Hafta V PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi Doç. Dr. Hilâl Özdağ
F Đ Z Đ K Đ A L T Y A P I
Reaksiyonda kullanılanlar: P C R I. Kalıp DNA a) PCR degrade olmuş DNA ile de çalışma imkanı veren bir teknik olmakla beraber özellikle hedef amplikonun boyu arttıkça kullanılacak DNA nın bütünlüğü önem kazanır. b) Kullanılacak genomik DNA nın A260/A280 oranının temizliğinin bir göstergesi olarak 1.7-1.9 arasında olması gerekir. c) A260 Nükleik asitlerin maksimum absorbans, d) A280 Proteinlerin maksimum absorbans, e) A230 ise fenolün maksimum absorbans verdiği dalga boyudur. f) +4 (kısa-orta süreli) veya -20oC de (uzun süreli) saklanmalı. Genomik DNA esas itibariyle oda ısısında da stabil olmakla beraber daha güvenilir olan ısı ayarlı soğuk ortamlarda saklanmalıdır.
Reaksiyonda kullanılanlar: P C R II. Düz primer ve ters primer: Tasarım kriterlerine uygun olarak seçilmiş primerler genellikle 18-24 bç arasında olan oligonükleotidlerdir. Primerler üreticilerinden 3 farklı yöntemden biri ile saflaştırılmış olarak alınır. Tuzdan arındırma (desalting)- En ucuz yöntemdir, ancak özellikle primerler dizi analizi benzeri uygulamalarda kullanılacaksa bu yöntem tercih edilmemelidir. Kolon bazlı saflaştırma (OPC/HPSF benzeri)- Çok temiz sonuç veren tuzdan arındırma yöntemine göre pahalı ancak HPLC ye göre ekonomik olan bir seçimdir. HPLC- En başarılı saflaştırma yöntemi olmakla beraber maliyeti en yüksek olan seçimdir. Genellikle liyofilize halde gelen primerler steril ortamda 100 pmol/ul olacak şekilde sulandırıldıktan sonra bu stoktan 10 pmol/ul lik bir dilüsyon hazırlanıp reaksiyonlarda kullanılabilir.
Reaksiyonda kullanılanlar: P C R III. dntp: Eşit konsantrasyondaki datp, dgtp, dctp ve dttp nin karışımıdır. Karışım halinde veya ayrı ayrı olarak satın alınabilir. Genellikle 100 mm konsantrasyonda satılan dntp karışımlarının stok halinde 10 mm konsantrasyonda olması tercih edilir. Herhangi bir kontaminasyon riskine karşı kullanıma açılan dntp miktarı 200-300 ul üzerinde olmamalıdır. Bu amaçla dntp hazır olarak geldiğinde veya laboratuvarda hazırlandığında küçük hacimlere bölünerek saklanmalıdır. IV. MgCl 2 : Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli kofaktör olarak görev alan Mg iyonunu sağlar. Genellikle 25 veya 50 mm stok konsantrasyonda gelir. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 0.8-3 mm arasında değişir. V. 10X buffer: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli stabil ph şartlarını sağlar. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 1X olacak şekilde kullanılır.
Reaksiyonda kullanılanlar: P C R VI. Taq DNA Polimeraz: Thermus aquaticus adlı termofil bir bakteriden elde edilen ve PCR reaksiyonlarında kullanılan bu DNA polimerazların hata oranı 1x10-4 dir. Enzimler protein oldukları için denatüre olma riski taşırlar, ayrıca ortam şartları aktiviteleri üzerine etki eder. Bu nedenle düşük ısıda saklanmaları gerekir. Ancak düşük ısıda donacakları için denatüre olurlar. Bunu engellemek için enzim stokları gliserol içinde gelir ve -20 o C de saklanır. -80 o C de gliserol de donacağı için Taq pol ın -80 o C de saklanması tercih edilmez. Amplifiye edilecek bölge klonlanacaksa hatasız olması istenir. Bu nedenle hata oranı daha az olan enzimler tercih edilir. a. Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus tan izole edilmiştir hata oranı 1.5x10-6 b. Vent polimeraz Thermococcus litoralis ten izole edilmiştir hata oranı Taq ile Pfu arasında seyreder.
P C R Örnek Reaksiyon (50 ul toplam hacim için) Stok Konsantrasyon/Miktar Son Konsantrasyon Kalıp DNA 25-100 ng genomik DNA 0.5-2 ng/µl Düz Primer 10 µm;10pmol/µl 0.2 pmol/µl Ters Primer 10 mm;10pmol/µl 0.2 pmol/µl dntp 10 mm 200 µm MgCl 2 25 mm 0.8-3 mm 10X buffer 10X 1X Taq DNA Polymeraz 5 U/ µl 0.3 µl Toplam 50 µl (steril deionize su ile hacim tamamlanır)
P C R Neredeyse hiçbir zaman tek bir reaksiyon kurulmadığı için muhakkak bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Tampon, primerler, MgCl 2, dntp, Taq pol ve sudan oluşan Pipetleme hatalarını engellemek üzere karışım olması gerekenin %10 fazlası olacak şekilde hazırlanır. Negatif kontrol Kalıp DNA olmayan bir tüp hazırlanır. Örnekler arası kontaminasyonu kontrol etmek üzere Pozitif kontrol PCR da kullanılan reaktiflerin dolayısıyla sistemin işlediğinden emin olmak için çalıştığı bilinen bir DNA ve primer seti ile pozitif kontrol reaksiyon setine dahil edilmelidir.
Genel Problemler Bant yok veya zayıf. Kontaminasyon var. Primer dimer oluşumu var. Özgün olmayan bant(lar) var.
Kontaminasyon Pre ve post PCR alanları muhakkak birbirinden ayrılmalı. Mümkünse PCR laminar akışlı kabin içinde kurulmalı. Bütün reaksiyon setlerinde muhakkak negatif kontrol bulunmalı Reaktifler küçük hacimlere bölünüp saklanmalı. Problem yaşandığı takdirde atılmaları mümkün olduğunca ekonomik olmalı. Filtreli uç kullanılmalı ki pipetler kontamine olmasın.
Bant yoksa veya zayıf ise Reaksiyona koymanı gereken bütün reaktifleri ilave ettiniz mi? Lab defterinizi kontrol edin. Reaksiyonu tekrarlayın. Reaktiflerin konsantrasyonları doğru mu? Kalıp Primer Taq MgCl 2 Hatalı primerler Dizileri kontrol edin. Yeni sentez veya yeni tasarım deneyin.
Bant yoksa veya zayıf ise Kötü kalıp Agaroz jelde kalıp DNA yı kontrol edin. DNA fazla degrade olabilir. Kalıp DNA PCR inhibitörü içeriyor olabilir (fazla tuz, fenol gibi). Optimal olmayan PCR şartları Bağlanma ısısını düşürün. MgCl2 konsantrasyonunu arttırın.
Özgün olmayan amplifikasyon var ise Özgün olmayan amplifikasyonu saptamak için Amplikonları agaroz jelde yürütün. Ürünün hedeflenen boyda olup olmadığını kontrol edin. Bunu saptamak için bir moleküler ağırlık standardı kullanın (100 bç, 1 kb merdiven,λ/hindiii gibi) Özgün olmayan amplifikasyonu ortadan kaldırmak için Amplifikasyon şartlarını sıkılaştırın Bağlanma ısısını arttırın MgCl2 konsantrasyonunu düşürün Termal döngü koşullarını değiştirin Uzama sürelerini ayarlayın Döngü sayısını azaltın Farklı primerler deneyin
PCR optimize ederken PCR son derece hassas bir işlemdir. Herbir primer çiftinin ayrı ayrı optimizasyonu gerekir. Farklı PCR cihazlarının (marka ve/veya model) kullanımı PCR ın sonucunu etkiler. Optimize edilmesi gerekenler: Konsantrasyonlar MgCl 2 konsantrasyonu Primer ve kalıp DNA konsantrasyonu Fazla kalıp PCR ı engelleyebilir. Kalıp gerekiyorsa seyreltilip kullanılmalıdır. Termal döngü şartları Bağlanma ısısı Primer çiftinin T m derecesine göre ayarlanır. Uzama süreleri Amplikonun uzunluğu dikkate alınır.
PCR optimize ederken Gradient PCR cihazları optimizasyon sürecini kolaylaştırır ve kısaltır Bu tip cihazlarda 96 lık veya 48 lik bloğun herbir 8 lik kolonuna farklı bağlanma ısıları uygulamak mümkündür.
PCR optimize ederken Touch-down (Đnen) PCR Özgün olmayan amplikasyondan yalnızca bağlanma ısısının arttırılması ve MgCl2 konsantrasyonunun düşürülmesi ile kurtulunamıyorsa: Touch-down PCR denenir. Yüksek bağlanma ısısı ile başlanır. (mesela 70 o C) Az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması beklenir. Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür. Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp popülasyondaki oranı arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizi çoğalacaktır.
PCR Destek Kuvvetler DMSO %2-10 Fazlası Taq aktivitesini düşürür. Kalıp DNA nın oluşturduğu ikincil yapıları çözer. Özellikle GC oranı yüksek hedef bölgelerin çoğaltılması için kullanılabilir. Betain 1-1.7 M DMSO ile aynı amaçla kullanılabilir. Formamid %1-5 Mümkün olduğunca az kullanılmalı. Đkincil yapıların önlenmesinde kullanılabilir. Non iyonik deterjanlar (Tween 20-NonIdet P40- TritonX) %0.1-1 arası kullanılabilir. %0.1 Taq ı stabilize eder ancak özgün olmayan amplifikasyonu teşvik edebilir. %0.5 kullanımı daha garantilidir.
PCR optimize ederken 7 deaza-2 deoksi guanozin. Stabil ikincil yapı oluşturan GC oranı çok yüksek hedef bölgelerde amplifikasyonu dgtp ile 1:3 oranında ilave edilmek suretiyle verimli bir şekilde sağlar. BSA (bovine serum albumin) Eski DNA materyellerinden yapılan amplifikasyonlarında kullanılabilir. PCR inhibitörlerinin etkisini azaltır.
Optimizasyon Örnekleri
Exon 1(1509 bç): Mg:2,2,5,3 mm, %5 DMSO, 60ºC 2mM 2,5mM 3mM
Ex 2(213 bç), Ex 1I(300bç), Ex 17I(300bç):Mg:1,1,5,2mM,50,55,60ºC 1,5 mm 1 mm 2 mm 1 mm 1,5mM 2 mm 50 55 60 50 55 60 50 55 60 50 55 60 50 55 60 50 55 60 50 1 mm 1,5 mm 2 mm 55 60 50 55 60 50 55 60
Ex 1I (300 bç): ilk 12 örnek 60-63 ºC,1,1,5,2 mm Mg 60 61 62 63 64 65 55 60 63 65 1mM 1,5m M 2mM 2mM
Ex1(1509bç): Mg:3mM, %5 DMSO, 60ºC
Ex 1I(300 bç): Ex1 den 1/10 oranında sulandırılmış ve Mg: 2-3 mm, 50,55,60ºC 2m 2,5m 3m M M M 50 50 55 60 50 55 60 55 60