T.C GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI

T.C GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI ALLOKSAN DİYABETİK TAVŞANLARDA RESVERATROL TEDAVİSİNİN ENDOTELİYAL NİTRİK OKSİT SENTAZ EKSPRESYONU ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ecz. Burcu ÇİLEKAYA Tez Danışmanı: Prof. Dr. Fatma AKAR ANKARA EKİM 2010

KABUL VE ONAY i

İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller Tablolar Kısaltmalar Önsöz i ii v vi vii viii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Diabetes Mellitus 3 2.1.1. Tarihçesi 4 2.1.2. Epidemiyolojisi 4 2.1.3. Diabetes Mellitus un Sınıflandırılması 5 2.2. Hayvanlarda Deneysel Diyabet Oluşturma Yöntemleri 8 2.3. Diyabet Endotel Fonksiyonu İlişkisi 9 2.4. Nitrik Oksit 18 2.4.1. Nitrik Oksitin Sentezi ve Etki Mekanizması 19 2.4.2. Nitrik Oksit Sentazın Genel Özellikleri ve Tipleri 23 2.4.3. Nitrik Oksitin Biyolojik Etkileri 24 2.4.4. Nitrik Oksit İnaktivasyonu 26 2.4.5. Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres 27 2.4.6. Serbest Radikal Süpürücü Mekanizmalar 31 2.5. Resveratrol 34 2.5.1. Resveratrolün Sentezi 36 2.5.2. Resveratrolün Farmakokinetik, Biyoyararlanım ve Metabolizması 37 2.5.3. Resveratrolün Vazodilatör Etkisi 39 2.5.4. Resveratrolün İskemi Reperfüzyon Hasarından Koruyucu Etkisi 41 ii

2.5.5. Resveratrolün Lipid Profili Üzerine Etkisi 42 2.5.6. Resveratrolün Diğer Biyolojik Etkileri 43 2.5.7. Resveratrolün Nitrik Oksit Üzerine Etkisi 44 2.5.8. Diyabette ve Metabolik Sendromda Resveratrolün Etkisi 48 3. GEREÇ ve YÖNTEM 52 3.1. Kullanılan Deney Hayvanları 52 3.1.1. Deney Hayvanları Grupları 53 3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 54 3.3. Çözeltilerin Hazırlanışı 55 3.3.1. Krebs Çözeltisi Bileşimi (mm): 55 3.3.2. Stok Etidyum Bromür Çözeltisi Hazırlanışı 55 3.3.3. Agaroz Jel Hazırlanışı 55 3.3.4. Kullanılan Primerler 56 3.4. Yöntem 58 3.4.1. Doku Örneklerinin Eldesi ve Homojenizasyon 58 3.4.2. Total RNA İzolasyonu 59 3.4.3. Reverse Transkriptaz-PCR Yöntemi 59 3.4.4. Agaroz Jel Elektroforezi 61 3.4.5. Görüntüleme 61 3.5. İstatiksel Analiz 62 4. BULGULAR 63 4.1. Deney Gruplarına Ait Ağırlık, Kan Şekeri ve Günlük Tüketilen Su Miktarı 63 4.2. enos ve GAPDH mrna Ekspresyonu PCR Sonuçları ve Dansitometrik Analizleri 65 5. TARTIŞMA 72 6. SONUÇ 78 iii

7. ÖZET 79 8. SUMMARY 81 9. KAYNAKLAR 83 10. ÖZGEÇMİŞ 99 iv

ŞEKİLLER Şekil 1. Nitrik oksitin L-arjininden sentezi 19 Şekil 2. Endotel hücreleri tarafından nitrik oksit üretimi 20 Şekil 3. enos sinyal ileti sistemi 21 Şekil 4. Vasküler oksidatif stresin ortaya çıkış zinciri 28 Şekil 5. Resveratrolün diastereomerleri ve metabolitleri; 37 Dihidroresveratrol, resveratrol-3-sülfat ve resveratrol-3-o-glukuronit Şekil 6. GAPDH kontrol ve diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü 65 Şekil 7. enos kontrol ve diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü 66 Şekil 8. GAPDH Resveratrol, Diyabetik-Res50, Res5-Diyabetik, Res50-Diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü 67 Şekil 9. enos Resveratrol, Diyabetik-Res50, Res5-Diyabetik, 68 Res50-Diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü Şekil 10. Deney grupların enos/ GAPDH mrna düzeyleri 70 Şekil 11. Deney gruplarını temsil eden bir örneğe ait enos ve GAPDH mrna düzeyleri 71 v

TABLOLAR Tablo 1. enos ve GAPDH için PCR tepkime karışımı 60 Tablo 2. Deney gruplarının ortalama ağırlık (g), kan glukoz düzeyleri (mg/dl) ve günlük su tüketim miktarları (ml) 64 Tablo 3. RT-PCR deneylerinin dansitometrik analizi 69 vi

KISALTMALAR Enos NOS SOD nnos inos FAD FMN BH 4 cgmp mrna NADPH LDL cdna dntp GAPDH RT-PCR HSP 90 DNA L-NAME L-NMMA L-NNA Cu Zn KoA GTP NADH HST-1 : Endotelyal nitrik oksit sentaz : Nitrik oksit sentaz : Süperoksit dismutaz : Nöronal nitrik oksit sentaz : İndüklenebilir nitrik oksit sentaz : Flavin adenin dinnükleotit : Flavin mononükleotit : Tetrahidrobiopterin : Siklik guanozin monofosfat : Messenger ribonükleik asit : Nikotinamidadenin dinükleotid fosfataz : Düşük yoğunluklu lipoprotein : Komplementer DNA : Deoksiribonükleozid trifosfat : Gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenaz :Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu : Heat shock protein, ısı şok proteini : Deoksiribonükleik asit : L-nitro-arjinin-metil ester : N G -monometil-l-arjinin : N G -nitro-l-arjinin : Bakır : Çinko : Koenzim A : Guanozin tri fosfat : Nikotinamid adenin dinükleotid : trans-1, 2 bis (3,5 dihidroksi fenil) eten, trans resveratrol analogu vii

ÖNSÖZ Yüksek lisans tezim olarak hazırladığım bu çalışmayı sunarken; Tez çalışmam boyunca desteğini gördüğüm, çalışmalarımın önlendirilmesi ve sonuçlandırılmasında emeği geçen danışmanım sayın Prof. Dr. Fatma AKAR a, Yüksek lisans eğitimime katkıda bulunan başta anabilim dalı başkanımız sayın Prof. Dr. Nurettin ABACIOĞLU olmak üzere tüm Farmakoloji Anabilim Dalı öğretim üyelerine, Sunumum esnasında bana fikirleriyle ışık tutan sayın Prof. Dr. Nuray ARI ya ve sayın Yrd. Doç. Dr. M. Orhan ULUDAĞ a, Tezimin deney aşamasında bana laboratuvarını açan, yardım ve desteklerini esirgemeyen, bilgi birikimiyle bu çalışmamı tamamlamamı sağlayan, değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Kamile ÖZTÜRK e, Laboratuvar deneyimiyle bana yardımcı olan biyolog Başak DUMAN a, Tez çalışmam boyunca deneyimini ve bilgisini benimle paylaşan ve bana desteğini hiç eksik etmeyen sayın Uzm. Dr. Erhan SÜLEYMANOĞLU na, Deney hayvanlarımın bakımı için yardımlarını esirgemeyen, çalışmalarım sırasında bana içtenlikle yardım eden sevgili Hacer ŞİRİN e, Beni bugünlere getiren, maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme ve özellikle sevgili anneme, Beni hayatta olduğu gibi bu tez çalışmasında da yalnız bırakmayan sevgili eşim Burhan a, viii

Yüksek lisans eğitimim boyunca,yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı ile beni destekleyentübitak a SONSUZ TEŞEKKÜRLERİMİ SUNARIM ix

1.GİRİŞ Diabetes mellitus dünya genelinde artan sıklıkla görülen yaygın ve ciddi bir hastalıktır. Diabetes mellitus, pankreasın insülin sekresyonunun yetersizliği ve/veya dokuların insüline cevabının bozulmasıyla oluşan, protein, yağ ve karbonhidrat metabolizmasını etkileyen metabolik bir hastalıktır. Dünya genelinde diyabetin prevalansı 2010 yılında % 6.4 iken 2030 yılında % 7.7 ye çıkması beklenmektedir. Diyabetik hastaların büyük bir kısmında zaman içinde çeşitli komplikasyonlar gelişmektedir. Bu komplikasyonların kesin nedeni tam olarak bilinmemekle birlikte birçok faktör etkili olmaktadır. Diyabetik komplikasyonların ortaya çıkış nedeni, uzun süreli hipergliseminin dokularda oluşturduğu tahribata bağlanmaktadır. Diyabetli hastalarda damarların endotel hücre fonksiyonundaki azalmanın, kardiyovasküler komplikasyonların ortaya çıkmasındaki esas etken olduğu bilinmektedir. Diyabetik damar dokusunda serbest oksijen radikallerinin oluşumunun arttığı buna karşılık antioksidan aktivitenin azaldığı ve giderek endotel kaynaklı nitrik oksit ve prostasiklin oluşumunun zayıfladığı kabul edilmektedir. Damarların endotel fonksiyonunu düzeltmek için çoğu zaman insülin tedavisi yeterli olmamakta, antioksidan tedavi alternatif bir yöntem olarak denenmektedir. Orta dereceli kırmızı şarap tüketiminin, kardiyovasküler hastalıklara bağlı ölüm insidansını azalttığı yapılan epidemiyolojik çalışmalarla gösterilmiştir. Kırmızı şarabın kardiyovasküler hastalıklardaki yararlı etkileri içerdiği polifenolik bileşiklerden resveratrole bağlanmıştır. 1

Bu çalışmanın amacı, diyabet nedeniyle bozulan endotel fonksiyonu üzerine, resveratrolün koruyucu etkisi olup olmadığının araştırılmasıdır. Bu amaçla, 100 mg/kg dozunda alloksan uygulaması ile diyabet oluşturulmuş tavşanlara, 8-10 hafta boyunca 5 ve 50 mg/l konsantrasyonda resveratrol içme suları içinde verilmiştir. Resveratrolün nitrik oksit kaynaklı vasküler cevaplılığı iyileştici bir özelliği olup olmadığını ortaya koymak amacıyla, diyabette endotel kaynaklı nitrik oksit sentaz (enos) ekspresyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Resveratrolün besin destekleyicisi olarak kullanımının, diyabet başta olmak üzere kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi veya tedavisindeki yerinin anlaşılmasına bu çalışmanın sonuçları katkıda bulunabilir. 2

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Diabetes Mellitus Diyabet son yıllarda hem dünyada hem de toplumumuzda artan sıklıkla görülen yaygın bir endokrin-metabolik hastalıktır. Diyabet, insülin salgısının mutlak veya göreceli eksikliği ya da insülin rezistansı ile oluşan, hiperglisemi ile kendini belli eden, karbonhidrat, yağ ve protein metabolizması bozuklukları ile karakterize bir hastalıktır. 1 Diyabetin makrovasküler komplikasyonları: koroner kalp hastalığı, serebrovasküler hastalık ve periferik damar hastalığı olarak sınıflandırılırken, mikrovasküler komplikasyonları diyabetik retinopati, nefropati ve nöropatidir. 2 Yapılan klinik ve deneysel çalışmalardan elde edilen sonuçlar, diyabetin aterosklerotik ve koroner kalp hastalıkları açısından yatkınlık oluşturan önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Koroner arter hastalığı, periferik damar hastalığı ve serebrovasküler hastalık gibi aterosklerotik komplikasyonlar, diyabetik hastalarda en sık morbidite ve mortaliteye yol açan nedenlerdir. 3 3

2.1.1. Tarihçesi Diyabet hakkındaki ilk bilgiye M.Ö.1500 yıllarında Mısır Ebers papirusunda rastlanmaktadır. Diyabetes aşırı idrar çıkışını simgeleyen, "sifon" anlamına gelen Yunanca kökenli bir kelimedir. Mellitus ise yine Yunanca "bal" anlamına gelen "mel" kelimesinden türetilmiş, "şekerli" anlamında kullanılmıştır. 1859'da Claud Bemard diyabetik hastaların kanında glukozun yükselmiş olduğunu göstermiştir. Diyabetin etiyopatogenezinde önemli adımları 1869'da Langerhans, pankreas bezi içinde adacık dokusunu ve 1889'da Von Mering ve Minkowski, köpeklerin pankreası çıkarılınca diyabetik olduklarını göstererek atmıştırlar. 4 2.1.2. Epidemiyolojisi Diyabetli insan sayısı, populasyon büyümesine, yaşa, kentleşmeye ve obezite prevalasındaki artışa ve fiziksel inaktiviteye bağlı olarak artmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü nün 2010 yılında yaptığı istatistiklere göre dünyada diyabetin görülme sıklığı % 6.4 iken 2030 yılında % 7.7 ye çıkması öngörülmektedir. Diyabetli insanların sayısı 285 milyon iken bu sayının da 2030 yılında 439 milyon olması beklenmektedir. Ülkemizde ise 2010 yılında diyabetin görülme sıklığı % 7.4 iken 2030 yılında % 9.6 olması beklenmektedir. 5 Diyabetin erkeklerde görülme oranı kadınlardan daha fazladır. Diyabet, gelişmekte olan ülkelerde 45 ile 64 yaş aralığında görülmekteyken, gelişmiş ülkelerde 64 yaşın üstünde görülmektedir. Hindistan, Çin ve Amerika Birleşik Devletleri diyabetin en sık görüldüğü ülkelerdir. 6 4

Türkiye Diyabet Epidemiyoloji (TURDEP) çalışmasının sonuçlarına göre ülkemizde tip 2 diyabet sıklığı % 7.2 bulunmuştur. 7 Tip 2 diyabetin, yaygın olarak, artmış insülin duyarlılığının azalmasına neden olan visseral obesiteyle ilişkili olduğu kabul edilmektedir. 2002 yılında, dünyada tip 2 diyabetli insan sayısı 150 milyon iken, son yıllarda obezitedeki artışa bağlı olarak tip 2 diyabetin daha da artması beklenmektedir. 8 Diyet değişikliği, fiziksel aktivite ve farmakolojik tedavilerle diyabet görülme sıklığı azaltılabilir. 5 2.1.3. Diabetes Mellitus un Sınıflandırılması Oluşum nedenleri açısından diyabet dört grupta incelenir; İmmun aracılı ve idiyopatik diye sınıflandırılan tip 1 diyabet, tip 2 diyabet, gestasyonel diyabet ve diğer spesifik tipler. Tip 1 Diyabet Diyabetin bu tipi, tüm diyabetlerin yaklaşık %7-10 unu karşılar. Tip 1 diyabetin büyük çoğunluğuna, pankreatik beta hücrelerinin, hücre aracılı otoimmün harabiyeti neden olmaktadır. Sonuç olarak pankreas insülin üretemez ve mutlak insülin yetersizliği meydana gelir. Sıklıkla otoimmün antikorların bulunduğu bu durum, diğer otoimmün hastalıkların (Graves hastalığı, Addison hastalığı, pernisyöz anemi) riskini de arttırmaktadır. 5

Tip 1 diyabet etiyolojik olarak immun aracılı ve idiopatik olarak sınıflandırılmaktadır. İdiyopatik tip 1 diyabet nadir görülür ve etiyolojisi bilinmemektedir. Tip 1 diyabet genel anlamda immun aracılı tip 1 diyabet için kullanılmaktadır ve hastaların % 90 ından fazlası bu grupta yer almaktadır. Tip 1 diyabetin hastalık tablosunda belirtiler genellikle akut başlangıçlıdır (poliüri, polidipsi, polifaji, kilo kaybı) ve çoğunlukla obez olmamalarına rağmen, genç nüfusu büyük ölçüde etkilemektedir. Olguların % 70 i 20 yaşına kadar ortaya çıkmaktadır. Çocukluk çağında en sık görülen kronik hastalıklardan birisidir ve dünyada sıklığı giderek artmaktadır. Yaşam boyu insülin tedavisi gerekmektedir. 9 Tip 2 Diyabet Tip 1 diyabete kıyasla yaklaşık 9-10 kat daha yaygındır. Tüm olguların % 90 ından sorumludur. Pankreastaki beta hücrelerinin yeterli miktarda insülin üretememeleri ile birlikte seyreden insülin direnci, tip 2 diyabete neden olmaktadır. Bu durumdan etkilenen kişilerde genetik yatkınlık bulunabilir. Ayrıca düşük doğum ağırlığı, erken yaşta gebelik, ileri yaş, beslenme alışkanlıkları, obezite ve hareketsiz yaşam biçimi gibi çevresel ve davranışsal risk faktörleri de tip 2 diyabetin oluşumunda etkilidir. 9 Genellikle ileri yaşlardaki kişilerde görülmekte ve bu kişilerin çoğunluğu obezdir. Tip 2 diyabetli hastaların üçte birinden daha azı nihai insülin tedavisine gereksinim duymaktadır. İlk semptomlar çoğunlukla görmezden gelinmekte ya da ihmal edilmekte, ilk kardiyovasküler ya da mikrovasküler komplikasyon ortaya çıkana kadar yıllarca tespit edilmeden 6

kalabilmektedir. Diyet, egzersiz ve kilo verme sonucu insülin direnci düzelebilmektedir. 9 Gestasyonel Diyabet İlk kez gebelik sırasında tespit edilen glukoz intoleransı olarak tanımlanmaktadır. Durumun hamilelikten sonra devam edip etmediğine ve tedavinin sadece diyetle veya insülinle yapılıp yapılmadığına bakılmaksızın bu tanım uygulanır. Glukoz toleransı gebelik sonrasında çoğunlukla normale dönmektedir fakat kadınların % 35 inde takip eden 5-10 yıl içerisinde tip 2 diyabet tanısı konmaktadır. 9 Diğer Spesifik Tipler Pankreatit, kistik fibrozis gibi ekzokrin pankreas hastalıkları, agromegali, Cushing sendromu gibi endokrinopatiler, pentamidin, nikotinik asit, beta agonistler gibi ilaç ya da kimyasal maddeler, konjenital rubella, coxsackie B ve benzeri infeksiyonlar, katı adam sendromu, anti-insülin reseptör antikorları gibi immun aracılı diyabetin yaygın olmayan tipleri, diyabetin diğer spesifik tiplerini oluşturmaktadır. 9 7

2.2. Hayvanlarda Deneysel Diyabet Oluşturma Yöntemleri Deneysel diyabet oluşturmak amacıyla fare, sıçan, kobay, tavşan, maymun, domuz, köpek ve kedi gibi deney hayvanları kullanılabilmektedir. Deneysel diyabet oluşturmak için kullanılan yöntemlere örnek olarak; kimyasal ajan kullanılanlar, spontan olanlar veya virus aracılı olanlar sayılabilir. 1 Deney hayvanlarında tip 1 diyabet cerrahi ve cerrahi olmayan metotlarla oluşturulmaktadır. Cerrahi yöntemler, parsiyel ve total pankreasın çıkartılması şeklinde olup; cerrahi olmayanlar, pankreas hücrelerini tahrip eden bazı kimyasal bileşikler ile yapılmaktadır. 10 Deneysel diyabet oluşturulmasında en yaygın kullanılan kimyasal bileşikler alloksan ve streptozosindir. 1 Alloksanın etki mekanizması: Alloksan monohidrat [2,4,5,6(1H,3H)- pyimidinetetrone] bir ürik asit türevidir. Alloksanın iki farklı patolojik etkisi vardır. Birincisi, seçici olarak beta hücrelerindeki glukokinazı inhibe ederek glukoz indüklü insülin salınmasını inhibe etmesidir. İkincisi, beta hücrelerinin selektif nekrozu sonucunda, serbest oksijen radikallerinin oluşumunun uyarılmasıyla insülin bağımlı diyabet oluşumuna yol açmasıdır. 10 8

Streptozosinin (STZ) etki mekanizması: N-(Metilnitrozocarbamoil)-α-D-glukozamin yapısındadır. Pankreas β hücrelerine hasar vererek hem insüline bağımlı hem de insülinden bağımsız diyabete neden olmaktadır. 1 2.3. Diyabet Endotel Fonksiyonu İlişkisi Diyabetli insanlar ve hayvanlarda yapılan çalışmalarda, damarların endotel hücre fonksiyonundaki azalmanın, kardiyovasküler komplikasyonların ortaya çıkmasındaki esas etken olduğu ve diyabette görülen vasküler hastalıkların temelinde endotel fonksiyon bozukluğunun yer aldığı bildirilmiştir. Endotel fonksiyon bozukluğunda, vazokonstriktör mediyatörlerin salıverilmesinin arttığı veya endotel kaynaklı nitrik oksitin salımının ve üretiminin azaldığı gösterilmiştir. Bunun sonucu olarak da endotel bağımlı vazodilatasyon cevabının bozulduğu saptanmıştır. 11,12 Endotel fonksiyon bozukluğunda serbet radikallerin oluşumunun arttığı ve hücresel adezyon moleküllerinin ekspresyonunun arttığı ve de antikoagülan etkinliğin azaldığı gösterilmiştir. Endotel fonksiyon bozukluğunda, vazoaktif, anti-koagülan ve antiinflamatuvar etkinliğin değiştiği serbest radikallerin salıverilmesinin arttığı ve nitrik oksit etkinliğinin azaldığı ileri sürülmektedir. Bu azalma; enos ekspresyonundaki azalma, yetersiz L-arjinin, tetrahidrobiopterin veya antagonistlerin (asimetrik dimetil arginin; ADMA) varlığı, azalmış enos aktivitesi ve nitrik oksit inaktivasyon hızının artması gibi etmenlere bağlı olabilir. 13 9

Deneysel diyabet ve insanlarda insülin bağımlı ve bağımsız diyabet modellerinde endotel fonksiyon bozukluğu olduğunu gösteren pek çok çalışma bulunmaktadır. 14 Pieper ve ark. nın yaptığı bir çalışmada, nitrik oksit salıverici ve antioksidan özellikteki NCX4016 bileşiğinin etkisi incelenmiştir. Çalışmalar sonucunda, kontrol ve streptozosin ile diyabet oluşturulmuş, sıçanların aortalarında, 8 hafta boyunca kronik NCX4016 uygulanmasından sonra asetilkolinin endotel-bağımlı gevşeme cevaplarının arttığı bulunmuştur. NCX4016 nın kronik uygulanması diyabetiklerde asetilkolinde bozulan endotel-bağımlı gevşemeleri önlemiştir; kan glukoz konsantrasyonunda herhangi değişikliğe yol açmamıştır. Bu çalışmanın sonucunda nitrik oksit vericisi olan antioksidan bileşiğin diyabetik endotel fonksiyonunu koruduğu ortaya çıkmıştır. 15 Streptozosin ile diyabet oluşturulmuş sıçanların histamin ile prekontrakte torasik aorta halkalarında, asetilkoline karşı oluşan endotel bağımlı gevşemeler ile kontrol grup arasında anlamlı bir fark olmadığı ve vasküler fonksiyon bozukluğuyla ilişkili diyabette süperoksitin nitrik oksit yıkımında ana etken olduğu gösterilmiştir. Diyabetik hayvan modellerinde, süperoksit süpürücü süperoksit dismutaz ile akut inkübasyondan sonra azalmış olan endotel bağımlı gevşemelerin düzeldiği gösterilmiştir. 16 Alloksan ile diyabet oluşturulmuş sıçanlarda, 4 hafta sonunda aortik ve mezenterik arterlerde asetikolin ile meydana gelen gevşemelerin azaldığı ve 4 hafta sonunda D-chiro-inositol (DCI) ve dibutiril DCI (db-dci) gibi inositollerin oral uygulanmasının, plazma glukoz ve trigliserit düzeyini anlamlı olarak düşürdüğü, asetikolin ile meydana gelen gevşemelerin arttığı 10

gözlenmiştir. Bu bileşiklerin, artmış serbest oksijen radikallerini azaltarak, sıçan aortik ve mezenterik halkalarında endotel fonksiyon bozukluğunu önlediği anlaşılmıştır. Dibutiril DCI, proteinkinaz C aktivasyonuna ve heksosamin yolağının aktivitesinde artışa neden olmakta, ayrıca, ileri glikasyon son ürünlerini bazal düzeylere düşürmektedir. 17 Tavşan aortasında, yüksek glukoza maruziyet sonucu ortaya çıkan endotel fonksiyon bozukluğunun serbest radikal süpürücüleri ile düzeldiği gösterilmiştir. 18 Diyabetik hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmaların bazılarında enos mrna ekspresyonunun arttığı, bazılarında azaldığı kimisinde de değişmediği gösterilmiştir. Hoshiyama ve ark., insan glomerüler endotel hücrelerini, yüksek glukoza (15, 30 ve 60 mm) 24, 48 ve 72 saat maruz bırakmışlardır. Western blot analizi sonucunda, bu hücrelerde, enos protein ekspresyonunun 12. saatten itibaren arttığı ve 48. saatte pik yaptığı görülmüştür. Yüksek glukozun nitrik oksit üretimi üzerinde inhibitor etkisinin L-arjinin (1 mm) ve süperoksit dismutaz eklenmesinden sonra düzeldiği gösterilmiştir. Bu sonuçlar, azalmış nitrik oksit oluşumunun, süperoksitin aşırı üretimine ve L-arjinin eksikliğine bağlı olduğunu göstermektedir. 19 Kısa ve uzun dönem streptozosin ile diyabet oluşturmuş sıçanların lumbar dorsal root gangliasında yapılan bir araştırmada, diyabetten 12 ay sonra nitrik oksit sentaz aktivitesinin arttığı, enos ekspresyonunun ise değişmediği gösterilmiştir. İmmünohistokimya ve RT- 11

PCR çalışmalarında 2. ayın sonunda diyabetik hayvanlarda enos mrna ekspresyonunun arttığı ve inos mrna düzeyinin değişmediği saptanmıştır. 20 Streptozosin ile diyabet oluşturulan sıçanların kardiyak endotel hücelerinde yapılan bir çalışmada, enos protein ve aktivitesinin anlamlı bir şekilde arttığı gösterilmiştir. Diyabetik miyokardiyumda gözlemlenen zayıflamış endotel bağımlı gevşemenin, süperoksit anyonları tarafından nitrik oksit inaktivasyonundan kaynaklandığı ve artmış nitrik oksit üretiminin, artmış nitrik oksit inaktivasyonunu dengeleyen kompansetuvar mekanizma olduğu bildirilmiştir. 21 İnsan aortik endotel hücrelerine, 22.2 mmol/l yüksek glukozun, 5 gün boyunca uygulanmasından sonra RT-PCR ile yapılan ölçümlerde yüksek glukoza maruziyetin enos mrna ekspresyonunu, nitrit /nitrat üretimini, enos protein ekspresyonunu arttırdığı saptanmıştır. Bu sonuçlar, sağlıklı damarlara yüksek glukoz uygulamasının endotel fonksiyonunu bozabileceğini göstermiştir. 22 Hink ve ark. ları tarafından steptozosin (65 mg/kg) ile diyabet oluşturulmuş sıçan aortalarında, 2 hafta sonunda enos mrna ve protein ekspresyonunun artmasına rağmen, nitrik oksit biyoyararlanımının azaldığını (elektron spin resonansı yöntemiyle) belirtilmiştir. Diyabette artmış glukoz düzeyinde, süperoksit, nitrik oksit ile reaksiyona girerek peroksinitrit oluşturmaktadır. Oluşan peroksinitrit tetrahidrobiopterini oksidize ederek enos un kenetsizlenmesine yol açmakta ve elektron akışı L-arginin yerine moleküler oksijene doğru kayarak nitrik oksit yerine 12

süperoksit oluşturmaktadır. Kemilüminesans yöntemi ile yapılan ölçümde NADPH oksidaz aktivitesinin arttığı gösterilmiştir. Ayrıca diyabetik hayvanların damarında NADPH oksidaz altüniti gp91 phox mrna sının çok belirgin bir biçimde arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak enos ve NADPH oksidaz kaynaklı süperoksit oluşumunun nitrik oksit biyoyararlanımını azalttığı görülmüştür. Endotel ve düz kas hücrelerinin yüksek glukoz ile inkübasyonunun, proteinkinaz C aktivasyonu sonucu düz kas hücrelerinde enos mrna ekspresyonunu inhibe ederek oksidatif hasarı arttırdığı bildirilmiştir. 23 Tip 2 diyabetik Goto-Kakizaki sıçanlarda diyabetin erken (12 hafta) ve geç (36 hafta) evreleri arasında aortik enos ekspresyonu ve aortik endotel fonksiyonu incelenmiş, enos ekspresyonunun 12. ve 36. haftalarda diyabetik sıçanların aortasında anlamlı bir artış gösterdiği, kontrol grubunda ise değişmediği RT-PCR ile saptanmıştır. inos mrna ekspresyonunda gruplar arasında anlamlı fark bulunmamış iken, ilginç olarak nnos mrna ekspresyonunun diyabetiklerde hem 12. hem de 36. haftalarda anlamlı bir şekilde azaldığı, kontrol grubunda ise değişmediği bulunmuştur. enos protein düzeyi Western Blot yöntemi ile 36 haftada Goto-Kakizaki sıçanlarda kontrollere göre daha yüksek bulunmuştur. Goto-Kakizaki sıçanların aortalarında, asetilkolin gevşemelerinin 12. hafta sonunda arttığı, 36. haftada azaldığı gösterilmiştir. Sonuç olarak, Goto- Kakizaki sıçanlarda diyabetin erken evresinde (12. haftada) endotel bağımlı gevşemelerin nitrik oksit aşırı üretimi ve enos overekspresyonu aracılığıyla arttığı, geç evrede ise (36. haftada) azaldığı, bu etkininde enos ekspresyonundaki azalmaya bağlı olmadığı, damar düz kas hücrelerinde nitrik oksit cevaplılığının ve total nitrik oksit üretiminin azalmasına bağlı olabileceği bildirilmiştir. 24 13

Srinivasan ve ark. ları tarafından yapılan bir çalışmada, 16 haftalık erkek CS7BL/6J kontrol ve diyabetik db/db farelerden izole edilen aortik endotel hücre kültürlerinde, enos mrna seviyelerinin kontrole göre % 60 oranında azaldığı bulunmuştur. enos ekspresyonundaki azalmanın, mitokondri kaynaklı serbest oksijen radikallerinin üretimindeki artışa bağlı olabileceği ileri sürülmüştür. 25 Stalker ve ark. ları ise, hiperglisemik şartlarda sıçanların mezenterik arterinde nitrik oksit ve HSP90 (heat shock protein)-enos kompleksi üretiminin azaldığını göstermişlerdir. Daha önceki çalışmalarda, kalmodulin ve HSP90 ın, enos un membrandan ayrılması için gerekli olduğu ve HSP90 ın enos aktivasyonunda önemli rol oynadığı gösterilmiştir. 26 Diyabet süresi ve enos protein ekspresyonu ilişkisinin incelendiği bir çalışmada, erkek Wistar sıçanlara 1, 3, 9 ve 12 haftalık diyabet süresi uygulanmıştır. Kalp ve mezenterik arterlerde yapılan ölçümlerde, 9 haftalık diyabet grubunda enos protein ekspresyonunun azaldığı bulunmuştur. İmmunohistokimyasal çalışmalarda ise enos yoğunluğunda 1. ve 3. haftalarda değişiklik bulunmaz iken, 9. ve 12. haftalarda azalma gözlenmiştir. 27 Bir başka çalışmada, 4 haftalık hiperglisemiden sonra diyabetik sıçanların aortasında, kalp ve siyatik sinirlerinde enos mrna ekspresyonunun belirgin azaldığı, α-lipoik asit tedavisinin bu azalmaları tersine çevirdiği gözlenmiştir. Öte yandan, inos mrna ekspresyonunun arttığı fakat α-lipoik asit tedavisinin bu artışları düzeltemediği gösterilmiştir. Plazma total antioksidan kapasitenin azaldığı, α-lipoik asitle tedavi sonrası 14

kontrole yaklaştığı gözlenmiştir. Antioksidan tedavinin, nitrik oksit-cgmp sistemindeki olumsuz etkileri tersine çevirerek ve diyabette vasküler hasarı önleyerek önemli bir tedavi yaklaşımı olabileceği ileri sürülmüştür. 28 enos ekspresyonunu ve aktivitesini sağlamanın bir yolu da gen transferidir. enos geninin özgül bölgelere transferi lokal olarak nitrik oksit düzeyini ve aktivitesini arttırmaktadır. enos genini kodlayan adenoviral vektör kullanılarak gen transferi yapılan bir çalışmada, iki günün sonrasında diyabetik sıçan penisinde enos gen ekspresyonunun arttığı ve diyabetik damarda azalmış olan asetilkolin gevşemesinin normale döndüğü gözlenmiştir. 29 Kobayashi ve ark. larının yaptığı bir çalışmada, 8 haftalık erkek Wistar sıçanlara streptozosin uygulanmasından 9 hafta sonra, diyabetik sıçanlara 1 hafta boyunca artan dozda (5-30 u/kg/gün) insülin tedavisi uygulanmıştır. 10. hafta sonunda RT-PCR ile, insülin uygulaması yapılmayan kontrol ve diyabetik grupların aortalarında enos mrna ekspresyonları arasında fark olmadığı, insülin uygulanmış diyabetik sıçanlarda mrna ekspresyonunun anlamlı oranda arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak, streptozosin ile diyabet oluşturulmuş sıçanlarda, kısa dönem yüksek doz insülin uygulanması ile, enos mrna ekspresyonunun arttığı, bozulmuş endotel bağımlı gevşemelerin ve nitrik oksit metabolizmasının düzeldiği gösterilmiştir. 30 Kısa dönem insülin tedavisinin, enos ekspresyonu üzerine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada ise, diyabet oluşturulmasından 9 hafta sonra, sıçanlara artan dozlarda bir hafta boyunca 5-30 u/kg/gün insan insülini uygulanmıştır. 10. hafta sonunda aortalarında RT-PCR ile enos 15

ekspresyonuna bakıldığında, insülin uygulanmış diyabetik sıçan grubunda enos mrna ekspresyonunun, insulin-like growth faktör 1 ekspresyonunun ve vasküler endotel growth faktör mrna ekspresyonunun arttığı saptanmıştır. Bu artışlara bağlı olarak, diyabetik sıçanlarda endotel fonksiyon bozukluğunun düzeldiği bildirilmiştir. 31 Erkek Wistar ve tip 1 diyabetik Bio Breeding (BB/W) Wistar sıçanların kardiyak endotel hücrelerinde yapılan bir çalışmada, enos protein düzeyinin arttığı fakat enos mrna ekspresyonunun değişmediği gösterilmiştir. Diyabetik sıçanların kardiyak endotel hücrelerinde kontrol gruba göre enos birikimi azalmıştır, bu da diyabette gözlenen vazodilatör cevabın azalmasını desteklemektedir. 32 Tip 2 diyabetli C57BL/K5J diyabetik farelerin mezenterik arterlerinde yapılan bir çalışmada ise, Western Blot analizi ve real time PCR sonucunda, enos mrna ekspresyonunun ve protein düzeyinin, kontrolden farklı olmadığı gözlenmiştir. 33 Streptozosin ile oluşturulan diyabetin erken, orta ve geç fazında endotel fonksiyonunun değerlendirildiği bir çalışmada, noradrenalin ile kastırılmış aorta halkalarında, streptozosin enjeksiyonundan 24 saat sonra erken dönemde; endotel bağımlı vazodilatasyonun arttığı, nitrik oksit fonksiyonunun arttığı, 1-2 hafta sonra yani ikinci basamakta vazodilatasyonun normalize olduğu, 8 hafta sonra olan üçüncü basamakta da vazodilatasyonun azaldığı bildirilmiştir. Bu çalışmada, diyabetin süresine bağlı olarak endotel bağımlı gevşemenin artması, değişmemesi, azalması şeklinde üç fazlı bir cevap gözlenmiştir. Normal aorta halkalarının, streptozosine akut maruziyeti, asetilkolin gevşemesini değiştirmemiştir. 16

Endotel fonksiyon bozukluğunun başlama zamanındaki değişiklik, arterin çeşidi, tipi, deneysel modellerdeki farklılık, incelenen vazodilator maddenin tipini içeren deney koşullarıyla açıklanabilir. 34 Shinbori ve ark. larının yaptığı bir çalışmada, streptozosin ile diyabet oluşturulan erkek Sprague-Dawley sıçanlara, 4 haftalık diyabet sürecinin sonunda, 4 hafta boyunca da 2 veya 8 mg/kg N-heksakosanol uygulanmıştır. 8 haftanın sonunda diyabetik aortalarda, enos mrna düzeyi değişmezken, muskarinik M3 reseptör ve inos mrna düzeylerinin anlamlı olarak arttığı gösterilmiştir. N-heksakosanol uygulaması bu durumu tersine çevirmiştir. 35 65 mg/kg dozda alloksan ile diyabet oluşturulmuş Yeni Zellanda tavşanlarının aortasında, 6 haftalık diyabet süresi sonunda fenilefrinin neden olduğu kontraksiyonlarda bir değişiklik olmadığı fakat asetilkolin gevşemelerinin azaldığı saptanmıştır. Diyabetik aortalardaki azalmış asetilkolin gevşemelerinin süperoksit dismutaz (300 U/ml) eklenmesiyle normale döndüğü bulunmuştur. Hem asetilkolin hemde kalsiyum iyonoforu olan A23187 (sitozolik kalsiyumu arttırarak nitrik oksit sentazı aktive eder) uygulanması sonucunda, diyabetik tavşanlarda cgmp üretiminin azaldığı görülmüştür. Diyabetik aortada görülen endotel-bağımlı gevşeme azalmasının, zayıflamış nitrik oksit-cgmp ilişkisine bağlı olduğu ileri sürülmüştür. 36 150 mg/kg dozda alloksan ile hiperglisemi oluşturulmuş erkek Yeni Zellanda tavşanlarında yapılan bir çalışmada, 8 haftalık hiperglisemi periyodu sonunda, karotid arterler, Ad5CMVb-gal (13109 and 33109 pfu/ml), Ad5CMVeNOS (33109 pfu/ml) ve Ad5CMVSOD (33109 17

pfu/ml) ın CMV promotorunu eksprese eden adenoviral vektör ile 2 saat süresince 37 C de inkübe edilmiştir. Asetilkolinin endotel-bağımlı gevşeme cevabı diyabetik tavşanlarda anlamlı ölçüde azalırken, enos adenoviral transfeksiyonu yapılan diyabetiklerde normale döndüğü görülmüştür. 37 150 mg/kg dozunda alloksan ile diyabet oluşturulduktan 10 hafta sonra, tavşanların torasik aortaları alınıp enos u kodlayan adenovirus ile ex vivo olarak 24 saat inkübe edilmiştir. Adenovirus aracılığıyla β galaktosidaz geni aktarılan aortalar, negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Düşük konsantrasyonlarda (3 10-8 -10-7 mol/l) asetilkolin gevşemelerinin, AdeNOS aktarılan diyabetik aortalarda anlamlı bir şekilde arttığı görülmüştür. Yüksek konsantrasyonda (3 10-7 -10-5 mol/l) asetilkolin cevaplarında ise bir farklılık gözlenmemiştir. Böylece, enos un adenovirusaracılıklı ex vivo gen transferi, diyabetik tavşanlarda endotel-bağımlı gevşemeyi kısmen arttırdığı bulunmuştur. 38 2.4. Nitrik Oksit Nitrik oksit, damar tonusunun ayarlanması, endotel bağımlı vazodilatasyon, düz kas hücre proliferasyonu ve trombosit adhezyonu inhibisyonu, demir metabolizmasının kontrolü, transkripsiyon faktör aktivasyonu, mide-bağırsak, uterus ve kalp tonusünün düzenlenmesi, penis ereksiyonu, immunite gibi bir çok olayda rol oynamaktadır 38,39 18

2.4.1. Nitrik Oksitin Sentezi ve Etki Mekanizması Şekil 1. Nitrik oksitin L-arjininden sentezi 40 Nitrik oksit endotelde L-arjininden nitrik oksit sentaz enzimi aracılığıyla sentez edilir. Bu reaksiyon sonucunda L- sitrullin ve nitrik oksit üretilir. Nitrik oksit sentezlenirken nitrik oksit sentaz dışında, moleküler oksijene ve dört tane kofaktöre gerek duyulur, bunlar; hem, FAD, FMN ve BH4 tür. Bu mekanizma, L-arjininin L-ornitine dönüşümü ile sonuçlandığında, nitrik oksit yerine arjinaz enziminin ortaya çıktığı ve arjinazın da arjinin kullanımında nitrik oksit ile yarışıp nitrik oksit üretimini azalttığı belirtilmiştir. 40 Nitrik oksit; endotel hücrelerinde, kaveolaeda (hücre membranındaki invajinasyonlar) lokalize enos un enzimatik etkisiyle prekürsörü olan L-arjininden sentezlenir. Kaveolin-1, kalmoduline bağlanır ve enos aktivitesini inhibe eder. Kalsiyumun (Ca ++ ) kalmodulin e bağlanması, kaveolin-1 i ayırır ve enos u aktive ederek, nitrik oksit üretimine yol açar. 41 19

Şekil 2. Endotel hücreleri tarafından nitrik oksit üretimi. 42 Endotel-bağımlı vazodilatör bileşikler veya shear stres kalsiyum iyon kanallarını açarak, hücre içi kalsiyum düzeyini yükseltirler. Artan intrasellüler kalsiyum, kaveolini kalmodulinden ayırır; böylece enos uyarılmış olur. Nitrik oksit, vasküler düz kas hücrelerine difüze olur ve guanilat siklaz enzimini hem grubuna bağlanarak aktive eder. Guanozin trifosfat cgmp ye dönüşür. Artan cgmp de protein kinazı ve iyon kanallarını aktif hale getirir. Kalsiyumun hücre dışına çıkışı artarken, hücre içi düzeyi azaltılır ve böylece, damar düz kasında gevşeme gerçekleşir. 42. 20

Şekil 3. enos sinyal ileti sistemi. 42 (Treonin 495: Thr 495, Serin artığı 1177: ser 1177, Miristolasyon: myr, Palmitolasyon: palm) Şekil 3 de de görüldüğü gibi enos, iki globuler protein modülünden oluşmaktadır. enos, homodimerik bir enzimdir. Her altünit redüktaz ve oksijenaz segmentlerini içerir. Bu iki segment esnek bir protein yapısı ile birbirine bağlanmıştır. NADPH, FMN ve FAD için bağlama yerleri içeren redüktaz segmenti, nitrik oksit sentezi için NADPH a bağlanarak dehidrojenasyonu katalize etmek için gerekli olan elektronları üretir. NADPH, nitrik oksit sentaz enzimi için elektron kaynağıdır. Enzim, dimer yüzeyinde çinko tiyolet bölgesi içerir. Bu bölüm, kofaktör tetrahidrobiopterinin ve substrat L-arjininin bağlanması için ana öneme sahiptir. Oksijenaz segmenti, nitrik oksit üretimi için gerekli olan katalitik 21

merkezden oluşur ve hem, moleküler oksijen, L-arjinin ve tetrahidrobiopterin bağlar. 41,43 enos, intraselüler kalsiyumda artış meydana getiren uyarılar ile aktive olabilmektedir. En iyi uyaranın kan akışının oluşturduğu shear stres olduğu kabul edilmektedir. enos aktivasyonu, enzimin fosforilasyonu aracılığıyla gerçekleşir. enos proteini, serin, treonin ve tirozin bölümlerinden fosforile edilmektedir. enos un serin 1179 dan fosforilasyonu enos enzimatik aktivitesini ve nitrik oksit üretimini arttırmaktadır. 44 Ser 1177 nin fosforilasyonu, reduktaz bölümüne elektron akışını uyarır ve enzimin kalsiyuma duyarlılığı artar, bu olay enos aktivasyonun, bağımsız bir mekanizmasıdır. Bazı proteinkinazlar, enos u, endotel hücrelerinin mekanik ve hormonal uyarılmasını takiben enos aktivasyonuna katılan Ser1177 aminoasidinden fosforiller. Bu kinazlar, Akt/proteinkinaz B proteinkinaz A (PKA) içerirler. 44 İnsülin, katekolaminler, vazopresin, bradikinin, histamin, seratonin, adenozin difosfat, trombin, vasküler endotel growth faktör ve shear stres gibi uyaranlar nitrik oksit üretimini, fosfatilinositol 3-kinaz (PI3- kinaz)/akt yolağı ile Ser 1177 fosforilasyonu yaparak enos u aktive ederek tetiklemektedir. 45 22

2.4.2. Nitrik Oksit Sentazın Genel Özellikleri ve Tipleri Nitrik oksit sentaz enziminin, ikisi temel olmak üzere üç izoformu bulunmaktadır: 1. Yapısal NOS (cnos) a.endotel kaynaklı NOS (enos); endotel kaynaklı nitrik oksitin sentezinden sorumludur. b.nöron kaynaklı NOS (nnos); santral sinir sistemi ve nöronlarda nitrik oksitin üretiminden sorumludur. 2. İndüklenebilir NOS (inos) İmmunolojik uyaranlar ile indüklenmekte ve bütün çekirdekli hücrelerde bulunmaktadır. Özellikle inflamasyon durumunda eksprese olmaktadır. 42 Her üç nitrik oksit sentaz izoformunun aktivasyon için kalmoduline bağlanması gerektiği tespit edilmiştir. Yapısal NOS un etkinliği, kalsiyum iyonlarının hücre içi konsantrasyonundaki artışa, indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotit fosfat ve tetrahidrobiopterin varlığına bağlıdır. inos, bakteriyel endotoksin ve sitokinler tarafından aktive edilir, etkinliği kalsiyuma bağlı değildir. inos, immun ve inflamasyon olaylarına katılan ve hücre aracılı immun cevapta etkili olan bir komponenttir. 46 23

inos kalsiyum-kalmodulin kompleksinden bağımsız çalıştığı için aktivitesi daha uzun sürebilmektedir. Bunlara bağlı olarak inos un ürettiği nitrik oksit, fizyolojik sınırların oldukça üzerindedir. Yapısal NOS selüler membranla ilişkiliyken, inos bir sitozolik enzimdir. Her iki enzimde L-arjininin guanido bölgelerinde değişikliklerle ortaya çıkan L-NMMA, L- NAME yada L-NNA gibi L-arjinin türevleriyle inhibe edilir. inos aktivasyonunu glukokortikoid bileşikler de inhibe edebilir. 47 2.4.3. Nitrik Oksitin Biyolojik Etkileri Nitrik oksit, damar tonusunun fizyolojik olarak düzenlenmesinde özellikle kan basıncı ve kan akımının ayarlanmasında önemli rol oynamaktadır. 48 Endotel kaynaklı nitrik oksit, intimanın poliferasyonunu azaltan, lökosit adhezyonunu önleyen, trombosit fonksiyonunu inhibe eden ve vasküler tonusü kontrol eden parakrin bir faktördür. Nitrik oksit sentezinin azalması veya inaktivasyonu, kardiyovasküler hastalıklar için risk faktörü olarak kabul edilir. 43 enos aracılığıyla sentezlenen nitrik oksit, sağlam damarları aterosklerotik süreçten koruyan önemli bir faktördür. Nitrik oksit substratı olan L-arjininle kronik tedavinin, ateroskleroz oluşan hayvanlarda, aterosklerotik lezyon oluşumunu inhibe ettiği gösterilmiştir. 49 Deneysel modellerde, enos un genetik olarak eksikliğinde, aortada aterosklerotik lezyon oluşumunun tetiklendiği bildirilmiştir. 50 Nitrik oksit, miyozin hafif zincirin defosforilasyonunu azaltarak da gevşemeye katkıda bulunur. Endotel yüzeyindeki adezyon moleküllerinin 24

ekspresyonunu inhibe ederek endotel bütünlüğünü korur. Endotel kaynaklı nitrik oksit, damar düz kas hücrelerinin proliferasyonunu ve kollajen sentezini inhibe etmektedir. 51 Nitrik oksitin, nitroksit iyonu (NO -1 ) ile sitotoksik, nitrozonyum iyonu ile (NO + ) hücre koruyucu etki gösterdiği kaydedilmiştir. 52 nnos, beyinde davranış ve bellek gibi fonsiyonları etkileyen nitrik oksit üretiminden sorumludur. 53 Nitrik oksit, ayrıca inflamatuvar hücre ölümünün regülasyonunda cgmp den bağımsız yolaklarla etki göstermektedir. 54 Nitrik oksitin mast hücrelerinde ve trombositlerde proenflamatuar mediatörlerin yapımını inhibe ederek antiadezif etki gösterdiği saptanmıştır. 55 Trombosit agregasyonu ve adezyonu in vitro olarak nitrik oksit tarafından inhibe edilir. Trombositlerin aktivasyonu sonucu salınan adenozin difosfat ve serotonin, endotel hücrelerindeki guanilat siklazı aktive ederek damar düz kasının gevşemesine katkıda bulunabilir 56, 57 Nitrik oksit lökositlerin agregasyonunu ve lökositlerden süperoksit salımını inhibe eder. Deneysel inflamasyon modellerinde nitrik oksitin lökositlerin infiltrasyonunu inhibe ederek dokuları koruyucu etki gösterdiği ileri sürülmüştür. 35 Nitrik oksitin belirli koşullarda inflamasyonu arttırıcı etki gösterdiğini ileri sürmüştür. Bu hipoteze göre nitrik oksit molekülü süperoksit ile reaksiyona girerek peroksinitriti oluşturmakta ve oldukça güçlü olan bu reaktif oksijen bileşiği de doku hasarını arttırmaktadır. 58 25

2.4.4. Nitrik Oksit İnaktivasyonu Nitrik oksit, hemoglobinin hem grubu, serbest radikaller ve süperoksit tarafından hızla yıkılmaktadır. Süperoksit anyonu, nitrik oksit ile reaksiyona girer ve daha az potent vazodilatör, peroksinitrit, nitrit ve nitrat üretilir. Bu radikal türlerin oluşumu, nitrik oksitin inaktivasyonunu hızlandırmaktadır. Nitrik oksitin primer inaktivasyon ürünü, oksihemoglobin ve süperoksit gibi oksidize türlerin varlığını gerektiren nitrit ve nitrattır. 30 Nitrik oksit, süperoksit radikalleri ile etkileşip çok daha güçlü oksidan olan peroksinitrit oluşumuna yol açarak inaktif hale gelir ve oluşan peroksinitrit, lipit, protein, nükleik asitlerle reaksiyona girer ve lipid peroksidasyonu, DNA fragmantasyonu, plazma antioksidanlarının azalması, protein hasarı ve damar düz kas gevşemesinin engellenmesi gibi olumsuz etkilere neden olur. 43 Üretilen nitrik oksitin, yayılma yönü esas olarak damar düz kaslarına ve daha az oranda lümene doğru olduğu kabul edilmektedir. Lümendeki nitrik oksit, plazmadaki oksijen ve süperoksit anyonları tarafından hızla inaktive olmaktadır. İnaktive olmayan nitrik oksit ise trombositlere ve eritrositlere girer ve oksihemoglobin tarafından inaktive edilir. Tüm bu mekanizmalar, nitrik oksitin salgılandığı yerden uzak bölgelerde etkili olamayışını ve endotel fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak nitrik oksit üretiminin bozulması durumunda, sağlıklı endotel hücrelerinin salgıladığı nitrik oksitin, yetmezliği kompanse edemeyebileceğini göstermektedir. 59 26

2.4.5. Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres Yörüngelerinin en dışında eşlenmemiş elektron çifti içeren moleküllere serbest radikal denmektedir. Yarı ömürleri çok kısa olduğundan, oldukça reaktiftirler. Oksidatif stres ve serbest oksijen radikallerinin zayıflamış inaktivasyonu veya artmış üretimi toksik peroksinitrit oluşumu ile nitrik oksit biyoaktivitesinin azalmasına neden olur. Vasküler nitrik oksitin biyovarlığını azaltan baskın mekanizma, nitrik oksitin reaktif oksijen türlerinden süperoksit ile hızlı oksidatif inaktivasyonudur. 43 Vasküler oksidatif stres ile reaktif oksijen türlerinin artmış üretimi, vasküler fonksiyon bozukluğuna katkıda bulunur. Oksidatif stres, endojen pro-oksidatif enzimlerin (NADPH oksidaz, ksantin oksidaz veya mitokondri solunum zinciri) ve anti-oksidatif enzimlerin (süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, hem oksijenaz, tiyoredoksin peroksidaz/ peroxiredoxin, katalaz ve paraoksonaz) arasındaki dengenin bozulması olarak tanımlanabilir. Oksidatif streste, serbest oksijen radikallerinin üretimi antioksidan savunma sistemlerinin gücünü aşmaktadır. 43 Kardiyovasküler hastalıklardan hipertansiyon, diyabet, hiperkolesterolemi ve ateroskleroz, damar duvarında reaktif oksijen türlerinde dramatik artışa neden olur. Reaktif oksijen türleri, serbest oksijen radikallerini, oksijen iyonlarını ve peroksitleri içerir. Damar duvarında reaktif oksijen türleri üretebilen enzim sistemlerinden ana öneme sahip dört tanesi şunlardır: NADPH oksidaz, ksantin oksidaz, kenetsizlenmiş enos ve mitokondri solunum zinciri enzimleri. 43 27

Şekil 4. Vasküler oksidatif stresin ortaya çıkış zinciri. 43 NADPH oksidaz, ksantin oksidaz, kenetsizlenmiş enos ve mitokondri solunum zinciri enzimleri önemli eşlenmemiş elektron kaynağıdır. Moleküler oksijen, oksidatif solunum sırasında mitokondriden aktif oksijenin sızmasıyla yani eşlenmemiş elektron ile reaksiyona girer ve süperoksit anyonu oluşur. Süperoksit, süperoksit dismutaz ile hidrojen peroksite dönüşür. Süperoksit, Fenton reaksiyonuyla hidroksil radikaline indirgenebilir. Hidroksil radikali çok reaktiftir ve çoğu hücre komponentini etkileyebilir. Hidrojen peroksit, glutatyon peroksidaz, katalaz ve tiyoredoksin aracılığıyla detoksifikiye edilir. Miyeloperoksidaz, hidrojen peroksiti, okside klor ile güçlü oksidasyon ajanı hipoklorik asit oluşturmakta kullanmaktadır. 43 28

NADPH Oksidaz NADPH oksidazlar, fibroblastlar, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerini içine alan çeşitli hücre tiplerinin membranlarında görevli çok komponentli enzimlerdir. Çeşitli damar hastalıklarında NADPH oksidazlar damar duvarında upregüle olur ve süperoksit üretirler. 43 Çeşitli hayvan modellerindeki hiperkolesterolemi, diyabet, hipertansiyon gibi damar hastalıklarında NADPH oksidazın aktive olduğu ve ayrıca aterosklerotik arterlerde NADPH oksidazın altüniti gp 91 phox ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. 43 Ksantin Oksidaz Proteolizis ile ksantin dehidrogenazdan üretilir. Ksantin oksidaz elektronlarını kolayca moleküler oksijene verir ve böylece süperoksit ve hidrojen peroksit üretilir. Oksipürinol ksantin oksidaz inhibitörü olup, süperoksit oluşumunu azaltarak, hiperlipidemik hayvanların kan damarlarında asetilkoline karşı oluşan endotel bağımlı gevsemeleri arttırmıştır. Bu durum, erken hiperkolesterolemide endotel disfonksiyona ksantin oksidazın katkı sağladığını göstermektedir. Ksantin oksidazın kaynağı açıkça belli değildir. Fakat artmış kolesterol seviyeleri enzimin karaciğerden dolaşıma salınmasını uyarır. Ksantin dehidrogenazın endotel hücrelerinde bulunduğu gösterilmiştir. 43 29

enos Kenetsizlenmesi L-arjinin ve tetrahidrobiopterin düzeylerinin azalması gibi bazı durumlarda NOS, nitrik oksitten çok süperoksit oluşturmaktadır. Bu duruma NOS kenetsizlenmesi denilmektedir. NOS un redüktaz bölgesinden oksidaz bölgesine giden elektronlar, L-arjinin yerine moleküler oksijene giderek enos un kendisini süperoksit kaynağı durumuna getirir. Nitrik oksit, moleküler oksijen varlığında stabil olmayıp, hızlı ve spontan olarak çeşitli nitrojen oksitlerine dönüşerek, kendi kendine okside olmaktadır. NOS enzimleri, elektronları oksijene geçiren dört redoks aktif prostetik (FAD, FMN, hem ve BH 4 ) grup içerirler. enos kenetsizlenmesi yüzünden diyabet, hiperkolesterolemi ve esansiyel hipertansiyon gibi hastalıklarda süperoksit oluşumunun artması sonucu endotel fonksiyon bozukluğu görülebilir. 43 Tetrahidrobiopterin doğal ve önemli NOS kofaktörüdür. Sadece NOS tarafından nitrik oksit üretim hızının artmasında değil, endotel hücrelerinde süperoksit anyonlarının üretimini kontrol etme de önemli role sahiptir. Tetrahidrobiopterinin oral takviyesi, endotel fonksiyonunu restore ederek, insüline direnç geliştirmiş sıçanların aortalarında, enos aktivasyonu yoluyla oksidatif doku hasarını önlemektedir. 35 Spontan hipertansif sıçanların izole aortalarına tetrahidrobiopterin eklenmesi, endotel fonksiyonu restore etmiştir. Diyabetiklerde, hiperkolesterolemik hastalarda ve hipertansif bireylerde yapılan çalışmalarda, enos kofaktörü tetrahidrobiopterinin infüzyonu, enos un fonksiyonunu restore etmiştir. Peroksinitrit, enos un önemli kofaktörü BH4 ü (tetrahidrobiopterin), BH3 e oksitleyebilir. BH3 orantısız bir 30

şekilde BH2 ye dönüşür, enos kenetsizlenmesi olur ve azalmış oksijen, süperoksite dönüşür fakat daha fazla nitrik oksit sentezlenemez. 44 Mitokondri Solunum Zinciri Mitokondri kaynaklı süperoksit oluşumu, matrikste bulunan manganez süperoksit dismutaz 2 aktivitesine bağlı olarak gerçekleşir. Bazı kardiyovasküler hastalıklarda, serbest oksijen radikallerinin mitokondriyel üretimi ile mitokondri fonksiyon bozukluğu arasında bir ilişki bulunmaktadır. Süperoksit dismutaz eksikliğinden kaynaklanan mitokondri fonksiyon bozukluğu, mitokondride DNA hasarını arttırmaktadır. Mitokondri kaynaklı süperoksit oluşumunun apo E geni silinmiş farelerde aterosklerozisi hızlandırdığı bildirilmiştir. 43 2.4.6. Serbest Radikal Süpürücü Mekanizmalar Önemli antioksidan enzimler: süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GP X ), katalaz, hem oksijenaz (HO) ve tiyoredoksin peroksidaz (Trx) ve paraoksonazlar bulunmaktadır. Süperoksit Dismutaz Süperoksit dismutaz, süperoksiti, oksijen ve hidrojen peroksite dönüştürerek, önemli bir antioksidan rolü oynar. İnsanda üç formu vardır. 31

SOD 1 (Cu-Zn-SOD) sitoplazmada bulunur. SOD 2 (Mn-SOD) mitokondride bulunur. SOD 3 (Cu-Zn-SOD) hücre dışında bulunur. 43 Süperoksit dismutaz içeren farmakolojik serbest radikal süpürücülerin diyabetik sıçanlarda bozulmuş endotel fonksiyonunu düzelttiği bildirilmiştir. Süperoksit düzeyi, diyabetik sıçanların aortalarında kontrole göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Diyabetik aortalar, süperoksit dismutaz ile inkübe edildiğinde nitrit ve nitrat üretimi normalize olmuştur. Diyabetik sıçanlarda kontrole göre hem basal hem de asetilkolin uyarımlı süperoksit üretimi anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. 30 Süperoksit dismutaz gibi süperoksit anyon süpürücüler, serbest oksijen radikallerinin peroksinitrit oluşturmasını engelleyerek nitrik oksit aktivitesini korur. Böylelikle, nitrik oksitin yıkımını yavaşlatıp, yarı ömrünü uzatırlar ve etkisini potansiyelize ederler. Serbest oksijen radikalleri, direkt nitrik oksit aktivitesini değiştirmekten ziyade NOS enzim sistemini etkilemektedir. Serbest oksijen radikalleri, enos ve nnos fonksiyon bozukluğu yaparak nitrik oksit salımını etkilemektedir. 43 Katalaz Hidrojen peroksitin su ve oksijene ayrışmasını katalize etmektedir. 43 32

Glutatyon Peroksidaz Glutatyon peroksidaz, serbest hidrojen peroksiti, suya ve lipit hidroperoksitlere karşılık gelen alkollere dönüştürür. Bir çok memeli dokusunun sitoplazmasında bulunur. 43 Hem-Oksijenaz Hem-oksijenaz, hemi karbonmonoksit, biliverdin ve serbest demir iyonlarına ekimolar miktarda dönüştürür. Hem-oksijenaz, hücreleri, pro-oksidatif hemi, biliverdine yıkarak korur. Bu da bilirubine dönüşür. Bilirubin radikal süpürücü özelliğe sahip olup, fonksiyonel NADPH oksidazı direkt inhibe eder. Hem-oksijenaz tarafından, hem içeriğinde azalma, hemin biyoyararlanımını sınırlamakta ve hücresel serbest oksijen radikalleri üretiminde azalmaya neden olmaktadır, o da NADPH oksidazın NOX 2 altünitinin fonksiyonunu önlemektedir. Hem-oksijenaz tarafından üretilen karbonmonoksit, vazodilatör özellikler kadar antiproliferatif ve antiinflamatuvar özelliğe sahiptir. Demirin potansiyel sitotoksik etkileri, intraselüler ferritin yükselmesi ile sınırlanır. 43 Tiyoredoksin Tiyoredoksin doğrudan antioksidan özelliktedir ve sinyal transdüksiyonunu düzenleyerek, dokuları oksidatif stresten korumaktadır. Tiyoredoksin, damar düz kasında ve endotel hücresinde bulunmaktadır, 33

tiyoredoksin peroksidaz aracılığıyla serbest oksijen radikallerini süpürücü özellik göstermektedir. 43 Paraoksonaz Damar antioksidan savunmasını artırarak kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu özelliğe sahiptir. Paraoksonaz, serbest oksijen radikallerinden süperoksiti uzaklaştırmaktadır. 43 2.5. Resveratrol Resveratrol başlıca üzüm olmak üzere, yer fıstığı, ahududu, dut, erik, böğürtlen gibi sebze ve meyvelerde, kırmızı şarapta ve Polygonum cuspidatum adlı bitkinin köklerinde yüksek oranda bulunan doğal fitoaleksin yapısında bir bileşiktir. Resveratrol maddesinin kökeni eski Hindistan da yaşam bilgisi anlamına gelen ayurveda ya dayanmaktadır. 60 1940 lı yıllarda, resveratrol, ko-jo-kon ya da İdatori çayı (Polygonum cuspidatum bitkisinin kurutulmuş kökleri) olarak adlandırılan drog, geleneksel Çin ve Japon tıbbında deri hastalıklarında ve mantar tedavisinde kullanılmıştır. Bu bileşiğin bitkiler tarafından travmatik zedelenmeye, ultraviyole ışınına maruziyete ve fungal saldırılara karşı cevap olarak sentezlenmiştir. 61 34

Resveratrol (3, 5, 4 -trihidroksistilben) cis ve trans izomerleri bulunan stilben sınıfına ait sekonder bir bitki metabolitidir. Trans izomerlerinin biyolojik aktivitesinin, dietilstilbesterole ve 17β-estradiole benzediğinden, cis izomerlerine göre daha yüksek olduğu saptanmıştır. 62 Resveratrolün en iyi kaynağının üzüm olduğu ve en yüksek oranda kırmızı ve siyah renkli üzümlerde bulunduğu tespit edilmiştir. Kırmızı şarap içinde de bulunan resveratrolün vazodilatör, antihiperlipidemik, antienflamatuvar, antiagregan, estrojen agonisti ya da antagonisti özelliklere sahip olduğu anlaşılmıştır. 63 Epidemiyolojik çalışmalar, günde 250-400 ml şarap tüketen toplumlarda kardiyovasküler hastalıklara yakalanma sıklığının az olduğunu göstermektedir. 60 Kırmızı şarabın polifenolik ekstraktlarında yapılan çalışmalarda, endotel hücre fonksiyonunun ve nitrik oksit oluşumunun arttığı, trombosit agregasyonu ve lökosit adezyonunun azaldığı, ayrıca düşük dansiteli lipoprotein oksidasyonunun önlendiği gösterilmiştir. Bu polifenolik bileşenlerden birisi olan resveratrol de benzer biyolojik etkiler taşıdığından şarabın yararlı etkilerinin resveratrol üzerinden olabileceği görüşü ortaya çıkmıştır. 60 Düşük dansiteli lipoproteinlerin damarlarda birikmeden taşınabilmesinde resveratrol büyük bir öneme sahiptir. Şöyle ki; Fransızların doymuş yağ oranı fazla olan gıdalar almalarına ve plazma kolesterol seviyelerinin yüksek olmasına rağmen kalp krizinden ölüm oranının düşük olduğu belirtilmiştir. Bu durum, Fransız paradoksu olarak 35

bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda bu paradoksun Fransızların yemeklerde kırmızı şarap tüketiminden kaynaklandığı bulunmuştur. 64 2.5.1. Resveratrolün Sentezi Resveratrol bitkilerde fenil alaninden birkaç basamakta sentezlenir. Fenil alaninden fenilalanin amonyaliyaz enzimi ile deaminasyonla sinnamik asit oluşur. Bu bileşik sinnamat 4-hidroksilaz ile 4- kumarik asite dönüşür. 4-kumarat ile Ko-A esteri oluşur. Bu ester KoA ligazdır. 4-kumaril Ko-A ile 3 malonil Ko-A stilben sentaz enzimi ile resveratrole dönüşür. 65 36

2.5.2. Resveratrolün Farmakokinetik, Biyoyararlanım ve Metabolizması Şekil 5. Resveratrolün diastereomerleri ve metabolitleri; Dihidroresveratrol, resveratrol-3-sülfat ve resveratrol-3-o-glukuronit. 66 Resveratrolün sülfat ve glukuronit konjugatlarının; mono, di ve tri konjugasyon şeklinde farklılıklar gösterdiği Wistar sıçanlarda yapılan araştırmada gösterilmiştir. Ayrıca safra örneklerinde resveratrol-3-sülfat-4 - glukuronit, resveratrol-3-glukuruonit-5-sülfat, resveratrol-3-glukuronit-4-37

sülfat, resveratrol-3,4 -disülfat, resveratrol-3-glukuronit ve resveratrol-3- sülfat metabolitlerinin yanında çok düşük resveratrol-diglukuronitmonosülfat ve resveratroldisülfit-monoglukuronit şeklinde trikonjugatlarına da rastlanmıştır. 67 Klinik bir çalışmada 0.5 5 g dozaj aralığında 10 farklı dozda resveratrol verilmiş ve 2.4 μm kan düzeyinde serbest resveratrolün pik yaptığı görülmüştür. Resveratrolün saptanan ana metabolitleri sülfat ve glukuronik asit konjugatlarıdır. 68 Oral yoldan verilen resveratrolün, 10 dakika içinde plazmada en yüksek düzeye ulaştığı ve 60 dakika içinde, konsantrasyonun 1/10 oranına düştüğü bulunmuştur. Besinler içinde alınan resveratrol, deneysel çalışmalarda etkin bulunan miktarın 1/10-1/100 i kadardır. Bu veriler, besinler içinde alınan resveratrolün biyolojik olarak etkili olamayacağı düşüncesini ortaya çıkarmıştır. Yapılan başka bir araştırmada ise, resveratrolün karaciğer, böbrek ve midede biriktiği, onun metabolitlerinin de etkili olduğu ve diğer aktif polifenolik bileşikler ile sinerjik etki gösterdiği bulunmuştur. 69,70 Trans resveratrolün farmokinetiği tek doz çalışmalar ve göreceli düşük doz çalışmalarıyla incelenmiştir. Günlük iki defa yiyeceklerle alınan 2000 mg trans resveratrolün, farmakokinetiği ve tolere edilebilirliği incelenmiştir. Trans resveratrolün plazma konsantrasyonları, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresiyle ölçülmüştür. Yüksek yağlı kahvaltının, standart kahvaltıya göre eğri altında kalan alanı % 45-46 38

oranında düşürdüğü saptanmıştır. İçerikteki, kersetin ve alkolün ise trans resveratrolün farmakokinetiğini etkilemediği bulunmuştur. 71 2.5.3. Resveratrolün Vazodilatör Etkisi Resveratrolün 1-100 mol/l konsantrasyonlarda sıçan aortası 72,domuz koroner arteri 73, sıçan ve kobay mezenterik arterleri 74,75, insan safen ven ve internal meme arterinde 76 hem endotel bağımlı ve hem de endotel bağımsız gevşetici etkilere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalarda endotel bağımlı gevşetici etkisinin nitrik oksit aracılıklı olduğu saptanmıştır. Endoteli sağlam sıçan aortasında yapılan bir çalışmada, resveratrolün noradrenalin ve fenilefrin ile oluşan kasılmaları inhibe ettiği gösterilmiştir. Resveratrolün endotel bağımlı gevşetici etkisinin, vasküler NADH/NADPH oksidaz inhibisyonu ile süperoksit radikal oluşumunu azaltarak, nitrik oksit biyovarlığını arttırması sonucunda meydana geldiği gösterilmiştir. 72 Endotel hücrelerinde NOS aktivasyonunun kritik basamağı, nitrik oksit üretimine ve endotel bağımlı vazodilatasyona yol açan kalsiyum konsantrasyonundaki artışa bağlıdır. Kırmızı şarap polifenolik bileşiklerinin ekstraselüler kalsiyum bağımlı mekanizma ile nitrik oksit oluşumuna bağlı vazodilatasyona neden olduğunu gösterilmiştir. 77 39

Dişi ve erkek 14-16 haftalık Wistar sıçanlara 50 mg/l dozunda resveratrolün 21 gün boyunca verildiği bir çalışmada, resveratrolün hem erkek hem de dişi sıçanların aortalarında asetilkolinin endotel-bağımlı gevşemelerini arttırdığı, fenilefrinin kontraktil cevabını ise anlamlı azalttığı saptanmıştır. 78 Spontan hipertansiyonlu sıçanlara resveratrol (4.48 mg/l) 28 gün süre ile içme suyu içinde verildiğinde, kan basıncında önemli bir değişiklik oluşturmadığı, fakat aortada hidrojen peroksit oluşumunu azaltarak asetilkolinin endotel-bağımlı gevşeme cevabını arttırdığı saptanmıştır. 79 Resveratrolün oluşturduğu endotel-bağımlı gevşeme yanıtları, nitrik oksit üzerindeki akut etkilerine, enos aktivasyonuna ve süperoksit radikal süpürücü özelliğine bağlanabilir. 76,80,81,82 Daha geç dönemde ortaya çıkan genomik etkilerden enos protein ve mrna ekspresyonunu artırıcı ve NADPH ekspresyonunu baskılayıcı özellikler de endotel bağımlı gevşemeye katkıda bulunabilir. 80,81,83 Endotel-bağımsız gevşetici etkileri ise, vazokonstriktör prostaglandinlerin sentezinin inhibisyonu, potasyum kanallarının aktivasyonu, kalsiyum desensitizasyonu ve estrojen reseptörlerinin uyarılmasına bağlanabilir. 74 Resveratrolün güçlü antioksidan, trombosit ve lökosit fonksiyonunu inhibe edici ve antiaterosklerotik özellikte olduğu bildirilmiştir. 20,63,64 40

2.5.4. Resveratrolün İskemi Reperfüzyon Hasarından Koruyucu Etkisi 25 mg/l resveratrolün içme suyu içinde 15 gün boyunca sıçanlara verilmesi sonucunda, Langendorf aparatı ile perfüze sıçan kalbindeki iskemi-reperfüzyon hasarının belirgin olarak azaldığı rapor edilmiştir. Bu koruyucu etkinin, kısmen nitrik oksit sentezindeki artışa bağlı olarak ortaya çıktığı ileri sürülmüştür. 84 Erkek Wistar sıçanlara 0.23 g/kg dozda verilen resveratrolün, sıçanlarda renal iskemi reperfüzyon hasarı sonucu ortaya çıkan mortaliteyi % 50 ye varan ölçülerde azalttığı gösterilmiştir. 85 Resveratrolün iskemi reperfüzyondan koruyucu etkisi, ritim düzensizliklerinde, kardiyak infarkt alanında ve laktat dehidrogenaz, kreatin kinaz plazma seviyelerinde azalmaya yol açmasından da kaynaklanmaktadır. Nitrik oksitin, kardiyak dokuda direkt, koroner perfüzyonda indirekt etkisi aracılığıyla iskemi-reperfüzyon boyunca kardiyak fonksiyonu koruyabildiği gösterilmiştir. 86 İzole-perfüze sıçan kalbinde resveratrolün, koroner arter iskemisi sonucu oluşan fatal ventriküler taşikardi ve fibrilasyon sıklığını azaltarak, mortalitede belirgin bir azalma oluşturduğu görülmüştür. Resveratrolün bu etkileri, serbest oksijen radikal oluşumunu baskılamasına bağlanmıştır. 87 41

2.5.5. Resveratrolün Lipid Profili Üzerine Etkisi Kırmızı şarabın polifenolik bileşiklerinden, resveratrolün, epikateşinin ve kersetinin karşılaştırıldığı bir çalışmada, resveratrolün epikateşin ve kersetinden daha güçlü bir şekilde düşük dansiteli lipoprotein peroksidasyonunu önlediği gösterilmiştir. 88 Resveratrolün düşük dansiteli lipoprotein oksidasyonunu önleyici etkisinin, esas olarak (0,5; 1; 1,5 μm), bakırla şelasyon sonucu ortaya çıkan serbest radikal süpürücü etkisinden kaynaklandığı anlaşılmıştır. 89 Sağlıklı sıçanlar üzerinde yapılan bir çalışmada, 3 mg/kg dozda resveratrolün intraperitonal enjeksiyonu sonrasında, pankreatik beta hücrelerinde bulunan adenozin-tri-fosfat aracılı potasyum kanallarını ve voltaj bağımlı potasyum kanalarını bloke edici etkisi sonucu, insulin sekresyonunu arttırıcı, dolayısıyla plazma glukoz düzeyini düşürücü etkisi olduğu gösterilmiştir. 90 Apolipoprotein E geni silinmiş 6 haftalık fareler, 8 hafta boyunca % 0.27 resveratrol, % 1.37 kafeik asit ve % 8.35 kateşin karışımı ile şarabın içindeki polifenolik içerik göz önünde bulundurularak beslenmişlerdir. Çalışmada, ateroskleroza yatkın farelerin kateşin, kafeik asit ve resveratrol ile desteklenmesi, aortada ateroskleroz gelişiminin, inflamatuvar hücreleri etkileyerek, anlamlı bir şekilde azaldığı kaydedilmiştir. 91 42

2.5.6. Resvaratrolün Diğer Biyolojik Etkileri Trans resveratrolün akciğer kanseri ve lösemiyi önleyici etkisi açıkça belirtilmiştir. Trans resveratrol, iskemi reperfüzyon ve asetik asit ile indüklenen ülser iyileşmesini geciktirmektedir. 40 Resvaratrolün yaşlanmayı geciktirici etkisi birçok organizmada (maya, solucan, meyve sineği, fare ve balık) kanıtlanmıştır. Resvaratrolün DNA tamir geni olarak bilinen sirtiun1 i aktive ettiği bilinmektedir. Resvaratrölün kalori kısıtlama etkisi göstererek, hücre yaşam süresini uzattığı bilinmektedir. Bundan başka resvaratrolün yaşam süresini uzatmadaki etkilerini şu şekilde sıralayabiliriz: Aerobik kapasiteyi arttırma, insülin duyarlılığı arttırma, insülin like growth faktör, mitokondri miktarında ve enerji üretiminde artma, metabolik hastalıklara karşı koruma. Resvaratrolün sirtuinleri aktive ederek yaşam süresini uzattığı insan ve hayvan çalışmalarında gösterilmiştir. 92,93 Tümör aşılanmış farelere 18 hafta boyunca haftada iki kez 1, 5, 10 veya 25 µmol resvaratrol veren araştırıcılar, tümör sayısının kontrole göre sırasıyla % 50, % 63, % 63 ve % 88 oranında azaldığını ortaya koymuşlardır. 1997 yılında İllionis üniversitesinde yapılan bir araştırmada ise kanser aşılanmış farelerde resvaratrolün lezyon gelişimini engellediği ve tümör oluşumunu azalttığı saptanmıştır. 94 43

2.5.7. Resveratrolün Nitrik Oksit Üzerine Etkisi Polifenolik bileşiklerin nitrik oksit salımına etkisi üzerine en az iki mekanizma vardır. NOS aktivitesinin uyarılması ve bazal şartlarda nitrik oksit salımının korunması ve stabilizasyonu. Bu mekanizma diğer serbest radikaller ve süperoksit tarafından nitrik oksitin yıkımının korunmasını içermektedir. 95 Resveratrolün konsantrasyona bağımlı olarak insan umbilikal ven endotel hücre kültüründe 72 saat inkübasyonu sonucunda enos mrna ekspresyonunun ve nitrik oksit üretiminin arttığı gösterilmiştir. Fakat sadece bu bileşiğin kırmızı şarabın total uyarıcı etkisini açıklamak için yeterli olmayacağı düşünülmüştür. Favonoidlerden kateşin ve epikateşin, flavonollerden fisetin, myrisetin, isokersitrin ve hiperosit, antosiyaninlerden delphinidin, malvidin ve paeonidin, gallik asit ve hidroksisinnamik asitlerden ferulik ve sinapinik asit, enos ekspresyonunu veya enos promotor aktivitesini değiştirmemiştir. İlginç olarak kırmızı şarapta bulunan flavonol olan kersetin, enos ekspresyonunu inhibe etmiştir. Antosiyaninlerden siyanidin, hidroksisinnamik asitlerden, p-kumarik ve kafeik asit, fenolik asitlerden benzoik ve vanillik asit, enos ekspresyonunu orta derceli arttırmıştır. Araştırmanın sonucunda insan umbilikal ven endotel hücre kültürlerinde kırmızı şarabın polifenolleri içinde, trans resveratrolün en güçlü enos mrna uyaranı olduğu gösterilmiştir. 96 Başlangıçta yoğunluğu mililitredeki hücre sayısı 1 10 5 olan sığır pulmoner arter endotel hücre kültürlerine, resveratrol 10, 50 ve 100 μm konsantrasyonlarda 3 gün boyunca uygulanmıştır. Western Blot analizine 44

göre, resveratrol 50 100 μm dozlarda uygulandığında, enos ekspresyonunda 3 kat artış gözlenmişken, 10 μm resveratrol uygulamasının enos mrna ekspresyonu üzerinde etkisi olmamıştır. 97 Erkek ve dişi sıçanların (14-16 haftalık) aortalarında yapılan bir çalışmada 50 mg/l dozunda resveratrol, 21 gün boyunca içirilmiştir. Erkek ve dişi sıçanların aortalarında, uzun süreli resveratrol uygulamasının enos mrna ve protein ekspresyonunu arttırdığı, nitrik oksit oluşumunu arttırdığı ve endotel fonksiyonu iyileştirdiği bulunmuştur. 82 Wallerath ve ark. larının yaptığı bir çalışmada, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) 1-100 μg/l resveratrolle, 12 ile 72 saat süresince inkübe edilmiştir. RNAse protection assay kullanılarak enos mrna ekspresyonunun 24 saat ve 33 μmol/l resveratrol konsantrasyonundan sonra arttığı saptanmıştır. Resveratrol ile 72 saat inkübasyondan sonra enos protein miktarının, uygulanan resveratrol konsantrasyonuna bağlı olarak arttığı ve enos aktivitesinin upregüle olduğu gözlenmiştir. 80 İnsan umbilikal ven endotel hücrelerine, hücre kültüründe, alkol içermeyen kırmızı şarap polifenol ekstresi, konsantrasyon bağımlı dozlarda (100-600 μg/ml) uygulanmıştır. DAF-2 floresan probu kullanılarak enos salımının insan umbilikal ven endotel hücrelerinde 3 kat arttığı gözlenmiştir. Western Blot çalışmalarında ise enos protein düzeyinin 2 kat arttığı saptanmıştır. 98 45

Nicholson ve ark. larının yaptığı bir çalışmada, insan umbilikal ven endotel hücrelerine, kersetin ve resveratrolün 0-1.0 μm artan konsantrasyonlarda uygulanması sonucunda, enos mrna ekspresyonunun önemli ölçüde arttığı gözlenmiştir. 99 Orallo ve ark. ları resveratrolün (1-10 µm) sıçan aortasında enos aktivitesini değiştirmediğini fakat endotel bağımlı gevşemeye neden olduğunu bulmuşlardır. Bu gevşemenin enos aktivitesini veya nitrik oksit biyosentezini direkt arttırma yoluyla olmadığını, NADPH oksidaz aktivitesini azaltmasıyla olduğunu bildirmişlerdir. 100 Spontan hipertansif sıçanlarda yapılan bir çalışmada, sıçanlara 0.01568 mg (düşük) ve 0.1568 mg (yüksek) dozlarda günlük içme suyunda resveratrol verilmesi sonucunda, enos protein düzeyinin değişmediği gösterilmiştir. Resveratrol tedavisinin, pro-oksidan enzim NADPH oksidazın altüniti olan gp 91 phox ve süperoksit dismutaz-1 veya süperoksit dismutaz-2 gibi antioksidan enzimlerin protein seviyesini değiştirmediği saptanmıştır. 79 Tang ve ark. larının yaptığı bir çalışmada yüksek kalorili diyet ile beslenen erkek Yeni Zellanda tavşanlarına, 15 ve 30 mg/kg dozunda kroketin verilmiştir. Yüksek kalorili diyet ile beslenme, torasik aortada enos mrna ekspresyonunu downregüle etmiştir. Yüksek kalorili diyet ile kroketinin birlikte verilmesi, tek başına yüksek kalorili diyet ile beslenenlere göre enos mrna ekspresyonunu anlamlı bir şekilde arttırmıştır, kontrole göre ise anlamlı fark bulunamamıştır. 101 46

Aterosklerotik apo E geni silinmiş farelere 7 gün boyunca mide sondası yoluyla 30 veya 100 mg/kg/gün resveratrol uygulandıktan sonra kalpte süperoksit dismutaz 1-3, glutatyon peroksidaz ve katalazın upregüle olduğu ve buna bağlı olarak, süperoksit oluşumunun azaldığı bulunmuştur. Ayrıca NADPH oksidazın altünitleri olan NOX 2 ve NOX 4 ün mrna ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir. Resveratrol tedavisinden sonra kalpte 3-nitrotirozin ve malondialdehitin içeriğinin azaldığı ve böylelikle lipit peroksidasyonun ve oksidatif stresin azaldığı ortaya çıkmıştır. Apo E-geni silinmiş farelerde, oksidatif strese sahip hayvan modelinde, enos kenetsizlenmesi olmakta ve nitrik oksit yerine süperoksit üretmektedir. Bu durum BH4 ün kısmi eksikliğine bağlıdır. Apo E geni silinmiş farelere resveratrol uygulanması, BH4 ün GTP den sentezlenmesinde hız sınırlayıcı enzim olan GTP siklohidrolaz 1 in ekspresyonunu arttırmıştır ve BH4 seviyeleri kalp dokusunda anlamlı artış göstermiştir. 102 Sprague Dawley sıçanlara mide sondası yoluyla 7 gün boyunca resveratrol uygulanan bir çalışmada, 7 günün sonunda sıçanların kalbi, Langendorf perfuzyon aparatına takılarak, iskemi reperfüzyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Western Blot analizi sonucunda inos, enos protein düzeylerinin, resveratrol alan sıçanların kalbinde önemli ölçüde arttığı saptanmıştır. inos protein düzeyinin, resveratrol alımından 24 sonra, enos protein düzeyinin ise 5 gün sonra arttığı saptanmıştır. İskemi sonrası miyokardiyal fonksiyonda, infarkt alanında ve apoptotik kardiyomiyositlerin yüzdesinde resveratrol uygulamasına bağlı olarak belirgin bir iyileşme görülmüştür. 103 Erkek Swiss albino farelerde yapılan bir çalışmada indometazinin tek doz olarak 18 mg/kg oral uygulanmasıyla akut gastrik ülserasyon oluşturulmuştur. %1 lik trans resveratrol ve HST-1 (resveratrol 47

analoğu), DMSO içinde günlük uygulanmıştır. Ülser gelişiminden 4 gün sonra doku örneklerinin real time PCR ı sonucunda enos un ülserli fakat hiçbir tedavi uygulanmamış farelerde, trans resveratrol uygulanmış farelere göre 1,5 kat, inos un ise 2,5 kat arttığı bulunmuştur. Trans resveratrol enos ekspresyonunu çok az indüklemiş fakat güçlü bir şekilde siklooksijenaz-1 in eksprese olmasını inhibe etmiştir. Siklooksijenaz-1 endotel hücre proliferasyonunu, anjiyogenezin azalmasını ve ülser iyileşmesinin gecikmesini sağlar. enos gen ekspresyonu, HST-1 uygulananlarda, trans resveratrol uygulanmış ve ülserli hiçbir şey uygulanmamış farelere göre 4,8 kat eksprese olmuştur. Trans resveratrol HST-1 e göre enos üzerinde daha az etkiye sahiptir. enos ekspresyonu gastrik ülser iyileşmesinde ana rol oynamaktadır. Böylelikle; HST-1, trans resveratrol gibi ülser durumunu kötüleştirmez, indometazin indüklü ülserin iyileşmesini NOS bağımlı yol ile hızlandırır. 40 2.5.8. Diyabette ve Metabolik Sendromda Resveratrolün Etkisi Fruktoz ile beslenme sonucu sıçanlarda ortaya çıkan hipertansiyon, resveratrol verilen grupta belirgin olarak azalmış, bu etkinin mezenterik arter enos aktivitesindeki artış ve plazma lipit peroksit değerlerinde azalma ile birlikte oluştuğu bildirilmiştir. 104 Resveratrolün yüksek kolesterollü diyetle beslenen tavşanlarda kan akışını artırdığı, aterom plak oluşumunu azalttığı gösterilmiştir. Resveratrol ve kırmızı şarap uygulamasıyla endotelin-1 plazma seviyelerindeki artış ve plazma nitrik oksit konsantrasyonundaki düşüş, tersine dönmüştür. 105 48

Orta yaştaki erkek C57BL/6NIA farelere yüksek kalorili diyet (yağ içeriği %60) verilerek yapılan bir çalışmada, yem içinde, günde 5-22 mg/kg resveratrol verilmiştir. 6 ay sonra yaşam süresinin ve insülin duyarlılığının arttığı gözlenmiştir. Resveratrol verilmesinin, karaciğerde yağ akümülasyonunu azalttığı, mitokondri sayısını ve insulin duyarlılığını artırdığı ve organ histolojisinde belirgin bir düzelme sağladığı gösterilmiştir. Resveratrolün memelilerde, nikotinamid adenin dinukleotid (NAD)-bağımlı deasetilaz grubundaki sirtuinlerden Sirtuin-1 i aktive ederek mitokondri biyogenezini artırdığı, böylece enerji metabolizması bozukluğunu, hücre fonksiyonunu ve kalp-damar ve nöronal hastalıkları düzelttiği ileri sürülmektedir. Resveratrolün Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans ve Drosophila melanogaster gibi türlerde yaşam süresini uzattığı saptanmıştır. Bu organizmalarda uzamış yaşam süresi, Sirtuin-2 ye bağlanmıştır. Resveratrol, yüksek kalori ile beslenen farelerin fizyolojisini, standart diyet ile beslenen farelerin durumuna getirerek kalori alımını azaltmaksızın sağlıkları üzerinde yararlı etkiler göstermektedir. 70 Normal dişi sıçanlar yüksek yağlı diyet (% 42 yağ, % 36 karbonhidrat ve % 22 protein) ile 8 hafta boyunca beslendikten sonra, vücut ağırlığında ve plazma lipit profilinde anlamlı artış olmamıştır. Yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanların sistolik ve diastolik kan basınçlarında standart diyet ile beslenenlere göre artma, asetilkolin bağımlı gevşemelerde ise azalma gözlenmiştir. Yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanlarda, vasküler disfonksiyon ve kalplerinde perivasküler fibrozis gözlenmiştir. 8 hafta boyunca yiyeceklerine eklenerek verilen 20 mg/kg/gün resveratrolün, yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanların kan basınçlarında artışı önlemiş ve aortalarda gözlenen asetilkolin bağımlı gevşemeleri düzeltmiştir. Resveratrol damar lümeni alanını ve duvar kalınlığını değiştirmemiş, perivasküler fibrozis cevabını azaltmada başarısız olmuştur. Yüksek yağlı diyetin, sıçanlarda, hipertansiyonu ortaya çıkartabileceği ve hiperlipidemi 49

yokluğunda ve aşırı obezite gelişiminden önce perivasküler fibrozisi indükleyebileceği gözlenmiştir. Resveratrolün, perivasküler fibrozis gelişimini etkilemeden, yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanlarda hipertansiyon cevabını önleyebileceği görülmüştür. Yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanlarda standart diyet ile beslenenlere göre asetilkolinin maksimal gevşemesinde anlamlı düşüş olmuştur. Yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanlarda, antioksidan resveratrolün, nitrik oksit sentaz aktivitesini uyardığı ve asetilkolin aracılı gevşemeyi normalize ettiği, standart diyet ile beslenenlerde ise gevşemeyi etkilemediği gözlenmiştir. Bu çalışmanın sonucuna göre resveratrol, yüksek yağlı diyet ile beslenen sıçanlarda damar fonksiyon bozukluğunu önlemede yeni farmakolojik yaklaşım sunmaktadır. 106 Tip II diyabetik farelerde 4 hafta boyunca 20 mg/kg/gün dozda verilen resveratrolün artmış olan TNFα mrna ve protein düzeyini düşürdüğü, azalmış enos (Ser 1177) fosforilasyonunu arttırdığı, kontrol grubu üzerinde etkisinin olmadığı belirtilmiştir. enos fosforilasyonundaki artış, nitrik oksit biyovarlığındaki artış ile yakından ilgilidir. Diyabetik farelerde resveratrolün nitrik oksit salımını arttırdığı bulunmuştur. 107 Farelere 100 mg/kg (düşük doz), 400 mg/kg (normal doz) ve 2400 mg/kg (yüksek doz) gibi üç farklı dozda standart diyet, sınırsız diyet ve yüksek kalorili diyet ile beraber verilen resveratrolün etkileri incelendiğinde, yüksek kalorili diyet ile beslenen farelere 12. aydan itibaren düşük doz resveratrol verilmesinin, ömrü uzatma üzerinde etkili olduğu bulunmuştur. Standart ve sınırsız diyet ile beslenen farelerde 12. aydan itibaren resveratrol verimi yaşam süresini uzatamamıştır. Yüksek kalorili diyet ile beslenen farelerde kısalmış olan yaşam ömrünün resveratrol 50

uygulamasıyla uzadığı fakat yine de standart yem ile beslenen obez olmayan farelerinkine ulaşamadığı gözlenmiştir. 108 Erkek Sprague Dawley sıçanlara 45 gün süresince 10 mg/kg/gün resveratrol mide sondası yöntemiyle verilmiştir. Ayrıca içme sularında %10 oranında fruktoz verilmiştir. Kronik resveratrol uygulaması, kardiyak enos aktivitesini arttırmıştır. Bu çalışmanın sonucunda resveratrolün, enos ekspresyonunu arttırmasından dolayı insülin rezistansıyla ilişkili aterojenik kalp hastalığı gelişimini önleyebileceği öngörülmüştür. 104 İnsan umbilikal ven endotel hücre kültüründe yüksek glukoza maruziyet sonucunda (400 mg/dl) asetillenmiş p53 ün arttığı, intraselüler adezyon molekülü-1 in (ateroskleroz gelişiminde önemli rol oynamaktadır) ekspresyonunun arttığı ve endotel hücrelerin yaşam döngüsünün kısaldığı gözlenmiştir. Streptozosin ile diyabet oluşturulmuş farelerde 4 haftalık diyabet sürecinden sonra, Sirtuin-1 ekspresyon düzeyinin azaldığı fakat p53 ve p21 ekspresyonunun arttığı bulunmuştur. Resveratrol tedavisinin, diyabetik farelerin aortalarında, asetillenmiş p53 düzeyini, p21 ve adezyon molekülü-1 ekspresyonunu azalttığı bulunmuştur. Sirtuinlerin aktivasyonuyla hipergliseminin yol açtığı hücre ölümlerinin azaldığı bildirilmiştir. 109 51

3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Kullanılan Deney Hayvanları Bu çalışmanın deneysel protokolü Gazi Üniversitesi Hayvan Etik Komitesinin, G.Ü.ET-05.047 kararı ile onaylanmıştır. Deneyler, 16-18 haftalık, 1850-2100 kg ağırlığındaki beyaz erkek Yeni Zellanda tavşanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tavşanlar, Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde deney hayvanları için özel ayrılmış odalarda tutulmuşlardır. Tavşanlar sıcaklık kontrollü (21 24 o C) odalarda 12 saatlik karanlık/aydınlık periyodunda yaşatılmışlardır. Resveratrol (5 ve 50 mg/l) 0.05% etil alkol ile çözülerek tavşanların içme sularına karıştırılmıştır. İçme suyu olarak kontrol gruplarına ve yalnız diyabet yapılmış tavşanlara çesme suyu, diğer gruplara ise deney protokolünde belirtilen miktarda resveratrol ilave edilmiş çeşme suyu verilmiştir. Resveratrol içeren su şişeleri ışık geçirmez malzeme ile kaplanmıştır. Hayvanlar standart yem ile beslenmiş ve içebildikleri kadar su içmelerine izin verilmiştir. Diyabetik tavşanların içme kaplarındaki su, sabah-akşam kontrol edilmiştir. Diyabet, steril izotonik NaCl çözeltisi içinde çözdürülen 100 mg/kg alloksanın kulak veninden enjeksiyonu ile oluşturulmuştur. Alloksan enjeksiyonundan sonraki ilk 24 saat içinde %10 glukoz içeren içme suyu verilmiştir. Uygulamadan 3, 5 ve 15 gün sonrasında hayvanların kulak veni 52

kanatılarak ve Accu-Chek (Roche) cihazı kullanılarak kan şekeri ölçümü yapılmıştır. Kan şekeri 250 mg/dl üzerinde ölçülen tavşanlar diyabetik olarak değerlendirilmişlerdir. Diyabet takip süresi 8 hafta olarak belirlenmiştir. Tavşanlar, sodyum tiyopental (% 2 intravenöz) enjeksiyonu ile anesteziye edildikten sonra doku örnekleri toplanmıştır. 3.1.1. Deney Hayvanları Grupları Deney grupları aşağıda gösterilmiştir: Grup 1: Kontrol Grup 2: Diyabetik (100 mg /kg alloksan) Grup 3: Önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (5mg/L resveratrol ve 100 mg /kg alloksan; Res5-diyabetik) Grup 4: Önceden resveratrol alan diyabetik (50mg/L resveratrol ve 100 mg /kg alloksan; Res50-diyabetik) Grup 5: Aynı anda resveratrol alan diyabetik (100 mg /kg alloksan ve 50mg/L resveratrol; Diyabetik-Res50) 53

3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler Bu çalışmada kullanılan kimyasal malzemeler ve temin edildikleri firmalar aşağıda belirtilmiştir. 1-Maxima Hot Start Taq Polimeraz (Fermentas) 2-Etidyum Bromür (Fermentas) 3- enos ve GAPDH primeri (Alpha DNA) 4- Agaroz (Seakem) 5- Resveratrol (Sigma, Herb-Tech) 5- Revert Aid First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas) 6- RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (Qiagen) 7- DNA marker 100 bp (Bioron) 8-0.5 TBE buffer 9- Alloksan monohidrat (Sigma) 10- Etanol (Merck) Bu çalışmada kullanılan başlıca cihaz ve teknik malzemeler ve temin edildikleri firmalar aşağıda belirtilmiştir. 1- Spektrofotometre (Agilent 8453) 2- Hassas terazi (Denver Enstrument) 3- Su banyosu (Nüve) 4- Ph metre (İnolab) 5- Jel görüntüleme cihazı (Biorad- GelDoc) 6- Vorteks (Velb scientifica) 7- Mikrodalga fırın (Beko) 54

8- Elektrofotik güç kayanağı (Consort) 9- Elektroforez (Biorad) 10- Thermal Cycler (İcycler thermal cycler-biorad) 11- Otomatik pipetler (Thermo scientific) 12- Santrifüj (Hettich Zentrifugen Mikro 200 R) 13-Mikro Dismembrator Homojenizatörü (Santorius-ODTÜ Merkez Laboratuvarı) 14- Şeker ölçüm cihazı (Accu-Check Go (Roche)) 3.3. Çözeltilerin Hazırlanışı 3.3.1. Krebs Çözeltisi Bileşimi (mm): NaCI:118, KCl:4.73, KH2PO4:1.2, MgSO4:1.2, CaCl2:2.5, NaHCO3:25, Glukoz:11, EDTA: 0.026. 3.3.2. Stok Etidyum Bromür Çözeltisi Hazırlanışı 10 mg etidyum bromür 1 ml distile suda çözülerek hazırlanmıştır. 3.3.3. Agaroz Jel Hazırlanışı (%1 ve %2) 0,35 g Agaroz, 35 ml 0.5 TBE çözeltisinde çözülerek hazırlanmıştır.(%1) 0,70 g Agaroz, 35 ml 0.5 TBE çözeltisinde çözülerek hazırlanmıştır.(%2) 55

3.3.4. Kullanılan Primerler Tavşan enos primeri için reverse dizilimi: CTCCAGGAT GTTGTAGCGGTGA ve forward dizilimi: GCTGGAGTGGTTCGCGGCC olan primer seçilmiştir. Gen Bankasından enos Geninin Sorgulanması Oryctolagus cuniculus endothelial nitric oxide synthase NOS3 (LOC100009498), mrna LOCUS NM_001082733 3630 bp mrna linear MAM 29-MAR- 2009 DEFINITION Oryctolagus cuniculus endothelial nitric oxide synthase NOS3 (LOC100009498), mrna. ACCESSION NM_001082733 VERSION NM_001082733.1 GI:130502159 901 gtcccggacg agcccccaga actcttcact ctgccccctg agttggtcct ggaggtgtcc 961 ctggagcacc ccacgctgga gtggttcgcg gccctgggtc ttcgctggta tgccctcccg 1021 gcagtgtcca acatgctgct ggaaatcggg gggctagagt tccctgcagc ccctttcagc 1081 ggctggtaca tgagcacgga gatcggcaca cggaacctgt gtgaccctca ccgctacaac 1141 atcctggagg atgtggccgt ctgcatggac ttggataccc ggacaacgtc gtccctgtgg 56

gctggagtggttcgcggcc dizilimi, enos primerinin forward dizilimini ifade ederken, tcaccgctacaacatcctggag dizilimi, enos primerinin reverse formunun ters diziliminin komplementerini göstermektedir. Tavşan GAPDH primeri için reverse dizilimi: ACCACGGTG CACGCCATCAC ve forward dizilimi: TCCACCACCCTGTTGCTGTA olan primer seçilmiştir. Gen Bankasından GAPDH Geninin Sorgulanması NCBI Reference Sequence: NM_001082253.1 Oryctolagus cuniculus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), mrna LOCUS NM_001082253 1282 bp mrna linear MAM 30-MAR- 2010 DEFINITION Oryctolagus cuniculus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), mrna. ACCESSION NM_001082253 VERSION NM_001082253.1 GI:126723532 541 cccccctggc caaggtcatc cacgaccact tcggcattgt ggaggggctc atgaccacgg 601 tgcacgccat cactgccacc cagaagaccg tggacgggcc ctctgggaag ctgtggcgtg 661 acggccgcgg ggccgcccag aacatcatcc ctgcctccac tggcgctgcc aaggccgtgg 721 gcaaggtcat ccccgagctg aacgggaaac tcactggcat ggccttccgt gtgcccaccc 781 ccaacgtgtc ggtcgtggac ctgacctgcc gcctggagaa agctgctaag tatgacgaca 57

841 tcaagaaggt ggtgaagcag gcatccgagg gccccctgaa gggcatcctg ggctacaccg 901 aggaccaggt cgtctcctgc gacttcaaca gtgccaccca ctcctctacc ttcgatgctg 961 gggctggcat tgccctcaat gaccactttg tgaagctcat ttcctggtat gacaacgaat 1021 ttggctacag caacagggtg gtggacctca tggtccacat ggcctccaag gagtaagagc accacggtgcacgccatcac dizilimi, GAPDH primerinin reverse dizilimini ifade ederken, tacagcaacagggtggtgga dizilimi, GAPDH primerinin forward formunun ters diziliminin komplementerini göstermektedir. 3.4. Yöntem 3.4.1. Doku Örneklerinin Eldesi ve Homojenizasyon Tavşanlar, kulak veninden sodyum tiyopental (%2 intravenöz) enjeksiyonu ile anesteziye edildikten sonra torasik aortalar izole edildi. İzolasyon, damarı germemeye ve endotel bütünlüğünün korunmasına dikkat edilerek gerçekleştirilmiştir. İzole edilen torasik aortalar % 95 O 2 -% 5 CO 2 gaz karışımı ile devamlı gazlandırılan, ph sı 7,4 ve sıcaklığı yaklaşık 37 C olan Krebs çözeltisi içine alındı. Krebs çözeltisinde torasik aorta dokusunun yağ ve bağ dokuları temizlendi ve doku örnekleri birkaç parçaya ayrıldıktan sonra steril tüplere kodlanarak yerleştirilip, deney gününe kadar tüplerde -80 C de saklanmıştır. 58

Homojenizasyon öncesinde her bir örnek 100 mg olacak şekilde hassas terazide tartılmıştır. Homojenizasyon işlemi Odtü Merkez Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir. Gruplar kontrol, diyabet, önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik, önceden resveratrol alan diyabetik ve aynı anda resveratrol alan diyabetik olmak üzere homojenize edilmiştir. Homojenizasyon, Mikro Dismembratör homojenizatöründe 5 ml örnek flasklara uygun grinding ball kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her bir grup için ayrı flask kullanılmıştır. Homojenize edilen örnek steril tüplerde sıvı azotta tutulmuştur. Ardından total RNA izolasyonuna geçilmiştir. 3.4.2.Total RNA İzolasyonu Total RNA izolasyonu GATA Araştırma Geliştirme Merkez Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir. RNA izolasyonu RNeasy Fibrous Tissue Mini Kiti (Qiagen) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İzole edilen örneklerin 260-280 nm de spektrofotometrede okunması ile total RNA konsantrasyonu ve saflıkları saptanmıştır. RNA nın bütünlüğü % 1 lik agaroz jel elektroforezinde de kontrol edilmiştir. Her bir örnekte 1 µg RNA olacak şekilde cdna sentezine geçilmiştir. 3.4.3. Reverse Transkriptaz-PCR Yöntemi cdna sentezi, PCR aşaması ve görüntüleme işlemleri, GATA Araştırma Geliştirme Merkez Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir. cdna sentezi Revert Aid First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas) kullanılarak yapılmıştır. Bunun için elde edilen RNA ya dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş su ve oligo (dt) 18 eklenerek 70 C de 5 dakika 59

inkübe edilmiştir. Sonra buz üzerine alınan karışıma, 5x reaksiyon tamponu (250 mm Tris-HCl (ph 8.3), 250 mm KCl, 20 mm MgCl2, 50 mm DTT), 10 mm dntp karışımı (datp,dctp,dgtp,dttp), RNase inhibitörü ilave edilerek 37 C de 5 dakika inkübe edilmiş ve MMLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transkriptaz enzimi ilave edilerek 42 C de 1 saat, 70 C de 10 dakika inkübasyonun ardından PCR aşamasına geçilmiştir. PCR reaksiyonları 50 µl hacimde yapılmıştır. 1 reaksiyon tüpü içine sırasıyla; 30.8 µl steril distile su, 5 µl (25 mm) MgCl2, 5 µl (25 mm)10x PCR tamponu (500 mm KCl, 100 mm Tris-HCl (ph 8.3), 15 mm MgCl 2 ), 2 µl (10 mm) dntp, 1 µl (100 pmol/µl) forward primer, 1 µl (100 pmol/µl) reverse primer, 0.2 µl (10 U/1 µl) Hot-Start Taq DNA polimeraz, 5 µl (1 µg/µl) cdna eklenerek PCR gerçekleştirilmiştir. Tablo 1. enos ve GAPDH için PCR tepkime karışımı. cdna µg/µl 10 PCR tamponu Primerler 100 pmol/µl MgCl2 (25 mm) dntp (10mM) Tag DNA polimeraz 250 unıts Distile su Toplam hacim enos 5 µl 5 µl 1 µl +1 µl GAPDH 5 µl 5 µl 1 µl +1 µl 5 µl 2 µl 0.2 µl 30.8 µl 5 µl 2 µl 0.2 µl 30.8 µl 50 µl 50 µl PCR reaksiyonu; 95 C de 5 dakika enzim aktivasyonunundan sonra, 35 siklus 95 C de 45 saniye (denatürasyon), 60 C de (erime sıcaklığı) 30 saniye (annealing:bağlanma), 72 C de 30 saniye (uzama) ve son olarak 72 C de 10 dakika inkübasyon basamakları ile 60

gerçekleştirilmiştir. enos geni için PCR program aynı olup sadece annealing sıcaklığı 58.3 o C olarak değiştirilmiştir. 3.4.4. Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünleri % 2 lik agaroz jel elektroforezinde yürütülmüştür. Bunun için öncelikle 0.5xTBE (ph:8.0) tamponu içinde hazırlanan agaroz, mikrodalga fırında kaynatılmıştır. Agarozun homojen bir şekilde erimesinden sonra 0.5 µl etidyum bromür eklenmiştir. İyice karıştırıldıktan sonra elektroforez kalıbına dökülmüştür. Jel donduktan sonra elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Jelin üzerini örtecek şekilde 0.5xTBE çözeltisi eklenmiştir. PCR ürünlerinden 10 µl alınıp, 2 µl jel yükleme boyası ile karıştırılarak kuyucuklara yüklenmiştir. 5 µl DNA markerı (100 bp) agaroz jelin ilk kuyucuğuna yüklenmiştir. 100 voltluk sabit akımda 1 saat boyunca elektroforez gerçekleştirilmiştir. 3.4.5. Görüntüleme Elektroforezden sonra bantlar ultraviyole ışığı altında Gel Doc aletinde uygun ışık ayarında görüntülenmiştir. Bantların dansitometrik analizi Quantitiy 8.6.6. Software programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 61

3.5. İstatiksel Analiz Deney gruplarından elde edilen bantların dansitometrik analizinde veriler ortalama ± standart hata olarak ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki farklar GraphPad Instat programı ile ikiden çok bağımsız grup verilerinin değerlendirilmesinde kullanılan One-way ANOVA testi yapılarak karşılaştırılmıştır. P 0.05 düzeyi istatiksel olarak anlamlı kabul edilmektedir. 62

4. BULGULAR 4.1. Deney Gruplarına Ait Ağırlık, Kan Şekeri ve Günlük Tüketilen Su Miktarı Deney grupları arasında hayvan ağırlıkları karşılaştırıldığında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.(p>0,05) Diyabetin vücüt ağırlığına etki yapmadığı ve ayrıca resveratrol alımının hayvan ağırlıklarında belirgin fark oluşturmadığı gözlenmiştir. Deney hayvanlarının kan glukoz düzeyleri karşılaştırıldığında; diyabetik ve resveratrol içen diyabetik gruplarının glukoz değerleri, kontrol grubunun glukoz değerinden anlamlı olarak yüksek bulunmuştur.(p<0,05) Gruplar arasında günlük su tüketim miktarları karşılaştırıldığında; tüm diyabetik hayvan gruplarında günlük su tüketim miktarlarının, kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı gözlenmiştir. (p<0,05) Resveratrol alımının günlük su tüketim miktarını değiştirmediği gözlenmiştir. 63

Tablo 2. Deney gruplarının ortalama ağırlık (g), kan glukoz düzeyleri (mg/dl) ve günlük su tüketim miktarları (ml). GRUPLAR AĞIRLIK (g) KAN ŞEKERİ (mg/dl) GÜNLÜK TÜKETİLEN SU MİKTARI (ml) GRUP 1 (kontrol) GRUP 2 (diyabetik) 2185 ± 20 100 ± 15 150 ± 15 2110 ± 15 425 ± 30* 590 ± 15* GRUP 3 (Önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik) 2150 ± 24 410 ± 30* 600 ± 20* GRUP 4 (Önceden resveratrol alan diyabetik) 2180 ± 25 370 ± 22* 625 ± 23* GRUP 5 (Aynı anda resveratrol alan diyabetik) 2315 ± 15 430 ± 40 * 620 ± 10* Kontrol, diyabetik ve önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res 5- Diyabetik), önceden resveratrol alan diyabetik (Res50-Diyabetik), diyabet ile aynı anda resveratrol içmeye başlayan diyabetik (Diyabetik-Res 50) tavşanların ortalama ağırlık (g), kan glukoz düzeyleri (mg/dl) ve günlük su tüketim miktarları (ml). Değerler ortalama ± standart hata ortalaması olarak ifade edilmiştir. n=5-8 * p<0,05 kontrole göre istatistik olarak anlamlı farklılığı göstermektedir. 64

4.2. enos ve GAPDH mrna Ekspresyonu PCR Sonuçları ve Dansitometrik Analizleri Şekil 6. GAPDH kontrol ve diyabet gruplarına ait PCR görüntüsü. Şekilde 1,2,3,4,5 olarak numaralanmış GAPDH bantları kontrol; 6,7,8,9,10 olarak numaralanmış GAPDH bantları ise diyabetik tavşanları, 11. numara ise kontaminasyon olup olmadığını gösteren negatif kontrolü temsil etmektir. 65

Şekil 7. enos kontrol ve diyabet gruplarına ait PCR görüntüsü. Şekilde 1,2,3,4,5 olarak numaralanmış enos bantları kontrol; 6,7,8,9,10 olarak numaralanmış enos bantları ise diyabetik tavşanları, 11. numara ise kontaminasyon olup olmadığını gösteren negatif kontrolü temsil etmektir. 66

Şekil 8. GAPDH Resveratrol, Diyabetik-Res50, Res5-Diyabetik, Res50- Diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü. Şekilde 1,2,3 olarak numaralanmış GAPDH bantları 50 mg/l resveratrol alan (Resveratrol); 4,5,6,7,8 olarak numaralanmış GAPDH bantları aynı anda resveratrol alan diyabetik (Diyabetik-Res50); 9,10,11,12,13 olarak numaralanmış GAPDH bantları ise önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res5-Diyabetik); 14,15,16,17 olarak numaralanmış GAPDH bantları da önceden resveratrol alan diyabetik (Res50- Diyabetik) tavşanları temsil etmektedir. 67

Şekil 9. enos Resveratrol, Diyabetik-Res50, Res5-Diyabetik, Res50- Diyabetik gruplarına ait PCR görüntüsü. Şekilde 1,2,3 olarak numaralanmış enos bantları 50 mg/l resveratrol alan (Resveratrol); 4,5,6,7,8 olarak numaralanmış enos bantları aynı anda resveratrol alan diyabetik (Diyabetik-Res50); 9,10,11,12,13 olarak numaralanmış enos bantları ise önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res5-Diyabetik); 14,15,16,17 olarak numaralanmış enos bantları da önceden resveratrol alan diyabetik (Res50- Diyabetik) tavşanları temsil etmektedir. 68

Tablo 3: RT-PCR deneylerinin dansitometrik analizi GRUPLAR enos/gapdh oranı Kontrol 0,217 ±0,052 Diyabet 0,252 ± 0,035 Res5-Diyabetik 0,240 ± 0,047 Res50-Diyabetik 0,203 ± 0,019 Diyabetik-Res50 0,207 ± 0,042 Kontrol, diyabetik ve önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res 5- Diyabetik), önceden resveratrol alan diyabetik (Res50-Diyabetik), diyabetle aynı anda resveratrol içmeye başlayan diyabetik (Diyabetik-Res 50) tavşanların enos/gapdh mrna düzeyleri. Sonuçlar ortalama ± standart hata ortalaması olarak ifade edilmiştir. n=5. enos/gapdh mrna düzeylerinin belirlenmesi amacıyla uygulanan RT-PCR sonucu elde edilen grafik Şekil 10 da gösterilmiştir. Bantların dansitometrik analizi Quantitiy 8.6.6. Software programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RT-PCR deneyleri sonucunda, enos/ GAPDH mrna düzeyleri açısından deney grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. 69

Şekil 10. Deney grupların enos/ GAPDH mrna düzeyleri. Kontrol, diyabetik ve önceden düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res 5- diyabetik), önceden resveratrol alan diyabetik (Res50-Diyabetik), diyabet ile aynı anda resveratrol içmeye başlayan diyabetik (Diyabetik-Res 50) tavşanların enos/gapdh mrna düzeyleri. Sonuçlar ortalama ± standart hata ortalaması olarak ifade edilmiştir. n=5. 70

Şekil 11. Deney gruplarını temsil eden bir örneğe ait enos ve GAPDH mrna düzeyleri. Şekilde M ile gösterilen markerı ifade ederken, 1 ile gösterilen kontrol, 2 ile diyabetik, 3 ile düşük doz resveratrol alan diyabetik (Res 5-diyabetik), 4 ile önceden resveratrol alan diyabetik (Res50-diyabetik), 5 ile gösterilen ise diyabet ile aynı anda resveratrol alan başlayan diyabetik (diyabetik-res 50) grubu temsil eden bir örneğe ait enos ve GAPDH mrna düzeyini ifade etmektedir. 71