EK-8 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU OTOZOMAL RESESİF SAĞIRLIK GEN LOKÜSLERİNİN TÜRK AİLELERDE TARANMASI VE MUTASYON ANALİZİ Proje Yürütücüsünün İsmi Doç.Dr. Mustafa Tekin 2003-08-09-103 Başlama Tarihi: 26/02/2003 Bitiş Tarihi: 26/02/2005 Rapor Tarihi 7.2.2005 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2005

I.Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Otozomal Resesif Sağırlık Gen Loküslerinin Türk Ailelerde Taranması ve Mutasyon Analizi Genetik nedenli işitme kaybı yaklaşık 2000 canlı doğumda bir görülmektedir. Bunun en az üçte ikisinde işitme kaybı dışında bulgular bulunmamakta ve sendromik olmayan işitme kaybı olarak adlandırılmaktadır. Bu olguların yaklaşık %80 inde otozomal resesif tipte kalıtım görülmektedir. Bugüne değin 100 den fazla kromozom bölgesi sendromik olmayan sağırlık ailelerinde tespit edilmiş ve bu bölgelerde 21 dominant, 22 resesif ve 1 X e bağlı sağırlık geni ortaya çıkarılmıştır. Bu genler içinde GJB2 (connexin 26) mutasyonları beyaz ırkta en önemli yeri tutmaktadır. Bu çalışmada işitme kaybı nedeni olan GJB2 ve mitokondrial A1555G mutasyonları olmayan 12 ailede toplam 11 işitme kaybı gen bölgesine bağlantı olup olmadığına bakılmıştır. Ayrıca 117 işitme engelli probandda CLDN14 geni mutasyonlar için taranmıştır. Araştırmanın birinci kısmında üç ailede OTOF gen bölgesi için birlikte kalıtım olduğu gösterilmiş, bu ailelerden birinde OTOF geninde daha önce tanımlanmamış c.3033t>c(p.leu1011pro) mutasyonu saptanmıştır. CLDN14 geni mutasyon taramasında bir probandda c.11c>t (p.t4m) değişikliği heterozigot olarak, bir probandda da c.243c>t (p.r81r) değişikliği homozigot olarak bulunmuştur. Her iki değişiklik de daha önce polimorfizm olarak bildirilmiştir. Dolayısıyla Türk toplumunda CLDN14 gen mutasyonları önemli bir işitme kaybı nedeni olarak düşünülmemiştir. Screening for known deafness loci and mutation analysis in Turkish families with autosomal recessive deafness Genetic factors are responsible for hearing impairment in 1/2000 births. In two thirds of these children there is no associated finding, which is referred to as nonsyndromic deafness. Autosomal recessive inheritance is observed in approximately 80% of these cases. More than 100 loci for nonsyndromic deafness have been mapped on human chromosomes and a gene has been identified at 21 dominant, 22 recessive and 1 X-linked loci. Mutations in GJB2, encoding connexin 26, are the most commonly identified cause in many populations. In this study we searched for linkage for 11 previosly identified loci in 12 Turkish families with autosomal recessive nonsyndromic deafness in which mutations in GJB2 and mtdna (A1555G) were found to be negative. Additionally, 117 probands with nonsyndromic deafness were investigated for mutations in the CLDN14 gene. Three families showed segregation of microsatellite marker genotypes of OTOF with autosomal recessive deafness. Further screening of OTOF revealed a novel mutation, c.3033t>c(p.leu1011pro) in one family. In the second part of the study, no disease causing mutations were identified in CLDN14 in 117 probands. The c.11c>t (p.t4m) alteration was found in one proband in heterozygous state and the c.243c>t(p.r81r) change was found in one proband in homozygous state. Both changes have been reported as polymorphisms previously. In conclusion, mutations in the CLDN14 gene are not a major cause of deafness in the Turkish population. Anahtar kelimeler: Bağlantı, işitme kaybı, OTOF, otozomal resesif, sağırlık

II. Amaç ve Kapsam Genetik nedenli işitme kaybının sıklığı 2000 canlı doğumda birdir [Tekin ve ark., 2001a]. Genetik temeli kesin olarak belirlenmiş olgular sendromik ve sendromik olmayan olarak ikiye ayrılır. İşitme kaybına başka hiçbir patolojik organ veya laboratuar bulgusunun eşlik etmediği durumda sendromik olmayan işitme kaybı söz konusudur. Genetik nedenli işitme kayıplarının yaklaşık %70 i bu gruba girmektedir. Geriye kalan %30 luk grupta işitme kaybı dışında bulgular olmakta ve bu bulgular toplu olarak değerlendirildiğinde bir sendrom tanısı konabilmektedir [Tekin ve ark., 2001a]. Bugüne değin bulguları arasında işitme kaybı olan yüzlerce sendrom tanımlanmıştır [http://ncbi.nlm.nih.gov/omim]. Bunların büyük kısmı klasik Mendel tipi kalıtım biçimlerine uymakta bir kısmı ise mitokondrial kalıtım göstermektedir. Sendromik olmayan grupta da benzer biçimde Mendel tipi kalıtım biçimlerinden birisine veya mitokondrial kalıtıma uyan geçiş biçimleri tanımlanmıştır. Otozomal resesif kalıtım sendromik olmayan grupta yaklaşık %80 görülmektedir. Otozomal dominant ve X e bağlı kalıtım biçimleri sırayla %15-20 ve %1-2 olguda saptanır. Mitokondrial kalıtımın sendromik olmayan işitme kaybı içindeki yeri etnik gruplarda göre değişmekle birlikte %1 ile 20 arasındadır [Tekin ve ark., 2001a]. Sendromik olmayan işitme kayıplarının genetiğini çalışmak iki nedenle büyük güçlük göstermektedir: 1. İç kulağın karmaşık yapısı ve işlevleri yüzlerce farklı proteinin görev almasıyla sağlanabilmekte ve bunlardan herhangi birindeki sorun sağırlıkla sonuçlanabilmektedir. En az 100-150 farklı proteini kodlayan gendeki mutasyonların sendromik olmayan işitme kaybına yol açtığı tahmin edilmektedir. 2. Sendromik olmayan işitme kayıplı aileleri fenotipik olarak gruplara ayırmak son derece güçtür. Dolayısıyla birçok farklı genetik sorun sadece işitme kaybı ile kliniğe yansımaktadır. Bu iki zorluk uzun yıllar işitme kaybının genetik özelliklerinin aydınlatılmasına engel olmuştur. Ancak 1990 lı yılların başında büyük ve akraba evliliği olan sağırlık ailelerinin Pakistan, Hindistan, Lübnan ve Kuzey Afrika ülkelerinde ortaya çıkarılması çok önemli adımların atılmasına ön ayak olmuştur. Bu aileler sayesinde tek bir ailede genom boyu bağlantı analizi yapılabilmiş ve büyük bir hızla sağırlık gen lokusları ortaya çıkarılmıştır. Bu hızlı süreç 1997 de ilk sendromik olmayan işitme kaybı geni olan GJB2 (connexin 26) nin saptanmasıyla yeni bir ivme kazanmıştır. Bugüne değin 100 den fazla kromozomal lokus sendromik olmayan sağırlık ailelerinde tespit edilmiştir [http://webhost.ua.ac.be/hhh/]. Bu bölgerden 21 inde otozomal dominant, 22 sinde otozomal resesif ve birinde de X e bağlı kalıtım biçimlerine uyan bir veya birden fazla hastalık yapıcı mutasyon tespit edilmiştir. Burada dikkat çekici bir nokta bulunan genlerin büyük kısmının izole ailelerde bulunmuş olmasıdır. Sendromik olmayan işitme kaybı gen bölgeleri "DFN" olarak kısaltılır. Bu üç harften sonra A geliyorsa bu otozomal dominant, B geliyorsa otozomal resesif kalıtımı gösterir. X e bağlı olanda ise A veya B gelmez. Bugüne değin bulunmuş sendromik olmayan işitme kaybı genleri Tablo 1 de görülmektedir. Tabloda da görüldüğü gibi aynı gendeki mutasyonlar hem dominant hem de resesif kalıtılan sendromik olmayan işitme kaybına neden olabilir (örneğin MYO7A ve GJB2 genleri). Ayrıca bazı genlerdeki mutasyonlar hem sendromik hem de sendromik olmayan işitme kaybı nedeni olabilir (MYO7A: Usher sendromu; PDS/SLC26A4: Pendred sendromu). Sendromik olmayan işitme kaybı nedeni olan genler içinde en önemli yeri GJB2 tutmaktadır. Akdeniz çevresi, Kuzey Avrupa ve Kuzey Amerika kökenli otozomal resesif doğuştan işitme kayıplı olguların yaklaşık yarısı GJB2 genindeki bir mutasyona bağlı olarak ortaya çıkmaktadır [Cohn ve ark., 1999; Green ve ark., 1999; Gasparini ve ark., 2000]. 13q11.12 kromozomal bölgesinde bulunan GJB2 bir "gap junction" proteini olan connexin 26 yı kodlamaktadır. Bugüne kadar bu gen içinde 100 den fazla mutasyon bildirilmesine rağmen yalnızca bir mutasyon (35delG) beyaz ırkta tüm mutasyonların yaklaşık % 60-70 ini kapsamaktadır. Bu mutasyonun taşıyıcılığı Avrupa kökenlilerde %2 ile 4 arasındadır [Gasparini ve ark., 2000]. Sağlıklı Türk

toplumunda ise bizim çalışmamızda %1.8 olarak bulunmuştur [Tekin ve ark., 2001b]. Başka bir mutasyonun (167delT) Ashkenazi Yahudilerinde taşıyıcılık sıklığı %3-4'tür [Morell ve ark., 1998]. Türkiye deki mutasyonların dağılımı Anadolu nun tarihsel özelliklerini yansıtmaktadır [Tekin ve ark, 2001b; Tekin ve ark., 2003a; Tekin ve ark., 2005]. GJB2 genindeki bazı mutasyonlar otozomal dominant kalıtılan sendromik olmayan işitme kaybı nedeni de olabilir [Tekin ve ark., 2001c ]. CLDN14 geni claudin14 adı verilen Corti organında görevli bir tight junction proteinini kodlamaktadır. Bu gende iki Pakistanlı otozomal resesif işitme kaybı ailesinde mutasyonlar gösterilmiştir [Wilcox ve ark., 2001]. Aynı gende henüz dünyada başka bir mutasyon tanımlanmamıştır. Mitokondrial DNA daki 12S rrna geninde bulunan A1555G mutasyonu da sendromik olmayan işitme kaybı yapmaktadır. Bu mutasyonun Türk işitme kayıplıların küçük bir kısmında bulunduğu tarafımızdan gösterilmiştir [Tekin ve ark., 2003b]. Tablo 1: Bulunmuş sendromik olmayan işitme kaybı genleri Dominant Resesif X linked Mitochondrial DFNA1: DIAPH1 DFNB1: GJB2/GJB6 DFN3: POU3F4 12SrRNA DFNA2: GJB3 (Cx31)/KCNQ4 DFNB2: MYO7A trnaser(ucn) DFNA3: GJB2 (Cx26)/GJB6 (Cx30) DFNA4: MYH14 DFNA5: DFNA5 DFNA8-12: TECTA DFNA9: COCH DFNA10: EYA4 DFNA11: MYO7A DFNA13: COL11A2 DFNA14: WFS1 DFNA15: POU4F3 DFNA17: MYH9 DFNA20/26: ACTG1 DFNA22: MYO6 DFNA28:TFCP2L3 DFNA36:TMC1 DFNA48:MYO1A CRYM DFNB3: MYO15 DFNB4:SLC26A4 DFNB6:TMIE DFNB7/11: TMC1 DFNB8/10: TMPRSS3 DFNB9: OTOF DFNB12: CDH23 DFNB16:STRC DFNB18:USH1C DFNB21: TECTA DFNB22: OTOA DFNB23:PCDH15 DFNB29: CLDN14 DFNB30:MYO3A DFNB31:WHRN DFNB36: ESPN DFNB37:MYO6 PRES GJA1 (Cx43)

Sendromik olmayan işitme kayıplarıyla ilgili çalışmalarda sağlanan en önemli sonuçlardan birisi farklı toplumlarda işitme kaybına neden olan genetik özelliklerin belirgin farklılık gösterdiğinin bulunmasıdır. Türk işitme kayıplı ailelerde farklı genetik bölgelerin sıklığının araştırıldığı çalışmaların önemli bir kısmı tarafımızdan yapılmış ve GJB2, SLC26A4 ve mtdna 12SrRNA mutasyonlarının sıklığıyla ilgili veriler ortaya konmuştur [Tekin ve ark, 2001b; Tekin ve ark., 2003a; Tekin ve ark., 2003b; Tekin ve ark., 2003c; Tekin ve ark., 2003d; Tekin ve ark., 2005]. Ancak diğer genlerin katkısıyla ilgili Türkiye den bir veri yayınlanmamış, yayınlanan veriler çok az sayıda ailenin Batı ülkelerinde taranmasıyla elde edilmiştir Türkiye de işitme kaybı çok önemli bir sağlık sorunudur. Bunun en iyi kanıtlarından birisi Türkiye nin değişik bölgelerinde bulunan 48 yatılı işitme engelliler ilköğretim okulu ve 8 yatılı lisede binlerce öğrencinin bulunmasıdır. Bu öğrencilerin önemli bir kısmında genetik nedenlerin bulunduğu bugüne kadar ortaya konulan verilerde açıkça görülmektedir. Ayrıca akraba evliliğinin yüksek oranda olması ve ailelerin belli bölgelerde izole kalmasıyla nadir görülen otozomal resesif sağırlık genlerinin Türkiye deki dağılımının tanımlanması önem kazanmaktadır. Bu araştırmanın amaçları: Türk toplumunda işitme kaybının genetik özelliklerinin daha iyi aydınlatılabilmesi için, 1.GJB2 geninde mutasyon saptanamayan ve mitokondrial A1555G mutasyonu olmayan otozomal resesif işitme kayıplı ailelerde bilinen bir grup resesif işitme kaybı lokusunun taranması ve bu lokuslardaki genetik değişikliklerin Türk toplumu için öneminin ortaya çıkarılması. 2. CLDN14 geninde mutasyon analizi yapılarak bu gendeki mutasyonların Türk toplumundaki sıklığının ortaya çıkarılması. III.Materyal ve Yöntem Bu çalışmaya daha önce mitokondrial A1555G ve GJB2 genindeki mutasyonlar taranmış ve bulunamamış 12 aile dahil edilmiştir (Şekil 1). Hastalardan DNA örnekleri alınmadan önce Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından 14.11.2001 tarih ve 30817 sayı ile kabul edilen bilgilendirilmiş onay formları imzalatılmıştır. Aşağıdaki aileler diğerlerinden farklılık göstermektedir: 035 numaralı ailede işitme engelli çocukların odyogramlarında U şekli gözlenmektedir. Daha önce benzer odyogramlar TECTA geni mutasyonlarında gözlenmiştir. 098 numaralı ailede işitme engelli iki çocukta, işitme engeli olmayan kardeşte ve anne babada mitokondrial DNA da 961delC(n)insT mutasyonu saptanmıştır. Daha önce aminoglikozid toksisitesine neden olduğu gösterilen bu mutasyonun resesif kalıtım örneği gösteren bu ailede bulunması resesif bir modifiye edici bölgenin bulunduğunu düşündürmüştür. 166 numaralı ailede işitme engelli iki çocuğun temporal kemik görüntülemesinde koklea agenezi saptanmıştır. Bu aile bu çok nadir anomalinin genetik temeli olduğunu düşündürmektedir. Tablo 2 de isimleri verilen mikrosatellit tarama belirleyicileri hereditary hearing loss homepage de tarama için kullanılan belirleyiciler arasından ve ilgili yayınlar taranarak seçilmiştir. Bu belirleyiciler için elde edilen primerler kullanılarak standart PCR reaksiyonları ile PCR ürünleri elde edilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri %6 lık poliakrilamid jel elektroforezinde denatüre edici poliakrilamid jel elektroforeziyle yürütülmüş ve bantlar gümüş boyama ile görünür hale getirilmiştir. Daha sonra kurutma kağıtlarına alınan jel

örnekleri skorlanmıştır. Her aile kendi içinde skorlanmış ve işitme kaybının mikrosatellit belirleyici allelleriyle birlikte dağılıp dağılmadığına bakılmıştır. Önce her loküs için tek belirleyici kullanılmış, eğer bağlantı olmadığı görülüyorsa o ailede başka bir loküse geçilmiştir. Tablo 2. Proje kapsamındaki mikrosatellit belirleyiciler Belirleyici Bölge Gen Belirleyici Bölge Gen D13S141 DFNB1 GJB2 D10S580 DFNB12 CDH23 D13S1275 DFNB1 GJB2 D7S661 DFNB13? D13S1236 DFNB1 GJB2 D7S498 DFNB13? D13S250 DFNB1 GJB2 D7S527 DFNB14? D13S175 DFNB1 GJB2 D7S3074 DFNB14? D11S916 DFNB2 MYO7A D15S132 DFNB16 STRC D11S4128 DFNB2 MYO7A D15S123 DFNB16 STRC D11S4081 DFNB2 MYO7A D7S2487 DFNB17? D11S911 DFNB2 MYO7A D7S655 DFNB17? D11S1321 DFNB2 MYO7A D7S480 DFNB17? D11S4179 DFNB2 MYO7A D11S419 DFNB18 USH1C D11S527 DFNB2 MYO7A D11S921 DFNB18 USH1C D11S906 DFNB2 MYO7A D11S899 DFNB18 USH1C D11S4186 DFNB2 MYO7A D11S902 DFNB18 USH1C D11S352 DFNB2 MYO7A D18S62 DFNB19? D11S937 DFNB2 MYO7A D18S378 DFNB19? D17S805 DFNB3 MYO15 D11S969 DFNB20? D17S122 DFNB3 MYO15 D11S439 DFNB20? D7S501 DFNB4 SLC26A4 D11S925 DFNB21 TECTA D7S2456 DFNB4 SLC26A4 D11S1899 DFNB21 TECTA D7S2459 DFNB4 SLC26A4 D11S4107 DFNB21 TECTA D7S2420 DFNB4 SLC26A4 D11S4089 DFNB21 TECTA D7S496 DFNB4 SLC26A4 D11S1774 DFNB21 TECTA D14S286 DFNB5 DFNB5 D11S4111 DFNB21 TECTA D14S79 DFNB5 DFNB5 D11S2017 DFNB24? D3S1767 DFNB6 TMIE D11S1986 DFNB24? D3S1289 DFNB6 TMIE D11S1992 DFNB24? D3S1582 DFNB6 TMIE D4S405 DFNB25? D9S166 DFNB7/11 TMC1 D4S428 DFNB25? D9S301 DFNB7/11 TMC1 D1S1679 DFNB26? D21S1225 DFNB8/10 TMPRSS3 D2S326 DFNB27? D21S1575 DFNB8/10 TMPRSS3 D2S2257 DFNB27? D21S1260 DFNB8/10 TMPRSS3 D2S2273 DFNB27? D21S1259 DFNB8/10 TMPRSS3 D22S283 DFNB28? D2S158 DFNB9 OTOF D22S423 DFNB28? D2S174 DFNB9 OTOF D22S274 DFNB28? D2S2223 DFNB9 OTOF D22S283 DFNB28? D2S2350 DFNB9 OTOF D21S1252 DFNB29 CLDN14 D10S569 DFNB12 CDH23 D21S2079 DFNB29 CLDN14 D10S532 DFNB12 CDH23 D10S1160 DFNB30 MYO3A D10S532 DFNB12 CDH23 D10S1775 DFNB30 MYO3A D10S535 DFNB12 CDH23 D10S197 DFNB30 MYO3A Proje boyunca listedeki loküsler yukarıdaki sıra ile taranmaya başlanmış ve DFNB1, DFNB2, DFNB3, DFNB4, DFNB7/11, DFNB8/10, DFNB9, DFNB12, DFNB16, DFNB21 ve DFNB30 bölgeleri taranmıştır. Araştırma sırasında elde edilen bilgiler ışığında daha önce çok az sayıda ailede tanımlanmış bölgelerle taramaya devam edilmemiştir.

Daha önceki çalışmalarımızda toplanan 117 birbiriyle akraba olmayan probandda CLDN14 geni SSCP ile taranmıştır. Tek kodlayan ekson örtüşen iki parça halinde PCR ile çoğaltılmış (dizayn edilen primerler: F1-5 aggagcggcgtgaccc3 R1-5 aggctatgcccgagagc3 ve F2-5 gcgccctcatggtcatct3 R2-5 tgccaccaatgagcgagag3 ) ve SSCP için geliştirilmiş 4ºC de stabilizasyonu sağlayan bir elektroforez modülü ile denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi gerçekleştirilmiştir (D-code mutasyon arama modülü, BioRad, ABD). SSCP için yapılan poliakrilamid jeller gümüş boyama ile görünür hale getirilmiştir. Bant farklılığı gösteren örnekler laboratuarımızda bulunan otomatize edilmiş dizi analizi cihazı (Beckman-Coulter CEQ 2000 XL) ile mutasyon varlığı yönünden araştırılmıştır. IV. Analiz ve Bulgular DFNB1, DFNB2, DFNB3, DFNB4, DFNB7/11, DFNB8/10, DFNB9, DFNB12, DFNB16, DFNB21 ve DFNB30 loküslerinin taranması sonunda DFNB9 bölgesi ile birlikte kalıtılan üç aile saptanmıştır (Şekil 2). Belirleyici allelleri bu loküsteki OTOF geninde mutasyon olması halinde her ailedeki mutasyonun farklı olduğu izlenimi vermiştir. DFNB7/11 belirleyicilerinden D9S301 ile birlikte kalıtım 034 numaralı ailede görülmüş, ancak diğer belirleyicinin allel heterozigotluğu yeterli olmadığından desteklenememiştir. DFNB3 belirleyici allel heterozigotluğu yeterli olmadığından 013 numaralı ailede; DFNB7/11 belirleyici allel heterozigotluğu yeterli olmadığından 007 ve A052 numaralı ailelerde; DFNB16 belirleyici heterozigotluğu yeterli olmadığından 013 ve 338 numaralı ailelerde; DFNB30 belirleyici heterozigotluğu yeterli olmadığından 456 ve 448 numaralı ailelerde dışlanamamıştır. 456 numaralı ailenin yapısı nedeniyle DFNB1, DFNB3, DFNB8/10, DFNB21 ve DFNB30 bölgeleri dışlanamamıştır. Diğer belirleyiciler ile yapılan taramada fenotiple birlikte resesif kalıtım gösteren başka bir bölge saptanamamıştır. Mitokondrial DNA da 961delTinsC(n) mutasyonu saptanmış olan 098 numaralı ailede yukarıda sayılan bölgelerden DFNB9 ile birlikte kalıtım olduğu görülmüştür. Bu ailede OTOF geninde bir mutasyon olup olmadığı Türkiye Bilimler Akademisi destekli bir çalışmada Almanya Tübingen Üniversitesi nden Dr. Susan Kupka dan elde edilen primerler kullanılarak taranmış ve bir mutasyon saptanmamıştır. Bu aile ile ilgili bulgular yayınlanmak üzere hazırlanmaktadır. OTOF ile birlikte kalıtım gösteren F ve 035 ailelerinde benzer şekilde OTOF geninin 48 kodlayan eksonu ve intron-ekson bileşkeleri taranmıştır. F ailesinde mutasyon bulunanamıştır. U şeklinde odyogramları bulunan 035 numaralı ailede OTOF geninin 25. eksonunda c.3033t>c (p.leu1011pro) mutasyonu bulunmuştur (Şekil 3). Bu mutasyon üç işitme engelli çocukta homozigot ve anne babada heterozigottur. İşitme sorunu olmayan 50 Türkte ise bu mutasyona rastlanmamıştır. CLDN14 geninde bir probandda 11C>T (T4M) değişikliği heterozigot olarak saptanmıştır (Şekil 4). Yine bir probandda 243C>T (R81R) değişikliği homozigot olarak görülmüştür (Şekil 5). V. Sonuç ve Öneriler Anadolu kökenli 12 sendromik olmayan işitme kayıplı otozomal resesif kalıtım gösteren ailenin büyük çoğunluğunda bağlantı gösterilememesi Anadolu da işitme kaybının genetik etiyolojisinin çok heterojen olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgu daha önce yaptığımız çalışmanın sonuçlarını desteklemektedir. Daha önceki çalışmada en sık işitme kaybı nedeni olan GJB2 mutasyonu bulunan ailelerde anne baba akrabalığının sağlıklı toplum düzeyinde olduğunu ancak GJB2 mutasyonu olmayanlarda akraba evliliği oranının %55 e yükseldiğini göstermiştik (Tekin ve ark. 2003). Ayrıca GJB2 allel sıklığının Anadolu da bölgeler arasında belirgin farklılık gösterdiğini bulmuştuk. Bu durumda Anadolu kaynaklı işitme kayıplı ailelerin çoğunda nadir

görülen mutasyonların izole bölgelerde, belki de tek bir ailede, bulunduğu sonucu çıkmaktadır. Bu nedenle dünyanın izole bölgelerinde tek ailede tanımlanmış olan gen loküslerinin Türk ailelerde taranması yerine Türkiye den büyük ailelerde genom boyunca tarama yapılmasının gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. Yaptığımız bağlantı analizi sonucunda OTOF bölgesine bağlantı gösteren üç aile bulduk. Ancak ailelerin yapısı bulunan birlikte kalıtımın rastlantı sonucu olup olmadığı konusunda bilgi vermemektedir. Bu üç ailede OTOF genini taradığımızda yalnızca birinde c.3033t>c (p.leu1011pro) mutasyonunu saptadık. OTOF geni 48 tane kodlayan eksonu olan büyük bir gendir ve bugüne kadar içinde yalnızca 15 mutasyon tanımlanmıştır [Yasunaga ve ark. 1999; Yasunaga ve ark. 2000; Adato ve ark. 2000; Houseman ve ark. 2001; Migliosi ve ark. 2002; Mirgomizadeh ve ark. 2002; Rodriguez-Ballesteros ve ark. 2003; Varga ve ar., 2003]. Mutasyon bulamadığımız ailelerde kodlamayan bölgelerde genin ekspresyonunu etkileyebilecek bir değişiklik bulunabilir. Ayrıca kullandığımız tarama metodu olan SSCP %100 duyarlı olmadığından mutasyonu atlamış olma olasılığımız da bulunmaktadır. Daha önce de belirttiğimiz gibi c.3033t>c (p.leu1011pro) mutasyonu OTOF geninin 25. eksonunda ve proteinin C2D bölgesinde Leu yerine Pro gelmesiyle sonuçlanmaktadır. Bulduğumuz değişikliğin patojenik olduğu yönünde üç kanıt bulunmaktadır: 1) Mutasyon ailede fenotip ile segrege olmaktadır; 2) Mutasyon 100 sağlıklı Türk kromozomunda bulunmamaktadır; 3) Mutasyon genin işlevsel olarak çok önemli bir bölgesinde olmakta ve bu nokta evrimsel olarak korunmaktadır (Tablo 3). C2 bölgeleri vezikül-membran füzyonunda önemli görevleri olan proteinlerin kalsiyum bağlayan bölgeleridir. Otoferlin proteininin işlevinin bu bölgeler yardımıyla kalsiyum bağlayarak aktive olması ve nörotrasnmitterlerin sinaptik aralığa boşaltılması olduğu öne sürülmektedir [Yasunaga ve ark. 1999]. Bu durumda bu aktif bölgedeki bir değişiklik protein fonksiyonunun bozulmasıyla sonuçlanabilir. CLDN14 geninde 117 probandda patojenik olabilecek bir değişiklik saptayamadık. Bu gende bulduğumuz iki değişiklik de daha önce polimorfizm olarak bildirilmiştir. Dolayısıyla Türk toplumunda CLDN14 gen mutasyonları önemli bir işitme kaybı nedeni olarak düşünülmemiştir. Bu çalışma devam ettiği sırada İstanbul dan Uyguner ve arkadaşları [2003] tarafından yayınlanan makalede 60 probandda bu gende bir mutasyon saptananamıştır. Bu da bulgularımızı desteklemektedir.

Tablo 3. Evrimsel olarak OTOF ta mutasyon noktasının korunması Otoferlin [Homo sapiens] Otoferlin [Apis mellifera] Otoferlin [Canis familiaris] Otoferlin [Rattus norvegicus] Otoferlin [Anopheles gambiae] Otoferlin [Tetraodon nigroviridis] Otoferlin [Drosophila melanogaster] Otoferlin [Fugu rubripes] Otoferlin [Danio rerio] Otoferlin [Gallus gallus] Otoferlin [Mus musculus] myoferlin [Homo sapiens] dysferlin [Homo sapiens] TWDQMLVFDNLELYG TWDELLLFDDILIYG TWDQMLVFDNLELYG TWDQMLVFDNLELYG TWDELLVFDEVTVYG TWDQLLVFDDVELFG IWNAVITFNWVSLPG TWDQLLVFDDVELFG TWDQLLVFDHVELYG TWDQLLVFDNVELYG TWDQMLVFDNLELYG TWDQTIIFDEVEIYG TWDQTLIFYEIEIFG

VI. Kaynaklar Adato A, Raskin L, Petit C, Bonne-Tamir B. Deafness heterogeneity in a Druze isolate from the Middle East: novel OTOF and PDS mutations, low prevalence of GJB2 35delG mutation and indication for a new DFNB locus. Eur J Hum Genet 2000; 8: 437-42. Cohn ES, Kelley PM. Clinical phenotype and mutations in connexin 26 (DFNB1/GJB2), the most common cause of childhood hearing loss. Am J Med Genet 1999; 89: 130-6 Gasparini P, Rabionet R, Barbujani G, Melchionda S, Petersen M, Brondum-Nielsen K, Metspalu A, Oitmaa E, Pisano M, Fortina P, Zelante L, Estivill X. High carrier frequency of the 35delG deafness mutation in European populations. Genetic Analysis Consortium of GJB2 35delG. Eur J Hum Genet 2000; 8: 19-23 Green GE, Scott DA, McDonald JM, Woodworth GG, Sheffield VC, Smith RJ. Carrier rates in the midwestern United States for GJB2 mutations causing inherited deafness. JAMA 1999; 281: 2211-6 Houseman MJ, Jackson AP, Al-Gazali LI, Badin RA, Roberts E, Mueller RF A novel mutation in a family with non-syndromic sensorineural hearing loss that disrupts the newly characterised OTOF long isoforms. J Med Genet 2001; 38: E25. Migliosi V, Modamio-Hoybjor S, Moreno-Pelayo MA, Rodriguez-Ballesteros M, Villamar M, Telleria D, Menendez I, Moreno F, Del Castillo I Q829X, a novel mutation in the gene encoding otoferlin (OTOF), is frequently found in Spanish patients with prelingual non-syndromic hearing loss. J Med Genet 2002; 39: 502-6. Mirghomizadeh F, Pfister M, Apaydin F, Petit C, Kupka S, Pusch CM, Zenner HP, Blin N. Substitutions in the conserved C2C domain of otoferlin cause DFNB9, a form of nonsyndromic autosomal recessive deafness. Neurobiol Dis 2002; 10: 157-64. Morell RJ, Kim HJ, Hood LJ, Goforth L, Friderici K, Fisher R, Van Camp G, Berlin CI, Oddoux C, Ostrer H, Keats B, Friedman TB. Mutations in the connexin 26 gene (GJB2) among Ashkenazi Jews with nonsyndromic recessive deafness. N Engl J Med 1998; 339: 1500-5 Rodriguez-Ballesteros M, del Castillo FJ, Martin Y, Moreno-Pelayo MA, Morera C, Prieto F, Marco J, Morant A, Gallo-Teran J, Morales-Angulo C, Navas C, Trinidad G, Tapia MC, Moreno F, del Castillo I. Auditory neuropathy in patients carrying mutations in the otoferlin gene (OTOF). Hum Mutat 2003; 22: 451-6. Tekin M, Arnos KS, PandyaA. Advances in hereditary deafness. Lancet 2001a; 358: 1082-1090 Tekin M, Akar N, Cin S, Blanton SH, Xia XJ, Liu XZ, Nance WE, Pandya A.Connexin 26 (GJB2) mutations in the Turkish population: implications for the origin and high frequency of the 35delG mutation in Caucasians. Hum Genet 2001b; 108: 385-9 Tekin M, Arnos KS, Xia XJ, Oelrich MK, Liu XZ, Nance WE, Pandya A.W44C mutation in the connexin 26 gene associated with dominant non-syndromic deafness. Clin Genet 2001c; 59: 269-73 Tekin M, Duman T, Bogoclu G, Incesulu A, Comak E, Ilhan I, Akar N. Spectrum of GJB2 mutations in Turkey comprises both Caucasian and Oriental variants: roles of parental consanguinity and assortative mating. Hum Mutat 2003a; 21: 552-553.

Tekin M, Duman T, Boğoçlu G, İncesulu A, Çomak E, Fitoz S, Yılmaz E, İlhan İ, Akar N. Frequency of mtdna A1555G and A7445G mutations among children with prelingual deafness in Turkey. Eur J Pediatr 2003b; 162: 154-158. Tekin M, Akcayoz D, Çomak E, Bogoclu G, Duman T, Fitoz S, Ilhan I, Akar N. Screening the SLC26A4 gene in probands with deafness and goiter (Pendred syndrome) ascertained from a large group of students of the schools for the deaf in Turkey. Clin Genet 2003c; 64: 371-374. Tekin M, Duman T, Boğoçlu G, İncesulu A, Cin Ş, Akar N. Moderate hearing loss and pseudodominant inheritance due to L90P/35delG mutations in the GJB2 (connexin 26) gene. Genet Counsel 2003d; 14: 379-386. Tekin M, Boğoçlu G, Arıcan ST, Orman MN, Taştan H, Elsayed S, Akar N. Evidence for single origins of 35delG and dele120 mutations in the GJB2 gene in Anatolia. Clin Genet 2005; 67: 31-37. Uyguner O, Emiroglu M, Uzumcu A et al. Frequencies of gap- and tight-junction mutations in Turkish families with autosomal-recessive non-syndromic hearing loss. Clin Genet 2003; 64: 65-69. Varga R, Kelley PM, Keats BJ, Starr A, Leal SM, Cohn E, Kimberling WJ Non-syndromic recessive auditory neuropathy is the result of mutations in the otoferlin (OTOF) gene. J Med Genet 2003; 40: 45-50. Yasunaga S, Grati M, Cohen-Salmon M, El-Amraoui A, Mustapha M, Salem N, El-Zir E, Loiselet J, Petit C. A mutation in OTOF, encoding otoferlin, a FER-1-like protein, causes DFNB9, a nonsyndromic form of deafness. Nat Genet 1999; 21: 363-9. Yasunaga S, Grati M, Chardenoux S, Smith TN, Friedman TB, Lalwani AK, Wilcox ER, Petit C. OTOF encodes multiple long and short isoforms: genetic evidence that the long ones underlie recessive deafness DFNB9. Am J Hum Genet 2000; 67: 591-600.

VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları YAPILAN HARCAMALAR : 85,000,000,000 TL bütçesi bulunan projeden 41,024,960,000 TL lik harcama yapılmıştır. Projede alınan malzemeler aşağıdaki işlemlerde kullanılmıştır. Makina/Techizat İstenen Kullanım Yeri 1 Multichannel pipet, 8 kanallı PCR sırasında 2 Şarj edilebilir pipet kontrolörü PAGE dökümü 3 SSCP için modül Mutasyon taraması Sarf Malzemesi MALZEME DNA ekstraksiyon kiti (250 örnek) Kullanım Yeri DNA eldesi 1.5 ml'lik Eppendorf (5.000 adet) PCR ve yükleme sırasında 0.5 ml'lik Eppendorf (5.000 adet)- PCR için 0.2ml lik 12 li strip PCR tüpleri (10.000 adet tüp) Sarı pipet ucu (15.000 adet) Mikro pipet ucu (15.000) Trisma Base (5kg) EDTA (500g) Agaroz (500g) Nusieve Agaroz (125g) Borik asit (1kgx2) dntp set (100mMx6) Taq polymerase (15.000U) Ethidium bromide (1g) Acrylamide (5 kg) Bisacrylamide (100gx5) TEMED 2 kutu Amonyum persulfat (150 mg'lık 100 kapsü1) PCR sırasında PCR sırasında PCR sırasında PCR sırasında Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez PCR sırasında PCR sırasında Jel görüntüleme Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez Jel dökümü ve elektroforez

Marker (Φx 174 RF DNA Hae III Digest)(50u) Plastik eppendorf tüpü taşıyıcı (5 adet) Plastik DNA saklama kutusu (5 adet) Primer (3500 baz) AgNO3 (50gx2) CaCO3 (1kg) Formaldehit (1lt) NaOH (1kg) Urea (2kg) Xylene Cyanol (10g) Na2C03 (l kg) DNA dizi analizi (35 adet) Elektroforez PCR sırasında DNA saklama PCR sırasında Gümüş boyama Gümüş boyama Gümüş boyama Gümüş boyama Jel dökümü ve elektroforez Elektroforez Gümüş boyama Dizi analizi b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar (BAP Demirbaş numaraları dahil ) Aşağıdaki cihazlar halen AÜTF Pediatrik Moleküler Genetik Laboratuarında başka araştırmalar için kullanılabilir durumdadır. D-Code mutasyon tarama sistemi (Demirbaş No: 11692) 8 kanallı pipet (Henüz demirbaş numarası verilmemiştir) Pipet kontrolörü (Henüz demirbaş numarası verilmemiştir) c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) Çalışmanın sonuçları Europen Society of Human Genetics 2005 kongresine gönderilmiş ve kabul beklenmektedir. e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler Sonuçlar makale olarak yayına hazırlanmaktadır. CLDN14 geninin taranması A.Ü. Biyoteknoloji öğencisi Saniye Tuğba Arıcan ın Klaudinlerin işitme kaybındaki önemi başlıklı tez çalışmasının bir kısmı olarak yapılmıştır. NOT :Verilen kesin rapor 2 nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD veya disket ile verilecektir.

007 Erzincan Kemah Gölkaynak köyü 3 2 201 301 101 102 166 Kastamonu- absent cochlea 166-2066-301 2 2 166-502 166-501 166-1066-102 338 Bayburt 4 6 4 338-301 338-201 338-104 338-103 338-105 338-102 338-101 2 2 2

448- Rize Cayeli Armutlu 4 448-402 448-401 448-201 448-301 448-102 448-101 035 I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 II-4 III-1 III-2 III-3 III-4 3 3 2 IV-1 IV- 2-4 IV-5 IV-6 IV- 7-9 IV- 10-11 V-1 V-2 V-3 052 Amasya Kayacik 034 Çankiri Çerkez Yalaközü 2 2 3 034-801 A052-201 A052-301 034-201 034-301 034-102 034-103 034-101 A052-102 A052-103 guatr A052-101 303 I:1 I:2 D197 II:1 II:2 II:3 II:4 I:1 I:2 III:1 III:2 II:1 II:2 II:3 IV:1 IV:2

013 9 10 18 013-802 013-801 013-800 13 11 013-430 5 4 6 3 013-403 25013-402 013-420 deaf late deafened? deaf 2 3 2 2 24 013-201 013-401 013-301 013-302 8 14 15 013-501 progressive 013-502 progressive 013-601 1 yasinda menenjit 17 013-101 013-102 F Family- Konya 3 3 4 2 2 2 2 098- mtdna961 961-961 961 098-521 098-531 098-621 098-631 098-301 098-201 PEO ve ptosis 961-961 961 961 098-501 098-601 098-103 098-101 098-102 Şekil 1. Çalışmaya alınan aileler.

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 IV:1 961delTinsC(n) - 1 3 2 1 IV:2 961delTinsC(n) 2 1 3 3 2 2 3 3 I:1 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10 IV:11 IV:12 IV:13 IV:14 IV:15 IV:16 IV:17 IV:18 IV:19 IV:20 IV:21 IV:22 IV:23 IV:24 IV:25 IV:26 IV:27 IV:28 961delTinsC(n) 961delTinsC(n) - 961delTinsC(n) 961delTinsC(n) 2 1 1 3 3 1 2 1 4 2 2 1 1 3 I:2 5 3 4 7 4 2 7 V:1 V:2-6 V:7-9 V:10-13 V:14 V:15-21 V:22-25 V:26-27 V:28-34 V:35 V:36 V:37 V:38 V:39-44 V:45-48 V:49-53 V:54-59 V:60-61 V:62-69 961delTinsC(n) 961delTinsC(n) - 961delTinsC(n) 961delTinsC(n) 961delTinsC(n) 2 2 3 3 1 3 3 2 2 2 1 3 2 3 6 4 5 6 2 8 Şekil 2.a) 098 numaralı ailede OTOF belirleyicileri. Belirleyiciler yukarıdan aşağıya D2S158, D2S2223, OTOF 5 UTR 3C/5C polimorfizmi, D2S2350, ve D2S174.

F Family- Konya 1 3 1 3 Şekil 2.b) F kodlu ailede OTOF belirleyicileri. Belirleyiciler yukarıdan aşağıya D2S158, D2S2223, D2S2350, ve D2S174.

035 Samsun U shape 035-201 1 3 035-301 2 2 035-103 2 2 035-101 2 2 035-102 2 2 Şekil 2.c) 035 numaralı ailede OTOF belirleyicileri. Belirleyiciler yukarıdan aşağıya D2S158, D2S2223, D2S2350, ve D2S174.

A T G C T C G G T G Şekil 3. Heterozigot c.3033t>c mutasyonu.

A B Şekil 4. A: Solda heterozigot T4M (11C>T) değişimi, sağda normal allel; B) Solda homozigot R81R (243C>T) değişimi, sağda normal allel.