Hastane Kökenli Dirençli Bakterilerin Kontrolünde HIZLI TANI TESTLERİ Zeynep Gülay Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim dalı İzmir
Hastane Kökenli Dirençli Bakterilerin Kontrolünde HIZLI TANI TESTLERİ MRSA ve VRE için kullanılan fenotipik ve genotipik testler Hızlı TESTler: 1 Hızlı konfirmasyon Testleri: 2 Hızlı tarama (doğrudan örnekten saptama) testleri:
Çoklu Dirençli Mikroorganizmalar MRSA, VRE, GSBL(+) Gram negatifler ve nonfermentatifler özellikle hastane ortamında sorun yaratır.
MRSA ve VRE Klinik önemi Morbidite ve mortalitede artışa Hastanede yatışın uzamasına Maliyetin artmasına Yeni ve daha kapsamlı direnç mekanizmalarının gelişmesine (ör. MRSA ve VRE VRSA (ABD, 2002)), neden olmaktadır.
Çoklu dirençli bakteriler ülkemiz 2008 E.coli GSBL %41.8 Florokinolon R %52.3 K.pneumoniae GSBL %45.1 Florokinolon R %24.2 Karbapenem R %3.8 P.aeruginosa CAZ(R) %22.8; Karbapenem (R)%29.8 MRSA % 36.7 (kanbos) MRSA %81 (YBÜ VAP) VankoRE.faecium %5.9 VR E.faecalis %0.2 w w w.earss.rivm.nl
Hastanelerde ÇDM Kontrolü Siegel JD, Rhinehart E, Jackson M, Chiarello L, CDC HICPAC..Management of Multidrug Resistant Organisms In Healthcare Settings, 2006 ÇOK YÖNLÜDÜR Yönetim desteği Akılcı antibiyotik kullanımı Sürveyans Standart önlemler ve temas önlemlerinin uygulanması Çevre ile ilgili önlemler Eğitim Tedavi ve kolonizasyonun giderilmesi Arttırılmış önlemler: Rutin kontrol uygulamalarına rağmen ÇDM yayılımı sürüyorsa Bir ünitedeki ÇDM prevalansı diğer ünite ve hastanelere göre yüksekse Hastanede yeni bir ÇDM saptandıysa
Arttırılmış önlemler Aktif sürveyans kültürleri= Kolonizasyonun saptanması Çevre kontrolü ve temizliği
Neden aktif sürveyans kültürleri? Kolonize/infekte hastaların saptanması Kolonize/infekte hastalara temas önlemleri uygulanması çapraz bulaşın önlenmesi MRSA, VRE infeksiyonları ve ilişkili mortalite, morbiditenin azaltılması Hasta güvenliğinin iyileştirilmesi, bakım kalitesinin arttırlması
Buzdağı etkisi MRSA/ Infected VRE ile infekte Colonized KOLONİZE Kolonize hastalar önemli bir depo oluşturur
Active surveillance for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) decreases the incidence of MRSA bacteremia Inf Control Hosp Epidemiol, 2006; 27:1004 1008 Shitrit P, Gottesman BS, Katzir M, Kilman A, Ben Nissan Y, Chow ers M 700 yataklı hastane, MRSA endemik Haziran 2003 Haziran 2004 arası tüm yüksek riskli hastalardan yatış sırasında ASK alınıyor Temas izolasyonu ve eradikasyon ted ASK sayısı 272,57 kültür/aydan 855.83 kültür/aya çıkıyor Pozitif sürveyans kültürü sayısı %3.13 den %5.22 ye çıkıyor. Bakteriyemi insidansı 3.6 olgu / aydan 1.8 olgu aya düşüyor (p<0.001)
Aktif sürveyans kültürleri nereden alınmalı? MRSA burun anterior vestibulum Deri lezyonu olan kısımlar, boğaz, aksilla, inguinal, perirektal bölge VRE Dışkı, rektal/perirektal sürüntü ÇDM Gram negatifler: Rektal, perirektal, orofaringeal, endotrakeal, inguinal sürüntüler ve yara sürüntüleri
Gram negatif bakteriler için etkinlik tartışmalıdır Yararlıdır: Macrae ve ark. JHI 2001; 49:183 Troche ve ark ICHE 2005; 26:161 Yararlı değildir Gardam ve ark.jid 2002 186: 1754 Thouverez H ve ark ICHE 2004; 25:838 Genellikle salgın sırasında rezervuar (kolonize hasta, eşya vb) bulunması için önerilebilir. Salgın yoksa gereksiz
Hızlı sonuç ASK yararlı olabilmesi için sonuç HIZLI verilmelidir. Kolonize hastaların hızla ayrılması; dekolonizasyon uygulanması Çevre temizliği bulaşın azaltılması Kolonize olmayan hastanın izolasyonun yan etkilerinden korunması
Klasik kültür yöntemleri MRSA Mannitol tuz besiyeri (6mg/L oksasilin) TSB+ %6.5 NaCl 2 3 gün sürer. VRE Bile esculin azide agar ve sıvı by (6 8 mg/l vankomisin) 3 5 gün sürer.
Hızlı tanı yöntemleri Fenotipik yöntemler: Kromojenik besiyerleri Diğer: MRSA için 3M BacLite TM Moleküler yöntemler: Klasik ve Gerçek zamanlı PZR testleri
Metisiline dirençli S.aureus Metisilin direnci mec A geni tarafından kodlanan yeni bir PBP :PBP 2a (2 ) varlığına bağlıdır. meca, SCC mec adı verilen bir hareketli eleman tarfından taşınır Günümüze kadar VII tip SCCmec bildirilmiştir
MRSA için hızlı tanı yöntemleri
Kromojenik besiyerleri Renksiz bir kromojen ve seçici antibiyotik içeren besiyerleridir. İdeal bir besiyeri 24 saatte hem tür hem direnç özelliği olarak tanımlanmayı sağlar. Az sayıda hedef bakteriyi üretebilmesi; flora elemanlarını baskılayabilmesi; Ek doğrulama testlerine gerek olmaması istenir Moleküler testler için gerekli kurulum, maliyet ve yetişmiş personele gerek yok tur.
MRSA için kullanılan Kromojenik besiyerleri Sefoksitin (4 6mg/L) veya oksasilin (2mg/L) (ORSAB) içeren seçici besiyerleridir. 24 saatte özgüllük çok yüksektir (doğrulama gerekmez?); 48 saat, duyarlılık biraz artıyor ancak özgüllük düşüyor.
MRSA için kullanılan kromojenik besiyerleri Chrom ID (biomerieux) MRSASelect(Bio Rad) CHROMAgar MRSA (BD) ORSAB (Oxacillin resistance screening agar base) (Oxoid) MRSA Ident Agar (Heipha, Almanya) Chromogenic MRSA/Denim blue (Oxoid)
Kromojenik besiyerleri CHROM Agar MRSA(BD) Duyarlılık %59 95.6*; Özgüllük %99.5 %99.7 *: zenginleştirme Nahimana et al 2006 vanhal 2007 Compernolle et al 2007 Stoakes et al 2006
ORSAB (Oxoid) chromid MRSA (BioMerieux) Duyarlılık %60 %97.3 Özgüllük : > %95 (24 saat);48 st: %47 %94
JCM 2007; 45:2486 Seçici by 48 saatlik inküb duyarlılığı biraz arttırıyor ama özgüllüğü düşürüyor.
Diğer özellikler Tüm besiyerleri için nazal sürüntülerdeki duyarlılık daha yüksektir. Saptama zamanı: 1.3 (MRSASelect) 2.3gün (ORSAB) Örnekteki bakteri miktarı performansı etkiler: 37 MRSA 10 000 koü 100 koü CHROMAgar: 37 ChromID : 35 ORSAB : 35 CHROMAgar: 35 ChromID : 34 ORSAB : 30 Perry ve ark.jcm 2004 42:4519
MRSASelect, Mannitol tuz (4 mg/l oksasilin) e göre: örnek başına iş yükünü % 12.6 azaltmış; toplam işlem zamanı MRSA pozitif örnekler için 1.97 gün, negatifler için 1.3 gün kısalmış. Teknisyen zamanından 300st/yıl kazanılıyor.
Donald C. Vinh, Kim A. Nichol, Fern Rand, James A. Karlowsky* Kromojenik besiyerlerinde yalancı pozitiflikler olabilir. Sefoksitine dirençli ve aynı enzimatik reaksiyonu veren bakteri ve mayalar yalancı pozitifliğe yol açabilir. Gram boyama veya lateks agg. ile hızlı konfirmasyon gerekir
BacLite TM MRSA(3M) Kültür tabanlı Sefoksitin, kolistin varlığında, MRSA izolatlarını çoğaltıyor İmmunomanyetik ayırma; Lizis ve adenilat kinaz aktivitesinin ölçümü (biyoluminisans) Negatifler 5 saatte çıkar Pozitifler ertesi gün Duyarlılık %95.6 %100%100 Özgüllük %79 %96.9 O Hara 2007; Cohen 2007; Malhotra Kumar 2008 Seçici çoğaltma Ekstraksiyon ve üretme Lizis Okuma
MRSA için kullanılan moleküler yöntemler Birçok PZR yöntemi var meca + S.aureus a özgü bir başka geni saptar: nuc, fema, femb, sa442, coa
mec A saptanması= MRSA için altın standart Aktif sürveyans için sürüntü örneği Kan kültürü (16SrRN A (meca) (nuc) MRSA Küçük Koloni varyantı Harbarth S ve ark Crit Care 2006;10:R5 Louie L, Goodfellow J, Mathieu P, Glatt A, et all. J Clin Microbiol. 2002; 40: 2786 90 Gülay Z, Vilken T. Staphylococcus aureus Cüce Koloni Varyantlarının Saptanması: Bir Olgu Sunumu. XXXI. Türk Mikrobiyoloji Kongresi,295, 19 23 Eylül 2004, Kuşadası Aydın
Multipleks PZR Gerçek zamanlı PZR formatında olursa daha hızlıdır (1 2 st vs.3 4 st) Doğrudan sürüntü örneklerinden uygulanabilir. Sorun: Örnekte MSSA ve MRKNS lerin birlikte olması halinde yalancı pozitif sonuç.
PPV, %40 a düşürecek kadar sık!
Ticari otomatize testler Lightcycler Staphylococcus ve MRSA (LC Assay, Roche) Hyplex Staphyloresist (BAG) Genotype MRSA Direct (Hain Lifesciences) BD GeneOhm MRSA veya Staph S/R (IDI MRSA; Becton Dickinson) GeneXpert MRSA (Cepheid)
1. Kuşak testler Light Cycler MRSA TM Hyplex Staphyloresist TM MSSA ve MRKNS birlikteliği sorun (PPV %31 75.9) NPV yüksek olduğu için MRSA prevalansının düşük olduğu ortamlarda MRSA negatiflerin hızla ayırtedilmesi için k ullanılm alı
Hem S.aureus a özel SCCmec dizilerini hem mec A yı saptayan testler Yalancı pozitiflik sorunu çözülmekte BD GeneOhm MRSA Genotype Direct MRSA Cepheid GeneXpert
BD GeneOhm MRSA (IDI MRSA) FDA onaylı, kalitatif gerçek zamanlı PZR Doğrudan burun sürüntüsü, yara sürüntüsü örneklerinden MRSA tanımlaması yapıyor Toplam işlem süresi : 2 2.5 saat (ürün kataloğu) Hem hastane hem toplum kökenli MRSA izolatlarını saptar
SCCmec meca orfx MRSA primerler MSSA SCCmec orfx kesişimi sadece MRSA suşlarında bulunur.
En başarılı BD GenOhm MRSA. Genotype MRSA duyarlılığı düşük;kromojenik by.leri ile eşdeğer.
Nazal örneklerde duyarlılık daha yüksek
Kaynak Çalışma Duyarlılık Özgüllük PPV NPV Yorum Farley ve ark. JCM 2008 46: 743 Boyce ve Hall JCM 2008; 46: 350 BD GeneOhm vs BBL ChromAgar MRSA Baltimore Cezaevi BD GeneOhm MRSA vs ChromAgar MRSA N=286 88.5(89)* 91 (91.7) 62.6 97 NPV yüksek= kolonize hastalar çabuk ayırt ediliyor. 100 98.6 95.8 100 Maliyet Kültür: 6,71 7,52 USD GeneOhm 25,50 USD PZR TAT**: 14.5 st *: zenginleştirme sonrası **: Toplam işlem ve sonuç verme zamanı
SCCmec primerleri (MR) meca orfx S.aureus primeri (SA) Çoğalma Ürün saptanması Duyarlılık çok sayıda primer seti (SCCmec) ile sağlanır Yalancı negatiflik: yeni SCCmec tipleri; bazı Tip IV varyantları (Danimarka), tip V Yalancı pozitiflik: Bazı KNS (S.haemolyticus, bazı S.epidermidis) orf X ile genom benzerliği SCCmec olmayan SCC elemanlarının varlığı (ör. SCCcap1) Boş kaset : meca eksize oluyorama orfx kalabiliyor
9 MSSA izolatı, MRSA epidemik klonlarından kısmi SCCmec delesyonu ile ortaya çıkmış. orfx e ait SCCmec elemanı dizileri ise duruyor : MR MSSA Prevalans % 4,6; %68 (yerel klon)
Cepheid GeneXpert Özellik GeneXpert BD GeneOhm Alet GeneXpert Dx Smart Cycler DNA ekst Elüsyondan sonra tamamen otomatik Birçok manual basamak Lizis Sonikasyon (otomatik) Cam boncuk Hedef SCCmec insersiyon bölgesi AttBssc ye özgü SCCmec 3 ucundaki orfx Süre 75 dk 60 75 dk Kullanıcı Özel eğitim gerekmez Eğitimli teknisyen Ücret 35 55 USD 25 36.7 USD FDA onayı orta derece kompleks yüksek Source: FDA 510(k) summary
Örnek işlemleme süresi 2 dk Eküvyonu elüsyon tamponuna batır. İşaretli yerden kır Vorteksle ve örneği S blm.ne koy Ayraç 1 i 1 nolu bölüme koy Ayraç 2 yi 2 nolu bölüme koy Kartuşu makineye yerleştir
GeneXpert vs GeneOhm GeneXpert Duyarlılık %98.5 Özgüllük %90.4 Burun sürüntüsü Çok merkezli çalışma ABD %94.3 (dy), %93.2 (öz) PPV %73 Wolk DM JCN 2009;47:758 GeneOhm Duyarlılık %97.1 Özgüllük %89.2 Mehta et al 2007 ICAAC Yeni SCCmec varyantlarının saptanmaması veya boş kaset sorunu bu testte de var.
Yeni Cepheid Xpert sistemleri Xpert MRSA/SA SSTI ( Deri/yumuşak doku) ve BC (Kan kültüründen tanımlama) Spa dizisi, mec A ve attbscc insersiyon bölgesine ait diziler beraberce saptanır. Boş kaset sorunu çözülmüş ancak MRKNS/MSSA sorununa bağlı yalancı pozitiflik başlamış (%5 10) Wolk et al JCM 2009; 47: 827
Enterokoklarda glikopeptid direnci Hedef değişimlerine bağlıdır. Dalanil Dalanin Dalanil Dlaktat/D serin olarak değişir Van A, Van B, Van C(C1,C2,C3), Van D (D1 D6), Van E, Van F ve Van G tipi direnç söz konusudur. Klinik açıdan önemli olanlar :Van A ve Van B Van C tipi direnç doğal (intrinsik) dirençtir
Kromojenik Besiyerleri E.faecalis E.faecium CHROM ID VRE (VRE BMX) (BioMerieux) CHROM Agar VRE (BD) VRE.faecalis/ VRE.faecium pembe mor E.gallinarum/ E.casseliflavus mavi veya üremez diğer bakteriler: mavi, renksiz veya inhibe olur
Kromojenik besiyerleri Örnek Ekim Karşılaşt. Duyarlılık Özgüllük Kaynak CHROM ID VRE (VREBMX) Dışkı Doğrudan 24 s Doğrudan 48 s BEAV ve PZR 96.4 96.6 Lederboer 94.8 73.9 2007Diagn Microbiol Inf Dis Doğrudan 24 s Doğrudan 48 s BEAV 73.3 Kuch etal 2008 93.3 GZ 24s 100.0 GZ 48s 100.0 Dışkı/rekt al sürüntü Doğrudan 24 s Doğrudan 48 s Enterococ cosel 8mg/l vanko. 54.6 98.3 Delmas et al 2007 54.6 85.1 GZ 24s 100 95.1
Mavi veya mor renkli: Candida veya gram negatif basiller Yalancı pozitif izolatlar Renksiz izolatlar VRE BMX ve BEAV bylerinde 24 ve 48 st.te VR E.faecalis ve E.faecium dışı üremeler
VRE için moleküler yöntemler Light Cycler vana/b Detection kit (LC assay, Roche) GeneOhm VanR kiti (BD Diagnostics) FDA onaylı
Light Cycler vana/b Gerçek zamanlı PZR vana, van B, vanb2/3 genlerini hedefler Doğrudan fekal perianal örneklerden çalışılabilir Süre 3 4 saat
Enterococcosel agar ile kıyaslandığında LC için duyarlılık %100, özgüllük %95 97; PPV %32 42 bulunmuş (vanb +)
Sloan ve ark Uyumsuz sonuçlar LC VanB (+) kültür negatif: Araştırıcıların yorumu Bazı van B (+) suşlar 6 8 mg/l vankomisin varlığında üreyemiyor. Bakteri ölü olabilir DNA pozitiftir Sloan ve ark JCM 2004;42:2636
Ancak
Ballard ve ark, bazı Clostridium spp. Ruminococcus spp, Egghertella lenta da van B elemanı varlığını göstermişler.
FDA onaylı test; BEAV ile kıyaslandığında duyarlılık %96.6; ancak özgüllük %87 (van B ye bağlı)
VRE moleküler yöntemler Özellikle van B pozitifliğinin başka bir yöntemle doğrulanması gerekli
Moleküler yöntemler Hızlı Duyarlı Çok sayıda örnek kısa sürede çalışılabilir
Moleküler yöntemler/sorunlar Maliyet sorun: ör. MRSA kitleri 25 50 USD vs. besiyerleri (3.2 YTL) Suşlar üretilmediği için başka testler için (ör. moleküler tiplendirme) elimizde bulunmaz. DNA pozitifliği vs. canlı bakteri: izolasyon sona erdirilmesi VRE için dışkının inhibitör etkisi vardır. Bu nedenle önce sıvı by.ne ekim nedeniyle protokoller 24 saat sürer. VRE de dışkıdaki vanb taşıyan anaerop flora elemanları nedeniyle yalancı pozitiflik olur
Aktif sürveyans kültürleri başlamadan önce Nereden? Hangi hastalardan? (yüksek riskli vs. tüm) Ne zaman? Kim alacak? Kim ödeyecek? Kim işlemleyecek? Hangi yöntemle? Pozitif sonuçlar kime bildirilecek? Pozitif sonuçlarda hangi önlemler alınacak? Bunlar uygulanabilir mi? İzolasyon ne zaman sona erdirilecek? Ek önlemlere uyum nasıl izlenecek? Programın sonuçları nasıl izlenecek?
Metaanaliz 1498 potansiyel çalışma: 10 u alınabilmiş. 3 grup: 1 Tarama (+): hızlı test kullanılmış 2 Tarama (+) : kültür kullanılmış 3 Aktif Tarama yok MRSA edinme/veya önlem açısından kültür veya moleküler tabanlı tarama testleri arasında fark yok (%95 CI 0.61 1.24) Hızlı test uygulayanlarla hiç tarama uygulanmayanlar kıyaslandığında Hızlı test ile bakteriyemiler azalıyor Cerrahi alan infek siyonlarında fark yok
Meta analiz rapor verme süreleri Kaynak sonlanma zamanı (median) Moleküler test Kültür + zeng. Jeyaratnam ve ark (2008) Cunningham et al (2007) 21.8 (17.9 25.4) 46.4 (39.1 66.1) <1 çalışma günü 3 çalışma günü Harbarth (2006) Tüm YBÜ Cerrahi YBÜ Dahili YBÜ Aldeyab (2009) Cerrahi servis Kardiyoloj servs 22.2 (16.2 27.6) 21 23 19.3 (13.8 23.8) 22.7 (19.8 23.8) 93.1 (73 118.9) 87 106 51.8 (44.4 69) 42.2 (40 70)
Sonuç MRSA/VRE kontrolünde tarama ve hızlı tanı için: İyi planlama Yönetim desteği şarttır. Yeni başlanıyorsa Moleküler testler hızlı (gerçek hayat??) fakat pahalı Kromojenik besiyerleri ucuz fakat 24 st özgül sonuç veriyor. (Tercih edilebilir)
ANTİBİYOTİK FARKINDALIK GÜNÜ (18 Kasım 2009) NEZLE; SOĞUKALGINLIĞI; GRİP: BİR FİNCAN SICAK ÇAY İÇ ANTİBİYOTİK İÇME!