Genequality JAK-2 Kod 04-26A Kod 04-26R

KULLANICI EL KİTABI Genequality JAK-2 Kod 04-26A Kod 04-26R Jak-2 geninin V617F genetik varyantını tanımlama kiti 04-26R-50_8033622781851_TR.doc

1. ÜRÜN BİLGİSİ 3 1.1 Amaç 3 2. KIT İÇERİĞİ 4 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ 5 4. KULLANIM ÖNLEMLERİ 6 5. GÜVENLİK KURALLARI 7 5.1 Genel güvenlik kuralları 7 5.2 Kite özel güvenlik kuralları 8 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN ANCAK GEREKLİ OLAN MALZEMELER 9 6.1 Reaktifler 9 6.2 Cihazlar 9 6.3 Malzemeler 9 7. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI 10 8. GİRİŞ 11 9. TEST PRENSİBİ 13 10. ÜRÜN TANIMI 14 11. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, İŞLENMESİ VE ÖN-HAZIRLIĞI 15 11.1 Perifer kanı veya kemik iliği 15 12. PROTOKOL 15 12.1 DNA Ekstraksiyonu 15 12.2 DNA Çoğaltma 16 12.3 Çoğaltma ürünlerinin görüntülenmesi 17 12.3.1 Agaroz jel elektroforezi 17 12.3.2 Örnek yükleme 18 12.4 Sonuçların değerlendirilmesi 19 Page 1

13. SORUN GİDERME 21 14. DONANIM SINIRLARI 23 15. DONANIM PERFORMANSI 23 15.1 Analitik özgüllük 23 15.2 Tanısal özgüllük 23 15.3 Analitik duyarlılık 23 15.4 Tanısal duyarlılık 23 15.5 Doğruluk- kesinlik 24 15.6 Tekrarlanabilirlik 24 16. REFERANSLAR 25 16.1 Kullanışlı olabilecek web siteleri 25 Page 2

1. ÜRÜN BİLGİSİ 1.1 Amaç JAK-2 kiti bir IVD kit olup Jak-2 geninin V617F genetik varyantını tanımlamak için kullanılır. Bu el kitabı aşağıdaki ürünleri içerir: JAK-2 Agaroz jel elektroforezi ile olan çoğaltma (amplifikasyon) ve görüntüleme ile ilgili tüm reaktifler. Kod ürün Paketleme 04-26A-25 JAK-2 25 test 04-26A-50 JAK-2 50 test JAK-2 Çoğaltma reaktifleri Çoğaltma için gerekli tüm reaktifler. Kod ürün paketleme 04-26R-25 JAK-2 çoğaltma reaktifleri 25 test 04-26R-50 JAK-2 çoğaltma reaktifleri 50 test Page 3

2. KİT İÇERİĞİ Dikkat: Bazıları farklı kittir. (açıklama: x = kit içeriğinde bulunur; 0 = kit içeriğinde bulunmaz) P KUTUSU 30 / 20 C DE SAKLAYIN kod 04-26A kod 04-26R TANIM ETİKET TÜP (T) VEYA KAPAK RENGİ 25 test 50 test 8 test X X Tek doz JAK-2 premiks tüpleri Sarı (T) 25 50 8 X X Thermostable Taq DNA polymerase AB TAQ 5 U/μL Kırmızı 50μL 50μL 6μL KÜÇÜK TORBA 30 / 20 C DE SAKLAYIN kod 04-26A kod 04-26R TANIM ETİKET TÜP (T) VEYA KAPAK RENGİ 25 test 50 test 8 test X X Plazmid DNA JAK-2 V617F 100% MUT JAK-2 MUT Pozitif kontrol Mavi 1X 15μL 1X 25μL 1X 5 μl X X Plazmid DNA JAK-2 100% WT JAK-2 WT Pozitif kontrol Mavi 1X 15μL 1X 25μL 1X 5 μl F KUTUSU +2 / +8 C DE SAKLAYIN kod 04-26A kod 04-26R TANIM ETİKET TÜP (T) VEYA KAPAK RENGİ 25 test 50 test 8 test X 0 X 0 X 0 Elektroforez yükleme tamponu Ethidium Bromide eriyiği (2.5 mg/ml) DNA Moleküler Ağırlık Markeri Blue 6X mavi 100μL 150μL 1X 24μL Ethidium Bromide TOXIC R 23 68 S 36/37 45 Kırmızı 100μL 150μL 1X 40μL MW Marker Sarı 100μL 150μL 1X 15μL Page 4

A KUTUSU +15 / +25 C DE SAKLAYIN kod 04-26A kod 04-26R TANIM ETİKET TÜP (T) VEYA KAPAK RENGİ 25 test 50 test 8 test X 0 X 0 Agaroz - molecular biology grade- Elektroforez tamponu TRIS- Asetat -EDTA ph: 8.00 AGAROZ 1X 5 g 1X 10 g 1X 2 g TAE 50X 1X 15 ml 1X 30 ml 1X 5 ml 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her parçası kendi kutuları üzerinde yazan uyarılara gore saklanmalıdır. Örneğin: P kutusu Küçük torba F kutusu A kutusu -30 /-20 C -30 /-20 C +2 / +8 C +15 / +25 C Önerilen ısıda saklandığında tüm reaktifler son kullanma tarihlerine kadar stabildir. Page 5

4. KULLANIM ÖNLEMLERİ Bu kit sadece IVD olarak kullanılabilir,yeterli deneyime sahip ve uygun eğitimi almış, diyagnostik moleküler biyolojide çalışmakta olan araştırmacılar tarafından kullanılmalıdır; Kullanmaya başlamadan önce kullanım klavuzunu dikkatle ve tamamen okuyunuz; Ürünü sıcaktan koruyunuz; Kitin herhangi bir kısmını son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü veya yöntemin uygulanması ile ilgili herhangi bir şüphe olduğunda AB ANALITICA teknik servisi ile temas kurun: laboratorio@abanalitica.it Araştırmacı, nükleik asidlerin çoğaltılmasında aşağıdaki özgün koşulları uygulamalıdır: Filtreli pipet ucu kullanınız; Biyolojik örnekleri, ekstrakte edilmiş DNA yı, kit içerisindeki pozitif kontrolü ve tüm çoğaltma ürünlerini farklı alanlarda saklayınız. Çalışma alanını pre- ve post- PCR üniteleri olarak farklı bölümlere ayırınız; sarf malzemelerini bu alanlarda asla ortak (pipetler, pipet uçları, tüpler, vb). Eldivenleri sıkça değiştiriniz; Çalışma yüzeylerini %5 hipoklarid ile yıkayınız; PCR premiksleri kullanmadan once oda ısısında eritiniz. Taq polimerazı ve saf DNA yı oda ısısında veya bir buz banyosunda çok hızlı olarak ekleyiniz. Page 6

5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel güvenlik kuralları Reaktifleri ve klinik örnekleri tutmak için tek kullanımlık eldivenler kullanınız ve çalışma sonunda ellerinizi yıkayınız; Ağzınızla pipetleme yapmayınız; Enfeksiyon etkeninin olmadığından emin olmamızı sağlayacak herhangi bir tanı yöntemi olmadığından, her bir klinik örneği potansiyel olarak enfeksiyöz kabul ederek öyle davranmak gerekmektedir; Klinik örneklere direct olarak değen tüm cihazlar kontamine olmuş olarak kabul edilmeli ve böyle atılmalıdırlar. Örneklerin kazaen saçılması durumunda, %10 sodyum hipoklorid ile yıkayınız. Materyaller özel taşıyıcı taşıyıcılar içerisnde atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller, ve kontamine ürünler aşağıdaki gibi dekontamine edildikten sonre atılmalıdırlar: VEYA 30 dakika sure ile ( her 10 hacim için 1 hacim) %5 sodyum hipoklorid solüsyonuna daldırma. 121 C de en az 2 saat otoklavlama (NOT: Sodyum hipoklorid içeren solüsyonları otoklavlamayın!!) Page 7

5.2 Kite özel güvenlik kuralları Bu kitte tek bir malzeme riskli olarak bulunmaktadır: Tehlikeli maddeler: Ethidium Bromide (04-26A) <%2 oranında 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARELERİ VE S İBARELERİ ETHIDIUM BROMIDE R 23 ve R 68 S 36/37 45 Solunum sistemine toksik. Geri dönüşü olmayan riskler. Laboratuvar kıyafeti ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumunda tıbbi yardım iste ve paket etiketini göster. R ve S ibareleri, agaroz jelde sulandırılana kadar özellikle Ethidium Bromide için kitte sağlanan konsantre ürünü temsil eder, Konsantre Ethidium Bromide ile çalışırken, kimyasal kabin kullanın. Daima tek kullanımlık eldivenler ve laboratuvar kıyafeti giyin. Ürün genel atıklar içine atılmamalıdır. Genel atık sistemine de atılmamalıdır. Yerel kurallar mutlaka uygulanmalıdır. Kazaen Ethidium Bromide etrafa saçıldığında sodium hipoklorid ve sui le yıkanmalıdır. Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir Page 8

6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN ANCAK GEREKLİ OLAN MALZEMELER 6.1 Reaktifler DNA ekstraksiyonu için gerekli reaktifler; Granülosit ayrıştırma için gerekli reaktifler, eğer DNA ayrıştırma granülositlerden yapılacaksa (paragraf 12.1); Steril DNase ve RNase içermeyen su; Distile su; DNA nın agaroz jel elektroforezi ile gösterilebilmesi için gerekli reaktifler (04-26R kiti için gerekli). 6.2 Cihazlar Laminar air flow (çoğaltma premiksine TAQ polymerase eklerken kontaminasyondan korunmak amacı ile kullanılması önerilir;ekstrakte edilmiş DNA nın eklenmesi için de başka bir laminar air flow kullanılması önerilir); Mikropipetler (aralık: 0.2-2 µl; 0.5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl); Thermal cycler; Mikrosantrifüj (max 12,000-14,000 rpm); Terazi; Manyetik ısıtıcılı karıştırıcı veya mikrodalga fırın; Kimyasal güvenlik kabini (Ethidium Bromide kullanılırken önerilir); Agaroz minijel için horizontal elektroforez kamarası; Güç kaynağı (50-150V); UV Transillüminator; Fotoğraf makinesi veya görüntü analizörü. Spektrofotometre 6.3 Malzemeler Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık steril filtreli pipet uçları (aralık: 0.2-2 µl; 0.5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl); TAE sulandırımı için dereceli beherler (1 L); Agaroz jel hazırlama için Pyrex bottle veya Becker; Parafilm. Page 9

7. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI 1 L hacminde 1X TAE tamponu hazırlanması 50X TAE (04-26A kitinde bu reaktif bulunmaktadır) den 20 ml alarak 980 ml distile su ile karıştırın. Page 10

8. GİRİŞ Kronik myeloproliferatif hastalıklar (CMD) 1951 de tanımlandı,, William Dameshek POLİSİTEMİA VERA (PV), ESANSİYEL TROMBOSİTEMİ (ET) ve PRİMER MYELOFİBROZİS (PMF) gibi hastalıkları tekrar gruplandırdı. Kronik myeloid lösemi de CMD olarak bilinse de t(9;22)(q34;q11) translokasyonunun tanımlanması ve BCR-ABL tekrar düzenlemesi ile bu sınıflamanın dışında kalmıştır. Tanı kriterlerinin sistematik olarak gözden geçirilmesi ve histolojik karakteristikleri CMD sınıflamasının Dünya Sağlık Teşkilatı - World Health Organization (WHO; 2001)-tarafından da kullanımı ile hızlandı, diğer klinik formlar olan hipereozinofilik sendrom, sistemik mastositozis ve diğer nadir ve henüz çok az anlaşılmış bulunan formlar CMD nin tipik karakteristiklerini taşıyan myelodisplastik sendromların ara formları olarak kabul edilirler. Yeterli sayıda araştırma yapılmış olmasına rağmen, PV, ET, ve PMF gibi tipik CMD Ph - negatif moleküler patogenezi ve Jak-2 mutasyonu 2005 yılına kadar beş araştırma grubunun hemen hemen aynı anda yaptığı çalışmalara kadar bilinmiyordu. Mutasyon, 1849 pozisyonundaki guanine thymidine yer değiştirmesidir, buda 617 pozisyonundaki valine phenylalanine (V617F) yer değiştirmesine neden olur. Jak-2 geni hematopoietik büyüme faktörlerince indüklenen önemli bir proteini kodlar. Bu protein tarafından indüklenen sinyal de farklı sitoplazmik moleküllerin fosforillenmesine neden olur-stat (signal transducers and activators of transcription)-. Hücresel modellerle yapılan çalışmalar göstermektedir ki V617F somatic mutasyonu fonksiyon kazandırıcı bir mutasyondur, JAK2 mutasyona uğramış protein daha az inaktivasyonu engeller ve büyüme faktörlerinin özgül reseptörlerine bağlanması ile sinyal daha etkin olarak indükler ve bu transdüksiyon, hematopoietik hücrelerin daha az apoptozuna neden olur. Son yapılan çalışmalar multipotent hematopoietik kök hücrede spontan olarak görülen mutasyonun neden sadece myeloproliferatif hastalığa neden olduğunu ve sadece myeloid seriyi etkilediğini açıklamaktadır: JAK2, aslında eritropoietin, G-CSF, ve thrombopoietin reseptörleri gibi büyüme faktör reseptörlerinin transdüksiyon sinyalinde çok önemli bir rol oynar. Bu reseptörler sadece myeloid hücrelerde eksprese edilirler ve lenfoid hücreler bu reseptörleri içermez, bu nedenle lenfoid seri hücreleri klonal çoğalma göstermezler (Levine et al., 2005). JAK-2 V617F mutasyonu ile indüklenen klonal myeloid proliferasyon gösteren myeloproliferatif hastalıklarda moleküler patogenezin çok fazlı tahmini çözümlenmesi aşağıdaki gibidir (Cazzola et al., 2006): Page 11

1. Birinci hal : spontan JAK-2 V617F somatik mutasyonu ve heterozigot hematopoietik hücrenin klonal proliferasyonu; 2. İkinci hal: heterozigot hematopoietik hücrede JAK-2 V617F için mitotik rekombinasyon, kromozom 9p nin heterozigositesinde azalma ve mutasyonla homozigot hücrelerin klonal çoğalması. İkinci basamaktaki işlemin sonucu V617F mutasyonu ile normal, heterozigot ve homozigot hücre popülasyonunun karışımıdır,hücre tiplerinin oranları oldukça değişken olabilir. Heterozigositeden homozigositeye doğru ilerleme patolojideki ilerleme ile paraleldir.: aslında, homozigot hücrelerin baskınlığı PV nin fibrotik fazına doğru gelişme ile kuvvetle birliktelik gösterir, CD34+ hücrelerin ve trombosit aktivasyonunun belirleyici mobilizasyonu ile karakterlidir. V617F mutasyonu hemen hemen tüm PV vakalarında, ET hastalarının %60-70 inde ve PMF hastalarının %50-60 ında saptanabilir. Homozigot formdaki mutasyon (mitotik yeniden düzenleme için) PV ve PMF hastalarında %25-30 dur, ET hastalarında %2 civarındadır.homozigot formda mutasyonun frekansı post-polisitemi veya thrombositemik myelofibrosis olan hastalar arasında bile yüksektir (%50 nin üzerinde) Bu nedenle, WHO, CMD değerlendirmesi için V617F mutasyonunun gösterilmesini, özellikle klinik ve morfolojik bilgileri yeterince açık olmayan olgularda önemli bir tanısal kriter olarak kabul etmektedir (Tefferi et al., Blood 2007). Son zamanlarda yapılan gözlemler, mutasyonun varlığı / yokluğunun kalitatif tanımlanmasından çok, V617F allellerinin yüzdesinin tanımlanmasının ileri düzeyindeki hastaların sınıflandırılmasına daha fazla yardımcı olabileceğini göstermektedir, prospektif bir çalışmadaki 173 PV hastasında, %75 ten fazla mutant alleli olanlarda var olan trombotik bulguların istatistiksel olarak önemli risk taşıdığı ve myeloproliferasyonun kontrolü için gerekli kemoterapi ve takibin gerekli olduğu gösterilmiştir (Vannucchi et al., Blood 2006). Page 12

9. TEST PRENSİBİ PCR yöntemi (Polymerase Chain Reaction) literatürde tanımlanmış ilk DNA çoğaltma yöntemidir (Saiki RK et al., 1985). DNA nın özgül bir parçasının (hedef sekans) bir termostabil DNA polimeraz ile in vitro çoğaltılması reaksiyonu olarak tanımlanır. Üç nükleik asid segmenti reaksiyonda yer alır: çift iplikçikli DNA (hedef DNA) çoğaltılabilir ve daha önceden dizayn edilmiş iki tek-iplikçikli oligonükleotid primer in hedef DNA ya özgül olarak bağlanmaları sağlanır. DNA polimeraz primerler tarafından işaretlenmiş bölgeden sentez işlemine başlar ve yeni çift iplikçikli DNA molekülü sentezlenir.bu yeni çift iplikçikli DNA molekülü original çift iplikçikli hedef DNA bölgesi ile aynıdır. Serbest solüsyon halinde tamamlayıcı nükleotidlerin (dntp) eklenmesi bağlanmayı kolaylaştırır. Pek çok siklustan sonra hedef sekansı temsil eden milyonlarca DNA molekülü elde edilir. Bu testin duyarlılığı laboratuvar tanıda uygulanabilirliği için özellikle uygundur. Diğer taraftan, çoğaltma reaksiyonu pek çok biyolojik örnek karşılaşabilir ve çok küçük DNA parçalarının çoğalmasına neden olabilir, başlangıç DNA sı kısmen parçalanmış olabilir. Page 13

10. ÜRÜN TANIMI Bu kit, Jak-2 geninin V617F mutasyonunu PCR ARMS (Amplification Refractory Mutation System) temelinde multipleks olarak tanımlar. Bu teknik, ortak bir primer ve iki allele özgü primer kullanır; biri 364 bp ürünüdür ve hem mutant hem de wild-type allellerden olup internal PCR kontrolü olarak işlev görür. Diğeri ise 203 bp ürünüdür ve mutasyona uğramış allellere özgüldür. Jak-2 geninin daha geniş bölgesinin ortak-çoğaltılması, başlangıç örneğinin ve takip eden çoğaltma için bütünsel kontrolü sağlar. 364 bp ürününün amplifikasyonundaki negatif bir sonuç, ekstrakte edilmiş DNA da tamamlayıcı DNA nın birkaç molekülünün var olduğu veya reaksiyonun başlangıç basamaklarında hata olduğu anlamını taşır. Bu geçerlilik sağlayan durum sayesinde, JAK-2 V617F mutasyonu için teknisyen yanlış negative sonuçları tanıyabilir, mültipleks çoğaltma olduğundan ayrıca bir zaman harcamasına gerek kalmaz. Kit içeriğinde iki kontrol vardır: %100 mutant alleller için bir DNA iplikçiği ve %100 wild-type alleller için bir DNA iplikçiği. Kontrollerin doğru olarak çoğaltılması (beklenen bandlar %100 MUT DNA için 364 bp ve 203 bp ve %100 WT DNA için ise sadece 364 bp bandıdır) reaksiyonun doğru olarak çalıştığının garantisidir. Bu kontroller plazmid DNA sı olup teknisyen için tehlikeli değildirler. Kit, premiks formatındadır: amplifikasyon için gerekli tüm reaktifler pre-miks olarak hazırlanmış ve tek kullanım amacı ile test tüplerine eşit miktarda adğıtılmışlardır, Taq polimeraz ve ekstrakte edilmiş DNA eklenecektir Bu şekilde pre-miks format sayesinde ön-çoğaltma işlemindeki manüplasyon basamakları azaltılmış olur, teknisyen için zaman tasarrufu sağlar, reaktiflerin dondurma/eritme işlemleri tekrarlanmaz (ürün performansı değişmez) ve tüm bunlar nedeniyle kontaminasyon riski ve yalancı pozitiflik önemli ölçüde azalır. Bu amaçla, amplifikasyon kontrollerinin devamlı kullanılması tavsiye edilir. Page 14

11. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, İŞLENMESİ VE ÖN- HAZIRLIĞI 11.1 Periferal kan veya kemik iliği Örnekler genel sterilite kurallarına uygun olarak alınmalıdır. Kan, EDTA lı tüplerle alınmış olmalıdır.heparin gibi diğer antikoagülasyon ajanları TAQ polimerazın güçlü inhibitörleridir, bu nedenle çoğaltma reaksiyonunun etkinliğini bu nedenle değiştirirler. Taze kan eğer işlem kısa sürede yapılacaksa +2/+8 C de saklanmalıdır, eğer DNA ekstraksiyonu kısa sure içerisinde yapılamayacak ise örnek dondurulmalıdır. 12. PROTOKOL 12.1 DNA Ekstraksiyonu DNA direkt olarak tam kandan veya granülositlerden ekstrakte edilebilir. Granülositlerden elde edileceğinde, kan, Histopaque -1119 (Sigma-Aldrich) kullanılarak dansite gradientine göre santrifüj edilmelidir. DNA elde edilmesi için herhangi bir ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir, saf ve parçalanmamış DNA elde edilmesi esastır (AB ANALITICA, QIAamp DNA BLOOD Mini Kit QIAGEN kullanmaktadır). Daha sonra, elde edilen DNA bir spektrofotometre ile miktar açısından değerlendirilmelidir. Çoğaltma için kullanılacak DNA nın miktarı 80 ng civarında olmalıdır.eğer çoğaltılacak olan DNA miktarı gerekli miktardan az ise (5 μl), çoğaltma mikst hacmi, su eklenerek veya ekstrakte edilen DNA nın sulandırımı hazırlanarak hacim ayarlaması yapılmalıdır (paragraf12.2). Page 15

12.2 DNA Çoğaltma Her bir örnek için bir sarı tüpe ekleyin: AB TAQ 0.25 µl DNA 80 ng H 2 O 5 µl V FINAL 25 µl Sonuçların optimal değerlendirilmesi için, daima ayrı ayrı 5 µl JAK-2 MUT positif kontrol ve 5 µl JAK-2 WT positif kontrol (kit içeriğinde bulunur) ün de çoğaltılması uygundur. Ayrıca, bir çoğaltma negatif kontrolü (DNA yerine su) kullanılması da olası kontamitantların gözlenmesi açısından uygundur. Kısa bir santrifüjden sonra tüpleri aşağıdakiprograma uygun olarak thermal cycler da inkübe edin: 1 siklus 94 C 5 dak 36 siklus 94 C 58 C 72 C 45 sn 45 sn 60 sn 1 siklus 72 C 10 dak Çoğaltma ürünü uzunluğu: Internal kontrol: 364 bp JAK-2 V617F geni: 203 bp Page 16

12.3 Çoğaltma ürünlerinin gösterilmesi 12.3.1 Agaroz jel elektroforezi % 3 agaroz jel hazırlayın: 1.5 g agaroza 50 ml hacminde 1X TAE ekleyin Eriyiği manyetik karıştırıcılı ısıtıcıya veya mikrodalga fırına koyun, eriyik berrak olana kadar ısıtın. (DİKKAT: aşırı köpük oluşmasını önlemek amacıyla güç olabilidiğince en az düdeyde olmalıdır ). Jeli birkaç dakika için soğutmaya bırakın ve 2.5 mg/ml Ethidium Bromide eriyiğinden 10 µl ekleyin. UYARI: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven kullnın ve bu reaktifle veya Ethidium Bromide içeren jel ile çalışırken tercihan kimyasal güvenlik kabini kullanın. Jeli uygun bir jel dökme tepsisine dökün, tarağı yerleştirerek jeli oda ısısında soğumaya bırakın daha sonra buzdolabında sertleşene kadar bekletin. Jel sertleştiğinde, dikkatle tarağı çıkartın (jeldeki çukurcukların zedelenmemesine dikkat edin) jeli elektroforez kamarasına yerleştirin ve uygun miktarda, jeli tamamen kaplayacak şekilde 1X TAE tamponu ekleyin, (jel yüzeyini 1-2 mm aşmalıdır). Page 17

12.3.2 Örnek yükleme Bir tüpte karıştırın veya direkt olarak bir parafilm tabakaya uygulayın: 2 μl 6X Blue* 10 μl Çoğaltma ürünü veya moleküler ağırlık markeri (DNA molecular weight marker) (MW Marker*) Karışımı jel çukurcuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı 80-100 V arasında ayarlayın. Yaklaşık 45 dakika boyunca jelde yürütün,daha sonra jeli bir UV transillüminatöre yerleştirin ve referans moleküler ağırlık markeri ile çoğaltma ürününün karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * = 6X Blue ve MW Marker 04-26A kit içeriğinde bulunur; başka bir yükleme tamponu veya moleküler ağırlık markeri kullanacağınız zaman üreticinin önerilerine uyun. DNA Moleküler Ağırlık Markeri (MW Marker, 04-26A kitinde bulunur): 501-489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. (501-489 bp bandları genellikle net olarak ayrlamaz tek bir band gibi görülebilirler; 34 ve 26 bp bandları düşük moleküler ağırlıkları nedeni ile bazen çok küçük olup ancak %3 lük agaroz jelde görülebilirler). UYARI: UV ışınları deri ve gözler için tehlikelidir: her zaman eldiven ve güvenlik gözlüğü kullanın veya UV transillüminatörün koruyucusunu kullanın. Page 18

12.4 Sonuçların değerlendirilmesi KONTROL SONUÇ DEĞERLENDİRME Negatif kontrol (su) NEGATİF Kontaminasyon yok. JAK-2 MUT Positif Kontrol JAK-2 WT Positif Kontrol 364 bp de BAND ve 203 bp de BAND 364 bp de SADECE BİR BAND Çoğaltma ve gösterme doğru olarak yapılmış. Çoğaltma ve gösterme doğru olarak yapılmış. Daha sonra, band paternini belirlemek için aşağıdaki tabloyu takip edin: SONUÇ DEĞERLENDİRME Sadece 364 bp de bir band görülüyor Örnek sadece JAK-2 wild-type alleli ile karakterli 364 bp de bir band ve 203 bp de bir Örnekte JAK-2 V617F mutant alleli var band görülüyor Band yok Örnek çoğaltılamamış veya miktar yetersiz (DNA ektraksiyonunu tekrarla) Page 19

1 2 3 4 5 364 bp 203 bp Figür 3. %3 agaroz jel elektroforezi ile çoğaltma ürününün gösterilmesi. 1. JAK-2 V617F %100 MUT positif kontrol 2. JAK-2 %100 WT positif kontrol 3. JAK-2 V617F mutant alleli olan örnek 4. Sadece JAK-2 wild-type alleli olan örnek 5. Negatif Kontrol Page 20

13. SORUN GİDERME Üründe veya positif kontrol DNA bandlarında çoğalma yok TAQ polimeraz premikse doğru olarak eklenmemiş Pipet ve pipet uçlarını uygun hacimlerde kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); Görsel olarak TAQ polimerazın premikste diffüz olarak dağıldığını control edin: bu oldukça kolaydır, enzim gliserolde kolayca dağılr, dansitesi yüksektir; Alternatif olarak, tüp duvarına TAQ polimeraz damlası koyduğunuzdan emin olun ve kısa bir santrifüj uygulayın. Thermal cycler doğru olarak programlanmamıştır Thermal cycler programının doğruluğunu ve kullanım klavuzundaki ısı profiline uyulup uyulmadığını kontrol edin; daha sonar doğru program ile oğaltma işlemini tekrarlayın. Kit düzgün çalışmıyor Premiks, TAQ polimeraz ve pozitif kontrolü -30 /-20 C de saklayın; Premiks ve reaktifleri tekrarlayan şekilde dondurma/eritme işleminden uzak durun. Agaroz jelde çoğaltma ürününün görüntülenmesinden sonra özgül olmayan ürünler veya ekstra bandların varlığı Thermal cycler ısı değişikliklerini çok yavaş gerçekleştiriyor. Thermal cycler revizyonu gerekli. Çoğaltma reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında uzun sürede yapılabiliyor. Oda ısısında çalışma sürenizi hızlandırın. Buzda çalışın. Ekstrakte edilmiş DNA yeterince saf değil. Page 21

Ekstraksiyon prosedürünü gözden geçirin. Çalışılan örnek kısmen parçalanmış DNA içeriyor Başka bir klinik örnek kullanarak ekstraksiyonu tekrarlayın; Elinizdeki örneğin uygun yöntemle alındığından ve saklandığından emin olun. Herhangi başka bir problem için AB ANALITICA nın teknik desteği için: laboratorio@abanalitica.it fax (+39) 049-8709510, veya tel. (+39) 049-761698. Page 22

14. DONANIM SINIRLARI Aşağıdaki durumlarda kitin performansı azalır: Kan örneği bu analiz için uygun değildir (ektraksiyondan sonra uygunsuz saklama; antikoagülan olarak heparin kullanımı); Histolojik örnek bu analiz için uygun değildir (nötral formalin tamponu yerine alternative fiksatifler kullanın, örnek doğru saklanmamıştır); Kit paket üzerinde yazan önerilen ısıda saklanmamıştır. 15. DONANIM PERFORMANSI 15.1 Analitik özgüllük Primer sekans dizilimi en önemli bilgi bankalarında özgül olmayan dizilimlerin olmadığını göstermektedir. Genomik DNAile çapraz reaksiyon görülmemiştir. 15.2 Tanısal özgüllük JAK-2 V617F mutasyonu için seçilmiş önemli sayıdaki negatif örnekler başka bir referans yöntemi ile JAK-2 kitine parallel olarak test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara gore JAK-2 kitinin tanısal özgüllüğü %100 dür.. 15.3 Analitik duyarlılık Analitik duyarlılığı tanımlamak için, AB ANALITICA, sertifikalı uluslararası bir tedarikçiden yüksek derecede konsantre edilmiş JAK-2 V617Fmutasyonu içeren hücresel DNA elde etmektedir.bu DNA nın seri sulandırımları ile JAK- 2 V617F / 100 JAK-2 wild-type allellerin 1 mutant allele eşit duyarlılık limiti doğrulanmaktadır. 15.4 Tanısal duyarlılık JAK-2 V617F mutasyonu için seçilmiş önemli sayıdaki pozitif örnekler başka bir referans yöntemi ile JAK-2 kitine parallel olarak test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara gore JAK-2 kitinin tanısal duyarlılığı %100 dür. Page 23

15.4 Doğruluk-kesinlik JAK-2 kitinin kesinliği%100 dür. 15.5 Tekrarlanabilirlik 10 örnek, üç farklı günde ardışık 3 çalışmada çoğaltıldı ( %100 MUT ve %100 WT positif kontrollerle). Sonuçlar tekrarlanabilirliği göstermektedir. Page 24

16. REFERANSLAR Cazzola M. Haematologica reports 2(6), 3-5, 2006. Jones AV, Kreil S et al. Neoplasia 106 (6), 2162-68,2005. Levine R, Wadleigh M et al. Cancer Cell 7, 387-97, 2005. Lippert E, Boissinot M et al. Hematopioesis 108, 1865-67, 2006. Poodt J, Fijnheer R et al. Hematological Oncology 24, 227-33, 2006. Tefferi A, Thiele J et al. Blood 110, 1092-97, 2007 16.1 Kullanışlı olabilecek web siteleri www.hematology.org www.bloodjournal.org www.bloodline.net www.haematologica.it www.il-st-acad-sci.org/data6.html http://medocs.ucdavis.edu/imd/420a/dib/index.htm http://web.tiscali.it/ematologia www.ematologia-italia.net/frame_b.htm www.simti.it http://stemcells.alphamedpress.org www.blacksci.co.uk/uk/society/bsh Page 25

AB ANALITICA srl Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it