Kluyveromyces Lactis Kullanarak Laktik Asit Üretiminin RSM ile Optimizasyonu Vahap Yönten, Nurettin Şahiner, Nahit Aktaş Yüzüncü Yıl Üniversitesi,65100 Vahap Yönten, Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Van, 65100, vyont@mynet.com Özet Yapılan çalışmada K. Lactis in kültür ortamı, laktik asit üretimi için optimize edilmiştir. Optimizasyon Cevap Yüzey Yöntemi (RSM) kullanılarak gerçekleştirildi. Laktik asit üretiminin maksimum olabilmesi için kültür ortamında biokütle derişimi mevcut olan 7 parametrenin ( laktoz (g/l), toplam amonyum (g/l), maya özütü (g/l), MgSO 4 (g/l), NaCI (g/l), ph ve sıcaklık ) etkileri Plackett-Burman programı ile elemine edildi. Bu eleminizasyonda laktoz, sıcaklık, ph ve maya özütü en etkin parametreler olarak seçildi. Bu etkin parametreler bulunarak Steepest-Ascent deneyleri gerçekleştirildi. Son olarak Merkezi Kompozit Tasarım (MKT) kullanılarak bulunan optimum noktalarla laktik asit üretimi optimize edilmiştir. Yaklaşık 17 g/l laktoz miktarı, 0.14 g/l maya özütü, 7 ph ve 26 ºC de maksimum 1.4 mg/l laktik asit üretilmiştir. Anahtar Kelimeler: Kluyveromyces Lactis, Laktik asit, Optimizasyon, Response Surface Methodology (RSM) Giriş Günümüzde mikroorganizmaların kullanım alanları teknoloji ile birlikte giderek artmaktadır. Bu kullanım alanlarını, biyoenerji (hidrojen, elektrik, metan, etan), biyokataliz (enzim, organik çözücüler), bioayırma (yağ çekirdeklerinden ağır metal analizi), çevresel (kirlilik kontrolü, toksik suların temizliği, atık suların temizliği), kimyasalların üretimi (organik asitler, polisakkaritler, biyo-sörfektantlar, butanol, 1,3- propanediol), gıda sektörü ve günlük ürünler (yoğurt, peynir altı suyu, şarap), sağlık sektörü (insan terapisi, proteinler, antibiyotikler) diye ayırabiliriz. Bu ürünlerden biride laktik asittir. Laktik asit hem kimya hem de gıda endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ekmek ununda, gıdalarda aroma ihtiyacını karşılamada vb. büyük rol oynar [1-2]. Laktik asit genellikle L. lactis, L. delbrueckii, L.helveticus, K. Lactis ve E. Coli gibi mikroorganizmaların glikoz, laktoz, peynir altı suyu ve gıda atıklarıyla muamelesi sonucunda meydana gelir [2]. Laktik asit üretimi için yapılan bir çalışmada PCS (plastik kompozit destekler) ve L. Casei kullanılarak 132 g/l laktik asit kullanılmıştır. Karbon kaynağı olarak 80 g/l glikoz kullanılmıştır [6]. Çalışmamızda laktik asitin üretim optimizasyonu için istatiksel bir program olan Cevap Yüzey Yöntemi (CYY) kullanılmıştır. Cevap Yüzey Yöntemi (CYY), gerek endüstriyel gerekse de bilimsel çalışmalarda araştırmacılar tarafından sıkça kullanılan bir yöntemdir. Yöntem matematiksel ve istatiksel verileri bir arada değerlendiren bir algoritmaya sahiptir. Endüstriyel alanda bir çok kullanım alanı olmakla beraber, literatür çalışmalarında da optimum deney şartlarını belirlemede son zamanlarda sıkça kullanılmaktadır [3]. Deneysel Çalışmalar Yaptığımız çalışmada maya kültürünün mikrobiyal büyüme koşulları, ilk önce kalibrasyon doğrusu çizilerek sonra Design Expert 6.0 deneme sürümü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu programda uygulanan istatistiksel yöntemin dayandığı temel prensip birden fazla değişkeni aynı anda değiştirerek değişkenlerin ortak etkilerinin biokütle derişiminin çoğalması ve maksimum laktik asit üretimi üzerine etkilerini araştırmak ve en iyi koşulları belirlemektir. Plaket Burmann Design (PBD), Steepest-Ascent (SA) programları maksimum biokütle derişimi için, Merkezi Kompozit Tasarım (MKT) deneyleri ise laktik asit üretimindeki optimum şartlar bulunmak üzere gerçekleştirilmiştir.
Plackett-Burman (PBD) deneyleri K. Lactis in derişmi için Laktoz, toplam amonyum, maya özütü, MgSO 4, NaCI, ph ve ortam sıcaklığı olmak üzere 7 parametre belirlendi. Diğer parametreler dummy (sahte) olarak program tarafından otomatik belirlendi ve toplam 12 deney gerçekleştirildi. K. Lactis için PBD etkileri incelenen parametreler ve düzeyleri Çizelge 1 de verilmektedir. Ayrıca parametrelerin cevap kısmına olan etkileri de Çizelge 2 de görülmektedir. Çizelge 1. K. Lactis in optimizasyonu için PBD parametreleri Değişken no Değişken Düşük düzey(-1) Yüksek düzey(+1) X 1 Laktoz 5 25 gr/l X 2 Top Amonyum 0 5 gr/l X 3 Maya Özütü 0 1.5 gr/l X 4 MgSO 4 0 0.4 gr/l X 5 NaCI 0 0.15 gr/l X 6 ph 3 7 X 7 Sıcaklık 20 o C 40 o C Çizelge 2. K Lactis nin derişimini etkileyen parametrelerinin elenmesi için PBD deneyleri ve cevap kısmına olan etkileri. Bağımısız Değişkenler No X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 D D D D Biokütle derişimi (g/l) 1 25 0 0 0 0 7 4-1 1 1-1 6.22 2 5 0 1.5 0.4 0.15 3 40 1 1 1-1 0.96 3 5 5 0 0 0 7 40 1-1 1 1 3.52 4 25 5 1.5 0 0.15 7 20 1-1 -1-1 14.85 5 25 0 1.5 0.4 0 7 20-1 -1 1 1 14.93 6 5 5 1.5 0 0.15 3 20 1 1 1 1 2.50 7 5 5 1.5 0.4 0 7 40-1 1-1 -1 11.97 8 25 5 0 0.4 0.15 3 40-1 -1-1 1 1.23 9 25 5 0 0,4 0 3 20 1 1 1-1 1.39 10 25 0 1.5 0 0 3 40 1 1-1 1 1.25 11 5 0 0 0.4 0.15 7 20 1 1-1 1 4.24 12 5 0 0 0 0 3. 20-1 -1-1 -1 2.72
Steepest Ascent (SA) deneyleri Elde ettiğimiz bilgiler dahilinde PBD ile elde edilen birinci derece eşitlikten faydalanılarak en dik artış deneyleri yapıldı. En dik artış deneyleri optimum noktanın hangi değerlere yakın olduğunu ve daha sonraki aşamada yapılacak optimizasyonunda daha spesifik değerler elde etmek için bize fikir vermektedir [4].K. Lactis için yapılan SA deneyleri Çizelge 3 de verilmiştir. Çizelge 3. K.Lactis için SA deneyleri. Laktoz Sıcaklık Maya Özütü ph Deney No Biokütle Derişimi (g/l) (gr/l) (C 0 ) (gr/l) 0 15.0 30.00 0.75 5 3.9 0 +1Δ 15.5 29.00 0.79 5.5 4.6 0 + 2Δ 16.0 28.00 0.83 6 20.4 0 + 3Δ 16.5 27.00 0.87 6.5 33.9 0+ 4Δ 17.0 26.00 0.91 7 39.2 0 + 5Δ 17.5 25.00 0.94 7.5 33.4 0 + 6Δ 18.0 24.00 0.10 8 28.6 Merkezi Kompozit Tasarım (MKT) deneyleri Merkezi Kompozit Tasarım (MKT), Cevap Yüzey Yöntemi (CYY) içerisinde bulunan ve en çok kullanılan istatiksel optimizasyon yöntemidir. Bir MKT üç kısma ayrılabilir. Bunlar iki düzey noktalar, aksiyal noktalar(iki düzey ötesi, α) ve merkez noktalardır. Yöntemin iki düzey (faktoriyel) noktaları, bir faktörün +1 veya -1 yani en yüksek veya en düşük düzeylerinden oluşur. Aksiyal noktalar, deneycinin belirlediği iki düzey noktalarının daha da ötesinde olan program tarafından Eşitlik 3 ile belirlenen ve +α ve -α değerlerdir. Program bu yolla deneycinin belirlediği düzeyleri genişleterek hatayı azaltmayı amaçlamaktadır. α = 2 k/4 (k= çalışılan bağımsız değişken sayısı) (1) Merkez noktalar ise; deneysel hatayı tahmin etmek için tekrar edilen noktalardır. Parametrelerin iki düzey (faktoriyel) noktalarının orta noktalarıdır. Sonuç olarak MKT da her bir parametrenin beş düzeyi vardır. Bunlar +1 ve -1 ile ifade edilen faktoriyel noktalar, +α ve α ile ifade edilen aksiyal noktalar, 0 olarak ifade edilen merkez noktalardır. MKT, Dizayn-Expert 6.0.5 deneme versiyonu kullanılarak uygulandı. Üç değişkenli deneylerin toplam sayısı 20 olarak tespit edildi ( = 2 k + 2k + 6 formülüne göre hesaplandı ). Burada k; değişkenlerin sayısı olarak ifade edilir. Saf hatayı tespit etmek için değişkenlerin merkez noktasında toplam 6 deney yapıldı. Optimizasyon prosedüründe yanıt lineer veya quadratik olarak seçilen değişkenlerle ilgili olabilir. Bir quadratik model eşitliği aşağıdaki gibi verilebilir [5]. Burada y β 0 : yanıt (Laktik asit üretimi) : sabit katsayı
X i : çalışılan değişkenler β i : lineer katsayı β ii : quadratik katsayı : interaksiyon katsayısı β ij Yanıt ve proses değişkenleri arasındaki etkileşimi elde etmek için ANOVA testi içeren Dizayn- Expert 6.0.5 programı kullanılarak Eşitlik 4 elde edildi. Modelin uygunluğu R 2 ile verilmekte ve istatisitksel önemi aynı programda bulunan F testi ile incelendi. Etkin parametre olarak seçilen dört değişken ile optimizasyon deneylerinde değişkenlerin kodlu ve kodsuz değerleri MKT için önerilen deney programı bu etkin parametrelerin Cevap kısmına olan etkileri Çizelge 4ve Çizelge 5 de verilmektedir. Bu programda cevap olarak laktik asit üretimi alınmıştır. Çizelge 4. MKT değişkenlerin kodlu ve kodsuz değerleri. Değişkenler Kodlu değerler - α(-1.68) -1 0 +1 +α(+1.68) Laktoz (gr/l) (X 1 ) 11 14 17 20 23 Sıcaklık( o T) (X 2 ) 20 23 26 29 32 Maya Özütü ( gr/l) (X 3 ) 0,1 0,5 0,9 1,3 1,7 ph (X 4 ) 4,0 5,5 7,0 10 Çizelge 5. Laktik asit üretimi için MKT deneyleri. Deney X 1 X 2 X 3 X 4 y 2 No Laktoz (g/l) Sıcaklık ( C 0 ) Maya Özütü(g/L) ph Laktoz Tüketimi (%) 1 17.00 26.00 1.70 7.00 25.5 2 17.00 26.00 0.90 10.00 34.5 3 20.00 29.00 0.50 5.50 34.4 4 17.00 26.00 0.90 7.00 69.8 27 17.00 32.00 0.90 7.00 13.5 28 20.00 23.00 0.50 8.50 48.5 29 17.00 26.00 0.90 7.00 73.3 30 14.00 29.00 1.30 8.50 76.2 Sonuçlar ve Tartışma Laktik asit üretiminin optimizasyonu için sadece 49 deney yapılmıştır. Sonuç olarak aşağıda verildiği gibi quadratik bir model ve üç boyutlu grafikler elde edilmiştir. Modelimiz ANOVA tablosuna göre % 80 güven aralığında olup yaptığımız çalışmanın % 60 nı açıklayabilmektedir.
Şekil 1-2-3 te bağımsız ve etkili parametrelerin interaksiyon etkileri ve cevaba olan etkileri 3 boyutlu grafikler halinde verilmektedir. Şekil 1 de görüldüğü gibi 0.9 g/l maya özütü konsantrasyonu ve 26 C sabit sıcaklıkta laktoz konsantrasyonu 14 g/l den başlayarak 17 g/l ye kadar artmış ve bu noktada maksimum laktik asit üretimi sağlanmış. 17 g/l laktoz konsantrasyonundan sonra azalmaya başlamıştır. Yine 5.5 den başlayan ph değeri yaklaşık olarak 7 de maksimuma ulaşmış ve bu noktada maksimum 1.046 g/l laktik asit üretilmiştir. ph 7 değerinden sonra azalma başlamıştır. Şekil 2 de ise sabit ph 7ve 26 C sıcaklıkta maya özütü ve laktoz konsantrasyonunun cevabı nasıl etkilediği açıkça görülmektedir. Bu grafikte yaklaşık 17 g/l laktoz miktarı, 0.14 g/l maya özütü ile maksimum 1.4 g/l laktik asit üretimi gerçekleştirilmiştir. ph 7 ve 27 ºC de maksimum 1.4 mg/l laktik asit üretilmiştir. Şekil 3 e baktığımız zaman sabit maya özütü ve laktoz konsantrasyonlarında ph ve sıcaklığın cevap üzerindeki interaksiyon etkileri görülmektedir. ph, 5.5 den başlayarak 7 ye kadar artmış ve Burda optimum noktaya ulaşarak maksimum 1.401 g/l laktik asit üretimi sağlanmıştır. Sıcaklık ise 23 ºC den başlayarak 26 ºC ye kadar artmış ve bu noktada optimuma ulaşmıştır. Bu değerde maksimum yaklaşık olarak 1.401 g/l laktik asit üretilmiştir. 2 y ( gerçek değerler) = - 38.0 + 1.25 X 1-0.59 X 2 + 1.26 X 3 + 1.80 X 4 0.036 X 1 + 0.64 X 2 2-0.09 X 2 3-0.036 X 2 4-0.056 X 1 X 2-0.009 X 1 X 3 + 0.004 X 1 X 4 + 0.0014X 2 X 3-0.054 X 2 X 4 + 0.012 X 3 X 4 (4) Laktik asit (mg/l) 1.046 0.865 0.684 0.503 0.322 9.5 8.5 ph 7.5 6.5 5.5 14 16 21 19 18 Laktoz (g/l) Şekil 1. Etkili parametrelerden laktoz ve ph ın sabit sıcaklık ile maya özütü konsantrasyonunda cevap üzerindeki etkileri (Sabit 0.9 g/l maya özütü, sabit 26 ºC sıcaklık).
Laktik asit (mg/l) 1.400 1.187 0.973 0.760 0.547 1.3 1.1 Maya özütü (g/l) 0.9 0.7 0.5 14 16 22 20 18 Laktoz (g/l) Şekil 2. Etkili parametrelerden laktoz ve maya özütü konsantrasyonunun sabit ph ile sabit sıcaklıkta cevap üzerindeki etkileri ( Sabit ph 7 ve sabit 26 ºC sıcaklık ). Laktik asit (mg/l) 1.401 1.187 0.974 0.761 0.547 29 28 26 Sıcaklık ( C) 25 23 5.5 6.3 7.0 ph 7.8 8.5 Şekil 3. Etkili parametrelerden ph ve sıcaklığın sabit laktoz ile maya özütü konsantrasyonunda cevap üzerindeki etkileri ( Sabit 17 g/l laktoz miktarı, sabit 0.9 g/l maya özütü).
Öneriler Bu çalışma sonucunda bulduğumuz model, bazı atık sularda (peynir altı suyu, melas suyu, atık su) laktik asit üretimi için kullanılabilir. Semboller PBD = Plackett-Burman RSM = Response Surface Methodology CYY = Cevap Yüzey Yöntemi CCD = Central Composite Design MKT = Merkezi Kompozit Tasarım SA = Stepest Ascent y = Cevap (laktik asit ) Kaynaklar 1. F. Leroy and L. De Vuyst., Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends in Food Sci. Technol., 15 (2004) 67. 2. Wei-Cho Huang and I-Ching Tang., Bacterial and Yeast Cultures Process Characteristics, Products, and Applications Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, Bölüm 8 Editor: Shang-Tian Yang, Bioprocessing Innovative Company, Inc., 4734 Bridle Path Ct., Dublin, Ohio 43017, USA 3. Carla, J, S, M., Silva, I,C, R. Process Biochemistry 36 1119-1124 (2001). 4. Şahan, Tekin., Atık sularda bulunan bazı ağır metallerin biyosorpsiyon ile uzaklaştırılması ve biyosorpsiyon koşullarının optimizasyonu. (Doktora tezi), Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstütisi, Van, 2008. 5. Aktas, N. Optimization of biopolymerization rate by response surface methodology (RSM), Enzyme and microbial technology. 37:441-447, 2005.