1 2 3 7 8 9 4 5 6 Yeni Nesil Dizileme Prensipleri Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD
NGS Yeni Nesil Dizi Analizi Next Generation Sequencing Massively Parallel Sequencing Second Generation Sequencing Paired End Sequencing
Tarihçe En yaygın sekanslama teknolojisi Sanger sekanslama 1000-1200 bç HGP Shotgun sekanslama DNA nın enzimatik ya da mekanik olarak fragmanlara ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması Bireysel olarak okunan overlap diziler sayesinde insanın tüm genomu dizilendi Massively Parallel Sequencing in temeli
Tarihçe 1977- Sanger sekanslama 1990- HPRT geni klonlandı 1996- ABI 310 piyasaya çıktı 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi 2001- ilk insan DNA sı konsensus dizisi Sanger Lander et al., 2001; Venter et al., 2001 2004- Roche 454 2007- İlk diploid insan genomu Craig Venter whole-genome shotgun sequencing Levy et al., 2007 2008- İkinci diploid insan genomu James D Watson Roche 454 Wheeler et al., 2008 1,5 milyon $
Shendure J et al. Nature Biotechnology, 2008
NGS-2015 Steinbock LJ et al., Nanotechnology, 2015
NGS
İkinci Nesil Sekanslama Teknolojileri Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer 454 sequencing ABI SOLiD analyzer Illumina Genome Analyzer Solexa technology
Bench-top Sequencers
İllumina Solexa Teknolojisi
İllumina Solexa Teknolojisi
İllumina Solexa Teknolojisi
Sequencing By Synthesis (SBS) 3 5 Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases A T C A G T C T G C T A C G A Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat G T C A G T A C C C G A T C G A All four labelled nucleotides in one reaction High accuracy Base-by-base sequencing No problems with homopolymer repeats T 5
Clonal Single Molecule Array Technology 40 MILLION CLUSTERS PER FLOW CELL 20 MICRONS 100 MICRONS
Base Calling T G C T A C G A T 1 2 3 7 8 9 4 5 6 T T T T T T T G T
İllumina SBS Teknolojisi
MiSeq
Uygulamalar DNA Targeted Resequencing De Novo Sequencing Whole Exome Sequencing (WES) Whole Genome Sequencing (WGS) RNA Targeted Resequencing mrna Sequencing Small RNA Sequencing Total RNA Sequencing Methylation Sequencing
Hedef Zenginleştirme Metodları Meldrum C et al. Clin Biochem Rev 2011
MiSeq
MiSeq Örnek Hazırlama
Indeksleme
PCR-Sample Pooling Havuz 1 Havuz 2 Havuz 3 Havuz 4 Havuz 5 1+2+3+4+5
Pool 1 P o o l 1 Pool 2 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 CFTR 14 VHL 15 LOXL1 16 HNF1A 17 BCKDHB 18 SLC6A8 19 CD40 20 CD40L 21 BRCA1 22 BRCA2 23 EPM2A 24 RET 25 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 Pool 2 P o o l 2 Pool 3 22 BRCA2 23 EPM2A 24 RET 25 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 GBA 14 GDF6 15 LOXL1 16 HNF1A 17 GCDH 18 SLC6A8 19 CD40 20 CD40L 21 BRCA1 22 BRCA2 23 LPL 24 RET 25 WFS1 26 27 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 AR 3 FGFR2 Pool 3 P o o l 3 24 RET 25 WFS1 26 27 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 AR 3 FGFR2 4 MEFV 5 WFS1 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 CAV3 14 SF1 15 LOXL1 16 HNF1A 17 RMRP 18 TACİ 19 CTSK 20 BRCA1 21 BRCA2 22 SERPİNA1 23 EPM2A 24 ELA2 25 RET
MiSeq Örnek Yükleme
NGS Akış Şeması Sekanslama Görüntü işleme Okuma Alingment Varyant deteksiyonu Filtreleme
Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013
NGS Dosya Türleri Wangs S et al. Genomics and Informatics, 2013
NGS Dosya Türleri FASTAQ NGS raw datası FASTA sekans+kalite datası Wellcome Trust Sanger tarafından bulundu SAM/BAM Sequence Alignment/Map FASTAQ nun align edilmiş hali Varyant saptama algoritmalarına hazır format Kodlama şekilleri farklı
NGS Dosya Türleri VCF Variant Calling Format Align edilmiş dizideki varyantları gösterir Manifest dosyaya göre
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Analiz
MiSeq Analiz
MiSeq Analiz
BRCA2 Geni K2729N
BTD Geni c.617_619delttg
Sistemik Artefakt
NGS ve Nadir Hastalıklar Booycott et al. Nat Rev Genet, 2013
Varyant Saptama Oranı WES Ortalama 12.000 varyant WGS %90 veritabanlarında kayıtlı Ortalama 5 milyon varyant 144.000 yeni Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013
Kalıtılan Mutasyon Algoritması Boycott et al. Nat Rev Genet, 2013
www.omictools.com
Üçüncü Nesil Sekanslama Helicos HeliScope Dünyadaki ilk DNA mikroskobu Pacific Biosciences SMRT (Single Molecule Real Time) sequencer DNA polimeraz flow cell e bağlı Her nükleotid eklenmesinde ışıma
Dördüncü Nesil Sekanslama Nanopore DNA sequencer Nükleotid etiketleme ve tespiti yok Ekzonükleazla kesilen baz nanopordan geçer Polimerizasyon yok 15 dakikada WGS Çok düşük maliyet Ku CS et al. Expert Rev. Med. Devices, 2013
Oxford Nanopore Technologies