Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 5 Agaroz Jel Elektroforezi M. Somma, M. Querci WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Agaroz Jel Elektroforezi 2 İçindekiler Bölüm 5 Agaroz Jel Elektroforezi Giriş 3 Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri 3 Agaroz jel elektroforez bileşenleri 6 Deneysel 8 Kaynaklar 12
Agaroz Jel Elektroforezi 3 Giriş Jel elektroforezi, makromolekülleri büyüklük, elektrik yükü ve diğer fiziksel özellikler temelinde ayıran bir yöntemdir. Elektroforez (electrophoresis) terimi yüklü partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır. Elektro (electro) elektriğe karşılık gelir, forez (phoresis) anlamı karşıya geçirmek/taşımak olan Yunanca bir kelimedir. Jel elektroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar. Elektroforez için gerekli güç, jelin iki ucunda bulunan elektrotlara uygulanan voltajdır. Bir elektrik alanının bir molekülü hangi hızla jel ortamında hareket ettirdiği, molekülün özelliklerine bağlıdır. Birçok önemli biyolojik makromolekül (örn. amino asitler, peptitler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve ph ya bağlı olarak çözeltide katyon (+) ya da anyon (-) biçiminde, elektrik yükü taşıyan türler olarak bulunurlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katota veya anoda doğru hareket edecektir. Örneğin, elektrik alanının uygulandığı jel nötral ph da ise, DNA nın negatif yüklü fosfat grupları anoda doğru hareket eder (Westermeier, 1997). Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı, tanımlanması ve saflaştırılması için kullanılan standart bir yöntemdir. Teknik basit, hızlı ve diğer prosedürlerle ayrıştırılamayan DNA fragmanlarını çözebilme yeteneğindedir.ayrıca DNA nın jeldeki konumunu, düşük konsantrasyonlarda floresan veren etidiyum bromid ile boyayarak belirlemek mümkündür. Takip eden bölüm, agaroz jel elektroforezinin hazırlanması için fiziksel ilkeleri, bileşenleri (jel matriksi, tampon, yükleme tamponu ve markör) ve prosedürü açıklayacaktır (Sambrook ve ark., 1989). Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri Jel elektroforezi nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrılması için kullanılan bir tekniktir. Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır: yük ve kütle. DNA gibi biyolojik bir örnek bir tampon çözeltiye karıştırıldığı ve jele uygulandığı zaman bu iki değişken birlikte rol oynar. Bir elektrottan gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı anda diğer elektrot molekülleri kendine doğru çeker. Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü molekülleri büyüklüklerine göre ayırarak moleküler elek görevi yapar. Elektroforez sırasında makromoleküller, jelin porlarında hareket etmeye zorlanır. Elektrik alanı altında hareket oranları şu faktörlere bağlıdır: Alanın gücü
Agaroz Jel Elektroforezi 4 Moleküllerin büyüklüğü ve şekli Örneklerin göreceli hidrofobisitesi Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı Elektroforezle ilgili basit denklemlerin incelenmesi, jel elektroforezinde yüklü partiküllerin ayrılmasının tam olarak anlaşılması açısından önemlidir. Elektrotlara voltaj uygulandığında, potensiyal gradient, E, oluşur ve şu eşitlikle açıklanabilir : E = V / d (1) V, uygulanan voltaj ve d elektrotların cm olarak birbirinden uzaklığıdır. Potansiyel gradient, E, uygulandığı zaman, yüklü moleküller üzerinde bir güç, F, oluşur ve şu eşitlikle açıklanır : F = E q (2) q molekül üzerindeki yüktür (Coulomb). Bu güç Newton cinsinden ölçülebilir ve yüklü molekülün elektroda doğru hareket etmesini sağlar. Aynı zamanda yüklü moleküllerin hareketini yavaşlatan, sürtünmeden doğan bir de direnç vardır. Bu direnç fonksiyonları : Molekülün hidrodinamik büyüklüğü Molekülün şekli Elektroforez için kullanılan ortamdaki por büyüklüğü Tamponun yoğunluğudur. Elektrik alanında yüklü moleküllerin hızı (v) potansiyel gradient, yük ve sürtünme gücünün bir fonksiyonudur ve şu eşitlikle açıklanabilir: v = E q / f (3) f sürtünme katsayısıdır. Bir iyonun elektroforetik hareketi, M,iyon hızının potansiyel gradiente bölünmesi biçiminde gösterilir M = v / E (4) Buna ek olarak eşitlik 3 te görüldüğü gibi elektroforetik hareket M,molekül yükünün q, sürütnme katsayısı f e bölünmesi bçiminde de gösterilebilir
Agaroz Jel Elektroforezi 5 M = q / f (5) Potansiyel gradient uygulandığında farklı yüklü moleküller farklı elektroforetik hareketliliğe (M) bağlı olarak ayrılmaya başlayacaktır. Elektroforetik hareketlilik yüklü grubun pk değerine ve molekül büyüklüğüne bağlı olarak, yüklü bir molekülün önemli ve karakteristik bir parametresidir. Farklı sürtünme kuvvetlerine maruz kalacaklarından, aynı yükü taşıan moleküüler dahi farklı molekül büyüklüklükleri sebebi ile ayrılmaya başlayacaktır. Lineer çift zincirli DNA, jel matrislerinde baz çiftlerin sayısının log 10 una ters orantılı şekilde hareket eder. Daha büyük moleküller daha fazla sürtünme engeli ile karşılaşırlar ve jelin porlarında daha etkisiz bir şekilde hareket ettikleri için daha yavaştırlar. Çözeltideki elektrotlar arasındaki akım, çoğunlukla tampon iyonlar tarafından iletilirken, çok az bir bölümü de örnekteki iyonlar tarafından iletilir. Akım I, voltaj V ve direnç R arasındaki ilişki Ohm Kanunu nda şöyle gösterilir: R = V / I (6) Bu denklem, R dirençi için uygulanan V voltajını arttırarak elektroforetik ayrıştırmanın hızlandırılabileceğini gösterir. Bu da I akımında bir artışla sonuçlanır. Kat edilen uzaklık hem akım hem de zamanla orantılı olacaktır. Ancak, V voltajındaki artış ve buna bağlı olarak I akımındaki artış, çoğu elektroforez türünun başlıca problemlerinden biri olan ısı oluşumuna yol açar. Bu durum, elektroforez sırasında oluşan Watt olarak ölçülen W gücünün, direnç ile akımın karesinin çarpılması biçiminde hesaplandığı şu denklemle gösterilir: W = I 2 R ( 7) Elektroforez işleminde üretilen gücün büyük bölümü ısı olarak dağılacağı için şu zararlı etkiler ortaya çıkabilir: Ayrıştırılan örneklerin yayılmasına neden olan tampon iyonlarının ve örneğin difüzyon oranında bir artış, Ayrıştırılmış örneklerin karışmasına neden olan konveksiyon (ısıyayım) akımlarının oluşumu, Isıya duyarlı olan örneklerde intabilizasyon (örn. DNA nın denaturasyonu), Tampon yoğunluğunda azalma ve buna bağlı olarak ortam direncinin düşmesi.
Agaroz Jel Elektroforezi 6 Agaroz jel elektroforez bileşenleri Agaroz Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal bir kolloit olan agaroz, galaktoz ve 3,6- anhidrogalaktoz ünitelerinin ardışık olarak yer aldığı agarobioz ünitelerinin tekrarlanmasından oluşan ve moleküler kütlesi yaklaşık 12.000 Da olan lineer bir polisakkarittir. Agaroz çok hassastır ve elle dokunulduğunda kolayca bozulabilir. Agaroz jel büyük por çapına sahiptir ve temelde 200 kda dan daha büyük molekülerin ayrılmasında kullanılır. Agaroz jel elektroforez işlemi hızlıdır, fakat agaroz jellerde oluşan bantlar bulnaıkça ve dağılmaya meyilli oldukları için çözünürlüğü sınırlıdır. Bu por çapının bir sonucudur ve kontrol edilemez. Agaroz jel kuru toz halindeki agarozun sıvı bir tampon içine konması ve sonra karışımın, agaroz berrak bir çözeltiye dönüşene kadar kaynatılmasıyla oluşturulur. Daha sonra bu çözelti jel tepsisine dökülür ve oda sıcaklığında katılaşıncaya kadar soğutulur. Katılaştıktan sonra yoğunluğu agaroz konsantrasyonuyla belirlenen bir matris oluşturur. Elektroforez tamponu DNA nın elektroforetik hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna ve iyonik gücüne göre değişir. İyonların yokluğunda, eletrik iletimi en düşük düzeydedir ve DNA çok yavaş hareket eder yahut hiç etmez. Yüksek iyonik güçlü bir tamponda ise elektrik iletimi çok verimlidir fakat önemli miktarda ısı oluşur. En kötü durumda bu ısı sebebi ile jel erir ve DNA denatüre olur. Doğal çift zincirli DNA elektroforezinde kullanılan bir takım tamponlar mevcuttur. Bunlar genellikle EDTA (ph 8,0) ve yaklaşık 50 mm (ph 7,5-7,8) konsantrasyonunda Tris-asetat (TAE), Tris-borat (TBE), veya Tris-fosfat (TPE) içerir. Elektroforez tamponları genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında saklanır. TBE, agaroz jel elektroforezi için başlangıçta 1x çalışma gücünde kullanılmıştır. Ancak, 0,5x çalışma solüsyonu yeterinden fazla tamponlama kapasitesine sahiptir ve artık hemen hemen tüm agaroz jel elektroforezleri bu tampon konsantrasyonu kullanılarak yapılmaktadır. Agaroz konsantrasyonu Belirli büyüklükteki bir DNA parçası agarozun konsantrasyonuna bağlı olarak jel içinde farklı hızlarda hareket eder. Belirli konsantrasyondaki agaroz ve/veya tampon
Agaroz Jel Elektroforezi 7 için 20 ile 50.000 bp arasında büyüklüğe sahip bir DNA parçasını ayırmak mümkündür. Yatay jellerde agaroz genellikle %0,7 ile %3 arasındaki konsantrasyonlarda kullanılır (Tablo 1). Tablo 1. Lineer DNA moleküllerinin ayrımı için tavsiye edilen agaroz jel konsantrasyonu % agaroz DNA büyüklük aralığı (bp) 0,75 10.000-15.000 1,00 500-10.000 1,25 300-5000 1,5 200-4000 2,00 100-2500 2,5 50-1000 Markör DNA Belirli bir voltaj, agaroz jel ve tampon konsantrasyonu için hareket aralığı, başlangıç materyalinin molekül ağırlığına bağlıdır. Bu yüzden belirli bir büyüklükteki markör DNA, jelin sağ ve sol yanlarındaki kuyucuklara yüklenmelidir. Genellikle bir markör DNA belirli sayıda,ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir. Bu da elektroforez sırasında jel sistematik bir bozukluğa uğrarsa bilinmeyen DNA ların büyüklüğünü saptamayı kolaylaştırır. Yürütme tamponu Öncelikle agaroz jele yüklenecek DNA örnekleri, genellikle su, sakaroz ve bir boyadan (örn ksilen siyanol, bromofenol mavi, bromokresol yeşil vb) oluşan yürütme tamponuyla karıştırılır. Yüklenecek DNA nın maksimum miktarı parçaların sayısına bağlıdır. Etidiyum bromid ile boyanmış bir jelin fotoğrafıyla belirlenebilen minimum DNA miktarı, 0,5 cm genişliğindeki bir bantta, 2 ng dır. Bu genişlikteki bir bantta 500 ng dan daha fazla DNA varsa kuyucuk aşırı yüklenecektir ve bu da bulanıklığa yol açacaktır. Yürütme tamponunun üç görevi vardır: Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA nın kuyuya eşit bir şekilde yayılmasını sağlamak Örneğe renk katmak ve bu sayede yükleme işlemini basitleştirmek, Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda anoda doğru hareket eden örneğe renk vermek
Agaroz Jel Elektroforezi 8 Deneysel NOT Etidiyum bromid güçlü bir mutajen/karsinojendir ve orta düzeyde toksiktir. Etidiyum bromid içeren jellere ve solüsyonlara elle dokunurken mutlaka eldiven giyilmelidir. Malzeme Güç kaynağı olan yatay elektroforez ünitesi Mikrodalga fırın yada ısıtıcılı karıştırıcı Mikropipetler 1,5 ml reaksiyon tüpleri Terazi (0.1 g tartabilen) Spatulalar Reaksiyon tüpleri için taşıma rafı Cam malzeme Transilluminatör (UV, 312 nm) Belgeleme için gerekli cihazlar (örn polaroid fotoğraf makinesi veya kamera) Çözeltiler Agaroz, DNA elektroforezine uygun Tris (hydroxymethyl) aminometan (Tris) (CAS 77-68-1) Borik asit Na2EDTA (CAS 6361-92-6) Etidiyum bromid (CAS 1239-45-8) Sukroz Ksilen siyanol FF (CAS 2650-17-1) DNA Markörleri : Lambda DNA EcoRI / Hind III (ya da benzer ve aynı amaçlı kullanılabilecek markörler) 100 bp DNA ladder
Agaroz Jel Elektroforezi 9 10x TBE Tamponu (1 litre) Tris 54,0 g Borik Asit 27,5 g Na 2 EDTA 7,44 g Tartılan kimyasallar deiyonize suda çözülür, ph 8,3 e ayarlanır ve 1 litreye tamanlanır. Oda sıcaklığında depolanır. 6x Yükleme tamponu (10 ml) Ksilen siyanol FF 0,025 g Sukroz 4 g Sukroz ve Ksilen siyanol FF 10 ml çözelti hazırlamak üzere deioynize suya eklenir. Çözelti iyice karıştırılır ve otoklavlanır. Otoklavlandıktan sonra 4 C de saklanır.
Agaroz Jel Elektroforezi 10 Prosedür Temiz ve kuru plastik bir jel tepsisinin kenarları bantla ya da başka bir şekilde kapatılır.agaroz solüsyonu eklendiğinde yükleme kuyuların oluşması için uygun tarak yerleştirilir. Elektroforez haznesini doldurmak ve jeli hazırlamak amacıyla 10x TBE tamponu, uygun miktarda 0,5x TBE tamponu elde etmek için seyreltilir. Analiz edilecek örneğe ait standart çalışma prosedürü tarafından önerilen miktarda toz agaroz tartılır. Agaroz jel konsantrayonunu belirlemek için mutlaka analizi yapılacak örneğe ait standart çalışma prosedürüne bakılmalıdır. Buna göre agaroz jel elektroforezi uygulanacak örnek, izole edilen DNA ya da elde edilen PCR ürünü olabilir. Toz halindeki agaroz Tablo 2 ye göre tartılır ve bir Erlenmeyerde uygun miktarda 0,5x TBE tamponuna eklenir (genellikle 15x15 cm bir jel tepsisi için 150 ml jel solüsyonu ve 15x10 cm bir jel tepsisi için 100 ml jel solüsyonu kullanılır). Tablo 2. Kurs sırasında kullanılan agaroz jel konsantrasyonları. GMO3 GMO4 ZEIN3 ZEIN4 p35s-cf3 p35s-cr4 HA-nos118-f HA-nos118-r CRYIA3 CRYIA4 GMO7 GMO8 mg3 mg4 genomik DNA % 0,8-1 X % 1,5 X X % 2 X X X X X Karışım agaroz eriyene kadar, kaynayan bir su banyosunda ya da mikrodalga fırında ısıtılır (ısıttıktan sonra solüsyonun hacmi kontrol edilir) Karışım 50-60 C ye kadar soğutulduktan sonra 10 mg/ml stok solüsyonundan son konsantrasyon 0,2 µg/ml olacak şekilde etidiyum bromid ilave edilir ve iyice karıştırılır ( jeli köpürtmemeye, kabarcık oluşturmamaya dikkat ediniz). Solüsyon jel tepsisine dökülür ve jelin katılaşması beklenir. Oluşan jelin kalınlığı yaklaşık 3-5 mm olmalıdır. Jel tamamen katılaştıktan sonra tarak ve bant dikkatli bir şekilde çıkarılır ve jel elektroforez haznesine yerleştirilir. Jeli 2-5 mm derinliğinde kaplaması için yeterli miktarda 0,5x TBE tamponu elektroforez ünitesine eklenir.
Agaroz Jel Elektroforezi 11 Genomik DNA için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde gerçekleştirilir. Örnek Markör Su 3 µl Su 6 µl Yükleme tampon 2 µl Yükleme tamponu 2 µl Örnek 5 µl DNAEcoRI/HindIII 2 µl 10 µl 10 µl PCR ürünleri için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde gerçekleştirilir. Örnek Markör Yükleme tamponu 2 µl Örnek 8 µl 100 bp DNA Ladder 15 µl 10 µl Her örnegin 10 µl si birbirini izleyen kuyulara, uygun DNA markörü ilk ve son kuyucuğa yüklenir. DNA nın anoda doğru hareket edeceği biçimde jel haznesinin kapağı kapatılır ( anod jelin alt ucunda). 5-10 V/cm voltaj uygulanır. Ksilen siyanol jelin içinde uygun uzaklığa hareket edene kadar elektroforez yürütülür (yaklaşık 40-60 dakika). Akım kapatılır, elektrodlar ve jel haznesinin kapağı çıkartılır. Dışarı alınan jel UV ışık kutusunun üstüne yerleştirilir ve fotoğrafı çekilir. Jel etidiyum bromid katı çöp kutusuna atılır.
Agaroz Jel Elektroforezi 12 Kaynaklar Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, chapter 6. Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.