisi boya) C. Mast hücresi (Toluidin mavisi boya) hbps://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/f/f4/mast_cell_leukemia.jpg

23 Aldehit grupları ve Schiff belirteci Schiff belirteci aldehidler ile reaksiyona girdiğinde belirgin kırmızı veya mor renk elde edilir.bu reaksiyon Periyodik asit schiff in (PAS) ve Feulgen reaksiyonunun temelidir. PAS reaksiyonu (Periyodik asit + Schiff belirteci) karbonhidrat ve karbonhidrat zengin makromolekülleri boyar. Feulgen reaksiyonu (hidroklorik asit + Schiff belirteci) DNA yı boyar. Karbonhidrat heksoz şekeri Periyodik asit Periyodik asit Aldehit Deoksiriboz şekeri + HCl + Schiff s belirteci = Kırmızı veya Mor renk hbp://stainsfile.info/stainsfile/stain/schiff/reacxon- nucleal.htm Glikozaminoglikanların heksozamin Aldehit Deoksiriboz aldehid hbp://stainsfile.info/stainsfile/stain/schiff/reacxon- pas.htm

24 PAS boya İnce bağırsak epiteli hbp://flylib.com/books/2/953/1/html/2/24%20- %20small%20intesXne_files/ da7c24ff6.png Feulgen boya Soğan dokusu hbp://cache4.asset- cache.net/gc/ onion- hematoxylin- and- feulgen- stain- mitosis- gebyimages.jpg? v=1&c=iwsasset&k=2&d=f7ecra8da6epi7gnchiphot %2Ff8m3eFoGZtuQS07L6a25um5sQjyyIZtAcnJqzH2q

25 Histolojik örneklerin kimyasal kompozisyonu Boyama için hazırlanmış bir dokunun ve canlı bir dokunun kimyasal bileşimleri farklıdır. Hazırlanmış bir dokuda büyük moleküller diğer büyük moleküller ile reaksiyona girip kolaylıkla çözünmeyen makromolekül kompleksleri oluşturur. Makromolekül kompleks örnekleri: Nükleoproteinler (nükleik asit bağlanmış proteinler). Hücre içi cyto- iskelet proteinleri ve bunlarla ilişkili proteinler. Hücre dışı proteinleri. Membran fosfolipid- protein kompleksleri.

26 Doku hazırlanması sırasında kaybedilen doku bileşenleri Transfer RNA moleküller (trna) Nötr lipidler: Doku hazırlanmasında kullanılan organik çözücülerde çözülür. Glikojen, proteoglikanlar ve glikozaminoglikanlar. Fiksasyon çözelgsinin ph indan dolayi kaybedilir. Iyonlar parafin kesitlerin hazırlanması sırasında kaybolur. Glükoz, sodyum klorid gibi aracılık metabolitler.

27 Mikroskopi Mikroskopik nesneleri incelemek için mikroskop kullanma yöntemidir. Mikroskop görüntüyü büyüten bir araçor ve çıplak insan gözünden daha ayrınolı bir görüntü sağlar Mikroskopinin iki çeşidi vardır: Tek lens (Basit) Çoklu lens (Bileşik)

28 Mikroskop Çeşitleri Görüntüyü oluşturmak için kullanılan fiziksel prensiplere göre, mikroskoplar 2 gruba ayrılmışor: Işık / OpGk mikroskobu. Elektron mikroskobu. Işık / opxk mikroskobu Işık mikroskobu bir görüntü oluşturmak için görülebilir ışık veya ultraviyole ışık kullanır. Işık mikroskobu maksimum büyütme 1500 dır. Öğrenciler taraxndan en yaygın olarak kullanılan ışık mikroskobu Brighyield mikroskoptur.

29 Işık mikroskobunun ana kısımları : Işık kaynağı: Doku örneği aydınlatmak için. Kondenser lens: Doku örneğinin Yüzeyine ışık ışınını odaklamak için. Mekanik Staj: cam lamın veya doku örneğinin yerleşgrildiği yer. ObjekXf lens: Doku örneğinden geçen ışığı toplamak için. Oküler lens: Oküler lens objekgf lensin oluşturduğu görüntüyü görüntüler. hbp://histonano.com/books/junqueira's%20basic%20histology%20pdf%20whole%20book/ 1.%20Histology%20&%20Its%20Methods%20of%20Study.htm

30 Bazı diğer opgk mikroskoplar: Ters mikroskop, Faz kontrast mikroskobu, Dark field mikroskobu, Floresan mikroskobu. Elektron mikroskobu Elektron mikroskobu görüntüleri oluşturmak için elektron ışını kullanır. Işık mikroskobundan daha büyük bir çözünürlük gücüne sahipgr ve kata kadar büyütebilir. Sonuç olarak elektron mikroskobu hücrelerin iç yapısının ince ayrınolarını gösterebilir Elektron mikroskobu iki çeşizr: Transmisyon elektron mikroskobu ve Taramalı elektron mikroskobu

31 Transmisyon elektron mikroskopi (TEM) Elektron mikroskopisinde, elektron ışını doku örneğinden geçgğinde, iki boyutlu bir görüntü oluşturur. TEM sinde fiksasyon için % 2.5 Glutaraldehit kullanılır. Formaldehit gibi proteinlerle çapraz bağlano kurar. TEM tespig için doku boyutu 1mm 3 den büyük olmamalıdır. Osmiyum tetroksit hücre ve dokuyu boyamak ve elektron yoğunluğu vermek için kullanılır. Fosfolipidler boyanarak dokuya kontrast sağlar. Dehidrasyon işlemi ışık mikroskobundakine benzerdir ve dokuyu sertleşgrmek için doku Epoksi ile infiltre edilir. Elektronların sınırlı nüfuz gücü olduğu için, TEM örnekleri nm kalınlığında olmalıdır.

32 Transmisyon elektron mikroskopi (TEM) A. Transmisyon elektron mikroskop. B. Elektron mikroskobu inceleme için dokulardan ince kesit alan ultra mikrotomlar A B Bilir A. Bilir A.

33 Transmisyon elektron mikroskopi (TEM) A A. Meme kanser hücrelerinin elekron mikroskobik görünümü. Bilir A. B. Mast hücreleri elekron mikroskobik görünümü. B

34 C C. Mikroviluslar kanser hücrelerinin elekron mikroskobik görünümü. Bilir A. D D. Hücreler arasındaki bağlano Bilir A.

35 Taramalı elektron mikroskobu Elektron ışını doku örneğine ulaşır ancak elektronlar örneğin içinden geçmez ve yüzeyinden geri zıplarlar. Sonuç olarak üç boyutlu örneğin yüzey yapısının görselliğini sağlar. FerXlizasyon Ebola virusu hbp://41.media.tumblr.com/4c~80adfdea6a0399f6828b9c432/tumblr_nske6jsjtu1qievavo1_1280.jpg hbp:// 20/ebola- sareptas- promising- experimental- drug- goes- overlooked

36 hbp://nanofabricaxon.unt.edu/jeol- jsm- 7001f- scanning- electron- microscope Taramalı elektron mikroskob.

37