OREOCHROMİS NİLOTİCUS DA KADMİYUMUN BAZI KAN PARAMETRELERİ ÜZERİNE ETKİSİ * Effect of Cadmium on Some Blood Parameters of Oreochromis niloticus. Özgür FIRAT Biyoloji Anabilim Dalı Ferit KARGIN Biyoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu araştırmada, kadmiyumun Oreochromis niloticus da bazı kan parametreleri üzerine etkileri 0.1 ve 1.0 mg/l Cd ortam derişimlerinde, 7 ve 14 günlük sürelerde incelenmiştir. Balıkların eritrosit, lökosit, hemoglobin, hematokrit düzeyleri, Coulter LH 750 Analyser de, serum örneklerindeki glukoz ve kolesterol düzeyleri Roche Moduler DPP marka alette belirlenmiştir. Kan eritrosit sayısı, lökosit sayısı ve hematokrit düzeyi ortam derişimine bağlı olarak azalmış, kan hemoglobin düzeyinin ise arttığı belirlenmiştir. Serum glukoz düzeyi denenen süre ve yüksek derişimlerde artış göstermiş, kolesterol düzeyi ise tüm derişim ve sürelerde azaldığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Oreochromis niloticus, kadmiyum, kan parametreleri ABSTRACT In this study effects of Cd on some blood parameters of O. niloticus were investigated over 7 and 14 days period at concentrations of 0.1 and 1.0 mg/l Cd in the medium. Erythrocyte, leucocyte, hematocrit and hemoglobin levels were determined using Coulter LH 750 Analyser, glucose and cholesterol levels using Roche Moduler DPP. Blood hematocrit values, leucocyte and erythrocyte levels decreased with increasing cadmium concentrations while hemoglobin levels increased. Glucose content of serum increased by high cadmium concentrations, but the levels of cholesterol in the serum decreased in both exposure concentrations and periods. Key Words: Oreochromis niloticus, cadmium, blood parameters *Doktora Tezi- PhD Thesis 20
Giriş Ağır metaller, yoğunlukları 5 g/cm 3 den büyük elementlerin oluşturduğu bir grup olarak tanımlanmakta ve bu kategoriye giren 40 kadar elementten oluşmaktadır (Srivastav, 1994). Metallerin birçoğu yeterli miktarda bulunduklarında toksik değildirler. Su veya besinde yeterli düzeyde bulunmaları gereken mikro besleyici olarak düşünülmektedir. Balıklarda da Ca, Mg, Fe ve Zn gibi elementler besleyici elementler olup yeterince alınmadığında bir takım hastalık belirtileri ortaya çıkmaktadır. Cd, Hg ve Pb gibi metaller besleyici rolleri olmadığı gibi düşük düzeylerde bile organizmalara çok toksik etki yapmaktadır. Ağır metaller su kirleticilerinin büyük bir bölümünden sorumlu tutulmaktadır. Çünkü dünyanın birçok bölgelersinde kritik düzeyde bulunduğu saptanmıştır. Ağır metaller her zaman her yerde bulunmaktadır, suda çözünüp taşınmakta ve su organizmaları tarafından hemen alınmakta ve proteinlere bağlanarak toksik etki yapmaktadırlar. Kadmiyum (Cd) her yerde bulunabilen ve ağır metallerin içerisinde canlılara toksik etki göstermesi bakımından ilk sıralarda bulunan önemli bir elementtir. Kadmiyum canlılar için biyolojik işlevi olmayan bir metal olup günümüzde metal kaplama sanayisinde, seramikçilikte, cam, boya, plastik, pestisid ve gübre üretiminde çok yaygın olarak kullanılmaktadır (Sastry ve Subhadra, 1985). Balıklarda kan parametrelerindeki değişmeler ağır metallerin etkisinde kısa sürede ortaya çıktığından, bunların belirlenmesi su ortamındaki kirlenme düzeyinin (Tort ve Torres, 1988), ayrıca hastalıkların saptanmasında önem taşır. Balığın fizyolojik durumunun izlenmesi ve hastalıklarının tanısı için balık kan hücreleri ve parametrelerinin izlenmesi oldukça önemlidir (Stoskopf, 1993). Ağır metallerin birer indikatörü olarak hematolojik değişikliklerin kullanılması değişen çevre koşullarına karşı balığın verdiği tepkinin belirlenmesine olanak sağlamaktadır (Nussey ve ark. 1995). En çok kullanılan kan parametreleri eritrosit, lökosit, hemoglobin ve hemotkritdir. Bunlara ek olarak serumda glikoz ve kolesterol gibi metabolik parametrelerde çok kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalarda ağır metallerin su canlılarında hemoglobin, hemotokrit, eritrosit, lökosit, kolesterol ve glikoz gibi kan parametrelerini değiştirdiği gözlenmiştir (Majewski ve Giles, 1981; Cyriac ve ark. 1989; Lacroix ve Hontela, 2004). Bu çalışmada kadmiyumun Oreochromis niloticus da bazı kan parametreleri üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Bu projede araştırma materyali olarak kullanılan tatlı su çuprası Oreochromis niloticus, Çukurova Üniversitesi (Ç.Ü.) Su Ürünleri Fakültesi yetiştirme havuzlarından alınarak Ç.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümüne transfer edilmiştir ve bir ay süre ile 40X120X40 cm boyutlarındaki akvaryumlar içersinde laboratuar koşullarına adaptasyonları sağlanmıştır. Bu süre içerisinde 20.4±1.74 cm boy ve 70.9±7.4 g. ağırlığa ulaşmışlardır. 21
Deneyler 25 ± 1 0 C sıcaklıkta yürütülmüş, akvaryumlar merkezi havalandırma sistemi ile havalandırılmış ve günde sekiz saat aydınlanma (8 saat gündüz - 16 saat gece) periyodu uygulanmıştır. Balıklar, laboratuvar koşullarına adaptasyonları boyunca hazır balık yemiyle (Pınar Balık Yemi, Türkiye) beslenmiştir. Balıklar 7 ve 14 günlük deney süreleri dikkate alınarak deneyler iki seri halinde yürütülmüş ve her seride 7 akvaryum kullanılmıştır. Bir seride bulunan 40X120X40 cm boyutlarındaki 7 akvaryumdan ilk altısına her derişim için 3 akvaryum kullanılmak üzere 0.1 ve 1.0 mg/l lik 120 şer litre kadmiyum çözeltisi, serideki 7. akvaryum ise kontrol grubu olarak kullanılmıştır.. Deneyler denenen her derişim için altı tekrarlı olarak yürütülmüş ve her tekrarda dört balık kullanılmıştır. Belirlenen her sürenin sonunda deney akvaryumlarından alınan balıklar çeşme suyu ile iyice yıkanarak temizlenmiş ve kurutma kağıdı ile yüzeylerinde bulunan su damlacıkları alındıktan sonra kuyruk yüzgeçlerinden kesilerek kanları alınmıştır. Eritrosit, lökosit, hemoglobin ve hematokrit düzeylerini belirlemek için bir balık kanı (yaklaşık 0.6 ml kan) EDTA lı tüplere; serum glukoz ve kolesterol düzeylerini belirlemek amacıyla da iki balık kanı (yaklaşık 1.2 ml kan) düz tüplere alınmıştır. Düz tüplere alının kan örnekleri, 4.000 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek elde edilen serumlar eppendorf tüplere alınmıştır. Daha sonra EDTA lı tüplerdeki tam kan ve eppendorf tüplerdeki serum örnekleri incelenmesine geçilmiştir. EDTA lı tüplerdeki kan örneklerinin eritrosit, lökosit, hemoglobin ve hematokrit düzeyleri, Ç. Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarında Coulter LH 750 Analyser de, serum örneklerindeki glukoz ve kolesterol düzeyleri ise yine Ç. Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarında ROCHE Modüler DPP marka alette belirlenmiştir. Elde edilen verilerin istatistiksel analizleri Student s Nevman Keul s testi kullanılarak yapılmıştır. Araştırma Bulguları Kan eritrosit sayısı deney süresine ve Cd ortam derişimine bağlı olarak değişimler göstermiştir (Tablo 1 ve 2). Eritrosit sayısı 7. gün sonunda 1.0 mg/l Cd ortam derişiminde kontrole göre azalırken, 14. gün sonunda her iki ortam derişiminde de azalma göstermiştir. Kandaki eritrosit sayısı süreye bağlı olarak değişiklik göstermiştir (Şekil 1). Denenen tüm ortam derişimlerinde etkide kalma süresi arttıkça eritrosit sayısının azaldığı belirlenmiştir. Her iki ortam derişimi ve sürede belirlenen kan lökosit sayısı Tablo 1 ve 2 de verilmiştir. 7. gün sonunda 1.0 mg/l Cd ortam derişiminde lökosit sayısı kontrole göre azalırken, 14. gün sonunda her iki ortam derişiminde de kan lökosit sayısı kontrole göre azalmıştır. Denenen ortam derişimlerinde etkide kalma süresi arttıkça kan lökosit sayısının da azaldığı saptanmıştır (Şekil 2). 22
Tablo 1. O. niloticus da 7. gün sonunda kadmiyumun kan parametreleri üzerine etkisi. DERİŞİM (mg/l Cd) Kontrol * 0.1 * 1.0 * Eritrosit (10 6 /µl) 1.79±0.05 a 1.71±0.09 a 1.43±0.05 b Hemoglobin (g/dl) 8.52±0.07 a 8.62±0.05 a 8.70±0.06 a Hemotokrit (%) 30.12±0.18 a 29.42±0.22 a 29.21±0.25 a Lökosit (10 3 /µl) 48.91±0.28 a 47.12±0.35 a 41.94±0.14 b Glukoz (mg/dl) 52.77±1.66 a 52.03±1.31 a 75.14±1.01 b Kolesterol (mg/dl) 194±2.45 a 154±2.76 b 150±2.10 b Tablo 2. O. niloticus da 14. gün sonunda kadmiyumun kan parametreleri üzerine etkisi. DERİŞİM (mg/l Cd) Kontrol * 0.1 * 1.0 * Eritrosit (10 6 /µl) 1.78±0.12 a 1.50±0.13 b 1.15±0.19 c Hemoglobin (g/dl) 8.49±0.08 a 9.11±0.04 b 9.15±0.03 b Hemotokrit (%) 30.19±0.19 a 28.90±0.15 a 23.12±0.35 b Lökosit (10 3 /µl) 49.14±0.30 a 42.13±0.17 b 36.23±0.39 c Glukoz (mg/dl) 49.02±1.24 a 62.11±1.59 b 70.80±1.49 b Kolesterol (mg/dl) 196±2.21 a 149±2.89 b 117±2.33 c * : Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır. 23
Lökosit Sayısı (10 3 /µl) Eritrosit Sayısı (10 6 /µl) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:17-2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Şekil 1. O. niloticus da kan eritrosit sayısı üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. 50 40 30 20 10 0 Şekil 2. O. niloticus da kan lökosit sayısı üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. 24
Hematokrit Düzeyi (%) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:17-2 Kan hematokrit düzeyi denenen kadmiyum ortam derişimlerinde ve etkide kalınan sürelerde değişimler göstermiştir (Tablo 1 ve 2). 7. gün sonunda denenen her iki ortam derişiminde de kan hematokrit düzeyi bir değişiklik göstermemiş, 14. gün sonunda 1.0 mg/l Cd ortam derişiminde kan hemotokrit düzeyinin azaldığı belirlenmiştir. Kan hematokrit düzeyi etkide kalma süresinin artmasıyla özellikle yüksek ortam derişimlerinde (1.0 mg/l Cd) azaldığı saptanmıştır (Şekil 3). 35 30 25 20 15 10 5 0 Şekil 3. O. niloticus da kan hematokrit düzeyi üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. Denenen ortam derişimlerinde deney sürelerinde kan hemoglobin düzeyleri Tablo 1 ve 2 de verilmiştir. 7. gün sonunda denenen her iki Cd ortam derişimlerinde kan hemoglobin düzeyleri kontrole göre bir değişiklik göstermezken, 14. gün sonunda ise denenen her iki Cd derişiminde de kan hemoglobin düzeyinin arttığı saptanmıştır. Kan hemoglobin düzeyi etkide kalma süresinin artışıyla her iki ortam derişiminde arttığı belirlenmiştir (Şekil 4). Denenen ortam derişimleri ve deney sürelerinde belirlenen serum glukoz düzeyleri Tablo 1ve 2 de verilmiştir. Serum glukoz düzeyi 0.1 mg/l Cd ortam derişiminde 7. gün sonuna kadar kontrole oranla bir değişme göstermezken, 1.0 mg/l Cd ortam derişiminde ise kontrole göre artış göstermiştir. 14. gün sonunda Cd un her iki ortam derişiminde de serum glukoz düzeyleri kontrole oranla önemli düzeyde artmıştır. Denenen her iki ortam derişiminde de deney sürelerinde artış serum glukoz düzeylerini önemli düzeyde arttırmıştır (Şekil 5). 25
Glukoz Düzeyi (mg/dl) Hemoglobin Düzeyi (g/dl) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:17-2 9,2 9,1 9 8,9 8,8 8,7 8,6 8,5 8,4 8,3 8,2 8,1 Şekil 4. O. niloticus da kan hemoglobin düzeyi üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Şekil 5. O. niloticus da kan glukoz düzeyi üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. 26
Kollesterol Düzeyi (mg/dl) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:17-2 Serum kolesterol düzeyleri denene tüm ortam derişimleri ve sürelerde önemli değişmeler göstermiştir (Tablo 1 ve 2). Her iki sürede ortamdaki Cd derişiminin artışıyla serum kolesterol düzeyinin azaldığı belirlenmiştir. Denenen ortam derişimlerinde etkide kalma süresi arttıkça serum kolesterol düzeyinin de azaldığı saptanmıştır (Şekil 6). 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Şekil 6. O. niloticus da kan kolesterol düzeyi üzerine kadmiyum ortam derişimlerinin süreye bağlı etkileri. Tartışma ve Sonuçlar Ağır metaller düşük derişimlerde balıklarda hemoglobin, hematokrit, kan hücrelerinin sayısı, kolesterol ve glukoz düzeyleri gibi hematolojik parametrelerde önemli değişmelere neden olmaktadır (Hilmy ve ark. 1980). Balıklar yaşadıkları su ortamıyla çok yakın ilişkide olmaları ve çevrede kirleticilere karşı çok hassas olmaları nedeniyle kirleticilerin etkileri kan parametrelerine hemen yansımaktadır. Bu araştırmada Cd un etkisine bırakılan O. niloticus da 7. günde yüksek ortam derişiminde (1.0 mg/l Cd), 14. günde ise her iki ortam derişiminde kandaki eritrosit sayısı, lökosit sayısı ve hematokrit düzeyi düşmüş, hemoglobin düzeyi ise artmıştır (Tablo 1 ve 2). Scliorhinus canicula (köpek balığı) da çinko (Zn) eritrosit, lokosit sayısı ve hematokrit düzeyinde bir azalmaya neden olmuştur (Flos ve ark. 1987). Bakır (Cu) ve civanın (Hg) etkisine bırakılan Oreochromis mossambicus da (tatlı su balığı) düşük derişimlerde hematokrit düzeylerinde bir değişikliğin olmadığı, hemaglobin düzeyinin ise arttığı belirtilmiştir (Cyriac ve ark. 1989). Tort ve Torres (1988) 4 gün süreyle Cd un etkisine bıraktıkları Scyliorhinus canicula da hematokrit ve lökosit sayısında bir azalmanın olduğunu, hemoglobin düzeyinde ise 27
bir artışın olduğunu belirtmişlerdir. Ictalarus nebulosus balığında 30 gün süre ile bakırın etkisine bırakılmış ve hemoglobin düzeyinin arttığı belirtilmiştir (Christensen ve ark. 1972). Ağır metallerin etkisinde kan parametrelerinde meydana gelen değişiklikler kanın su içeriğinin değişmesinden kaynaklandığı belirtilmiştir (Tort ve Torres, 1988). Bu araştırmada Cd un etkisinde hematokrit düzeyinin düşmesi, kandaki su oranının artışının bir sonucu olabilir. Bu araştırmada hemoglobin düzeyi her iki sürede ve ortam derişiminde artış göstermiştir. Hemoglobin düzeyindeki bu artışın, balığın ortamdan daha fazla O 2 absorbe etmesine ve artan O 2 isteğini karşılamasından kaynaklanmaktadır. Balıklarda eritrosit ve lökosit sayısı ağır metallerin toksik etkisinden çok çabuk etkilenmesi nedeniyle hematolojik tepkiyi yansıtmada iyi birer belirteçtirler. Araştırmamızda Cd un etkisinde eritrosit ve lökosit sayısının azalması, balıkların strese girmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Glukoz balıklarda acil enerji gereksinimi karşılayan gerekli bir metabolik parametredir. Balıklarda kadmiyumun bakır ve çinkonun serum glukoz düzeyini arttırdığı belirtilmiştir (Sastry ve Subhadra, 1985; Cicik, 1999). Scyliorhinus canicula da düşük bakır ve kadmiyumun ortam derişimlerinde serum glukoz düzeyinin arttığı saptanmıştır (Tort ve ark. 1987; Tort ve Torres, 1988). Alabalıklarda serum glukoz düzeylerinin derişime bağlı olarak bakırın (Cu) etkisinde arttığı gözlenmiştir (Leuren ve McDonald, 1985). Bu araştırmada O. niloticus da Cd ortam derişimleri glukoz düzeyinin artışına neden olmuştur. Serum glukoz düzeyindeki bu artışın karbonhidrat metabolizmasının endokrin kontrolünün bozulmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Kolesterol sinir ve diğer dokuların yapı elemanları olarak kullanılır. Kolesterol balıklarda gelişme, eşeysel olgunluğa ulaşma ve üreme için gerekli bir yapı elemanıdır. Kolesterol, balıklarda kirleticilerin etkisinde meydana gelen değişiklikleri değerlendirmek için kullanılmaktadır. Araştırmada denenen tüm koşullarda Cd un serum kolesterol düzeyinde bir azalmaya neden olmuştur. Cyprinus carpio da bakır ve çinkonun etkisinde serum kolesterol düzeyinin kontrole göre değişim gösterdiği belirtilmiştir (Cicik, 1995). Kaynaklar CİCİK, B. (1995). Cyprinus carpio (L) da Bakır, Çinko ve Bakır+Çinko Karışımında Solungaç, Karaciğer Ve Kas Dokusundaki Metal Birikiminin Nicel Protein, Glikojen Ve Kandaki Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerin Etkileri. Çukurova Üniversitesi, Fen Bilimleri Dergisi, Biyoloji Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 107 s. CHRİSTENSEN, G. M., MCKİM, J. M., BRUNGS, W. A., HUNT, E. P. (1972). Changes in the Blood of the Brqwn Bullhead (Ictalarus nebolosus) Following Short and Long Term Exposure to Copper. Toxicol. And Appl. Pharmacol. 23, 417-427. CYRİAC, P. J., ANTONY, A., NAMBİSAN, P. N. K. (1989). Hemoglobin and Hemotocrit Values in the Fish Oreochromis Mossambicus After Short Term Exposure to Copper and Mercury. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 43, 315-320. 28
FLOS, R., TORT, L., BALASCH, J. (1987). Effects of Zinc Sulphate on Haematological Parameters in the Dogfish Scyliorhinus canicula and Influences of MS-222. Marine Environ. Res. 21, 289-298. HİLMY, A. M., SHABANA, M. B., SAİD, M. M. (1980). Haematological Responses to Mercury Toxicity in Marine Teleost, Ahanius dispar. Comp. Biochem. Phsiol. 67C, 147-158. LACROİX, A., HONTELA, A. (2004). A Comparitive Assessment of the Adrenotoxic Effects of Cadmium in Two Teleost Fish Species, Rainbow Trout Oncorhynus mykiss and Yellow Perch Perca flovences. Aquat. Toxicol. 67, 3-21. LAUREN, D. J., MCDONALD, D. G. (1985). Effect of Copper on Branchial Ionoregulation in the Rainbow Trout Salmo gairdneri Richardson. J. Comp. Phsiol. 155B, 635-644. MAJEWSKİ, H. S., GİLES, M. A. (1981). Cardiovascular- Respuratory Responses of Rainbow Trout (Salmo gairdneri) During Chronic Exposure to Sublethal Concentration of Cadmium. Water Res. 15, 1211-1217. NUSSEY, G., VAN VUREY, J. H. J., DU PEREEZ, H. H. (1995). Effects of Copper on the Haematology and Osmoregulation of Mozambique Tilapia, Oreochromis mossambicus (Cichlidae). Comp. Biochem. Phsiol. 111C, 369-380. SASTRY, K. V., SUBHADRA, K. M. (1985). In-vivo Effects of Cadmium on Some Enzyme Activities in Tissues of Freshwater Catfish Heteropneustes fossilis. Environ. Res. 36, 32-45. SRİVASTAV, R. K., GUPTA, S. K., NİGAM, K. D. P., VASUDEVAN, P. (1994). Treatment of Chromium and Nicel in Waste Water by Using Aquatic Plants. Water Res. 28, 7, 1631-1638. STOSKOPF, M. K. (1993). Clinical Patology in Fish. Medicine, Saunders, Philadelphia, 113-131, 882 pp. TORT, L., TORRES, P., FLOS, R. (1987). Effects of Dogfish Haematology and Liver Composition After Acute Copper Exposure. Comp. Biochem. Physiol. 87C, 349-353. TORT, L., TORRES, P. (1988). The Effects of Sublethal Concentrations of Cadmium Haematologycal Parameters in the Dogfish, Scyliorhinus canicula. J. Fish. Biol. 32, 277-282. 29