KABAK LİFİ (Luffa cylindrica) İLE TUTUKLANMIŞ RHİZOPUS ORYZAE DEN LİPAZ ÜRETİMİ Ş. BULUT, M.Ş.TANYILDIZI, V. SELEN, M. ELİBOL, D. ÖZER Fırat Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 23119, Elazığ ÖZET Yapılan çalışmada, doğal bir destek malzemesi olan kabak lifine tutuklanmış Rhizopus oryzae ile lipaz üretimi incelenmiştir. Glikoz ve zeytinyağı gibi karbon kaynaklarının kullanımının ve düşük glikoz konsantrasyonunda zeytinyağının indükleme etkisinin, lipaz üretimine etkileri araştırıldı. Karbon kaynağı olarak glikozun kullanıldığı ortamda maksimum lipaz aktivitesi, 2 g/l glikoz konsantrasyonunda 133 µmol/l.dk, zeytinyağının kullanıldığı ortamda maksimum aktivite, 15 g/l zeytinyağı konsantrasyonunda 62 µmol/l.dk olarak bulundu. Zeytinyağının indükleme etkisinin incelendiği ortamda, maksimum aktivite, 5 g/l glikoz konsantrasyonuna 1 g/l zeytinyağı ilave edildiği ortamda 589 µmol/l.dk olarak ölçüldü. Anahtar Kelimeler: Lipaz; Proses Şartları; Rhizopus oryzae; Tutuklu Mikroorganizma; Zeytinyağı. GİRİŞ Lipazlar, gliserin ve yağ asitlerinden oluşan esterleri hidroliz eden enzimlerdir. Trigliseridlerin di- ve monogliseridlere, gliserin ve yağ asitlerine hidrolizini; ayrıca belirli şartlar altında ters yönde gelişen ester ve transesterifikasyon reaksiyonlarını katalizlerler. Fermantasyon yolu ile mikroorganizmalardan çok kolay bir şekilde elde edilebilirler [1,2] ve bu şekilde elde edilen mikrobiyal kaynaklı lipazlar, gıda, deterjan, ilaç, kozmetik ve deri işleme gibi birçok endüstriyel proseste kullanılmaktadır [3,4]. Lipaz üretimine olan geniş ilginin bir çok sebebi mevcuttur. Birincisi, sadece hiroliz olayını değil, aynı zamanda esterifikasyon [5] ve transesterifikasyon [6] olaylarını da katalizleyebilmeleri; ikicisi, aktivitelerini ve yapılarını organik çözücülerde muhafaza edebilmeleri [7]; üçüncüsü, kimyasal katalizlerle kıyaslandığında, daha fazla substrat spesifikliğine, regio- ve enentio-seçiciliğine sahip olmaları ve ayrıca çok daha düşük sıcaklık ve basınç değerlerinde çalışmaları sayılabilir. Rhizopus oryzae lipaz üretimini gerçekleştiren mold türü bir mikroorganizmadır. Lipazların birçok ticari proseste geniş bir kullanım alanının bulunması, mikrobiyal lipaz üretimi üzerinde yapılan araştırmaları hızlandırmıştır. Literatürde mikrobiyal lipaz üretimi ile ilgili birçok çalışma olup, bunların büyük bir kısmını serbest mikroorganizmalarla veya jel içinde tutuklanmış mikroorganizmalarla yapılan çalışmalar oluşturmaktadır[8,9]. Tutuklanmış mikroorganizmaların kullanımı, endüstriyel fermantasyon sistemlerinde üretim verimini artırdığı gibi fermantasyon sonrası uygulanan alt akım işlemlerini de daha basit ve ekonomik hale getirmektedir. Bu çalışmada, Rhizopus oryzae fiziksel adsorbsiyonla doğal bir destek malzemesi olan kabak lifine tutuklanmış, bazı başlangıç ve çevre faktörlerinin lipaz üretimi üzerine etkileri incelenmiştir. DENEYSEL Çalışmada kullanılan Rhizopus oryzae NRRL 395 agarlı ortamda 3 o C de 72 saat süren bir inkübasyona tutulmuş ve daha sonra 4 o C de muhafaza edilmiştir. İnokulasyon işlemi için 1 ml steril destile su petri kaplarına ilave edilmiş ve platin öze ile sporların agar yüzeyinden
dislokasyonu gerçekleştirilmiştir. İçerisinde 5 ml besi ortamı ve kabak lifi destek malzemesi bulunan 25 ml lik erlenler 5 µl (~1x1 8 spor/ml) spor çözeltisi ile inokule edilmiştir. Daha sonra erlenler 15 rpm ve 3 o C de çalışan orbital çalkalayıcıya yerleştirilmiştir. Kullanılan besi ortamının içeriği: glikoz (2.5-3 g/l), MgSO 4.7H 2 O.2 g/l, K 2 HPO 4.5 g/l, KH 2 PO 4.5 g/l, yeast extract 2 g/l, zeytinyağı (1-15 g/l) ve ph=6 dır. Çalışmada karbon kaynağı olarak glikozun ve zeytinyağının kullanımının lipaz üretimi üzerine etkisi, ikinci aşamasında ise farklı glikoz konsantrasyonlarında zeytinyağının indükleme etkisi incelenmiştir. Tutuklamada kullanılan destek malzemesi 55x2x.8 mm boyutlarında hazırlanmış, muhtemel toksik kimyasalları uzaklaştırmak için iki kez saf su içerisinde otoklavlanmıştır. Daha sonra destek malzeme paslanmaz çelik tel ile L-şeklinde erlenlere sabitleştirilmiştir. Lipaz aktivitesinin ölçümü için, alınan numuneler blenderda 5 dakika süre ile homojenize edilmiştir. Daha sonra filtrasyon işleminden sonra ele geçen süzüntü lipaz kaynağı olarak kullanılmıştır. Aktivite %1 (v/v) tribütirinin kullanıldığı ph-stat sisteminde titrasyon yöntemi ile tayin edilmiştir. SONUÇLAR Mikroorganizmalar immobilize haldeyken farklı karakterler gösterebileceklerinden, Rhizopus oryzae den lipaz üretiminde fiziksel adsorpsiyonla kabak lifi ile tutuklanmış mikroorganizmalar kullanılmıştır. Mikroorganizmanın tutuklu olarak kullanımı tercih edildikten sonra, lipaz üretimi üzerine çeşitli proses şartlarının etkisi incelenmiştir. Glikoz ve zeytinyağı gibi karbon kaynaklarının kullanımının ve zeytinyağının indükleme etkisinin enzim üretimi üzerine etkileri araştırılmıştır. Fermantasyon proseslerinin çoğu substrat seçimi ve konsantrasyonundan önemli derecede etkilenebilmektedir. Bunu incelemek amacıyla 2.5-3 g/l arasında değişen farklı glikoz konsantrasyonlarında çalışılmış ve glikoz konsantrasyonunun lipaz üretimine etkisi Şekil-1 de verilmiştir. En yüksek enzim aktivitesi, 2 g/l glikozlu ortamda 133 µmol/l.dk olarak bulunmuştur. 16 14 12 8 6 4 2 2,5 5 7,5 1 15 2 25 3 Şekil.1. Maksimum aktivitenin glikoz konsantrasyonu ile değişimi.
Grubumuzca daha önceden yapılan çalışmalarda, zeytinyağının R.oryzae ile lipaz üretimi için uygun bir substrat olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmanın bu aşamasında, tutuklanmış haldeki mikroorganizma için karbon kaynağı olarak zeytinyağı seçilmiştir. Bu nedenle, zeytinyağının lipaz üretimi üzerine etkisini incelemek amacıyla, zeytinyağının 1-15 g/l arasında değişen farklı konsantrasyonlarında besiyerleri hazırlanmıştır. Substrat konsantrasyonun maksimum enzim aktivitesine etkisi Şekil.2 de verilmektedir. Şekilden de görüldüğü gibi maksimum enzim aktivitesi, substrat konsantrasyonu ile önemli bir değişim göstermemiştir. En yüksek lipaz aktivitesi, 15 g/l zeytinyağı konsantrasyonunda 62 µmol/l.dk olarak bulunmuştur. Çalışmanın diğer aşamasında, maksimum lipaz aktivitesinin gözlendiği 2 g/l glikoz ve düşük bir glikoz konsantrasyonu olduğu için 5 g/l glikoz konsantrasyonlarındaki ortamlarda aktiviteyi arttıracağı düşüncesiyle,.5-2 g/l zeytinyağı ilavesiyle indükleme etkisini incelemek amaçlanmıştır. Şekil.3 de 5 g/l glikoz konsantrasyonu için ve Şekil.4 de 2 g/l glikoz konsantrasyonu için zeytinyağının indükleme etkisi verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi, çalışmanın bu aşaması için, en yüksek lipaz aktivitesi 5 g/l glikoz konsantarsyonuna 1 g/l zeytinyağının ilave edildiği ortamda, 589 µmol/l.dk olarak bulunmuştur. 2 g/l glikoz konsantrasyonunda zeytinyağının indükleme etkisinin incelendiği çalışmalarda, zeytinyağının aktivite üzerine olumlu bir etkisinin olmadığı, aktiviteyi çok fazla değiştirmediği gözlenmiştir. Sonuç olarak kabak lifi ile tutulanmış R.oryzae den lipaz üretiminin incelendiği çalışmamızda, maksimum aktivite 15 g/l zeytinyağı konsantrasyonunda 62 µmol/l.dk olarak bulunmuştur. Ancak 5 g/l glikoz ve 1 g/l zeytinyağı ile oluşturulan ortamda maksimum aktivitenin 589 µmol/l.dk olmasına karşılık, düşük substrat konsantrasyonu gerektirdiğinden daha verimli olduğu sonucuna varılmıştır. 7 6 5 4 3 2 1 2,5 5 1 15 Şekil.2. Maksimum aktivitenin zeytinyağı konsantrasyonu ile değişimi.
7 6 5 4 3 2 1 2 3 4 Şekil.3. Glikoz ve zeytinyağının kullanıldığı ortamda enzim aktivitesindeki değişim. (1: 5 g/l glikoz, 2: 5 g/l glikoz +.5 g/l zeytinyağı, 3: 5 g/l glikoz + 1 g/l zeytinyağı, 4: 5 g/l glikoz + 2 g/l zeytinyağı) 16 14 12 8 6 4 2 1 2 3 Şekil.4. Glikoz ve zeytinyağının kullanıldığı ortamda enzim aktivitesindeki değişim. ( 1: 2 g/l glikoz, 2: 2 g/l glikoz +.5 g/l zeytinyağı, 3: 2 g/l glikoz + 1 g/l zeytinyağı) KAYNAKLAR [1] Simoes, D.C.M., McNeill, D., Kristiansen, B., Mattey, M., Extracellular esterase activity from Bacillus stearothermophilus, Biotechnol. Lett., 1995, 16, 953
[2] Ferrer, P., Sola, C., Lipase production by immobilized Candida rugosa cells, Appl. Microb. Biotechnol., 1992, 37, 737 [3] Valero, F., Ayats, F., Lopez-Santin, J., Poch, M., Lipase production by Candida rugosa: fermentation behaviour, Biotechnol. Lett., 1988, 1, 741 [4] Pokorny, D., Friedrich, J., Cimerman, A., Effect of nutritional factors on lipase biosynthesis by Aspergillus niger, Biotechnol. Lett., 1994, 16, 363 [5] Schmitt-Rozieres, M., Vanot, G., Deyris, V., Comeau, L,C., Borago officinalis oil: Fatty acid fractionation by immobilized Candida rugosa lipase, J., Amer. Oil Chem. Soc., 1999, 76, 557 [6] Osorio, N.M., Ferreira-Dias, S., Gusmao, J.H., Fonseca, M.M.R., Response surface modeling of the production of ω-3 polyunsaturated fatty acids-enriched fats by a commercial immobilized lipase, J. Molec. Cat. B, 21, 11, 677 [7] Khmelnitsky, Y.L., Biocatalysis in nonaqueous solvents, Curr. Opin. Chem. Biol., 1999, 3, 47 [8] Rapp P,Bachaus S. Formation of extracellular lipase by filamentous fungi, yeasts and bacteria. Enzyme Microbiology and Technology 1992; 14: 983-943. [9] Özer D, Elibol M. Effects of some factors on lipase production by Rhizopus arrhizus. Journal of Food Science and Technology 2; 37: 661-664.