Ampliquality HSV 1/2 Kod 03-75A Kod 03-75R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU Ampliquality HSV 1/2 Kod 03-75A Kod 03-75R Tip 1 ve 2 Herpes Simplex Eş zamanlı tanımlaması için kit

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ 5 2. KİT İÇERİĞİ 6 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 7 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 8 5. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİF HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Biyolojik sıvılar Sitolojik örnekler Sitolojik örneklerin ön-muamelesi Histolojik Örnekler Histolojik örneklerin ön-muamelesi PROTOKOL DNA ekstraksiyonu DNA amplifikasyonu ß-Globin DNA amplifikasyonu 19 Page 3

4 Direct amplifikasyon (1. amplifikasyon) HSV 1 ve HSV 2 DNA Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) HSV 1/2 DNA Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme Sonuçların yorumlanması SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık REFERANSLAR Yararlı websiteleri 29 Page 4

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir: HSV 1/2 Glikoprotein D ve G bölgelerinin DNA amplifikasyonu ile Herpes Simplex tip 1 ve 2 virusunun eş zamanlı tanımlanması için kit. Amplifikasyon ve agaroz jelde görüntüleme için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 03-75A-25 HSV 1/2 25 test 03-75A-50 HSV 1/2 50 test HSV 1/2 amplifikasyon reaktifleri Glikoprotein D ve G bölgelerinin DNA amplifikasyonu ile Herpes Simplex tip 1 ve 2 virusunun eş zamanlı tanımlanması için kit. Amplifikasyon için reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 03-75R-25 HSV 1/2 amplifikasyon reaktifleri 25 test 03-75R-50 HSV 1/2 amplifikasyon reaktifleri 50 test Page 5

6 2. KİT İÇERİĞİ DİKKAT! Farklı içerikler farklı kitler ile ilişkilidir. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR kod 03-75A kod 03-75R X X X X AÇIKLAMA Direk multipleks amplifikasyon HSV ½ için tek doz premiks Nested amplifikasyon HSV ½ için tek doz premiks ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Kırmızı (T) Yeşil (T) X X Tek doz BG premiks Mavi (PT) X X Thermostabil Hot start Taq DNA polymerase AB Super- Taq 5 U/μL Kırmızı 1X 50 μl 1X 100 μl 1X 16 μl KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR kod 03-75A kod 03-75R X X X X AÇIKLAMA HSV 1 genom parçası içeren plazmid DNA HSV 2 genom parçası içeren plazmid DNA ETİKET HSV 1 pozitif kontrol HSV 2 pozitif kontrol TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Mavi 1X 20 μl 1X 30 μl 1X 10 μl Mavi 1X 20 μl 1X 30 μl 1X 10 μl Page 6

7 KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR kod 03-75A kod 03-75R X 0 X 0 AÇIKLAMA Elektroforez için yükleme buffer Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test 6X Blue Mavi 1X 100 μl 1X 200 μl 1X 50 μl Ethidium Bromide toksik R23, 68 S 36/37 45 Kırmızı 1X 150 μl 1X 220 μl 1X 60 μl X 0 DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1X 150 μl 1X 260 μl 1X 50 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod 03-75A kod 03-75R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test X 0 Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1X 15 g 1X 26 g 1X 6 g X 0 Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA ph: X TAE 1X 50 ml 1X 100 ml 1X 30 ml 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C DE SAKLANIR +15 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. Page 7

8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Page 8

9 Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Page 9

10 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (03-75A kit içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Materyal Güvenlik Data Sheetleri gönderilebilir. Page 10

11 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Agaroz jelde elektroforez ile DNA görüntülemesi için reaktifler (03-75R kiti gerektirir) Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Tartı; Mikrosantrifüj (max rpm); Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Page 11

12 7. REAKTİF HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE (03-75A kitinde bulunur) ile 980 ml distile su karıştırın. Page 12

13 8. GİRİŞ Herperviridae ailesinin üyesi olan ve ikosahedral DNA virusu kapsülü içinde Herpes Simplex virusu (HSV) enfekte bitişik hücrelere tahliye edilen epitel hücrelerinin nukleusunde replike olabilir. Diğer insan herper virusleri gibi HSV, ilk enfeksiyonun (primer enfeksiyon) üretiminden sonra, host hücrenin nukleusunda epizom olarak ve duyusal sinirlerin gangli nöronları olarak belirsiz kalır ve bu yolla HSV latent ve devamlı enfeksiyona neden olur. HSV, enfeksiyonun klinik durumuna göre tip 1 ve 2 olarak ayrılır: HSV 1 tekrar eden perilabial herper lezyonları, genelde göbek üstünde genel deri enfeksiyonlarına ve genital enfeksiyonlara neden olur. HSV 2 erkek ve kadın genital alanında primer ve tekrar eden enfeksiyonlara neden olur; göbek üstü bölgesinde deri enfeksiyonlarının da sık nedenlerindendir. HSV için sadece doğal host insandır ve bu virus ile insan arasındaki etkileşimler komplekstir. Her iki virus, viral partiküllerin tekrar eden ya da asemptomatik eliminasyona neden olarak viral reaktivasyon artışı verebilen çeşitli doğal uyarıcılara bağlı olarak latent fazda aktif replikasyon formunda bulunabilir. Virus, yüzeyel mukozaya ve üretral sekresyon içeren çeşitli vücut sıvılarına direk temas ile aktarılabilir. Bu aktarım semptomların yokluğunda dahi yer alabilir (asemptomatik viral saçılım). Sonuçta bu oldukça sık ve uygundur ve herpes enfeksiyonunun yüksek insidansını açıklar. Latent viral replikasyon sırasında enfeksiyon aktarımı olan olguların % 80 inden fazlasında rapor edilmiştir. Tanı zorluğu, viral saçılımın kalıcılığı, görünür lezyonların yokluğu ve yok edilme tedavisinin eksikliğinde dahi yayılımın devamlılığına ve herpes enfeksiyonunun yüksek prevalansına katkıda bulunur. Son yirmi yılda genital herpes olgularının sayısında yoğun bir artış vardır. Uluslar arası Herpes Yönetim Forumuna (IHMF) göre dünya populasyonunun 1/3 ü enfektedir ve olguların %60 ında atipik sunum için ve %20 sinde toplam semptom yokluğu için enfeksiyon tanımlanmamıştır. HSV 2 tekrar etmesi HSV 1 den daha sık görülür, bu yüzden viral tiplendirme prognostik amaç için çok önemlidir. Genital herpes enfeksiyonları, istatistiksel olarak önemli bir şekilde kadın genital bölgesinde neoplazi gelişimi ile ilişkilidir. Önerilen hipotez, vur ve kaç durumunda özetlenen herpes simpleks virusunun neden olduğu bu transformayonu açıklamaktadır. Hücresel DNA etkileşimi ile ya da bazı spesifik fonksiyonların ekspresyonu vasıtası ile viral DNA, bu hücrelerde viral Page 13

14 dizinin ya da fonksiyonun belirgin olarak bıraktığı kalıntılar olmadan hücrede fenotip transformasyonuna neden olabilir. HSV reaktivasyonu, öldürücü sonuçlar ile enfeksiyon yayıldığından, immun yetmezlik virus enfeksiyonları, organ transplantları için immunbaskılayıcı terapiler ya da antineoplazya tedavisi sonuçları gibi spesifik durumlarda önemlidir. (Stewart, J.A. ve arkadaşları, 1995). 9. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. Herpes simpleks tanımlaması için, PCR teknikleri uygun örnekler kullanılarak her bir HSV enfeksiyonu tipini tanımlamak için laboratuarda kullanılabilir (Cone, R.W. ve ark., 1991; Kriesel, J.D. ve ark., 1994), ayrıca klasik lezyonlar yokluğunda ya da derin lokalizasyonunda ve/veya kolay görünür olmadığında ve/veya düşük viral yük ile ilişkili olduğunda doğru değerlendirme bulunabilir; okuler enfeksiyonlar ve herpes ensefalit bu olgularda bulunur (McConnel, I.M., 1994; Werner J.C., 1994). Bu diagnostik tekniğin diğer bir avantajı; hastalar altında olduğunda antiviral tedavi ile hepsini etkilememesidir. Bu nedenle, Acyclovir ile tedavinin ilk birkaç gününde dahi viral DNA elde edilebilir. Page 14

15 10. ÜRÜN TANIMI Bu kitte kullanılan metod bir nested multipleks amplifikasyonu öngörür. İki başarılı aşamada (nested) amplifikasyon duyarlılığı ve analizin etkilerini artırır ve özellikle HSV testleri için uygundur. Amplifikasyon, HSV 1 ve HSV 2 testlerini aynı reaksiyon tüpünde yapabilen multiplekstir. Özellikle, kapsid protein gpd kodlayan HSV 1 glikoprotein geni için spesifik primerlerin 2 kopyası ve kapsid protein gpg kodlayan HSV 2 glikoprotein geni için spesifik primerlerin 2 kopyası kullanılır. Farklı amplifikasyon ürün uzunluğu agaroz jel elektroforezinde görüntüleme ile iki viral tipin farklılaşmasını sağlar. Bu metod β-globin (BG) geni amplifikasyonu (amplifikasyon kontrolü) ile ekstrakte DNAnın uygunluğunu da değerlendirmeyi sağlar. β-globin gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya ekstrakte DNAda amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder. Bu metod olası yanlış negatif sonuçların tanımlanmasını sağlar ve ekstra zaman gerektirmez çünkü β-globin gen amplifikasyonu HSV ilk amplifikasyonu ile aynı dönemde uygulanır. Kit ayrıca HSV 1 ve HSV 2 için amplifikasyon kontrolleri içerir. Pozitif kontrolün başarılı amplifikasyonu rekasiyonun doğru çalıştığını garantiler. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir, çünkü viral genomun sadece bir parçasını içeren plazmid DNA dırlar. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir. Page 15

16 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Dudak uçuğu gibi HSV nin bazı tipik klinik semptomları laboratuar analizi ile doğrulama gerektirmeden genel olarak görülür; lezyonların atipik ya da direk görünmez olduğu durumlarda (ensefalit, endoservikal genital enfeksiyonlar) bir viral DNA testi vazgeçilmez bir diagnostik gereç olabilir. Bu amaç ile kullanılan örnekler klinik semptomların tipine bağlı olarak farklı olabilir: İrin, genital alan döküntüsü veya tamponu, göz ya da orofarenks tamponu, serebrial sıvı, deri, kornea ve kadın genital bölge biyopsileri Biyolojik sıvılar İntraokuler enfeksiyonlarda elde edilmesizor olan derin okuler doku örnekleri ve okuler sıvılar düşük viral yüke sahiptir, bir nukleik asit amplifikasyon tekniği duyarlılığından dolayı elzem bir gereçtir. Örnekler gözyaşları (Yamamoto S. ve ark., 1994), aköz ve vitröz vücut sıvıları olabilir (Garweg J. Et al., 1993). Ensefalit şüphesi için nukleik asit amplifikasyonu ile HSV testi serebral sıvı ile kısa bir zaman içinde yapılabilir (Aurelius E. ve ark., 1991; Schlesinger Y. ve ark., 1995; Lakeman F.D. ve ark., 1995). Örnekler eğer kısa bir süre içinde kullanılacaksa oda sıcaklığında ya da C de saklanabilir, aksi takdirde dondurulması önerilir Sitolojik örnekler Sitolojik örnekler serviks vajinal sıvılar, oral kavite hücreleri, göz ve orofarenks tamponları, deriden ve mukoz lezyonlardan elde edilen tamponlardan oluşur. Orofarenks ya da serviksden ekstraksiyon bir kazıcı ya da bir steril fırça (sitofırça) kullanılarak yapılabilir. Hücreler uygun bir tarnsport medyum içinde seyreltilir (1X PBS, fizyolojik solusyonlar ya da diğer medyumlar). Okuler ya da konjuktival ekstraktlar steril fizyolojik solusyon ile ıslak bir tampon kullanılarak alt konjuktivada yapılabilir. Tampon daha sonra uygun bir transport medyum içine eklenir (1X PBS, fizyolojik solusyonlar ya da diğer medyumlar). Mukoz ve dermal lezyonlar, irin varlığında, bir bozuk blisterden ya da lezyonun temelindekihücrelerden türeyen sıvının elde edilmesi ile steril Page 16

17 birtampon kullanarak toplanabilir. Blisterlerin yokluğunda, tampon lezyonların temelindeki hücreleri toplamak için steril bir fizyolojik solusyon ile nemlendirilmelidir. Virus izolasyonu, lezyonlar ülser olduğunda önemli ölçüde azalabilir. Tampon daha sonra uygun bir transport medyum içine eklenir (1X PBS, fizyolojik solusyonlar ya da diğer medyumlar). Örnek içeren şişeler maksimum 48 saat C de saklanabilir, sonra tercihen mukleik asit ekstraksiyonu ile devam edilir. Nukleik asitlerin kısa bir zaman içinde ekstrakte edilebilmesine imkan yoktur, ekstrakte materyaller -20 C de saklanmalıdır Sitolojik örneklerin ön-muamelesi DNA ekstraksiyonu yapılmadan önce örneklerin selülaritesi çok düşüktür, tekrar tekrar santrifüj ile örneklerin konsantre hale getirilmesi gerekebilir. Steril PBS örneklerin yeniden suspense edilmesi için kullanılabilir. Bir ya da iki santrifüj siklusu ve örneklerin PBS de başarılı yeniden suspensiyonu, mukoz ya da kırmızı kan hücreleri olası varlığının eliminasyonu için dahi yararlı olabilir Histolojik örnekler Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü biyopsilerdir. Rutin biyopsi ekstraksiyonu ile devam edin. Biyopsi bir kaç dakika içinde ekstrakte edilecekse taze kullanılabilir ya da Proteinaz K sindirimi ile devam edecek steril bir bisturi ile mekanik olarak kesime hazır olana kadar hızlıca likid nitrojen ile dondurulur ve -80 C de saklanabilir. Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler Histolojik örneklerin ön-muamelesi Page 17

18 Taze ya da donmuş histolojik örnekler (50 mg a kadar) steril bir bisturi kullanılarak mekanik olarak kesilmelidir. Bu muameleyi cam slaytlar üzerinde yapın. Sonra, kesilmiş parçaları Proteinaz K ile sindireleceği bir tüpe aktarın. Histolojik örnekler formalin fikse ve parafine gömülü olduğunda, ilk önce parafin uzaklaştırılmalı ve sonra örnek sindirilmelidir. Page 18

19 12. PROTOKOL DNA ekstraksiyonu Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Paragraf ve de BG, HSV 1 ve HSV 2 amplifikasyonu için belirtilen ekstrakte DNA miktarının AB ANALITICA metodları ile elde edilen ekstraktlara atıfta bulunduğunun hatırlanması gerekir. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 10 μl ya da 20 μl den düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır DNA AMPLİFİKASYONU ß-globin DNA Amplifikasyonu Her bir mavi premiks tüpüne ekleyin: AB Super-Taq Ekstrakte DNA 0.2 μl 20 μl Direk amplifikasyon (1. amplifikasyon) HSV 1 ve HSV 2 DNA Her bir kırmızı premiks tüpüne ekleyin: AB Super-Taq Ekstrakte DNA 0.25 μl 10 μl Her bir deneyde bir negatif kontrol (mikse DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (5 μl HSV 1 kontrol ve 5 μl HSV 2 kontrol kit içeriğinde bulunur) bulunması önemlidir. Page 19

20 Kısa bir süre santrifüj edin, tüpleri (ß-Globin ve HSV1/2) aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 94 C 2 minutes 35 cycle 94 C 56 C 72 C 30 seconds 30 seconds 30 seconds 1 cycle 72 C 5 minutes storage 10 C Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu: HSV 1: HSV 2: ß-Globin: 213 bp 183 bp 268 bp Direk amplifikasyonun sonunda HSV ½ nested amplifikasyonu ile devam edin. Page 20

21 Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) HSV 1/2 DNA Her bir yeşil premiks tüpüne ekleyin: AB Super-Taq 0,25 μl 1. amplifikasyon ürünü 1 μl Direk negatif ve pozitif kontrolleri ve HSV direk amplifikasyonuna eklenen pozitif kontrolü de yeniden amplifiye edin. Bu yararlı geldiğinde, direk amplifikasyon ürünü yerine nested mikse 1 µl steril su ekleyerek nested amplifikasyon için bir negatif kontrol de içermesi mümkündür. Kısa sure santrifüj edin, sonra mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94 C 2 minutes 30 cycle 94 C 58 C 72 C 30 seconds 30 seconds 30 seconds 1 cycle 72 C 5 minutes storage 10 C Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu: HSV 1: 137 bp HSV 2: 100 bp Page 21

22 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi: Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlayın: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μl 2.5 mg/ml Ethidium Bromide solusyonu ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 µl 6X Blue* 10 µl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)* Miksi jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V a ayarlayın. Çalışma sonunda, jeli UV transilluminatore koyun ve amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * = 6X Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 03-75A kit içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında sağlayıcı bilgilerini takip edin. Page 22

23 *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): , 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %3 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. Page 23

24 Sonuçların yorumlanması Eklenen kontroller beklenen sonuçları verdiğinde: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol POZİTİF Amplifikasyon doğru çalışmıştır Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon görülmez Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: SONUÇ YORUM ß-Globin band yokluğu ß-Globin band varlığı HSV 1 ve HSV 2 nested amplifikasyon bandları yokluğu ß-Globin band varlığı HSV 1 band varlığı HSV 2 band yokluğu ß-Globin band varlığı HSV 1 band yokluğu HSV 2 band varlığı ß-Globin band varlığı HSV 1 band varlığı HSV 2 band varlığı Örnek amplifiye edilemez ya da uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) Amplifiye olabilir örnek HSV 1 ve HSV 2 için negatif örnek Amplifiye olabilir örnek ve HSV 1 pozitif Amplifiye olabilir örnek ve HSV 2 pozitif Amplifiye olabilir örnek ve HSV 1 ve HSV 2 pozitif Page 24

25 Fig. 1: Nested amplifikasyon ürünlerinin %3 agaroz jel elektroforezi ile görüntülenmesi 1. DNA Moleküler Ağırlık Markır 2. HSV 1 pozitif örnek (137 bp band) 3. HSV 2 pozitif örnek (100 bp band) 4. HSV 1 ve HSV 2 için pozitif kontrol (137 bp ve 100 bp bandlar) 5. Negatif kontrol Page 25

26 13. SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir - -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); - -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; - Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz - -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; - -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. Test edilen örneklerde ya β globin ve HSV 1/2 için amplifikasyon bandı yoktur, fakat Pozitif kontrol için iyi bir band vardır Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: - Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; - Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; - Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur - Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; - Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; - Uygun ekstraksiyon sistemi kullanın. Page 26

27 Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın - Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. - Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; - Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte ürünler saflaşmamıştır - Örnekleri iyi saflaştıran bir ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir - Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; - Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Eğer sadece NESTED amplifikasyonda aspesifik ürünler görülürse, NESTED da ilk amplifikasyonun miktarı aşırı olmuş olabilir. - İlk amplifikasyon ürün miktarını azaltın ya da 1:10 ya da 1:100 seyreltin ve sonra nested amplifikasyon ile devam edin. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) , ya da tel. (+39) Page 27

28 14. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (sitolojik örneklerde kan varlığı, doğru saklanmamış örnekler ya da ph 7 de formalin buffer yerine alternatif fiksatifler). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. 15. TEST PERFORMANSI Özgünlük En genel bilgi bankasında primerlerin dizilimi aspesifik çiftlerin yokluğunu gösterir ve iki viral tipin spesifik amplifikasyonunu garanti eder: HSV 1 ve HSV 2. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Bu bilgi, hücre kültür enfeksiyonları ve immunofloresan testler gibi HSV 1 ve 2 için diğer diagnostik metodlar ile Nested Multipleks amplifikasyon karşılaştırılarak laboratuar testleri ile doğrulanmıştır Duyarlılık Kitin analitik duyarlılığı HSV 1 ve 2 TCID50 nin bir seri dülusyonunun amplifikasyonu ile değerlendirilmiştir (Doku kültür enfeksiyon dozu %50 kültür hücrelerinde %50 de enfekte doz). Laboratuar testleri, metodun HSV 1 için 0.001TCID50 ve HSV 2 için 0.01 TCID ye kadarbulanildiğini göstermiştir. Page 28

29 16. REFERANSLAR Aurelius, E., et al., 1991, Rapid diagnosis of herpes simplex encephalitis by nested polymerase chain reaction assay of CSF, Lancet, 337, Cone, R.W., et al., 1991, Extended duration of herpes simplex virus DNA in genital lesions detected by the polymerase chain reaction, J. Infect. Dis., 164, Garweg, J., et al., 1993, An improved technique for the diagnosis of viral retinitis from samples of aqueous humor and vitreous, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophtalmol., 231, Kriesel, J.D., et al., 1994, Correlation between detection of herpes simplex virus in oral secretions by PCR and susceptibility to experimental UV radiation-induced herpes labialis, J. Clin. Microbiol., 32, Lakeman, F.D., et al., 1995, Diagnosis of herpes simplex virus encephalitis: application of polymerase chain reaction to CSF from brain-biopsied patients and correlation with disease, J. Infect. Dis., 171, McConnell, I.M., 1994, Infectious diseases of the eye, In G.D. Ehrlich and S.J. Greenberg (Eds). PCR-based Diagnosis of Infectious Diseases. Blackwell Scientific, Boston. Schlesinger, Y., et al., 1995, Herpes simplex virus type 2 meningitis in the absence of genital lesions: improved recognition with use of the polymerase chain reaction, Clin. Infect. Dis., 20, Stewart, J.A., et al., 1995, Herpes virus infections in persons infected with human immunodeficiency virus, Clin. Infect. Dis., 21 (suppl. 1), S114-S120 Werner, J.C., 1994, Polimerase chain reaction for diagnosis of herpetic eye disease, Lab. Med., 25, Yamamoto, S., et al., 1994, Detection of herpes simplex virus DNA in human tear film by polymerase chain reaction, Am. J. Ophtalmol., 117, Yararlı websiteleri Page 29

30 Page 30

31

32 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it