Viroloji, Epidemiyoloji ve Mikrobiyolojik Tanı Yrd. Doç.Dr. Koray Ergünay Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD. Viroloji Ünitesi
Yapı ve Sınıflandırma Zarflı RNA virusu 40-60 nm çaplı, sferik virion (+) polariteli tek iplikli RNA, ~11-12 kb Flaviviridae ailesi, Flavivirus genusu: 68 virus, 8 antijenik kompleks Japon ensefaliti serokompleksi Japon ensefaliti virusu St. Louis ensefaliti virusu Batı Nil - Kunjin virusu Murray Vadisi ensefaliti virusu Usutu virus ICTVdB (2006). 00.026.0.01.051. West Nile virus. In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4.
Genom ve Proteinler NC ns4a ns2a 5'- C prm E NS5 NS3 NS1 ns2b NC -3' ns4b pr + M 3 yapısal protein 7 yapısal olmayan protein NS1: Viral replikaz kofaktörü C proteini: kapsid yapısı, sitotoksik etki, grup spesifik antikorlar NS2a: Biraraya gelme, interferon yanıtının modifikasyonu NS2b: Viral proteaz kofaktörü prm / M proteini: virion yapısı, biraraya gelme, olgunlaşma E proteini: zarf glikoproteini, hücreye tutunma, serotip spesifik antikorlar, hemaglutinin, immün yanıt NS3: Proteaz, NTPaz, Helikaz aktivitesi NS4a ve NS4b: İnterferon yanıtının modifikasyonu NS5: Viral replikaz (RNA bapımlı RNA polimeraz)
Virion Yapısı Nükleokapsid Zarf Japon ensefaliti serokompleksi ve diğer Flaviviruslarla antijenik benzerlik ve çapraz reaksiyonlar!!!
Replikasyon Hücre reseptörlerine tutunma DC-SIGNR, DC-SIGN, integrin αvβ3,??? Reseptör bağımlı endositozla hücreye giriş Klatrin kaplı çukurcuklar ph bağımlı füzyon ve nükleokapsidin salınımı Endoplazmik retikulum ilişkili replikasyon Golgi ağında olgunlaşma Egzositozla salınım
Genetik Çeşitlilik Botha EM et al. Emerg Infect Dis 2008; 14:222-230.
Virulans faktörleri Özellik Virulans Faktörü Patogeneze Etki Birçok türde enfeksiyon oluşturma ve geniş hücre tropizmi Birçok farklı ya da benzer hücre reseptörü Farklı türlerde ve değişik dokularda belirtiler Hızlı hücre ölümü NS3, kapsid Nöropatogeneze etki Genetik varyasyon kapasitesi In vivo replikasyonda değişiklikler Türümsü (quasispecies) oluşumu RNA bağımlı RNA polimeraz Antijenik varyasyon, nötralizasyondan kaçış İnterferon yanıtının modifikasyonu NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b In vivo interferon yanıtında azalma Artmış replikasyon ya da virulans E proteininde glikolizasyon NS1 proteininde glikolizasyon Samuel MA et al. J Virol 2006; 80:9349-9360.
Patogenez İnokülasyon bölgesinde primer replikasyon Periferik lenf nodları - Kan dolaşımı MSS ye geçiş Toll-like reseptörlerin uyarımı Artmış TNF-α düzeyi Nöronların infeksiyonu Direkt / immün yanıta bağlı hasar İmmün yanıtla temizlenme Persistans / mortalite Samuel MA et al. J Virol 2006; 80:9349-9360.
Epidemiyoloji (Vektörler) Farklı özelliklere sahip ~60 sivrisinek türünde replikasyon 10 dan azı vektör olarak önemli!!! En önemli tür: Culex spp. (Aedes, Ochleratus...) C.pipiens C.quinquefasciatus C. tarsalis
? Keneler Kuşlar Primer Döngü? Diğer memeliler Vektörler Sürüngenler Rodentler İnsanlar Atlar
Sivrisinekler (vektör) Kuşlar (rezervuar) Epidemiyoloji (Konaklar) Belirtisiz enfeksiyon, yüksek düzey viremi Beslenme davranışları / habitat özellikleri epidemiyolojide etkili Vertikal geçiş!!! Passeriformes (ötücü kuşlar) Strigiformes (baykuşgiller) Falconiformes... Genellikle belirtisiz enfeksiyon (!) Yüksek düzey viremi Virusun yayılmasında etkili Oral, fekal-oral yolla bulaşma!!! Atlar, insanlar (Diğer memeliler) Belirli oranda semptomatik enfeksiyon Düşük düzey viremi Virusun yayılmasında etkili değil!!! Bazı rodentler ve sürüngenler Keneler Epidemiyolojik önemleri belirsiz
En önemli yol: Bulaşma Enfekte sivrisinek sokması Kan transfüzyonu Organ transplantasyonu İntrauterin geçiş Anne sütü ile geçiş Laboratuvar maruziyeti
Tarihçe 1937- BNV nin izolasyonu (Batı Nil bölgesi, Uganda) (Smithburn ve ark.) 1951 - İsrail ve Mısır da insan ve sivrisineklerde BNV 1953 - Mısır da kanatlılarda BNV 1957 - İlk BNV ensefaliti olgusu İsrail 1958 - Güney Afrika da insan ve kuşlarda BNV 1962 - Fransa salgını: insan, at ve sivrisineklerde BNV 1974 - Güney Afrika salgını: 1000 i aşkın olgu 1980 - Hindistan da mortalite izlenen 3 olgu 1996 - Romanya salgını: ~ 400 meningoensefalit olgusu 1998 - İtalya da atlarda izolasyonu 1999 - NYC salgını, Volvograd salgını 2000 ve sonrası - Birleşik Devletler, Kanada, Meksika da olgular... 2010 - Yunanistan ve Türkiye de olgular
Global Epidemiyoloji (1937-1998)
Global Epidemiyoloji (1999 2004)
Epidemiyoloji (Orta ve Güney Amerika) 2002 2001 2003 2004 2004 2007
Epidemiyoloji (Kanada)
Epidemiyoloji (Birleşik Devletler)
Epidemiyoloji (Akdeniz)? İnsan Atlar Kanatlılar Zeller HG et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004; 23:147-156.
Epidemiyoloji (Akdeniz) Calistri P et al. Open Virol J 2010; 4:29-37.
Epidemiyoloji (Akdeniz)
Epidemiyoloji (Akdeniz)? Calistri P et al. Open Virol J 2010; 4:29-37.
Çalışmalar (Türkiye)
Bölge İl Ankara İç Anadolu Epidemiyoloji (Türkiye) Çalışma grubu Yöntem Kaynak Koyunlar Hİ, NT Radda, 1971 Kan donörleri Hİ, NT Özkul ve ark., 2005 MSS olgusu rrt-pcr Arpacı ve ark., 2009 MSS olguları ELISA, IIFT, rrt-pcr Ergünay ve ark., 2010 Kan donörleri ELISA, IIFT, NT Ergünay ve ark., 2009 Koyunlar Hİ, NT Radda, 1971 Hİ, NT Özkul ve ark., 2005 rrt-pcr Özkul ve ark., 2010 Hİ Ari, 1971 Hİ, NT Serter, 1980 Hİ, NT Özkul ve ark., 2005 Hİ Meço, 1977 IIFT, NT Ergünay ve ark., 2007 Büyükbaş hayvanlar Hİ, NT Özkul ve ark., 2005 Bölge sakinleri Hİ Meço, 1977 Konya Yozgat Sivas Hatay Akdeniz Katırlar Adana Atlar Antalya Bölge sakinleri Mersin Kan donörleri? Bölge sakinleri Ege Koyunlar İzmir Muğla Köpekler Köpekler Bölge sakinleri Şanlıurfa Güneydoğu Anadolu Mardin Diyarbakır Elazığ Siirt
Epidemiyoloji (Türkiye) : İnsanlarda doğrulanmış seroreaktivite : Hayvanlarda doğrulanmış seroreaktivite : Muhtemel/doğrulanmış olgular
Olgular (Türkiye)
Mikrobiyolojik Tanı Virusun izolasyonu Viral RNA nın saptanması Viral antijenlerin saptanması Virusa karşı özgül immün yanıtın saptanması
Mikrobiyolojik Tanı IgM / IgA IgG Viremi Viral RNA -5-4 -3-2 -1 0 1 2 Klinik belirtiler 3 4 5 6 7 8 9 10
BNV Tanısı: Virus İzolasyonu Altın standart yöntem, düşük duyarlılık Klinik tanıda kısıtlı kullanım: Düşük düzey ve geçici viremi Çeşitli yöntemler: Vero, C6/36 hücreleri, Deney hayvanları
BNV Tanısı: Viral RNA nın Saptanması Çeşitli hedefler: env, NS1, NS5, 3 -NCR... Çeşitli yöntemler: RT-PCR, RT-nested PCR Real-time RT-PCR (Taqman, FRET) NASBA, TMA, bdna Kalitatif, kantitatif sonuç Erime eğrisi analizi Çeşitli ticari testler: Roche, Abbott, Gen Probe, Chiron, Focus... Duyarlılık ve özgüllükte varyasyon Genellikle yüksek duyarlık!!! (0.1 pfu/ml, 5-50 kopya/ml) Farklı genotipler / mutant virus varlığında duyarlılık değişebilir!!! Tanıda ilk 5-7 günde etkili, tarama amaçlı kullanım
BNV Tanısı: Viral Antijenlerin Saptanması Çeşitli yöntemler: - in house (İSH, İHK) - Ticari (VecTest, RAMP) Duyarlılık ve özgüllükleri değişken Klinik tanıda kısıtlı kullanım Ticari yöntemler: Sivrisinek ya da kuşlarda tarama
BNV Tanısı: Özgül Antikorların Saptanması Klinik tanıda yaygın kullanım (IgM / IgG) Çeşitli yöntemler: IgM yakalama ELISA (MAC-ELISA) İndirekt ELISA İndirekt Fluoresan Antikor Testi (IIFT) Mikrokürecik-immünokromatografi Hemagglutinasyon önlenim Kompleman birleşmesi Plak redüksiyon nötralizasyon testi Çeşitli antijen kaynağı ve test platformları BNV serolojik tanısında sorunlar!!!
BNV Tanısı: Serolojik Tanıda Sorunlar 1. Çapraz reaksiyonlar Antikor pozitifliğinin doğrulanması için çapraz reaksiyonların ekarte edilmesi gereklidir!!! DOĞRULAMA: Nötralizasyon / Plak redüksiyon nötralizasyon testi (PRNT) Virus kontrol Negatif örnek Pozitif örnek
BNV Tanısı: Serolojik Tanıda Sorunlar 2. IgM / IgA Persistansı - Serumda 1 yılı aşkın süre (maksimum 525 gün) (IgM) - BOS ta 199 gün (IgM) DOĞRULAMA: - PRNT titresi artışı - IgG aviditesi Değerlendirmede hikaye, klinik ve bölgesel epidemiyoji mutlaka dikkate alınmalıdır!!! Pusch MP et al. J Infect Dis 2008; 198:984-93.
Klinik Bulgular: Tanı Kriterleri (Avrupa Birliği) Ateşli hastalık VEYA Ensefalit /Menenjit Epidemiyolojik Kriterler: - Atlar ya da kuşlarda WNV endemik bölgelerde yaşama, seyahat etme ya da sivrisinek sokması hikayesi - İnsandan insana geçişe ait kanıt (vertikal, kan/doku nakli) Laboratuvar Bulguları: DOĞRULANMIŞ: - Kandan ya da BOS tan virus izolasyonu - Kanda ya da BOS ta viral RNA - BOS ta özgül IgM - Serumda IgM VE IgG VE PRNT ile doğrulama / titre artışı MUHTEMEL: - Serumda özgül IgM
MUHTEMEL OLGU: Tanı Kriterleri (Avrupa Birliği) Uyumlu Klinik + Epidemiyolojik bağlantı VEYA Muhtemel olgu için laboratuvar sonuçları DOĞRULANMIŞ OLGU: Doğrulanmış olgu için laboratuvar sonuçları
BNV Tanısı: RNA persistansı??? PLoS ONE 5(5): e10649. doi:10.1371/journal.pone.0010649 J Infect Dis 2009; 201:2-4.