Journal of Neurological Sciences [Turkish] 31:(1)# 39; 028-039, 2014 http://www.jns.dergisi.org/text.php3?id=738 Araştırma Yazısı

Journal of Neurological Sciences [Turkish] 31:(1)# 39; 028-039, 2014 http://www.jns.dergisi.org/text.php3?id=738 Araştırma Yazısı Amiloid Beta Peptit ve Nöroaktif Steroid Uygulamasına Karşı İnsan ve Sıçan Nöronal Hücrelerinin Vital Yanıtlarının Değerlendirilmesi Özlem Gürsoy ÇALAN 1, Pınar AKAN 1, Hüsnü Alper BAĞRIYANIK 2, Meral FADILOĞLU 3 1 Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Sinir Bilimler Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 2 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 3 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye Özet Amiloid beta (Aβ) peptit ile oluşturulan toksisite Alzheimer hastalığı için geçerli in vitro nöral dejenerasyon modellerinden biridir. Sinir sisteminde sentezlenmeleri ve nörotransmitter gibi davranmaları nedeniyle nöroaktif steroidler olarak adlandırılan steroidlerin en belli başlıları pregnenolon (P), pregnenolon sülfat (PS)'tır. Sentezleri iskemi ve Aβ, glutamat uygulaması gibi iç ve dış uyaranlarla tetiklenebilen P ve PS'nin vital nöronal fonksiyonlar üzerindeki etkisi yeterince bilinmemektedir. Çalışmamızda insan ve hayvan kaynaklı iki farklı nöronal hücre hattında, P ve PS'nin Aβ uygulaması ve hücre canlılığına etkilerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Ayrıca oluşturulan in vitro nörodejenerasyon modelinde, uygulanan Aβ peptit monomerlerinin konformasyonel değişimlerinin hücre canlılığı üzerine etkisi değerlendirildi. Nöron modeli olarak kullanılan sıçan feokromasitoma (PC-12) ve insan nöroblastoma (SHSY-5Y) hücre hatları Aβ 25-35 peptit (20µM/40µM), P (0.25-100µM) ve PS (0.25-100µM) ile 24, 48 ve 72 saat muamele edildi. Aβ'nın monomerik yapıdan fibriler yapıya değişimi 37ºC'de 72 saat süresince inkübasyonu ile sağlandı. Farklı konformasyonel özelliklere sahip Aβ'nın, P ve PS'nin hücre canlılığına etkisi doz ve zaman bağımlı olarak MTT indirgenme yöntemi ve ters-faz ışık mikroskobik incelemeyle değerlendirildi. Aβ 25-35 peptit fragmanının konformasyonel değişimleri elektron mikroskobik olarak belirlendi. 20µM Aβ 25-35 'in ön inkübasyon işlemi olmaksızın monomerik yapıda SHSY-5Y'lere verilmesi 72.saate kadar hücre canlılığını etkilemezken PC-12'lerde canlılığı 24.saatten sonra anlamlı şekilde azalttı. Aβ'nın ancak 40µM dozda fibriler yapıda iken 72saat süresince uygulanmasının SHSY-5Y'lerde anlamlı toksik etki gösterdiği belirlendi.72.saatin sonunda P ve PS'nin 1µM ve üstü dozlarda uygulanmasının PC-12'lerde canlılığı kontrol grubunun %40'ı olacak şekilde azalttığı; SHSY-5Y'lerde ise ancak 5µM ve üstü dozlarda toksik etki göstermeye başladığı belirlendi. Her iki hücre hattında 0.5µM düzeyinde P uygulanmasının Aβ ile oluşturulan toksisiteye karşı koruyucu etkisi olduğu gösterildi. Çalışmamızın bulguları Aβ peptidin yapısal değişimlerinin hücre canlılığını etkileyen bir faktör olduğunu ve nöroaktif steroid düzey değişimlerinin nörodejenerasyon oluşumunda rolü olabileceğini düşündürmüştür. Anahtar Kelimeler: Nöroaktif steroid, pregnenolon, pregnenolon sülfat, amiloid beta toksisitesi 28

The Assessment of Vital Responses of Human and Rat Neuronal Cells Against to Amyloid Beta Peptide and Neuroactive Steroid Treatment Abstract Amyloid beta (Aβ) induced toxicity is an invitro neural degeneration model for Alzheimer's disease. Pregnenolone (P), pregnenolone sulphate (PS) are the major steroids produced in the neural tissue and are also called neuroactive steroids because of their behaviors like neurotransmitter. The synthesis of steroids in neural tissue could be changed by ischemia, oxidative stress or neurotoxicity namely induced by Aβ, glutamate. The potential roles of P and PS in vital neuronal functions and in Aβ peptide toxicity are not clearly identified. This work aims to investigate the effects of P, PS and Aβ on the cell viability using two separate cell lines. The effects of conformational changes in Aβ were also evaluated. Rat pheochromocytoma (PC-12) and human neuroblastoma (SHSY-5Y) cell lines were treated with Aβ 25-35 (20/40µM) and variable concentrations of P and PS ranging from 0.25µM to 100µM. The cell viability was evaluated with MTT reduction assay and reverse-phase microscopy. The conformational changes of Aβ peptides were induced with 72 hours incubation at 37ºC. The structural changes of Aβ were evaluated with electron microscopy. The treatment with 20µM Aβ 25-35 monomers did not affect SHSY-5Y cell viability, the significant toxicity was observed only with 40µM Aβ 25-35 fibrils after 72hours. However the significant reduction in PC-12cell viability was obtained by the treatment with 20µM Aβ 25-35 monomers. In PC-12 cell lines, the viability was decreased to 40% of control group by the treatment with 1µM and higher concentrations of P and PS separately. This same effect was observed in SHSY-5Y cells with 5µM and higher concentrations of steroids.0.5µm P showed protective effect against Aβ 25-35 induced toxicity in both cell lines. Our results suggest that Aβ fibrillogenesis and neuroactive steroid may play causal roles in the neurodegenerative processes. Keywords: Neuroactive steroid, pregnenolone, pregnenolone sulphate, amyloid beta toxicity GİRİŞ Beyinde ya da sinir sisteminde sentezlenen, alışılmışın dışında orijinleri ve farklı fonksiyonları nedeniyle nörosteroidler olarak isimlendirilen steroid hormonların en belli başlılarından biri pregnenolon (P) ve pregnenolon sülfat (PS)'tır (11,3). Bir nörotransmitter gibi de davranabilen P'nin sentezi nöroglial hücre mitokondrisinde kolesterolden side-chain cleavage (P450scc/Cyp-11a) enzim katalizi ile gerçekleşir (30). Hafıza ve bilişsel fonksiyonlarla yakın ilişkili olan pregnenolon sülfat ise sitoplazmada sülfotranferaz (SULT2) enzimi yardımı ile P'den oluşur (4,26). Sinir sisteminde steroid sentezinin artmasının nöronal apoptozun erken bir kanıtı olabileceği ileri sürülürken (16), dışarıdan verilen östrojen ve pregnenolon (P) gibi steroidlerin nöron ölümünü önleyebildiği (17,25), PS'nin ise nöronal hücre ölümünü tetikleyebildiği gösterilmiştir (8). Sinir sisteminde fizyolojik olarak yaklaşık 1 µm konsantrasyonda bulunan P ve PS'nin (26), düzeylerindeki herhangi bir değişimin vital nöronal fonksiyonlar üzerindeki etkisi günümüzde henüz yeterince aydınlatılmamış bir konudur. Amiloid beta (Aβ) peptit fragmanları ile oluşturulan toksisite Alzheimer hastalığı (AH) için geçerli in vitro nöronal dejenerasyon modellerinden biridir. PC-12 ve SHSY-5Y hücre hatları AH da dahil olmak üzere nöronal hastalıkların patogenezinin araştırıldığı çalışmalarda hücresel bir model olarak sıklıkla kullanılır. PC-12 hücre hattı sıçan nöral krestinden köken alan nöroendokrin özelliğe sahip kromaffin hücrelerinden 29

gelişen bir tümöral hattır. SHSY-5Y hücre hattı ise insan embriyonik nöral kresttinden kaynaklanan primitif, pluripotent sempatik hücrelerden köken alır (18). Farklı kaynaklı bu iki hücre hattının sahip olduğu nöronal fonksiyonlar orjinlerine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Ayrıca dışarıdan uygulanan Aβ peptit fragmanlarının amino asit sayıları yanı sıra sahip oldukları üç boyutlu yapılar da nöronal hücreler üzerinde farklı etkiler gösterebilir. Biz çalışmamızda P ve PS uygulamasının doza bağlı olarak nöronal hücre canlılığı üzerine etkileri yanı sıra farklı formlardaki Aβ 25-35 uygulamasına karşı oluşturacağı vital yanıtları insan ve hayvan kaynaklı iki farklı nöronal hücre hattında karşılaştırmalı olarak değerlendirmeyi amaçladık. Çalışmamız ile nöronal dokunun olağan bir bileşeni olan nörosteroidlerin düzey değişimlerinin nöronal hasar oluşum mekanizmasındaki olası rolüne ve Aβ peptide bağlı oluşan toksisite üzerindeki etkisine açıklık getirmek mümkün olabilir. GEREÇ VE YÖNTEM Kimyasallar ve Sarf Malzemeler Aβ peptit (25-35) fragmanı, poli-d-lizin, 5-pregnen-3-ol-20-one (pregnenolon), pregnenolon sülfat, formvar kaplı bakır grid Sigma Chemical Co., St. Louis, ABD.'den, Dimetil sülfoksid (DMSO) Merck Chemicals (Almanya)'dan temin edildi. P ve PS DMSO içinde çözüldü ve DMSO final konsantrasyonu 1 % olacak şekilde hücre kültür ortamı ile dilüe edildi. Tüm hücre kültür malzemeleri Seromed Biochrom FKG (Almanya)'dan, 3-(4.5- Dimetyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide (MTT) Applichem Chemica Synthesis Services (Almanya)'dan temin edildi. Hücre Kültürü Nöronal hücre kültür modeli olarak kullanılan sıçan feokromositoma kaynaklı PC-12 ve insan nöroblastoma kaynaklı SHSY-5Y hücre hatları DSMZ hücre bankası (Almanya)'dan temin edildi. PC-12 hücreleri hücre kültür kapları poli-d-lizin ile kaplandıktan sonra, SHSY-5Y hücreleri ise direkt olarak 96 ve 6 kuyulu plakların her bir kuyusuna sırasıyla 2x10 4 veya 2x10 6 yoğunluğunda olacak şekilde ekildi. Uygulamalar öncesi, PC-12 hücreleri poli- D-lizin kaplı plaklarda (96/ 6 kuyucuklu) RPMI 1640 medium, 10% donor at serum, (DHS) 5% fetal sığır serum (FBS) ve 1% penisilin/streptomisin/l-glutamin içerisinde ekilerek 24 saat süre ile plaklara yerleşmesi sağlandı. SHSY-5Y hücreleri ise benzer şekilde ancak poli-d-lizin kaplamadan plaklara DMEM medium, 17% fetal sığır serum ve 1% penisilin/streptomisin/l-glutamin içerisinde ekildi. Hücreler 37 C, 5% nem ve 95% CO 2 'li ortamda inkübe edildi. Amiloid beta peptit uygulaması 96 kuyucuklu plaklara, kuyucuk başına 2x10 4 olacak şekilde ekilen hücrelere 24 saatlik ön yerleşme süresinden sonra % 1.5-1.7 serum içeren kültür ortamı içinde 20-40 µm konsantrasyonda Aβ 25-35 peptidi önceden 37 ºC'de 72 saat inkübe ederek ve etmeden direkt olarak uygulandı. Hücre canlılıkları her iki koşulda da 24, 48, 72 saat süre boyunca değerlendirildi. Eş zamanlı olarak kontrol gruplarını oluşturmak için hücreler sadece %1.5 (PC- 12 için) ve %1.7 (SHSY-5Y için) serum içeren ortamlar ile muamele edildi. Steroid uygulaması DMSO içinde çözülerek stok solüsyonları hazırlanan P ve PS her iki hücre hattına 0.25-100 µm doz aralığında 72 saat süre ile uygulandı. Steroid uygulamasının Aβ 25-35 toksisitesi üzerine etkisini değerlendirmek için, eş zamanlı olarak hücre canlılığını yaklaşık % 50 azaltan konsantrasyondaki Aβ peptit ile birlikte düşük (0.5µM) ve yüksek (50µM) konsantrasyonlarda steroidler 72 saat boyunca uygulandı. Uygulama sonrası hücre canlılıkları MTT indirgenme ölçümü ve ters faz ışık mikroskobik olarak değerlendirildi. 30

MTT indirgenme ölçümü MTT indirgenme yöntemi, mitokondrial bir enzim olan süksinat dehidrogenaz enziminin 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır. Tetrazolium halkasının parçalanması sonucu soluk sarı renkli MTT boyası koyu mavi-mor formazan ürününe dönüşmekte ve canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamış hücrelerin bulunduğu ortam mor renge boyanmaktadır (28,23,5). MTT indirgenme ölçümü için 5 mg/ml oranında PBS içerisinde hazırlanan MTT solüsyonundan son konsantrasyon 0.5 mg/ml olacak şekilde hücre kültür ortamlarına eklendi. 37 C'de 2-4 saat inkübasyondan sonra, santrifüj sonrası üste kalan hücre kültür ortamları atılarak presipite reaksiyon ürününü solubilize etmek için 200 µl DMSO eklendi. 37 C'de 30 dakikalık inkübasyon sonrası absorbanslar 565 nm'de (referans dalga boyu 650 nm) spektrofotometrik olarak ölçüldü. Sonuçlar, kontrol hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edildi. Elektron mikroskobik görüntüleme Elektron mikroskobik görüntüleme için inkübe edilen ve edilmeyen 4 µm konsantrasyonunda iki farklı Aβ 25-35 peptit örneği hazırlandı. İnkübe edilmeyen örnek mikroskobik görüntülemeden hemen önce saf su içindeki 1mM'lık ana stoktan %1.7 serum içeren ortam ile seyreltilerek taze olarak hazırlandı. Diğer örnek ise 37ºC'de 72 saat süre ile inkübe edilerek farklı peptit formlarının oluşumu sağlandı. Örnekler formvar kaplı bakır gridlere damlatıldı ve kurumaya bırakıldı. Daha sonra Carl Zeiss Libra 120 EFTEM (Almanya) transmisyon elektron mikroskobu ile dijital olarak fotoğraflandı. JPEG formatında kayıt edilen dijital fotoğraflar UTHSCSA Image Tool for Windows (3.00) dijital fotoğraf analiz programı ile örneklere ait damlacık çaplarının ölçümleri yapıldı. İSTATİSTİKSEL ANALİZ Oluşturulan tüm deney koşulları her iki hücre hattında kendi içinde üçer kez ve farklı zamanlarda en az 3 kez çalışıldı. Gruplar Mann-Whitney U testini takip eden Kruskal-Wallis testi ile kıyaslandı. p değeri 0.05'in altında olanlar anlamlı kabul edildi. Sonuçlar ort ± SEM (ortalama±ortalamanın standart hatası) olarak verildi. BULGULAR Aβ 25-35 peptit monomerlerinin 37 C'de 72 saat süresince bekletilmesi, proteinin konformasyonel değişime uğrayarak anüler yada fibriler farklı yapısal formlara dönüşmesine neden oldu. 72. saatin sonunda Resim 1- C'deki olgun fibriler formdaki görünümün hakim olduğu saptandı. 20 µm Amiloid beta 25-35 fragmanın herhangi bir inkübasyon ön işlemi uygulanmadan, SHSY-5Y hücrelerine direkt olarak verilmesi 72. saate kadar hücre canlılığını etkilemezken, PC-12 hücrelerinde ise canlılığı 24. saatten sonra anlamlı bir şekilde azalttı (Şekil 2). Aβ 25-35 peptidinin ancak 40 µm dozda ve 37 C'de 72 saat süresince inkübe edildikten sonra uygulanmasının SHSY-5Y hücrelerinde anlamlı toksik etki ortaya çıkardığı gözlendi (Şekil 1 ve 3). Saf su içindeki 1 mm'lık ana stoktan %1.7 serum içeren ortam ile seyreltilerek hazırlanan 4 µm konsantrasyonundaki Aβ25-35 peptit örneği 37ºC'de 72 saat boyunca inkübe edilerek farklı yapısal formlara dönüştürüldü (Resim 1). 31

Resim 1: 37ºC'de 72 saat boyunca inkübe edilen Aβ25-35 peptidi A; Anüler agrege B; Nodüler protofibriler formları ve daha sonra C; Olgun fibriler formları oluşturdu. D; Olgun fibrilleri oluşturan protein aggregatları görülmektedir. PC-12 hücrelerine 24 saat süreyle 20 µm Aβ 25-35 peptidi direkt olarak uygulandığında MTT redüksiyonu yöntemi ile değerlendirme sırasında hücre canlılığında kontrole kıyasla azalma olsa da bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ancak 48 ve 72 saat boyunca 20 µm Aβ 25-35 peptidi ile muamele edilen PC- 12 hücrelerinin canlılıkları kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düşük bulundu (sırasıyla p=0.001 ve p=0.000) (Şekil 2). SHSY-5Y hücrelerine 72 saat boyunca 37 C'de inkübe edilerek fibriler form oluşumu sağlanan 40 µm Aβ 25-35 peptidinin 24. saatin sonunda hücre canlılığında kontrole kıyasla anlamlı azalma yaratmadığı gözlendi. SHSY-5Y hücrelerinin canlılıkları ancak hücreler 48 ve 72 saat süreyle fibriler Aβ 25-35 peptidine maruz bırakıldığında kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı azalma tespit edildi. (sırasıyla p=0.003 ve p=0.000) (Şekil 3). PC-12 hücrelerine P ve PS'nin 1 µm'ların altındaki dozlarda dışarıdan uygulanması hücre canlılığında 72 saate kadar anlamlı etki göstermezken, 1 µm'ın üstündeki konsantrasyonlarda canlılığı kontrol grubunun yaklaşık % 40'ı olacak şekilde azalttığı gözlendi. SHSY-5Y hücrelerinde ise bu steroidlerin 5 µm'ın üstündeki dozlarda toksik etki göstermeye başladığı ve bu toksik etkinin 40 µm ve üstündeki dozlarda hücre canlılığını ortalama % 20'e düşürdüğü belirlendi (Şekil 4 ve Şekil 5) Her iki hücre hattına 72 saat süreyle Aβ 25-35 peptidi ve Aβ 25-35 peptidi ile birlikte eş zamanlı olarak düşük (D: 0.5 µm) ve yüksek (Y: 50 µm) dozlarda pregnenolon (P) ve pregnenolon sülfat (PS) uygulandı. Daha önceki çalışmamızda da elde ettiğimiz veriler gibi (1) PC-12 hücrelerine 20 µm Aβ 25-35 verildiğinde hücre canlılığında kontrole kıyasla anlamlı azalma gözlendi (p=0.000). Aβ 25-35 peptidi ile eş zamanlı olarak 0.5 µm P uygulanan hücrelerin canlılıkları sadece Aβ uygulanmış gruba göre istatistiksel olarak anlamlı artış gösterdi (p=0.001). Diğer yandan Aβ ile birlikte uygulanan 0.5 µm PS, 50 µm P ve 50 µm PS hücrelerin canlılıklarında sadece Aβ verilen gruba 32

göre istatistiksel olarak anlamlı azalmaya neden oldu (sırasıyla p=0.006, p=0.018, p=0.005) (Şekil 6). SHSY-5Y hücrelerinde de Aβ ile birlikte eş zamanlı 0.5 µm P uygulamasının hücre canlılığını tek başına Aβ uygulanmış gruba göre istatistiksel olarak anlamlı arttırdığı saptandı (p=0.002). PC-12 hücrelerinden farklı olarak 0.5 µm PS ve 50 µm P'nin Aβ ile birlikte 72 saat boyunca uygulanması ise hücre canlılıklarında, sadece Aβ uygulanan gruba göre anlamlı bir değişiklik oluşturmadı. Aβ ile birlikte 50 µm PS ile muamele edilen hücrelerin canlılıkları ise tek başına Aβ uygulanmış gruba göre istatistiksel olarak anlamlı düşük bulundu (p=0.023). Diğer taraftan yine PC-12 hücrelerinden farklı olarak SHSY-5Y hücrelerinde Aβ ile birlikte düşük doz PS uygulamasının canlılığı yaklaşık %10 oranında arttırdığı saptandı (Şekil 7) Şekil 1: Direkt olarak uygulanan ve ön işlem ile olgun fibriler forma dönüştürülerek uygulanan 40 µm Aβ25-35 peptidin 72. saat sonunda SHSY-5Y hücre canlılığına etkisi (*p<0.005) (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) Şekil 2: Ön işleme tabi tutulmamış 20 µm Aβ25-35 muamelesinin 24., 48. ve 72. saatlerin sonunda PC-12 hücre canlılığına etkisi (*p<0.005) (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) 33

Şekil 3: Ön işleme tabi tutulan 40 µm Aβ25-35 peptit uygulamasının 24., 48. ve 72. saatlerin sonunda SHSY-5Y hücre canlılığına etkisi (*p<0.005) (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) Şekil 4: Farklı dozlarda steroid uygulamasının PC-12 hücre canlılığına etkisi (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) Şekil 5: Farklı dozlarda steroid uygulamasının SHSY-5Y hücre canlılığına etkisi (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) 34

Şekil 6: PC-12 hücre hattında farklı dozlarda P ve PS uygulamasının Aβ25-35 toksisitesi üzerine etkisi. Aβ+P/PS(D): 72 saat boyunca 20 µm Aβ25-35 ile birlikte 0.5 µm steroid uygulanan hücreler. Aβ+P/PS(Y): 72 saat boyunca 20 µm Aβ25-35 ile 50 µm steroid uygulanan hücreler.(*p<0.005, **p<0.005, ***p<0.05) (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) Şekil 7: SHSY-5Y hücre hattında farklı dozlarda pregnenolon (P) ve pregnenolon sülfat (PS) uygulamasının Aβ25-35 toksisitesi üzerine etkisi. Aβ+P/PS(D): 72 saat boyunca 40 µm olgun fibriler formdaki Aβ25-35 ve 0.5 µm steroid uygulanan hücreler. Aβ+P/PS(Y): 72 saat boyunca 40 µm olgun fibriler formdaki Aβ25-35 ile birlikte 50 µm steroid uygulanan hücreler. (*p<0.005, **p<0.005, ***p<0.05) (% hücre canlılık sonuçları ort ± S.E.M olarak verilmiştir, n=9) 35

TARTIŞMA Amiloid peptidin hücre dışı agregasyonu çözünür bir monomerden, çözünürlüğü kaybolmuş bir lifsel proteine değişimini içeren karmaşık bir süreçtir. Amiloid beta monomerleri öncelikle oligomerleri, daha sonra fibriller yapıları ve sonra betayapraklar şeklinde amiloid plakları oluşturur (14). Amiloid peptidin 37 C'de inkübasyonu ile tipik 3-20 nm arasındaki sferik yapısının 5 saatlik bir sürede protofibriler yapıya dönüştüğü ve bu protofibrillerin 24 saatlik inkübasyondan sonra matür fibrilleri oluşturmaya başladığı elektron mikroskobik olarak gösterilmiştir (27). Agregasyon süreci içinde fibriler agregatlar yanı sıra anüler agregatlar da oluşabilir (Şekil 8) (13). Bizim çalışmamızda 25-35 fragmanının, bütün amiloid beta peptit yapısının gösterdiği konformasyonel değişimleri gösterebildiği ve benzer agrege formları kolaylıkla oluşturduğu gözlenmiştir. Şekil 8: Aβ monomerlerinin agregasyonu ve fibrilizasyonu 17 AH'ın patolojik amiloid protein kaskadında beta sekretaz enzimi amiloid prekürsör proteinden üretilen 39-43 aminoasitlik amiloid beta peptitlerinden Aβ 1-42, diğer formlara göre çok daha hidrofobiktir ve ekstra-nöronal deposizyonlarda Aβ 1-40 ile beraber predominat olarak bulunur (19). Bununla beraber AH beyin dokusunda Aβ 11-40/42 ve Aβ 25-35 gibi çözünebilir oligomerlerin birikimi de gösterilmiştir (10,12). Aβ 25-35 amiloid betanın aktif bölgesidir ve in-vitro nörodejenerasyon modellerinde sıklıkla kullanılır. Bizim çalışmamızda da amiloid beta toksisitesi oluşturmak için amiloid beta peptidinin direkt toksik etki gösterebilen bu fragmanı tercih edilmiştir. Bizim çalışmamızda amiloid betanın 25-35 fragmanının 72 saatlik 37 C'deki inkübasyonunun protein yapısında oluşturduğu değişimler elektron mikroskobik olarak izlendi ve peptidin monomer yapıdan fibriler yapıya değişimi saptandı. Ön inkübasyon işlemine tabi tutulmayan monomer yapıdaki Aβ 25-35 36

peptidinin, PC-12 hücrelerinde toksisite oluştururken, ilginç olarak SHSY-5Y hücrelerinde 72 saate kadar herhangi bir toksisite oluşturmadığı belirlendi. Ancak 72 saatin sonunda olgun fibriler yapıya kavuşmuş peptit SHSY-5Y hücrelerinde hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı. Aβ peptid monomerlerinden öncelikle oluşan oligomer yapılarının daha çok sinaptik iletim üzerinden etkili olduğu, daha sonra oluşan fibrillerin ve amiloid plakların ise tau fosforilasyonunu tetiklediği bilinmektedir (14). Amiloid beta oligomerleri nöronların plasma membranına bağlanarak, iyon geçirgen porların oluşumu ile lipit peroksidasyonunu tetikleyerek nöronal ölümle sonuçlanan patolojik kaskadı başlatır. Hücre mebranının hasarı kalsiyum hemostazisini bozmanın yanı sıra glutamat eksitotoksitesini etkili hale getirebilirler. Ayrıca eksitotoksik aminoasitler dışında serbest radikal oluşumunu da tetikleyebilirler (7,24,2,20,32). Diğer taraftan adrenal medulladan ve santral sinir sisteminin kromaffin hücrelerinden köken alan PC-12 hücrelerinin nöronlara göre daha çok endokrin fonksiyona sahip olduğu akson ve dendritleri olmaksızın nörotransmitterlerini direkt olarak dolaşıma sekrete edebildiği gösterilmiştir (29). Çalışmamızdaki insan nöroblastoma kaynaklı SHSY-5Y hücrelerinin monomer peptit uygulamasına karşı saptanan dayanıklılığı, bu hücre hattında hücreler arası sinaptik iletişim ile tetiklenebilen nöroprotektif bir mekanizma oluşabildiğini düşündürmektedir. Bununla beraber olgun fibrillerin monomerik peptit formlarına göre çok daha hidrofobik ve daha lipofilik oldukları göz önüne alındığında bu konformasyonel yapıda hücre membranına daha kolay bağlanabildikleri de düşünülebilir. Diğer taraftan hücre membranına lokalize amiloid prekürsör proteinden oluşan Aβ oligomerlerinin hücre membranındaki kolesterol ve glikosfingolipidlerce zengin olan lipid raftlar ile etkişim sürecinde oluştuğu gösterilmiştir (31). Biyolojik lipid membranlar protein katlanma dinamikleri ve protein agregasyon hızını değiştirebilmektedir. Farklı membran lipid kompozisyonlarının Aβ agregasyonunda bazı rollere sahip olabileceği düşünülmektedir (14,31,22). PC-12 hücrelerinin membran lipid içeriği dışarıdan uygulanan amiloid beta peptidin katlanma dinamiğini ve agregasyon hızını değiştirmiş olabilir. PC-12 ve SHSY-5Y hücrelerinin Aβ 25-35 peptidine karşı verdikleri farklı yanıtların nedenleri hücrelerin haberleşme ve savunma mekanizmaları yanı sıra hücre makromoleküler yapılarını da inceleyen daha ileri çalışmalar ile ortaya konabilecektir. Ayrıca insan nöroblastoma kaynaklı hücrelerde ancak olgun fibriler formdaki amiloid betanın toksisite oluşturabilmesi, insan nöronal hücrelerinde amiloid beta toksisitesinden korunma ve yeni tedavi seçeneklerini ortaya koymak için, peptidin fibriler yapıya dönüşümünü önlemeye yönelik çalışmalara odaklanılması gerekliliğini de düşündürmüştür. Çalışmamızın bulgularına göre fizyolojik konsantrasyondaki P ve PS uygulaması nöronal hücre canlılığını etkilememektedir. Fizyolojik durumlar dışında hastalık ve stres durumlarında tetiklenebilen steroid sentezi, nöronal dokuda toksisitenin bir başlangıcı olabilir (6,15,21). Çalışmamızda uygulanan steroidlerin fizyolojik düzeyin üstündeki mikromolar konsantrasyonlarında gözlenen nöronal toksisite daha önce yapılan pekçok çalışmanın bulguları ile uyumlu görünmektedir (8,1,9). Diğer taraftan P ve PS'nin yüksek dozlarında görülen bu toksisitenin SHSY-5Y hücrelerinde PC- 12'lere göre yaklaşık 5 kat yüksek bir dozda başlaması ilgi çekici bir bulgudur. Çalışmamızın bulgularına göre sıçan feokromasitoma hücreleri, insan nöroblastoma hücrelerine göre hem amiloid beta hem de steroid uygulamasına karşı çok daha hassas görünmektedir. 37

Daha önceki çalışmamızda PC-12 hücrelerinde elde ettiğimiz veriler gibi (1) düşük doz olarak belirlediğimiz 0.5 µm P'nin Aβ ile birlikte eş zamanlı uygulanması SHSY-5Y hücrelerinde de toksisiteyi sadece Aβ uygulanan guruba göre anlamlı olarak azaltmış ve koruyucu etki göstermiştir. Ancak P'nin 50 µm dozda uygulanması bu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmış ve hatta hücre ölümünü arttırmıştır. Aynı zamanda hafıza ile ilişkili bir nörotransmitter olan P'nin sülfat esterinin dışarıdan uygulanması ise hücrelerde P'den farklı bir vital yanıt oluşturmuştur. İlgi çekici olarak PC-12 hücrelerinde düşük doz PS ile görülen anlamlı Aβ toksisitesini arttırıcı etki, SHSY-5Y hücrelerinde toksisiteyi artırmamış hatta istatistiksel olarak anlamlı olmasa da canlılığı yaklaşık olarak % 10 artırmıştır. Sonuç olarak çalışmamızda farklı kökenli, iki nöronal hücre hattında Aβ ve steroid uygulamasına karşı hücrelerin doz ve zamana bağlı yanıtlarının değişmesine rağmen, birer nöroaktif steroid olan P ve PS'nin fizyolojik düzeylerinin üstündeki artışlarının hücre canlılığını olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca düşük düzeyde (0.5 µm) dışarıdan P uygulamasının her iki hücre hattında da amiloid beta toksisitesine karşı koruyucu etkisi belirlenmiştir. Hücre hatları arasında steroid ve Aβ uygulaması sonrası gözlenen farklı yanıtların olası nedenlerinin ortaya çıkarılması için gelecekte yapılacak invitro ve in-vivo çalışmalar özellikle Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların patogenezinin anlaşılmasına ve yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. (Bu araştırma DEÜ Araştırma Fon Saymanlığı tarafından 2006.KB.SAG.036 sayı ile desteklenmiştir.) İletişim: Özlem Gürsoy Çalan E-mail: ozlemgursoycalan@yahoo.com Gönderilme Tarihi: 07 Şubat 2013 Revizyon Tarihi: 21 Ocak 2014 Kabul Tarihi: 22 Ocak 2014 The Online Journal of Neurological Sciences (Turkish) 1984-2014 This e-journal is run by Ege University Faculty of Medicine, Dept. of Neurological Surgery, Bornova, Izmir-35100TR as part of the Ege Neurological Surgery World Wide Web service. Comments and feedback: E-mail: editor@jns.dergisi.org URL: http://www.jns.dergisi.org Journal of Neurological Sciences (Turkish) Abbr: J. Neurol. Sci.[Turk] ISSNe 1302-1664 KAYNAKLAR 1. Akan P, Kizildag S, Ormen M, Genc S, Oktem MA, and Fadiloglu M. Pregnenolone protects the PC-12 cell line against amyloid beta peptide toxicity but its sulfate ester does not. Chem Biol Interact 2009; 177 (1):65-70. 2. Aksenov M, Aksenova M, Butterfield DA, and Markesbery WR. Oxidative modification of creatine kinase BB in Alzheimer's disease brain. J Neurochem 2000; 74 (6):2520-2527. 3. Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology 1998; 23 (8):963-987. 4. Beaujean D, Mensah-Nyagan AG, Do-Rego JL, Luu- The V, Pelletier G, and Vaudry H. Immunocytochemical localization and biological activity of hydroxysteroid sulfotransferase in the frog brain. J Neurochem 1999; 72 (2):848-857. 5. Boada J, Cutillas B, Roig T, Bermudez J, and Ambrosio S. MPP(+)-induced mitochondrial dysfunction is potentiated by dopamine. Biochem Biophys Res Commun 2000; 268 (3):916-920. 6. Brown RC, Cascio C, and Papadopoulos V. Pathways of neurosteroid biosynthesis in cell lines from human brain: regulation of dehydroepiandrosterone formation by oxidative 38

stress and beta-amyloid peptide. J Neurochem 2000; 74 (2):847-859. 7. Butterfield DA, and Lauderback CM. Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer's disease brain: potential causes and consequences involving amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress. Free Radic Biol Med 2002; 32 (11):1050-1060. 8. Cascio C, Guarneri R, Russo D, De Leo G, Guarneri M, Piccoli F, and Guarneri P. Pregnenolone sulfate, a naturally occurring excitotoxin involved in delayed retinal cell death. J Neurochem 2000; 74 (6):2380-2391. 9. Cascio C, Guarneri R, Russo D. A caspase-3- dependent pathway is predominantly activated by the excitotoxin pregnenolone sulfate and requires early and late cytochrome c release and cell-specific caspase-2 activation in the retinal cell death. J Neurochem 2002; 83 (6):1358-1371. 10. Chow VW, Mattson MP, Wong PC, and Gleichmann M. An overview of APP processing enzymes and products. Neuromolecular Med 2010; 12 (1):1-12. 11. Compagnone NA, and Mellon SH. Neurosteroids: biosynthesis and function of these novel neuromodulators. Front Neuroendocrinol 2000; 21 (1):1-56. 12. Evin G, and Weidemann A. Biogenesis and metabolism of Alzheimer's disease Abeta amyloid peptides. Peptides 2002; 23 (7):1285-1297. 13. Fändrich IMaM. Assembly of Alzheimer's Aβ peptide into nanostructured amyloid fibrils. Current Opinion in Colloid & Interface Science 2011; vol. 16, no. 6:508-514. 14. Finder VH, and Glockshuber R. Amyloid-beta aggregation. Neurodegener Dis 2007; 4 (1):13-27. 15. Guarneri P, Guarneri R, Cascio C, Pavasant P, Piccoli F, and Papadopoulos V. Neurosteroidogenesis in rat retinas. J Neurochem 1994; 63 (1):86-96. 16. Guarneri P, Russo D, Cascio C, De Leo G, Piccoli F, and Guarneri R. Induction of neurosteroid synthesis by NMDA receptors in isolated rat retina: a potential early event in excitotoxicity. Eur J Neurosci 1998; 10 (5):1752-1763. 17. Hosoda T, Nakajima H, and Honjo H. Estrogen protects neuronal cells from amyloid beta-induced apoptotic cell death. Neuroreport 2001; 12 (9):1965-1970. 18. http://www.dsmz.de/catalogues/catalogue-humanand-animal-cell-lines.html (DSMZ: Catalogue Human and Animal Cell Lines (DEUTSCHE SAMMLUNG VON MİKROORGANİSMEN UND ZELLKULTUREN)) [cited]. 19. Irie K, Murakami K, Masuda Y, Morimoto A, Ohigashi H, Ohashi R, Takegoshi K, Nagao M, Shimizu T, and Shirasawa T. Structure of betaamyloid fibrils and its relevance to their neurotoxicity: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease. J Biosci Bioeng 2005; 99 (5):437-447. 20. Janciauskiene S, Wright HT, and Lindgren S. Fibrillar Alzheimer's amyloid peptide Abeta(1-42) stimulates low density lipoprotein binding and cell association, free radical production and cell cytotoxicity in PC12 cells. Neuropeptides 1999; 33 (6):510-516. 21. Kimoto T, Tsurugizawa T, Ohta Y, Makino J, Tamura H, Hojo Y, Takata N, and Kawato S. Neurosteroid synthesis by cytochrome p450- containing systems localized in the rat brain hippocampal neurons: N-methyl-D-aspartate and calcium-dependent synthesis. Endocrinology 2001; 142 (8):3578-3589. 22. LaFerla FM, Green KN, and Oddo S. Intracellular amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci 2007; 8 (7):499-509. 23. Lobner D. Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death: validity for neuronal apoptosis? J Neurosci Methods 2000; 96 (2):147-152. 24. Mark RJ, Lovell MA, Markesbery WR, Uchida K, and Mattson MP. A role for 4-hydroxynonenal, an aldehydic product of lipid peroxidation, in disruption of ion homeostasis and neuronal death induced by amyloid beta-peptide. J Neurochem 1997; 68 (1):255-264. 25. Maurice T, Su TP, and Privat A. Sigma1 (sigma 1) receptor agonists and neurosteroids attenuate B25-35-amyloid peptide-induced amnesia in mice through a common mechanism. Neuroscience 1998; 83 (2):413-428. 26. Mellon SH. Neurosteroid regulation of central nervous system development. Pharmacol Ther 2007; 116 (1):107-124. 27. Milton NG, and Harris JR. Polymorphism of amyloid-beta fibrils and its effects on human erythrocyte catalase binding. Micron 2009; 40 (8):800-810. 28. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65 (1-2):55-63. 29. Olsson AK. Ras-MAPK signaling in differentiating SH-SY5Y human neuroblastoma cells ISBN 2000; 91-554-4793-4797. 30. Plassart-Schiess E, and Baulieu EE. Neurosteroids: recent findings. Brain Res Brain Res Rev 2001; 37 (1-3):133-140. 31. Rushworth JV., and Hooper NM. Lipid Rafts: Linking Alzheimer's Amyloid-beta Production, Aggregation, and Toxicity at Neuronal Membranes. Int J Alzheimers Dis 2010; 2011:603052. 32. Varadarajan S, Kanski J, Aksenova M, Lauderback C, and Butterfield DA. Different mechanisms of oxidative stress and neurotoxicity for Alzheimer's A beta(1-42) and A beta(25-35). J Am Chem Soc 2001; 123 (24):5625-5631. 39