Immunoafinite Kromatografisi ile Okratoksin A/B içeren Gıda ve Yem Örneklerinin Hammadde Özütlerinin Temizlenmesi ve HPLC-FLD ile Tespiti Prensip: Gıda ve yemde Okratoksin belirleme talimatı immünoafinite kolon (IAC) ve HPLC ile miktar özüt zenginleştirme adımına odaklanır. Kabul edilen laboratuar ekstraksiyon yöntemleri korunabilir. Organik çözücü toleransı, analitin elüsyon süreci ve kolon çalışma aralığının belirgin kriterleri izlenirse IAC kolonunun tüm performansı verilir. Gıda ve yemlerde Okratoksin tespitinin çoğu ön işlem yöntemleri sorunlu matrisler uygulanması halinde müdahale edici maddelerden dolayı düşük duyarlılık gösterir. Okratoksinlerin içerik belirleme yöntemi onun elüatı konsantre etme potansiyeli ve HPLC kolonuyla saflaştırmanın ek adımı ile immünoafinite kolonunun (IAC) yüksek seçiciliğini (IAC) birleştirir. Lütfen bu talimatın IAC kolon ile kullanılmaya odaklı olduğuna dikkat edin Hammadde ekstraksiyon adımı için bir literatür yöntemi verilir. Verilen cihaz (örneğin HPLC sistemi) diğer olasılıklar arasında örnek olarak hizmet verebilir. Ekstraksiyon (Verilen literatür metodu): 100ml metanol/su (80/20 v/v).toplamından 25g örnek elde edildiğini varsayın. Organik çözücü oranı değişirse, PBS ile özütü seyreltilmesi zenginleştirme aşamasında uygun şekilde ayarlanmalıdır. Öte yandan, örnek miktarının oranı ve ekstraksiyon çözücüsünün hacmi değişirse, gram eşdeğer hesaplanması düzeltilmelidir. Tahıllar Olsson et al. 1 literatür yöntemiyle hazırlanabilir. Sorunsal matriks örneği olarak süt için Zimmerli et al. 2 yöntemi uygulanabilir. Zenginleştirme Adımı IAC: 4ml özüt (yukarıya bakın, 1g okratoksin örnek miktarı içerir) 16ml 50mM PBS (ph=7.4) ile seyreltilir ve sonra B-Tez IAC Okratoksin 3ml kolonun üst kısmında bir haznede uygulanır. Kolonun tam performansını korumak için, lütfen kolonun üst kısmında çözelti içindeki seyreltme tamponu oranının küçük olmamasına dikkat edin. 16% metanol oranı, bu örnek zenginleşmesinde sonuçlanan, kolon performansını etkilemez. Dikkat! PBS seyreltilmiş özütün organik çözücüsünün oranı, kolonda uygulanan, %20 metanol ve %10 asetonitrili geçmemelidir. Organik çözücü oranı bu sınırların üzerinde yer alıyorsa, kurtarma oranları azalır. Ek PBS ile özütü seyrelterek seyreltilmiş özüt hacminin artışı,diğer taraftan, hemen hemen hiç kolon performansı sonuçları yoktur. Örnekler aynı anda hazırlanabilir ise, çeşitli 12 J.T. Baker örnekleri değeri kanıtlamıştır. Afinite jel içinden akış oranı 1-3 ml/dk 'dır. Sorunlu matris durumunda akış oranı altında 2ml/dk altında olmalıdır. Dikkat! ne jel ne de jel ve kolonun döner vidalı çıkışı arasında hiçbir büyük hava kabarcığının olmadığının farkında olun, sürekli akışı ya da gerekli madde değişimini engeller. Uygulama ve beklenen içeriklere bağlı olarak, daha büyük ya da daha küçük özüt alikotları uygulanabilir. Bu gibi durumlarda örnek hesaplama (aşağıya bakınız) adapte edilmelidir. Yıkama: Tam örnek jelden geçtikten sonra 10mM PBS/Metanolun 5ml (90/10 v/v) ile yıkanır. Jelde kalan sıvılar kolonun üstünden veya alttan alçak basınç uygulanarak kaldırılır. Elüsyon: 1/5
B-Tez IAC Okratoksin 3 ml kolonun üstünde örnek haznesi kaldırılır ve uygun bir şişe afinite kolonu altına yerleştirilir. Bağlı toksinler elüsyon çözücüsü olarak toplam 1.5ml metanol/asetik asit(98/2 v/v) kullanılarak elüe edilir. Elüsyon süreci analitlerin tam olarak yayılmasını sağlamak için iki adımda gerçekleştirilir. İlk olarak, 0.5 ml elüsyon çözücüsünden bir hacim uygulanır. Hacim kolondan geçtikten sonra yarım dakika bekletilir elüsyon çözücüsünün 1ml ikinci kısmı kolondan elue edilmeden önce. Kalan çözücü çözeltileri hafif bir uygulama ya da aşırı basınç ile elüe edilmelidir -.Tüm metanolik- asetik asit parçaları kolon eluat vermek için bütünleşmiştir. Kolon elüat doğrudan veya konsantrasyonlar düşük olduğunda, HPLC içine enjekte edilebilir,bu buharlaşma ile konsantre edilebilir ör. sürekli azot akımı altında 50 C de VLM buharlaştırıcı. Kuruluğu tamamlamak için elüt buharlaştırılsa bile analit kaybı tehlikesi yoktur. Kalan, sonra HPLC çözücüsü içinde tekrar çözünür ve bir alikot son olarak sisteme enjekte edilir. Dikkat!: Eğer kolonun elüsyon çözücüsü olarak önerilen metanol-asetik asit (98/2 v/v) karışımı yerine 100% metanol kullanılırsa, jelin mycotoxin tamamlanmamış yayılımından dolayı Okratoksin A geri kazanımında % 20 ye kadar kaybı tavsiye edilen elüsyon ile karşılaştırıldığında ortaya çıkabilmektedir. IAC Kolon Özellikleri: A) Çalışma Aralığı ve B-TeZ IAC Okratoksin 3ml Kolon Kurtarma Oranları: Kolonun çalışma aralığı: Kolonun Sıfır Kontaminasyonu: Çalışma aralığında Garantili Kurtarma Oranları: (*) IAC başına 0.04 200ng Okratoksin <0.04ng (det. lim. of metod) >85% ± 5% 2/5
Kurtarma oranları % 20 metanol veya% 10 asetonitril altında seyreltilmiş özütün çözücü içeriğine sınırlıdır (Zenginleştirme Adımı altında ayrıntılara bakınız). B) B-TeZ IAC Okratoksin 3ml Kolon Çapraz Reaktiviteler (**) : Okratoksin A (OTA): 100% Okratoksin B (OTB): 103% Eğer 1.5µg Okratoksin toplamı ( 1:1 molar oranıyla) kolon başına analiz edilirse OTA ve OTB geri kazanım oranı OTA geri kazanım oranıyla bölünür. Bu miktarın kolonun bağlanma yerlerinin sınırlandığı yerde kolonun kapasite sınırının yarısı etrafında olduğunun farkında olun. Böylece, kolonun çalışma aralığında analiz için, OTA VE OTB karşı çapraz reaktiviteler pratikte büyüklükte aynıdır. C) B-TeZ IAC Okratoksin 3ml Kolonun Kapasitesi (***) : (***) Maksimum Kolon Kapasitesi: 3µg Okratoksin Aşırı okratoksin, ör. 4µg, 2 ml PBS küçük bir hacmi 5 dakika için IAC ile inkübe edilir; daha sonra IAC 2ml, PBS ile yıkandı ve bağlı olmayan bölümü analiz edilir. Eklenen analitin farklılığı ve bağlı olmayan analit maksimum kolon kapasitesine eşittir. D) B-TeZ IAC Okratoksin 3ml Kolon Raf Ömrü: Raf ömrü: 2-8 C de 2 yıl oda sıcaklığında (20-25 C) 1 yıl AnalitikMetod: HPLC: Shimadzu; Kolon: Trentec Reprosil-Pur RP C18 120 ODS3 5µm; 125x3,0mm koruma kolonu ile; Mobil Faz A: asetonitril / deiyonize su (70/30 v/v); Mobil Faz B: 0.03 M sodyum asetat (ph=4,0) / asetonitril (65/35 v/v); Meyil: 0.01 dk B 100 %; 10 dk B 100 %; 11 dk B 0 %; 13 dk B 0 %; 15 dk B 100 %; Akış Oranı: 0.5ml/dk; Analiz Süresi: 25dk; Enjektör Hacmi: 100µl; Floresan-Tespit: λ EX [nm]: 333nm; λ EM [nm]: 460nm. Sıcaklık: Makine ve çözücüler oda sıcaklığındadır. Çözücülerin helyum gazı ile gazı giderilir. HPLC Metod Özellikleri: Ölçüm aralığı verilen HPLC yönteminde enjeksiyon başına (R 2 =0.999) 10pg den 1000pg Okratoksin A ya (OTA) doğrusaldır. Tespitin aşağı sınırı (LOD) enjeksiyon başına 10pg OTA dır (sese sinyal (S/N) oran = 3). Hammadde kontaminasyon dengesi ve HPLC ölçüm aralığı: Eğer belirtilen seyreltme adımları (zenginleştirme adımı, elüat konsantrasyon adımı) izlenirse, 0.04 ten 4ng/g a hammaddedeki OTA içerikleri HPLC yönteminin çalışma aralığı içinde yatar. Eğer içerikler yüksekse, 4 ten 200ng/g a, IAC kolon elüatı HPLC seyreltici ile uygun şekilde seyreltilmelidir veya alternatif olarak, enjektör hacmi ayarlanmalıdır. Sadece hammadde içerikleri 200ng/g OTA IAC kolonun çalışma aralığı üstündeyse, bu talimatın kolon başına 1g eşdeğeri indirilmelidir. Böylece, IAC zenginleştirme adımı ve sonraki HPLC analizi daha küçük özüt hacimleriyle tekrarlanmalıdır, ör. 4ml özüt yerine 2ml özüt hacmi, veya daha az uygulandığında, 10ml PBS ile seyreltilir ve IAC kolonuna uygulanır. OTA içeriğinin Örnek Hesaplaması : (OTB içeriğinin hesaplaması benzerdir) A) HPLC enjeksiyon başına Örnek Gramm Eşdeğerlerinin Hesaplanması: 25g Örnek 4ml Özüt 0.1ml 0.25g -------------------- x --------------------- x enjektör = Örnek 100ml Ekstraksiyon 0.4ml hacmi Eşdeğerleri Çözücü 3/5
B) ng/g da incelenen hammaddenin OTA kontaminasyonunun hesaplanması: # ng enjekte edilen OTA ----------------------------------------- = ng/g OTA ör. yer fıstığı yemeğinde Örnek Eşdeğerleri [g] Tampon, Kimyasallar Cihaz ve Literatür: Fosfat Tamponlu Tuzlu ph 7.4 (= 50mM PBS) 1.24g KH 2 PO 4 7.27g K 2 HPO 4 8.76g NaCl Kimyasallar: asetonitril, HPLC grade metanol, HPLC grade asetik asit, 100% ultrapure deiyonize su dipotasyum hidrojenfosfat, >98% potasyum dihidrojenfosfat, >98% sodyum klorür 1L deiyonize su içinde çözün. Gerekirse 1N NaOH veya 1N HCI ile ph 7.4 (± 0.3)'e ayarlayın Consumerables: B-TeZ IAC Okratoksin 3ml [BTOT312005] Consumerables: Elüsyon Çözücü: metanol/asetikasit (98/2 v/v) 2ml asetik asiti 98ml metanole pipetleyin ve karıştırın Buharlaşma: nitrojen gazı 5.0 [Hava Likit M55763810] (IAC-elüatın buharlaşması için) Cihaz: HPLC; Shimadzu; pump: LC-6A (2 parça); otomatik örnekleyici: SIL 6B; floresan dedektör:rf- 10AXL; veri işleme: CLASS LC10 Buharlaştırıcı (tripod ile) [VLM EVA EC1-S] Vakum SPE Manifold (BAKER spe-24g Kolon İşlemci 24 örneğe kadar işleme ) [J.T. Baker 7208] BioTeZ Berlin-Buch GmbH www.biotez.de 1 " GC-MS ve elektronik burun ile arpa tanelerinde deoksinivalenol ve okratoksin A miktarı ve tespiti" J. Olsson, T. Borjesson, T. Lundstedt, J. Schnurer, International Journal of Food Microbiology 2002, 72, 203 214 2 " Gelişmiş floresan tespiti ve immünoafinite kolon temizleme metodolojisi ve Swiss veri" B. Zimmerli, R. 4/5
Dick J. Chromatogr. B 1995, 666, 85-99 ile yüksek-performans sıvı kromatografisi tarafından insan kan, serum, süt ve bazı gıdalarda ppt seviyesinde okratoksin A tespiti 5/5