Clostridium perfringens Analizi (Kaynak 2) 1 01. Genel Bilgiler 02. Gıda Örneğinin Hazırlanması 03. Selektif Besiyerine Ekim 04. Cl. perfringens 'in Doğrulanması 04.01. Hareket-Nitrat Testi 04.02. Laktoz Jelatin Testi 05. Cl. perfringens Aranmasında Hızlı Analiz Yöntemleri 05.01. MUP İlave Edilmiş Besiyeri Kullanımı 05.02. Hazır Test Kitleri Kullanılarak Yapılan Toksin Analizleri 05.03. ELISA Tekniği 01. Genel Bilgiler Cl. perfringens aranmasında standart analiz yöntemlerinde esas olarak alınan canlı hücre sayısıdır. Türk Standartları Enstitüsü (TSE), Uluslararası Standartlar Örgütü (International Standard Organisation ; ISO), ABD Gıda ve Müstahzar İdaresi (Food and Drug Administration ; FDA) gibi organizasyonların standart metotlarında Cl. perfringens sayısı için kabul edilebilirlik sınırları belirlenmiştir. Bu standartlarda Cl. perfringens 'in varlığı veya yokluğunun gösterilmesinin değil canlı hücre sayısının esas alınmasının sebebi doğada çok yaygın olarak bulunması ve ancak yüksek sayılara ulaştıktan sonra insan sağlığını tehdit etmesidir. TSE' nin hazırladığı TS-6405/1989 sayılı Cl. perfringens sayımı kurallarını içeren standart metotla ISO 'nun hazırladığı 7937 sayılı metotla aynı ve FDA 'nın kabul ettiği sayım metoduyla büyük ölçüde paraleldir. Cl. perfringens zehirlenmelerinin önlenmesinin kolay olması ve ölüm/vaka oranının çok düşük olması sebebiyle Cl. perfringens aranması ve sayımı için daha çok klasik metotlar kullanılmakta olup hızlı analiz teknikleri az sayıdadır ve yeni geliştirilmektedir. ELISA ve benzeri hızlı analiz teknikleri daha çok tıbbi yönden öneme sahip suşlar üzerine yoğunlaşmıştır. 02. Gıda Örneğinin Hazırlanması Cl. perfringens sporları sıcaklığa dayanıklı olmakla birlikte vejetatif hücreler sıcaklık değişimine karşı oldukça hassastırlar. Bu nedenle örneklerin taşınmasında örneğin tutulacağı sıcaklık derecesi 10 o C' ın altında ve 15 o C' ın üzerinde olmamalıdır. Gıda örneklerinin laboratuvara ulaştırılması 8 saatten daha fazla uzun bir süre alacaksa örnekler tamponlanmış steril gliserin - tuz çözeltisi (Gliserin 100 ml ; K 2 HPO 4 12,4 g ; KH 2 PO 4 4 g ; NaCl 4,2 g ; Destile su 900 ml) içerisinde -60 o C' da dondurulmalıdır, bu amaçla kuru buz kullanımı uygun olmaktadır. 1 Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları ; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü
Uygun şartlarda laboratuvara getirilen gıda örneğinin katı olması halinde dikkat edilecek diğer bir husus homojenizasyondur. Bu işlemde yüksek hızların kullanılması halinde örnek içerisine fazla hava gireceğinden anaerob olan hücreler zarar görecek ve hücre sayımında gerçekte örnek içerisinde olduğundan daha düşük hücre sayısı bulunacaktır. 03. Selektif Besiyerine Ekim Cl. perfringens aranması ve sayılmasında önzenginleştirme yapılmamakta, direk olarak selektif besiyerine ekim yapılmaktadır. Bunun nedeni ise Cl. perfringens içerdiğinden şüphe edilen gıdalarda genellikle hücre sayısının yüksek oranlarda bulunması ve kullanılan temel besiyeri olan Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC)' in oldukça selektif özellikte olmasıdır. Bu besiyeri laboratuvarda hazırlanabileceği gibi ticari olarak hazır halde de bulunmaktadır. TSC besiyerinin adı, standartlarda hazır besiyeri SC agar olarak da verilmektedir. Besiyeri içerisine su içerisinde çözünmüş ve filtreden geçirilerek sterilize edilmiş %5 'lik (w/v) D- Cycloserine çözeltisinden litreye 10 ml ilave edilir. Cl. perfringens sayımında isteğe bağlı olarak dökme veya yayma kültürel sayım tekniklerinin her ikisi de kullanılabilir. Dökme kültürel sayım tekniğinde ise incelenecek ürün sıvı ise deney numunesinden, diğer ürünlerde ise ana dilüsyondan 1 ml alınır ve boş petri kutusuna aktarılır. Petriye 45 o C' da su banyosunda tutulan TSC (SC) agar besiyerinden yaklaşık 15 ml dökülür ve kutu hafifçe çevrilerek karıştırılır. Besiyeri katılaştıktan sonra aynı besiyerinden petrinin yüzeyini tamamıyla örtecek şekilde 10 ml daha ilave edilir. Katılaşması beklenir ve kapakları üste gelecek şekilde anaerobik kavanozlarda veya anaerobik inkübatörde 35 37 o C 'da 20 ila 24 saat kadar bırakılır. Yayma kültürel sayım tekniğinde hazırlanan besiyerinden 15 ml olacak şekilde petri kutusuna dökülür ve katılaşması beklenir. Kullanımdan hemen önce petri kurutma dolabında 50 o C' da 30 dakika kadar kurutulur. Bu işlemin yapılmaması halinde besiyeri üzerindeki nem, ekimden sonra dökülecek olan ikinci kat TSC besiyeri ile petri kutusundaki besiyerinin tam olarak kaynaşmasını engeller ve istenmeyen hava boşlukları oluşur. Kurutma işlemiyle bu durum önlenebilmektedir. Bu yöntemde önceden hazırlanmış TSC agar üzerine 0,1 ml örnek veya ana dilüsyon Drigalski spatülü yardımıyla yayılır. Yayılan sıvı absorbe edildikten sonra üzerine tekrar 10 ml TSC agar dökülür. Agarlı besiyeri katılaştıktan sonra anaerobik inkübasyona bırakılır. İnkübasyon süresi sonunda TSC agarda oluşan siyah koloniler muhtemel olarak Cl. perfringens kolonileridir. Standartlarda belirtilenlerin dışında Cl. perfringens sayımı ve identifikasyonu için OPSP Agar (Perfringens Supplement A ve Perfringens Supplement B Agar Base), Oxoid Shahadi Ferguson Agar, DCRM (Differential Reinforced Clostridial Agar), RCM (Clostridium agar) gibi besiyerlerinin kullanımı da uygun olmaktadır. 04. Cl. perfringens 'in Doğrulanması Cl. perfringens doğrulama deneyleri iki biyokimyasal yöntemle yapılır. Bunlardan birincisi hareket nitrat besiyeri kullanılarak yapılan doğrulama testi, diğeri ise Laktoz Jelatin besiyeri kullanılarak yapılan doğrulama testidir. TSC besiyerinde siyah koloniler meydana getiren Cl. perfringens hareketsizdir, nitratı nitrite indirger, laktozdan asit ve gaz oluşturur ve 48 saat
içinde jelatini sıvılaştırır. Bu sonuçları gösteren bakteriler Cl. perfringens olarak kabul edilir. Ancak bu iki biyokimyasal doğrulama testi yapılmadan önce selektif besiyerindeki karakteristik kolonilerin seçilmesi gerekmektedir. Eğer kolonilerin seçimi mümkün olmuyorsa koloniler sıvı Thioglycollate besiyerine aktarılır ve anaerob koşularda 35-37 o C da 18-24 saat kadar inkübe edilir. Daha sonra koloniler tekrar TSC agara alınır ve üzerleri 10 ml kadar yine TSC agarla örtülür ve tekrar anaerob inkübasyona bırakılır. Bu işleme siyah karakteristik koloniler seçilebilecek hale gelinceye kadar devam edilir. Seçilen kolonilere yukarıda belirtilen biyokimyasal doğrulama testleri uygulanır. Koloni seçme işleminde temel besiyeri olarak Lactose Sulfite (LS) Agar besiyeri, TSC Agar besiyerine alternatif olarak kullanılabilmektedir. 04.01. Hareket-Nitrat Testi Selektif besiyerinden seçilmiş koloniler yumuşak agarlı hareket nitrat besiyeri içine aşı iğnesi ile daldırılarak ekilir. Anaerobik şartlarda 35-37 o C 'da 24 saat süreyle inkübe edilir. Hareket nitrat besiyeri tüpleri ekim çizgisi boyunca meydana gelecek büyüme şekli açısından incelenir. Hareketlilik ekim çizgisinden uzak bölgedeki büyüme olmasıyla görülür. Besiyerinde hareket testi sonucu alındıktan sonra nitrit testi yapılır. Bu amaçla 0,2-0,5 ml nitrat reaktifi besiyeri tüpüne ilave edilir ve tüp karıştırıcıda karıştırılır. Kırmızı bir rengin oluşması tüpte nitrit varlığını yani nitratın indirgendiğini gösterir. 15 dakika sonrasında kırmızı renk oluşumu görülmezse az miktarda çinko tozu ilave edilir ve 10 dakika bekletilir. Çinko ilavesinden sonra yine kırmızı renk dönüşümü olmazsa nitratın nitrite, oluşan nitritin de amonyağa indirgendiği sonucuna varılır, bir diğer deyiş ile nitrit test sonucu pozitif olarak değerlendirilir. Çinko tozu ilavesinden sonra renk değişimi gözlenirse nitratın indirgenmediği sonucuna varılır ve test negatif olarak değerlendirilir. Testlerde kullanılacak nitrit tayin reaktifi aşağıda belirtilen iki maddenin eşit miktarlarda karıştırılması yoluyla elde edilir. Hazırlanan reaktif bekletilmeksizin kullanılmalıdır. 5-Amino-2-naftalen sülfonik asit (5-2 ANSA) çözeltisi : 100 ml asetik asit çözeltisi (% 15 v/v) içerisinde 0,1 g 5-2 ANSA çözülür. Süzgeç kağıdı ile süzülür ve kapaklı, damlalıklı kahverengi şişede 4 o C da saklanır. Sülfanilik asit çözeltisi : 100 ml asetik asit çözeltisi (% 15 v/v) içerisinde 0,4 g sülfanilik asit çözülür. Süzgeç kağıdından süzülür ve kapaklı damlalıklı kahverengi şişede 4 o C 'da saklanır. Hareket Nitrat besiyeri bileşimi Pepton 5 g ; Beef Exstract 3 g ; Galaktoz 5 g ; Gliserol 5 g ; Potasyum Nitrat 1 g ; Na 2 HPO4 2,5 g ; Agar 5-8 g ; distile su 1000 ml şeklindedir. Bu besiyeri ile hazırlanan tüpler 4 o C 'da depolanabilir. Kullanılmadan hemen önce 15 dakika süreyle kaynar su içerisinde veya buhara tutularak ısıtılır daha sonra hızla inkübasyon sıcaklığına soğutulur. Bu işlem, nitratlı besiyerinin yumuşak agar kıvamında kullanılacak olmasından dolayı ve besiyerine ilk ekimde mikroorganizmanın aerob koşullara maruz kalmaması için gereklidir. Isıtma ile besiyerindeki oksijen uzaklaştırılmış olur. 04.02. Laktoz Jelatin Testi
Seçilmiş siyah koloniler laktoz-jelatin besiyerine ekilir ve anaerobik şartlarda 35-37 o C 'da 24 saat inkübe edilir. Laktoz-jelatin besiyerinde laktoz fermentasyonu gaz oluşumu ve oluşan asitten kaynaklanan kırmızıdan sarıya renk değişimi ile gözlenir. Tüpler 5 o C 'da 1 saat süreyle soğutulur ve jelatinin sıvılaşıp sıvılaşmadığı kontrol edilir. Besiyeri katılaşmışsa 24 saat süreyle yeniden inkübe edilir ve tekrar jelatinin sıvılaşıp sıvılaşmadığı kontrol edilir. Laktoz - Jelatin besiyerinin bileşimi (TS 6405 'e göre) Triptose 15,5 g ; Yeast Extract 10 g ; Lactose 10 g ; Jelatin 120 g ; Phenol Red 0,05 g ; Su 1000 ml şeklindedir. Besiyerinin hazırlanmasında laktoz ve fenol red dışındaki maddeler suda çözülür. ph sterilizasyon sonrasında 7,5 olacak şekilde ayarlanır. Laktoz ve fenol red besiyerine ilave edildikten sonra tüplere 10' ar ml olacak şekilde dağıtılır ve 121 oc' da sterilize edilir. İnokülasyondan önce hareket-nitrat besiyerinde olduğu gibi tüpler 15 dakika kaynar su banyosunda tutulur ve hızla inkübasyon sıcaklığına getirilir. 05. Cl. perfringens Aranmasında Hızlı Analiz Yöntemleri Cl. perfringens 'in varlığının tespitinde ve tıbbi alanlarda öneme sahip suşlar için pek çok hızlı analiz yöntemi geliştirilmiş olmasına karşın bu tip hızlı analiz yöntemleri gıda örneklerinde pek kullanılmamaktadır. Buna karşın son yıllarda geliştirilen bazı teknikler gıda örneklerinde de kullanılabilir özelliktedir. 05.01. MUP İlave Edilmiş Besiyeri Kullanımı Cl. perfringens sayımında son yıllarda geliştirilmiş bir tekniktir. Bu metot TSC Agar besiyerine MUP (4-Methylumbelliferyl phosphate) katılması esasına dayanır. MUP alkali ve asit fosfataz için kullanılan fluorejenik bir substrattır. Asit fosfataz, Cl. perfringens için yüksek spesifikliğe sahip bir enzimdir. Asit fosfataz enzimi MUP' u 4-methylumbelliferone' a parçalar. Bu parçalanma ürünü 366 nm uzunluğa sahip uzun dalga boyunda ultraviyole el lambası ile floresan ışıma özelliği gösterir. Yapılan testlerde bu tip kolonilerin çok yüksek bir oranda Cl. perfringens olduğu tespit edilmiştir. Yukarıda verilen doğrulama testleri 24 saatlik iki inkübasyon süresi olmak üzere 48 saat gerektirirken bu yöntemde toplam 24 saatte sonuç alınabilmektedir. 05.02. Hazır Test Kitleri Kullanılarak Yapılan Toksin Analizleri Son yıllarda ticari firmalarca geliştirilen hazır test preparatları Cl. perfringens 'e ait 5 tip toksini ayırt edebilme özelliğine sahiptir. Bu kitler direk olarak hücresel bir sayım veya doğrulama tekniği olmamakla beraber gıda örneğinde eğer Cl. perfringens üremiş ve toksin üretmişse varlığı birkaç saat gibi kısa bir sürede tespit edilebilmektedir. Ancak toksin üretmeksizin gerçekleşen bir üreme söz konusu ise bu kitler kullanılamamaktadır. 05.03. ELISA Tekniği Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay olarak adlandırılan bu teknik daha çok tıbbi laboratuvarlarda kullanılmakla birlikte son yıllarda gıda örneklerinde de uygulanan bir tekniktir. Oldukça yüksek spesifikliğe sahip ve hızlı bir yöntem olmakla birlikte maliyetinin oldukça yüksek olması ve uzman bir kullanıcı varlığını gerektirmesi bu yöntemin en büyük
dezavantajıdır. Bu nedenle gıda analizlerinde uzmanlaşmış laboratuvarlar dışında pek yaygın olarak kullanılmamaktadır.