Mısırdan PROTEİN İzolasyon Kiti Öğretmen Kılavuzu a. Konu b. Kullanıcı Kitlesi c. Deney Süresi d. Materyaller e. Güvenlik f. Genel Bilgi g. Deney Öncesi Hazırlık h. Ön Bilgi i. Deneyin Yapılışı j. Deney Sonuçları k. Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları l. Kaynaklar Öğrenci Kılavuzu a. Genel Bilgi b. Deney süresince uyulması gereken kurallar c. Deneyin Yapılışı d. Sorular
Canlı hücrede en çok bulunan makromoleküller olan proteinler, 20 standart amino asitin farklı sayı ve konfigürasyonda bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Proteinler sahip oldukları 3 boyutlu yapıları sayesinde canlı organizmaların farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Hücre kütlesinin %10-20 sini proteinler oluşturmaktadır. Yapılacak olan deneyde hücre içerisindeki protein varlığını tespit edebilmek için nitel bir yöntem olan biüret ayıracı kullanılacaktır. Kit içeriği 10 öğrencinin deneyi yapabileceği şekilde dizayn edilmiştir. a) Konu Öğrenciler; Bitki hücrelerinin fiziksel ve kimyasal yöntemlerle parçalanmasıyla hücre içerisinde açığa çıkmış olan proteinleri, biüret ayıracı kullanılarak belirleyecektir. b) Kullanıcı Kitlesi Mısırdan protein izolasyon kiti, 9 yaş ve üstü çocukların kullanımına uygundur. c) Deney Süresi Deney: 60 dakika d) Materyaller Falkon tüpü içerisine konulmuş 5 gr mısır örneği: 10 tane Liziz solüsyonu 1: 75 ml (distile su ile hazırlanacak) Liziz solüsyonu 2: 75 ml (distile su ile hazırlanacak) Biüret ayıracı: 150 ml Pastör pipeti: 40 tane Küçük plastik kap: 10 tane Sargı bezi Deney tüpü 40 tane Eldiven: 20 tane Distile su
e) Güvenlik Laboratuvarda uyulması gereken genel kurallara dikkat edilmelidir. Deney süresince öğrenciler eldiven kullanmalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir temas olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır. f) Genel Bilgi 1. Amino Asitler Amino asitler proteinlerin temel yapısal alt üniteleridir. Protein yapısında bulunan 20 amino asitin hepsi ortak bir yapıya sahiptir (aynı karbona bağlı bir karboksil (-COOH) ve amino (NH2) grubu) (Şekil 1). R gruplarındaki farklılıklar, ortak yapısal iskeleti paylaşan amino asitlerin değişik yapıya, farklı elektrik yüküne ve suda değişik oranlarda çözünürlüğe sahip olmasını sağlar. Proteinlerin yapısında yer alan 20 temel (standart) amino asit, R gruplarının yapı ve özelliğine göre sınıflandırılmaktadır(şekil2). Şekil 2. Standart amino asit çeşitleri
Amino asitlerin bazıları vücutta sentezlenebildiği halde bir kısmı doğal olarak sentezlenemez. Vücudun sentezleyemediği ve besin yoluyla dışardan alınması zorunlu olan amino asitlere esansiyel amino asitler veya eksojen amino asitler denir. Vücutta sentezlenebilen ve dışarıdan besinlerle alınması zorunlu olmayanlara ise esansiyel olmayan amino asitler veya endojen amino asitler denir. 2. Proteinler Proteinler canlı hücrede en çok bulunan makromoleküllerdir. Hücrenin tüm kısımlarında ve çeşitli görevlerde binlerce farklı protein bulunabilir. Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart amino asitten meydana gelmiştir. Protein yapısında bu amino asitlerin farklı sayı ve dizilimde bulunmaları, bir protein zincirinin sayısız kombinasyonuna olanak tanımakta ve protein çeşitliliğini sağlanmaktadır. a) Proteinlerin Yapısı Her proteinin karakteristik üç boyutlu doğal bir yapısı vardır. Üç boyutlu yapısı bozulmuş (denatüre olmuş) bir protein biyolojik etkinliğini de kaybeder. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarını oluşumundan primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner olarak adlandırılan yapılar sorumludur. Primer Yapı Amino asitlerin birbirine kovalent bağla (peptid) bağlandığı düz zincir yapısıdır. 2 amino asitin peptit bağı ile bağlanması iledipeptit, 3 amino asitin birbiriyle bağlanmasıyla tripeptit, birkaç amino asitin bağlanmasıyla oligopepetit, çok sayıda amino asitin bu şekilde bağlanmasıyla da polipeptitler oluşur (Şekil 3). Şekil 3. Dipeptit yapısı ve peptit bağı Sekonder Yapı Bir proteinin sekonder yapısı, polipeptit zincirlerinin bükülmeler ve katlanmalarla oluşturdukları özgün yapısıdır. Bu bükülme ve katlanmalar, polipeptit zincirindeki amino asitlerin belirli bir düzende hidrojen bağlarıyla bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Zayıf hidrojen bağları bir polipeptit zincirinin içinde oluştuğu gibi komşu polipeptit zincirleri arasında da oluşabilir. -heliks ve -pilili formları sekonder yapılara örnektir.
Üçüncül Yapı İkinci yapıyı oluşturan alfa ve beta konfigürasyonlar üst üste katlanıp yumak şeklinde sarılarak elipsoid bir yapı gösterirler. Oluşan bu yapı proteinlerin tersiyer yapısıdır. Bu durum ise ancak yan zincirlerin reaksiyona girmesi ile mümkündür. Bu etkileşimler zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağları ve Van der Waals etkileşimleridir (Şekil 4). Kuarterner Yapı Primer, sekonder ve tersiyer yapıya sahip polipeptit zincirlerinin daha büyük yapılı agregatlar halinde bir araya gelmesiyle oluşan yapıdır. Her proteinin kuarterner yapısı olmayabilir, fakat molekül ağırlığı 100.000 Da un üzerinde olan bir protein genellikle kuarterner yapıya sahiptir. Bir proteinin kuarterner yapısını oluşturan polipeptit zincirlerinin her birine alt birim veya monomer denir; bu monomerler, hidrojen bağları, Van der Waals etkileşimleri ve iyon bağları etkisiyle polimerize olmuşlardır (Şekil 4). Şekil 4. Proteinlerin 3 boyutlu yapısı
b) Proteinlerin Sınıflandırılması Proteinler sahip oldukları 3 boyutları yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Proteinler yapılarına, kimyasal komposizyonlarına ve işlevsel özelliklerine göre 3 gruba ayrılırlar (Şekil 5). Şekil 5. Proteinlerin sınıflandırılması g) Deney Öncesi Hazırlık 1. Kit kitapçığı öğretmen ve öğrenci kılavuzu olmak üzere 2 kısımdan oluşmaktadır. Uygulama öncesi öğrenci kılavuz bölümü öğrencilere çoğaltılıp verilecektir. 2. Deneyde kullanılan ayırma yöntemlerinde gerçekleşen reaksiyonların bilgisi sadece öğretmen kılavuzuna koyulmuştur. Öğrenci kılavuzunda deney sonunda reaksiyonlar ile ilgili sorular verilerek, öğrencilerin akıl yürütmeleri ve araştırma yapmaları hedeflenmiştir. 3. Deneyde kullanılan liziz solüsyonu 1 ve liziz solüsyonu 2 çözeltileri hücrelerin kimyasal parçalanmasına yönelik hazırlanan kimyasallardır. Çözeltileri oluşturabilmek için liziz solüsyonu 1 ve liziz solüsyonu 2 nin bulunduğu şişeler 75 ml ye distile su ile tamamlanmalıdır. Liziz solüsyonu 1 ve liziz solüsyonu 2 çözeltilerinin bu şekilde kullanıma sunulmasının sebebi raf ömrünü uzatmak ve çözeltilerden maksimum verim alabilmektir.
h) Ön Bilgi Proteinleri biüret tepkimesi ile tanımlama Proteinlerin, biüret reaktifi ile mor renkli kompleks oluşturmaları prensibine dayanır. Biüret reaktifindeki Cu 2+ iyonları, alkali ortamda, en az iki peptit bağı içeren maddelerle mor renkli kompleksler oluştururlar. Proteinlerin yapısında en az iki peptit bağı bulunduğundan proteinler, biüret reaktifindeki Cu 2+ iyonları ile alkali ortamda, mor renkli kompleksler oluşturmaktadır. i) Deneyin Yapılışı Falkon tüpü içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 6 ml liziz solüsyonu 1 çözeltisi ve 6 ml liziz solüsyonu 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika). Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür. Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır. Üzerine pastör pipeti yardımıyla 2 ml biüret ayıracı eklenir ve iyice çalkalanır. Tüp sabit bir yere konularak 30 dakika çökmesi beklenir. Çökme işlemi sonrası üst taraftaki sıvı kısım pastör pipeti yardımıyla başka bir tüpe alınır. Bu sıvı kısım üzerine 4 ml biüret ayıracı pastör pipeti yardımıyla eklenir ve çalkalanır. Tüp sabit bir yerde hareket ettirilmeden 15 dakika bekletilir. Renk değişimi gözlenir. Kontrol amacıyla boş tüp içerisine bir miktar su koyulur. Üzerine pastör pipeti yardımıyla 4 ml biüret ayıracı ilave edilir ve hareket ettirilmeden 15 dakika bekletilir. Renk değişimi gözlenir.
j) Deney Sonuçları Mısır örneği Su Renk Açık mor Renk değişimi yok Mısır bitkisinin fiziksel ve kimyasal parçalanması sonrası açığa çıkan proteinler sebebiyle renk değişimi gözlenirken, su içerisinde protein bulunmamasından dolayı renk değişimi gözlenmemiştir. k) Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları 1. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarının oluşumundan; primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner olarak adlandırılan yapılar sorumludur. Bir proteinin temel işlevini belirleyen esas yapı ise, amino asitlerin peptit bağlarıyla biraraya gelmesiyle karakterize olan primer yapıdır. 2. Üçüncül yapıda hakim olan etkileşimler; zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağları, Van der Walls etkileşimleridir. l) Kaynaklar Biochemistry ;Fifth Edition; Jeremy M.Berg, John L.Tymoczko, Lubert Stryer. Biyokimya II; Prof. Hikmet Geçkil; Şubat 2012. Harper s Illustrated Biochemistry; Twenty-sixth edition; Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell. Lehninger Principles of Biochemistry; Fifth edition; David L. Nelson, Michael M. Cox.
Ad-Soyad: Tarih: Öğrenci Kılavuzu Canlı hücrede en çok bulunan makromoleküller olan proteinler, 20 standart amino asitin farklı sayı ve konfigürasyonda bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Proteinler sahip oldukları 3 boyutlu yapıları sayesinde canlı organizmaların farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Hücre kütlesinin %10-20 sini proteinler oluşturmaktadır. Yapılacak olan deneyde hücre içerisindeki protein varlığını tespit edebilmek için nitel bir yöntem olan biüret ayıracı kullanılacaktır. a) Genel Bilgi 1. Amino Asitler Amino asitler proteinlerin temel yapısal alt üniteleridir. Protein yapısında bulunan 20 amino asitin hepsi ortak bir yapıya sahiptir (aynı karbona bağlı bir karboksil (-COOH) ve amino (NH2) grubu) (Şekil 1). R gruplarındaki farklılıklar, ortak yapısal iskeleti paylaşan amino asitlerin değişik yapıya, farklı elektrik yüküne ve suda değişik oranlarda çözünürlüğe sahip olmasını sağlar. Proteinlerin yapısında yer alan 20 temel (standart) amino asit, R gruplarının yapı ve özelliğine göre sınıflandırılmaktadır(şekil2). Şekil 2. Standart amino asit çeşitleri
Amino asitlerin bazıları vücutta sentezlenebildiği halde bir kısmı doğal olarak sentezlenemez. Vücudun sentezleyemediği ve besin yoluyla dışardan alınması zorunlu olan amino asitlere esansiyel amino asitler veya eksojen amino asitler denir. Vücutta sentezlenebilen ve dışarıdan besinlerle alınması zorunlu olmayanlara ise esansiyel olmayan amino asitler veya endojen amino asitler denir. 3. Proteinler Proteinler canlı hücrede en çok bulunan makromoleküllerdir. Hücrenin tüm kısımlarında ve çeşitli görevlerde binlerce farklı protein bulunabilir. Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart amino asitten meydana gelmiştir. Protein yapısında bu amino asitlerin farklı sayı ve dizilimde bulunmaları, bir protein zincirinin sayısız kombinasyonuna olanak tanımakta ve protein çeşitliliğini sağlanmaktadır. c) Proteinlerin Yapısı Her proteinin karakteristik üç boyutlu doğal bir yapısı vardır. Üç boyutlu yapısı bozulmuş (denatüre olmuş) bir protein biyolojik etkinliğini de kaybeder. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarını oluşumundan primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner olarak adlandırılan yapılar sorumludur. Primer Yapı Amino asitlerin birbirine kovalent bağla (peptid) bağlandığı düz zincir yapısıdır. 2 amino asitin peptit bağı ile bağlanması iledipeptit, 3 amino asitin birbiriyle bağlanmasıyla tripeptit, birkaç amino asitin bağlanmasıyla oligopepetit, çok sayıda amino asitin bu şekilde bağlanmasıyla da polipeptitler oluşur (Şekil 3). Şekil 3. Dipeptit yapısı ve peptit bağı Sekonder Yapı Bir proteinin sekonder yapısı, polipeptit zincirlerinin bükülmeler ve katlanmalarla oluşturdukları özgün yapısıdır. Bu bükülme ve katlanmalar, polipeptit zincirindeki amino asitlerin belirli bir düzende hidrojen bağlarıyla bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Zayıf hidrojen bağları bir polipeptit zincirinin içinde oluştuğu gibi komşu polipeptit zincirleri arasında da oluşabilir. -heliks ve -pilili olmak üzere 2 sekonder yapı bulunmaktadır.
Üçüncül Yapı İkinci yapıyı oluşturan alfa ve beta konfigürasyonlar üst üste katlanıp yumak şeklinde sarılarak elipsoid bir yapı gösterirler. Oluşan bu yapı proteinlerin tersiyer yapısıdır. Bu durum ise ancak yan zincirlerin reaksiyona girmesi ile mümkündür. Bu etkileşimler zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağları, Van der Waals etkileşimleridir (Şekil 4). Kuarterner Yapı Primer, sekonder ve tersiyer yapıya sahip polipeptit zincirlerinin daha büyük yapılı agregatlar halinde bir araya gelmesiyle oluşan yapıdır. Her proteinin kuarterner yapısı olmayabilir, fakat molekül ağırlığı 100.000 Da un üzerinde olan bir protein genellikle kuarterner yapıya sahiptir. Bir proteinin kuarterner yapısını oluşturan polipeptit zincirlerinin her birine alt birim veya monomer denir; bu monomerler, hidrojen bağları, Van der Waals etkileşimleri ve iyon bağları etkisiyle polimerize olmuşlardır (Şekil 4). Şekil 4. Proteinlerin 3 boyutlu yapısı
Öğrenci Kılavuzu d) Proteinlerin Sınıflandırılması Proteinler sahip oldukları 3 boyutları yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Proteinler yapılarına, kimyasal komposizyonlarına ve işlevsel özelliklerine göre 3 gruba ayrılırlar (Şekil 5). Şekil 5. Proteinlerin sınıflandırılması b) Deney Süresince Uyulması Gereken Kurallar Laboratuvar dersinde uyulması gereken genel kurallar dışında kit içerisinde bulunan kimyasal malzemeler eldivensiz kullanılmamalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir müdahale olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Deneyler tamamlandıktan sonra verilen tablolara sonuçları yazılmalı ve üzerinde tartışılmalıdır. Deney sonu verilen sorular işlenen konuyu ve yapılan deneyi pekiştirici niteliktedir. Deney tamamlandıktan sonra soruların çözülmesi ve cevaplarının tartışılması önerilmektedir. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır.
Öğrenci Kılavuzu c) Deneyin Yapılışı Falkon tüpü içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 6 ml liziz solüsyonu 1 çözeltisi ve 6 ml liziz solüsyonu 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika). Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür. Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır. Üzerine pastör pipeti yardımıyla 2 ml biüret ayıracı eklenir ve iyice çalkalanır. Tüp sabit bir yere konularak 30 dakika çökmesi beklenir. Çökme işlemi sonrası üst taraftaki sıvı kısım pastör pipeti yardımıyla başka bir tüpe alınır. Bu sıvı kısım üzerine 4 ml biüret ayıracı pastör pipeti yardımıyla eklenir ve çalkalanır. Tüp sabit bir yerde hareket ettirilmeden 15 dakika bekletilir. Renk değişimi gözlenir. Kontrol amacıyla boş tüp içerisine bir miktar su koyulur. Üzerine pastör pipeti yardımıyla 4 ml biüret ayıracı ilave edilir ve hareket ettirilmeden 15 dakika bekletilir. Renk değişimi gözlenir. Renk Mısır örneği Su d) Sorular 1. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarını oluşumundan sorumlu olan yapılar nelerdir? Proteinin temel işlevinin belirlendiği yapı hangisidir? 2. Üçüncül yapıda hakim olan bağ etkileşimleri nelerdir?