www.bursagida.gov.tr Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) ISSN 133-317 GÜNEY MARMARA BÖLGESİNDE SATIŞA SUNULAN HAYVAN YEMLERİNDEKİ ANTİBİYOTİK VE ANTİKOKSİDİOSTAT DÜZEYLERİNİN LC-MS/MS YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA Ali ÖZCAN* Mehmet Yılmaz KARACA* Dilek BAYRAKTAR* ÖZET Bu çalışmada, Güney Marmara Bölgesinde satışa sunulmuş olan hayvansal yemlerde bulunan veteriner ilaç kalıntılarının düzeylerini tespit etmek için antikoksidiostatlar, kloramfenikol ve tetrasiklin grubu antibiyotikler incelenmiştir. Avrupa Birliği, yemlerde antibiyotik kullanımını 1 Ocak 6 tarihi itibarı ile yasaklamıştır. Ülkemizde de karma yemlere ilave edilen büyümeyi artırıcı maddelerden her türlü hormon ve hormon benzeri maddeler ile antibiyotiklerin kullanımı yasaklanmıştır. Önceleri kullanımına izin verilenler dahil antikoksidiyaller ve ilaç niteliğinde olan diğer maddelerin tamamı yasaklanmıştır. Bu kapsamda bölgesel olarak yapılan çalışmada, antikoksidostat ve antibiyotik analizleri gerçekleştirilmiş ve yemlerde bu tür maddelerin yaygınlığı ortaya çıkmıştır. Anahtar Kelimeler: Yem, Antibiyotik, lar,,, LC-MS/MS A STUDY ABOUT DEDECTING THE RESIDUE LEVELS of ANTIBIOTICS AND ANTICOCSIDIOSTATS IN ANIMAL FEEDS BY LC/MS/MS METHOD WHICH ARE PUT UP ABSTRACT SALE IN SOUTH MARMARA REGION In this study, animal feeds that put up for sale in the field of the South Marmara Region were searched to detect the veterinary drug residue levels of Chloramphenicol, Tetracyclin antibiotics and th Anticoccisidiostats. In the European Union, the usage of antibiotics has been prohibited since January 1, 6. In Türkiye, the usage of any hormones, hormone,-like substances and growth -promoting substances in compound feeds have been prohibited. Including the anticoccidiostats that are allowed to use, utilization of the substances as drug has also been prohibited. In this context, regional usage of anticoccidiostats and antibiotics in feeds was carried out and the currency of such substances were investigated. Keywords: Feed, antibiotic. antikoksidiostats, cloramphenicols, tetrasiclins, LC-MS/MS *Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü / BURSA email:vetali61@hotmail.com
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 1. GİRİŞ Ülkemiz de dahil olmak üzere bir çok ülkede hayvansal protein açığı vardır ve gün geçtikçe hızlı nüfus artışına bağlı olarak bu açık büyümektedir. Dünya nüfusundaki artışa paralel olarak, ekonomideki gelişme bunun ne kadarının et için talebe dönüşeceğini belirleyecektir. Gelişmekte olan ülkelerde 776 milyon kişi (her 6 kişiden biri) açlık problemi ile karşı karşıyadır (Aynagöz, 1993., Swick, 5). Halkımızın dengeli beslenebilmesi, başka bir ifade ile hayvansal protein açığının kapatılması hayvansal üretimin hızlı bir şekilde artırılmasına yönelik önlemlerin alınmasını zorunlu kılmaktadır (Aynagöz, 1993). Hayvan beslemede antibiyotikler, yemler ve biyoteknoloji alanındaki gelişmelere paralel olarak yıllardır büyütme faktörü olarak kullanılmaktadır. Ancak antibiyotikler, bağırsak mikroflorasındaki yararlı mikroorganizmaların azalmasına neden olmaktadır. Antibiyotiklerin uzun süre kullanımlarında ise patojen mikroorganizmalar direnç kazanmakta ve zamanla antibiyotiklerin etkilerini azaltmaktadırlar (Jensen, 1998.). Türkiye'de karma yemlere ilave edilen büyütmeyi artırıcı maddelerden her türlü hormon ve hormon benzeri maddeler ile antibiyotiklerin kullanımı yasaklanmıştır. Kullanımına izin verilenler hariç antikoksidiyaller ve ilaç niteliğinde olan diğer maddelerin kullanımı da yasaklanmıştır (Anon,., Anon, 5., Anon, 6.). Antibiyotiklerin dezavantajlarının yanı sıra, antibiyotik katkılı yemlerle beslenen hayvanların ürünlerinde kalıntı bırakması ve bu hayvanların ürünleriyle beslenen insanların sağlığını tehdit etmesi, tüketici hassasiyeti yaratmıştır. Özellikle insan sağlığını tehdit eden bu sonuçların paralelinde Avrupa Birliği yemlerde antibiyotik kullanımını 1 Ocak 6 tarihinden itibaren yasaklamıştır. Antibiyotikler, yaşayan bir organizma tarafından üretilip bir diğerinin yaşamasına ya da büyüyüp çoğalmasına engel olan maddelerdir. Hastalıktan korunma ve tedavi amacıyla olduğu kadar yemden yararlanma ve büyüme oranını artırma amacıyla da kullanılabilir. (Coskun ve ark.1998, Küçükersan, 1999). Antibiyotiklerin yemlere katılmasının karşısında olanlar, sürekli antibiyotik kullanımı ile mikroorganizmalara karşı direnç ve hastalıklara karşı mücadelenin zorlaşacağını, hayvansal gıdalarda kalıntı bırakacağı ve insan sağlığını tehdit edeceğini, karsinojenik ve mutajenik özellikleri olduğunu savunmaktadır. Yemlere antibiyotik katılması özellikle iştahsız, yem tüketimi düşük, rasyonun enerji ve özellikle protein düzeyi yetersiz, sağlığı bozuk, kümes koşullarının hijyenik olmaması ve stres altındaki hayvanlarda antibiyotiğin olumlu etkileri görülmesine karşın yukarıda sözü edilen tüm olumsuz koşulların görülmediği sağlıklı hayvanlarda ve rasyonları tüm besin maddelerini kapsayacak şekilde dengeli hazırlanmış hayvanlarda yararı görülmemekte ve ekonomik olmamaktadır.(coskun ve ark.1998, Küçükersan, 1999). Antikoksidiyaller hayvanlarda çok yaygın ve maliyetli hastalıklardan biri olarak koksidiyozis, protozoon parazit olan Eimeria spp tarafından oluşturulmaktadır. Koksidiyozis, bağırsaklarda doku hasarına sebep olarak yemlerin sindirimi ve besin maddesi emilimine engel olarak ağırlık kaybı ve kanlı dışkı ile sonlanır. Enfeksiyon hızla yayılır, birçok hayvanın ölmesine sebep olabilir. Eğer hayvanlar koksidiyozisten yaşayabilirse Clostridium perfringens tarafından oluşturulan nekrotik enteritis gibi bir
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 3 Hastalığa eğilim gösterebilirler. Hijyen ve benimsenen yetiştirme önlemleri, kanatlıları koksidiyozisten korumak için yeterli değildir. Koksidiyozis yemle verilen antikoksidiyaller ile kontrol edilebilir. İlaçsız gıdalara olan talep ve Eimeriaların direnç gösterdiği antikoksidiyal ilaç problemi, antikoksidiyallerin etkinliğini azaltmıştır. Üreticilerin çoğunun koksidiyozisin kontrolünde alternatif metodlara bakmasına yol açmıştır (Paganini, 5., Ziggers,.) Dünyada birçok farklı laboratuvarda yapılan çalışmalarda yüksek sıklıkta antikoksidiyallere karşı direnç olduğu doğrulanmıştır. Antikoksidiyal direnç performansı da bozar. Eimeria parazitinin ionoforlara olan hassasiyeti azalır ve bu ürünler önceden etkiledikleri kadar etkili olmazlar ve sonuçta koksidiyozisin kontrolünde optimal olmayan sonuçlara yol açar (Paganini, 5.). Avrupa Birliğinde, Koksidiostatlar ve Histomonostatların kullanımına 1 yılına kadar izin verilmiştir. Antibiyotik orjinli Koksidiostatlar için ise katı önlemler alınacaktır. Koksidiostatların güvenirliğini sağlamak için Avrupa Komisyonu, koksidiostatların ruhsatlandırılmasının dört yıllık periyotta incelenmesini ve insan sağlığını korumak için maksimum kalıntı seviyelerinin incelenmesine başlanmasını önermektedir (Ziggers,., Anon, 3.). Türkiye'de kullanılan antikoksidiyal etken maddeleri, decoquinate, monensin sodium, robenidine hydrocloride, lasocid A sodium, halofuginone hydrobromide, narasin, salinomycin sodium, maduramicin ammonium, diclazuril, nicarbazin ve semduramicin sodium dur. (Ziggers, ). Bu çalışmada yem ve yem katkı maddelerinde antikoksidiostatlar, kloramfenikol ve tetrasiklin grubu antibiyotikler incelenmiştir..materyal VE METOT.1. Materyal Çalışmada materyal olarak Güney Marmara Bölgesinde satışa sunulmuş hayvansal yemler (sığır besi yemi, piliç besi yemi, sığır süt yemi) kullanılmıştır. Toplam 17 adet örnek 1 kg'lık naylon torbalarda tesadüfi örnekleme metodu ile alınmış ve analizler gerçekleştirilene kadar karanlık ve oda ısısında muhafaza edilmiştir... Metot Analizlerde, farklı matrikslerde bulunan antikoksidiostatlar, kloramfenikol ve tetrasiklin grubu antibiyotiklerin her biri için geliştirilmiş 3 farklı LC-MS/MS kit yöntemi ile çalışılmıştır...1. 'ün miktar tayini LC-MS/MS yöntemi ile yapılmaktadır. Miktarlandırma iç standart kalibrasyon yöntemine dayalıdır ve iç standart olarak dötoro kloramfenikol standardı kullanılmıştır. İç standart ilavesi, ekstraksiyon aşamalarından gelen hataları, sıcaklık farklarından kaynaklanan ekstraksiyon verim farklılıklarını ortadan kaldırmak için yapılmıştır. Miktarlandırma, standart ilaveler yöntemine göre veya kloramfenikol içermeyen kör matriks ile harici standart yöntemine göre de yapılabilir.
4 A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11)..1.1. Deney Bu çalışmada kullanılan LC MS/MS metotları, Zivak firmasının geliştirdiği, laboratuar içi metotlardır. 5. g kloramfenikol içermeyen yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı., ml R1, 8, ml (x4 ml) R eklenerek 5 dakika vorteksde karıştırıldı. 6 devir/dakika' de 5 dakika santrifüjlendi. Üst kısımdaki berrak çözeltiden 3 ml alınır (berrak değilse 3mL olacak şekilde filtrelenir) ve 15 ml' lik cam o tüpte N atmosferi altında, 45 C' de, 5psi' da kurutuldu (sarımtrak, viskoz yağsı kısım kalıncaya kadar). 1, ml (x6 μl) R3 eklenerek saniye vorteksde karıştırıldı. 1, ml (x6 μl) R4 eklenerek, vortekste kısa aralıklarla (5 sn), 15 saniye karıştırıldı. devir/dakika' de dk. santrifüjlendi. Alt fazdan enjektörle numune alındı,,45 μm selüloz filtreden süzülerek HPLC flakonuna alındı. LC-MS/MS 'e 5μL enjeksiyon yapıldı...1.. Kalibrasyon 5. g kloramfenikol içermeyen yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı..5, 1,, ppb kalibrasyon örnekleri hazırlamak için her bir tüpe sırasıyla 5,, 15, µl ST (ana stok 5 ppb),, ml R1 ve 8, ml (x4 ml) R eklenerek 5 dakika vorteksde karıştırıldı. devir/dakika' de 5 dakika santrifüjlendi. Üst kısımdaki berrak çözeltiden 3 ml alındı (berrak değilse 3mL olacak şekilde filtrelenir) o ve 15 ml' lik cam tüpte N atmosferi altında, 45 C' de, 5psi' da kurutuldu (sarımtrak, viskoz yağsı kısım kalıncaya kadar). 1, ml (x6 μl) R3 eklenerek saniye vorteksde karıştırıldı. 1, ml (x6 μl) R4 eklenerek, vortekste kısa aralıklarla (5 s), 15 saniye vorteksde karıştırıldı. devir/dakika' de dk. santrifüjlendi. Alt fazdan enjektörle numune alındı,,45 μm selüloz filtreden süzülerek HPLC viyaline alındı. LC-MS/MS 'e 5μL enjeksiyon yapıldı.... ın miktar tayini LC-MS/MS yöntemi ile yapılmaktadır. Miktarlandırma dış standart kalibrasyon yöntemine dayalıdır. Miktarlandırma, standart ilaveler yöntemine göre veya antikoksidiostat içermeyen kör matriks ile harici standart yöntemine göre de yapılabilir....1. Deney. g öğütülmüş yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı. µl R1 ve 5 ml R ilave edilir. 15 saniye vorteks karıştırıcıda karıştırıldı. 6 ml R3 ilave edildi. dk vorteks karıştırıcıda karıştırıldı.4 x g 'de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonunda, üstteki berrak çözeltiden enjektör ile alındı..45 µm filtreden süzülerek aktarıldı. LC-MS/MS sistemine 1 µl enjeksiyon yapıldı....kalibrasyon. g antikoksidiostat içermeyen yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı.,, 3, 4 ppb kalibrasyon örnekleri hazırlamak için her bir tüpe sırasıyla 5,, 15, µl standart (ana stok 4 ppb) eklenerek 1 s vorteks karıştırıcıda karıştırıldı. µl R1 ve 5 ml R ilave edildi. 15 saniye vorteks karıştırıcıda karıştırıldı. 6 ml R3 ilave edildi. dk vorteksde karıştırıldı. 4 x g 'de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonunda, üstteki berrak çözeltiden enjektör ile alındı..45 µm filtreden süzülerek
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 5 aktarıldı. LC-MS/MS sistemine 1 µl enjeksiyon yapıldı...3. 'in miktar tayini LC-MS/MS yöntemi ile yapılmaktadır. Miktarlandırma dış standart kalibrasyon yöntemine dayalıdır. Miktarlandırma, standart ilaveler yöntemine göre veya tetrasiklin içermeyen blank matriks ile harici standart yöntemine göre de yapılabilir...3.1. Deney Prosedürü 5. g öğütülmüş yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı. 1 ml R1 ilave edilir, dakika vorteks karıştırıcıda karıştırıldı.,5 ml R ilave edildi, dakika vorteks karıştırıcıda karıştırıldı. 4 devir/dakika de 5 dakika santrifüj edildi. Üst fazdan 3 ml alınarak 5 µl sarımtırak koyu kıvamlı sıvı kalana kadar uçuruldu. 6 ml R3 ilave edildi. 15 s kadar ultrasonik banyoda bekletildi. 1 dk vorteksde karıştırıldı. Örnek ml lik enjektör ile çekilerek alındı ve.45 m selüloz filtreden filtrelenerek aktarıldı. LC-MS/MS sistemine µl enjeksiyon yapıldı...3..kalibrasyon 5. g tetrasiklin içermeyen yem numunesi 5 ml'lik santrifüj tüpüne alındı. 5,, 15, ppb kalibrasyon örnekleri hazırlamak için her bir tüpe sırasıyla 5,, 15, µl standart (5 ppb) eklenerek 1 s vorteks karıştırıcıda karıştırıldı. 1 ml R1 ilave edildi, dakika vorteks karıştırıcıda karıştırıldı.,5 ml R ilave edildi, dakika vorteksde karıştırıldı. 4 devir/dakika de 5 dakika santrifüj edildi. Üst fazdan 3 ml alınarak 5 µl sarımtırak koyu kıvamlı sıvı kalana kadar uçuruldu. 6 µl R3 ilave edildi. 15 s kadar ultrasonik banyoda bekletildi. 1 dk vorteksde karıştırıldı. Örnek ml lik enjektör ile çekilerek alındı ve.45 m selüloz filtreden filtrelenerek aktarıldı. LC-MS/MS sistemine µl enjeksiyon yapıldı...4. LC-MS/MS Cihaz Parametreleri HPLC, MS/MS cihaz ve MS/MS tarama parametreleri Çizelge 1, Çizelge ve Çizelge3'de verilmiştir. Çizelge 1. Yemlerde LC-MS/MS ile antibiyotik ve antikoksidostat analizlerinde kullanılan HPLC parametreleri Antibiyotikler A.Koksidiostat Zaman (dk) 1 1.1 5 5.1 9 5.3 9.3 9.31 15 3.55 4 6.5 7 1 7 7 7 7 7 7 7 7 15 15 3 3 3 3 3 3 3 3 85 85 HPLC PARAMETRELERİ %A %B Akış Hızı Enjeksiyon Hacim Yıkama Solventi. ml/dk 5 μl.5 ml/dk.5 ml/dk 1 μl μl 8: metonol:su (h/h) 8: metonol:su (h/h) 8: metonol:su (h/h)
6 A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) Çizelge. Yemlerde LC-MS/MS ile antibiyotik ve antikoksidiostat analizlerinde kullanılan MS/MS Cihaz Parametreleri MS/MS CİHAZ PARAMETRELERİ Parametre Ionization mode API Nebulizing gas pressure Drying gas temperature Drying gas pressure Scan Time SIM Width Needle Shield Capillary Detector CID gas pressure Spray chamber temp Mass peak width in amu Quad 1 Quad 3 ESI -VE 5psi 4 C 35 psi.4sec amu -4V -4V -55V -16V mtorr 6 C ESI (+), ESI (-) 55 psi 5 C 3 psi.9 sec amu + 5V + 6V 3V + 16 V. mtorr 65 C 1,5 ESI + 5 psi 3 C 3 psi.3 sec amu + 5V + 6V 6V + 16 V.5 mtorr 6 C 1,5 Çizelge 3. Yemlerde LC-MS/MS ile antibiyotik ve antikoksidiostat analizlerinde kullanılan MS-MS tarama parametreleri Analit D5 Nicarbazin (-) (-) ve epimeri (TC) (DC) ve epimeri (OTC) ve epimeri (CTC)..5. Metod Validasyon Parametreleri MS-MS TARAMA PARAMETRELERİ Capillary MS MS/MS (m/z) (m/z) -55 31 151.6-55 36 61.6 3,7 136,6-3 V 589 34.6-3 V 693 675 3 V 773 431 3 V 787 431 3 V 89 69 3 V 939 3 V 444.4 444.4 46.4 478.9 877 6 6 6 6 445. 445. 461. 479. Parçalama Enerjisi 16 11 1 35 35 45 45 5 41. 48. 46. 444. İyon tarama süresi (s) Bu metodun validasyon yapılırken lineer ölçüm aralığı, tayin limiti /ölçüm limiti, kesinlik, geri kazanım, CCα, CCβ, spesifiklik/seçicilik, birleşik belirsizlik kriterleri incelenmiştir...5.1. Lineer Ölçüm Aralığı Lineer ölçüm aralığını test etmek için 4 farklı konsantrasyonda 6'şar tekrarlı standart hazırlanarak enjeksiyon yapıldı. Elde edilen ve ölçüm aralığının belirlenmesinde kullanılan sonuçlar Çizelge 4'de verilmiştir..1.1,15,15,1,1,1,1,1-15 -15-15 -
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 7 Çizelge 4. Antibiyotik ve antikoksidiostat gruplarına ait lineer ölçüm aralıkları ve R değerleri LİNEER ÖLÇÜM ARALIĞI DEĞERLERİ Lineer Ölçüm Aralığı (µg/l) (R ) Nicarbazin,5 5 5 5 5 1 Lineer Ölçüm Aralığı (µg/l) 15 15 15 15 Lineer Ölçüm Aralığı (µg/l) 1,5 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4,9968 (R ),995,9944,998,9986 (R ),9986,9986,9967,9984,998,9995,995..5..Tayin Limiti /Ölçüm limiti Lineer ölçüm aralığında oluşturulan kalibrasyon grafiğinden yararlanılarak aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır. LOD ve LOQ değerleri Çizelge 5'te yer almaktadır. Tayin Limiti = 3,3*SD/m Ölçüm Limiti = 1*SD/m SD = Kalibrasyon eğrisinin en düşük seviyesindeki standart hata m= Kalibrasyon eğrisinin eğimi Çizelge 5. Antibiyotiklere ve antikoksidiostatlara ait tayin limiti ve ölçüm limiti değerler Nicarbazin TAYİN/ ÖLÇÜM LİMİTİ DEĞERLERİ LOD (µg/kg),46 4,77 8,84 1,147 9,4 1.34 15.51 18.56 14.77 6.36 11.48 34.84 LOQ (µg/kg),138 14,454 6,68 3,748 7,393 37.4 47.1 56.4 44.76 79.89 34.79 15.58
8 A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11)..5.3.Kesinlik..5.3.1.Tekrarlanabilirlik Tekrarlanabilirlik çalışması üç farklı seviyede spike edilmiş örnekle, her seviye için 6 tekrar yapılarak gerçekleştirilmiştir. Tekrarlanabilirlik sonuçları Çizelge 6'da verilmiştir. Çizelge 6. Tekrar edilebilirlik çalışmasında elde edilen overall mean, overall SD ve overall CV değerleri TEKRARLANABİLİRLİK DEĞERLERİ Konsantrasyon µg/kg 1 1,5 1 1,5 Overall Mean Overall SD,98 1,49,1,8,1,19 Konsantrasyon µg/kg 15 15 Overall Mean Overall SD 95.94 99. 96.41 99.11 145.48 149.3 147.69 145.44 198.4 199.16 1.98 6.89 7.9 8. 6.7 6.5 1.48 1.1 1.83 14.65 1.69 1.68 13.8 16.19 Konsantrasyon µg/kg 3 4 3 4 Overall Mean Overall SD Nicarbazin 8.49 15.88 186.83 197.7 6.15 186.84 5.8 31.95 31.43 31.18 318.9 95.35 36.16 317.73 394.18 47.61 4.65 396.56 393.94 396.15 385. 19.14 18.58 19.16 1.69 18.11 1. 9.4.8 5.14 19.51 6.19 35.9.45 36.85 5.98 3.3 3.63 5.9 5.63 31.45 7.75 1 1,5 Overall CV 8 7 15 9,4 Overall CV 7.6 8.6 8.3 8. 6.3 8.7 6.1 1.1 3 Overall CV 9. 6.4 8.6 8. 1.3 6.5 11. 8. 8.8 11.9 11.4 7.3 13.1 11.6 6.4 6.4 6.5 7.8 4 6.6 7.9 8.1 6.5 6.5 7.9 7...5.3..Tekrar üretilebilirlik Tekrar üretilebilirlik çalışması 1 ppb (µg/kg) seviyesinde spike edilmiş örnekle 5 paralel olacak şekilde, ayrı kişi tarafından 4 ayrı günde gerçekleştirilen 5 farklı çalışmadan oluşturulmuştur. Tekrar üretilebilirlik sonuçları Çizelge 7'de verilmiştir. Çizelge 7.Tekrar üretilebilirlik çalışmasında elde edilen overall mean, overall SD ve overall CV değerleri Konsantrasyon 1 µg/kg Konsantrasyon µg/kg Konsantrasyon µg/kg Nicarbazin TEKRAR ÜRETİLEBİLİRLİK DEĞERLERİ Overall Mean 1,3 Overall SD Overall CV,5 4,6 Overall Mean Overall SD Overall CV 16.45 16.68 16.98 11.17 3.5 6.89 4.99 7.3.9 6.5 4.7 6.6 Overall Mean Overall SD Overall CV 1.36 13.9.97 14.35 18.41 196.43.9 14.6.6 14.94.5 1.36 16.8.85 6.7 1.3 7.4 9.4 5.7 8. 1.3
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 9..5.4.Geri kazanım Geri kazanım çalışması üç farklı seviyede spike edilmiş örnekle, her seviye için 6 tekrar yapılarak 3 farklı günde gerçekleştirilmiştir. Geri kazanım sonuçları Çizelge 8'de verilmiştir. Geri kazanım her seviye için hazırlanan matriks standart kalibrasyon eğrisine göre hesaplanmıştır. Çizelge 8. Geri kazanım çalışmasında 3 farklı konsantrasyon da elde edilen % geri kazanım değerleri Konsantrasyon µg/kg Konsantrasyon µg/kg Konsantrasyon µg/kg Nicarbazin GERİ KAZANIM DEĞERLERİ 1 1,5 (% Geri Kazanım) 87.4 9.5 15 (% Geri Kazanım) 86. 84. 9. 85.8 79. 78.8 85.1 83.8 66. 96. 78.3 86.7 67.9 83.8 84. 3 (% Geri Kazanım) 71.4 9.8 8.9 87.8 67.9 85.3 77.1 95.4 8.6 84.7 91.9 87.7 4 7.8 86.8 8.7 8.5 77.3 8.1 8.4..5.5.CCα, CCβ Bu amaçla en düşük konsantrasyon seviyesinde farklı günlerde spike yapılmış 5 ayrı çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonuçlar Çizelge 9'da verilmiştir. Çizelge 9. Antibiyotiklere ve antikoksidiostatlara ait CCα ve CCβ değerleri Nicarbazin CCα ve CCβ DEĞERLERİ CCα µg/kg 1.11 CCα µg/kg 15. 111.31 18.19 111.86 CCα µg/kg 3.6 36.17 8.78 34.96 6.9 9.3 34.19 CCβ µg/kg 1.19 CCβ µg/kg 11. 1.61 116.38 13.73 CCβ µg/kg 46.1 7.35 57.56 69.9 53.84 58.63 68.38
1 A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11)..5.6. Spesifiklik/Seçicilik Spesifiklik için antibiyotik içermediği bilinen farklı yem örnekleri analiz edilerek piklerin çıkış zamanlarında herhangi bir sapma ve etkileşim olup olmadığına bakıldı. Sonuçta herhangi bir etkileşim gözlenmedi. Bu numuneler validasyon çalışmalarında kullanıldı ve tamamına yükleme yapılarak, ve bileşiklerinin tanımlandığı görüldü...5.7. Birleşik Belirsizlik Çizelge 1. Belirsizlik bileşenleri ile hesaplanan birleşik belirsizlik tablosu BİREŞİK BELİRSİZLİK Etken madde Standart hazırlama belirsizliği Numune hazırlama belirsizliği Kalibrasyon eğrisi belirsizliği Tekrarlanabilirlik belirsizliği Geri kazanım belirsizliği Birleşik Rölatif belirsizliği MRPL Birleşik Belirsizlik Genişletilmiş bel. (k=) Nikarbazin.6.14..99..11...14.14.14.141.7.19.19.19.19....8.8.8.8.59.39.59.41.3.39.74.45.39.11.44.78.5.9.7.53.75.8.11.4.8.11.14.6.7.31.5.69.33.64.71.59.68.58.75.15.99.11.118.37.94.1.143.14.1.17.9.19.3.37 19.87.98 3.637 18.8 4.383 8.633.798 1.45 1.7 8.959 1.88.75 39.654 4.596 47.73 37.599 48.766 57.65 496.489 5.4 17.917 5.76 3. BULGULAR Güney Marmara Bölgesinde satışa sunulmuş hayvansal yemlerde (sığır besi yemi, piliç besi yemi, sığır süt yemi) tetrasiklin, kloramfenikol ve antikoksidiostat, standartları (Şekil 1) kullanılarak kalibrasyon grafikleri elde edilmiş ve toplamda 17 adet numunede 1 parametreye bakılarak 398 analiz Şekil 1: ların LC-MS/MS'de kromotogram görüntüsü.
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 11 gerçekleştirilmiştir (Şekil ). 17 adet numunenin 5 adedin de pozitif sonuç elde edilmiştir (Şekil 3). Pozitif sonuçlar antikoksidiostat grubuna ait monensin, lasolosit A ve salinomisin alt gruplarında gözlenmiştir (Şekil 4), (Şekil 5). Şekil : Analizi yapılan örneklerin gruplara göre parametre sayısının dağılımı Şekil 3: Analizi yapılan örneklerin gruplara göre sonuçlarının dağılımı
1 A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) Şekil 4: Analizi yapılan örneklerin gruplara göre pozitif sonuçlarının dağılımı. Şekil 5. Pozitif çıkan antikoksidiosdatının kromotogram görüntüsü. 4. SONUÇ Numunelerin % 4,67'sinde antikoksidiostat etken maddelerinin kullanıldığı, % 95,33'ünde ise kloramfenikol, tetrasiklin ve diğer antikoksidiostat etken maddelerine rastlanmadığı gözlenmiştir. Analizi yapılan parametre bazında incelendiğinde %1,58'nde etken maddeye rastlanmıştır. Bu sonuçlar ışığında
A. Özcan ve ark. / Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi / Journal of Food and Feed Science - Technology 11:1-13 (11) 13 bakılırsa Güney Marmara Bölgesinde satışa sunulmuş olan hayvansal yemlerde kloramfenikol ve tetrasiklin antibiyotiği açısından bir risk olmadığı, antikoksidiostat açısından ise % 4,67 gibi bir düzeyde riskin olduğu gözlenmiştir. Bu durum; daha çok kanatlı yetiştiriciliğinde kullanılan yemlerde rastlanması açısından bakıldığından büyük baş yetiştiriciliği için kullanılan yemlerde risk olmadığı, kanatlı yetiştiriciliği için kullanılan yemlerde ise risk oluşturduğu görülmüştür. Kanatlı yemindeki bu riskin nedeni, ya yem üretiminde kullanılan yem katkı maddeleri ya da direkt olarak bu etken maddeleri yeme katılması ile olmuş olabilir. Yem ham maddelerinin kontaminasyon riskleri de unutulmamalıdır.bu açıdan bakıldığında yem rasyonları hazırlanırken çok dikkat edilmeli, menşeyi bilinmeyen hem ham madde hem de katkı maddeleri kullanılmamalıdır. Kontaminasyon ve hammaddeden kaynaklanan üretici maduriyetlerinin önüne geçmek için üretici firmaların kendi içlerinde kalite kontrol mekanizmaları geliştirmeleri gerekmektedir. Bir işletme için ideal olan uygulama ham madde ve katkı maddelerinin rasyonda kullanılmadan önce analizlerinin yapılması ve ondan sonra üretime geçilmesidir. 5. KAYNAKLAR Aynagöz, Z. 1993. Hormon ve benzeri maddelerin Hayvan Beslemede kullanılması, Doktora Semineri. Ankara Üniversitesi Sağlık BilimLeri Enstitüsü, Ankara. Swick, R.A., 5. Ingredient supply and global demand beyond 1. Feed Tech, 9(7) s. 8-31. Anon,. Yem Katkıları ve Premikslerin Üretimi, İthalatı, İhracatı, Satısı ve Kullanımı Hakkında Teblig. Tarım ve Köyisleri Bakanlığından. 18 Aralık. Sayı: 4967. Teblig No: /66 Resmi Gazete. Anon, 5. Karma YemLere Katılması ve Hayvanlara Yedirilmesi Yasak Olan Maddeler Hakkında Teblig. Tarım ve Köyisleri Bakanlıgından. 16 Haziran 5. Sayı:5847 Teblig No:5/4. Resmi Gazete. Anon, 6. Yem Katkıları ve Premikslerin Üretimi, ithalatı, ihracatı, Satısı ve Kullanımı Hakkında Tebligde Degisiklik Yapılmasına Dair Teblig. Tarım ve Köyisleri Bakanlıgından. 1 Ocak 6. Sayı: 656 Teblig No: 6/1 Resmi Gazete. Jensen, B.B., 1998. The impact of feed additives on the microbial ecology of the gut in young pigs. Journal Animal Feed Science 7, s.45 64. Çoskun, B., Seker, E., İnal, F., 1998. YemLer ve Teknolojisi. Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayın Ünitesi, Konya. Küçükersan, K., 1999. Yem katkı maddeleri. Ders Notları, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi. Paganini, F., 5. Controlling coccidiosis in drug-free production. Facing the challenge of Drug free production. World Poultry, 1(1). Advertorial. Ziggers, D.,. Growth promoting antibiotics finished in the EU. Feed Tech, 6(3) s.8-9.). Anon, 3. EU prohibits antibiotics as growth promoters. Feed Tech, 7(7) s. 6.