HBV ve HCV Moleküler Tanı. Dr. Cafer Eroğlu Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi

HBV ve HCV Moleküler Tanı Dr. Cafer Eroğlu Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi

HBV ve HCV de Moleküler Tanı Kültür Ǿ, Hayvan modelleri, mutasyon oranı HBV DNA veya HCV RNA sının gösterilmesi için Moleküler teknikler gerekli Hibridizasyon temelli teknikler Az kullanılıyor Amplifikasyon teknikleri (PCR, TMA, real-time PCR) Sık kullanılıyor

HBV

HBV de Moleküler Testlerin Kullanım Amacı Virüs kan düzeyi (Viral yük tayini) Direnç mutasyonlarının saptanması Genotip belirlenmesi Core promoter, precore veya s antijen mutantlarının belirlenmesi

Viral Yükün Kullanıldığı Alanlar Viral yük = replikasyon aktivitesi Hastalığın doğal seyrinin izlenmesi Prognozun belirlenmesi Hastalar tedaviye cevap ihtimali yüksek ve düşük olanlar Tedavi seçeneğinin belirlenmesinde Yanıtın belirlenmesi ve izlenmesi Antivirallere direncin öngörülmesinde Okült HBV tanısı

Ülkemizdeki Ticari HBV DNA Sistemleri Cobas Taqman Ampliprep (Roche) Abbot m2000 (Abbot) Artus HBV (Qiagen) Fluorion (İontek) AdvanSure (LG Life Science) Ölçüm m Aralığı IU/ml 20-1.1x10 8 15-10 9 20-10 9 40-10 9 50-10 9 Real-time PCR standart hale geldi İzolasyon sistemine göre alt sınır ve ölçüm aralığı değişebilmektedir HBV DNA tesbit alt sınırı kantitasyon aralığının altındadır Kantitasyon alt sınırı en az 60 IU/ml, mümkünse 10-15 IU/ml olmalıdır Kantitatif olmalı ve İnternal kontrol içermelidir Sonuç IU/ml olmalı ve kopya/ml ye çevrilebilmelidir

HBV DNA Düzeyi İzlenmesi Tüm hastalarda HBV DNA başlangıç, tedavinin 3. ve 6. ayında mutlaka bakılmalı Daha Sonra 3-6 ayda bir

HBV Genotiplerinin Önemi Ülkemizde akut, kronik ve inaktif hepatit B lilerde saptanan tek tip genotip D dir Genotip D Genotip A ya göre ciddi karaciğer hastalığı daha sık İnterferon tedavisine yanıt düşük Pre-core ve cor promotor mutasyonları sık KHB hastalarımızın çoğu HBeAg negatif

HBV Genotiplerin Belirlenmesi - 1 Sekans analizi altın standart Restriction fragment lengt polymorphism (RFLP) Reverse hybridization (line probe assay) Genotype specific PCR Simple PCR

Core ve precore mutantları HBeAg negatif=anti HBe pozitif/negatif=mutant HBV Prekor veya kor bölgesindeki mutasyonlar (G1896A, A1762T veya G1764A) e antijeni yapımını kısmen veya tamamen durdururlar Virüs daha heterojendir Özellikle Akdeniz bölgesi ve ülkemizde sık görülür Spontan remisyon düşük

Core ve precore mutantların Belirlenmesi Sekans analizi Restriction fragment lengt polymorphism (RFLP) Reverse hybridization (line probe assay)

Genotipik direnç, virolojik rebound ve biyokimyasal rebound Genotipik direncin tespiti Biyokimyasal kırılma 6 Virolojik kırılma HBV DNA (log 10 IU/mL) 5 4 3 2 En alt nokta 1 log 10 ALT (IU/L) 1 x NÜS Antiviral ilaç Zaman Ahmed S, et al. Hepatology 2000; 32:1078-1088 Lok AS & McMahon BJ. Hepatology 2007;45:507 539

Tedavi Yetersizliği ve Direnç HBV DNA düzeyinde 10 kat veya daha fazla artış olması antiviral direnci, akla getirmelidir Nükleozid (lamivudin) alanlarda dirence 6 ayda bir Entekavir ve tenofovir alan naiv hastalarda dirence yılda bir bakılabilir ALT yüksekliği ve Karaciğer yetmezliğinin semptom ve bulguları izlenmeli Sekanslama veya Line Probe Assay (LİPA) testi düşünülmeli Direnç düşünülmesine rağmen gösterilemiyorsa bilinen veya bilinmeyen mutantlar için fenotipik testler araştırılmalı

Direncin Ortaya Konması Sekans analizi Hassasiyeti düşük, dirençli suş oranı >%30 olmalı Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Reverse hybridization (line probe assay) dirençli suş oranı >%5 olmalı Deep Sekanslama Yeni sekans sistemleri ile dirençli suş oranı % 1 dahi olsa gösterilebilmekte Fenotipik testler

Mutasyon rtm204v Protein adı İlk (duyarlı) amino asit Pozisyon =Kodon Yeni (dirençli) amino asit Stuyver L, et al. Hepatology 2001;33:751757

173, 180 ve 204(YMDD) Kodonlarındaki Mutasyonların Gösterilmesi V173L Valin lösin L180M Lösin Metyonin M204V Metyonin Valin M204I Metyonin İzolösin

Line Probe Assay (LİPA) Testi v2.0

Line Probe Assay (LİPA) Testi v3.0 54 prob içermektedir 11 pozisyon: 80,173,180,181,184,194,202,204,233,2 35,250 Yeni eklenenler Entekavir 184,202,250 Tenofovir 194 Adefovir 233

HCV

HCV de Moleküler Testler HCV pozitif sarmallı RNA Virüsün yarı ömrü ortalama 7 saat Günlük virüs üretimi 3.7x10 11 kopya/ml HCV RNA pozitifliği = Aktif HCV viremisi HCV RNA negatifliği viremiyi ekarte ettirmez HCV-RNA düzeyleri bazı hastalarda dalgalı

HCV de Yanıtı Etkileyen Viral Faktörler Viremi düzeyi Genotip

Tedavi Öncesi HCV-RNA Düzeyi HCV-RNA düzeyinin tedavide prognostik değeri vardır. HCV-RNA düşük ise ilk tedaviye yanıt daha iyi Viral yük <600.000-800 000 IU/ml Poynard T. ve ark. Gatroenterology 2009;136:1618-28

Hızlı Virolojik Yanıt (HVY) Hızlı virolojik yanıt 4. haftada HCV RNA nın negatifleşmesi (< 50 IU/ml) HVY kalıcı virolojik yanıtın en iyi göstergesi HVY gösterenlerde 24 ve 48 haftalık tedavi ile benzer etki Başlangıç RNA sı yüksek olanlarda HVY olasılığı daha az Lee SS et al. J Hepatol 2002 Yee HS et al. AJG 2006

Erken Virolojik Yanıt (EVR) Erken virolojik yanıt 12. haftada HCV RNA kaybı (< 50 IU/ml) veya viral yükte 2 log (100 kat) azalma Negatif prediktif değeri % 98 HCV-RNA nın hızlı düşmesi Çoğunlukla yanıt veren hastalar da görülür İyi prognoz işaretidir Genotip 1 de EVR yok ise tedavi kesilir

Tedavi Sonrası Viral Yük HCV-RNA'nın kantitatif olarak saptanması, Tedavi sonunda relapsın belirlenmesi Relapsta HCV-RNA çoğunlukla tedavi öncesi değerlerde Bazen düşük HCV-RNA ya rağmen biyokimyasal relaps Serum HCV RNA bulunmaması < 50 IU/ml Kullanılan testin duyarlılığı en az 50 IU/ml olmalıdır

Ülkemizdeki Ticari HCV RNA Testleri Cobas Taqman 48 (Roche) Abbot m2000 (Abbot) Qiagene (Qiagene) Fluorion real-time sistemi (iontek) AdvanSure (LG Life Science) Real-time PCR standart Ölçüm Aralığı İÜ/ ml 25-1.1x10 8 30-10 8 34-10 8 30-10 9 25-10 9 İzolasyon sistemine göre ölçüm aralığı alt sınırı değişebilir Ölçüm aralığı alt sınırı en az 50 IU/ml olmalı Kantitatif olmalı ve İnternal kontrol içermeli Sonuç IU/ml olarak verilmeli

Genotiplerin Önemi Genom kodlama özelliği bakımından % 85 den fazla benzerlik gösteren viral diziler genotipleri oluşturur. Genotip sayısı 6 (subtip sayısı 70 in üzerinde) Ülkemizde en sık genotip 1b dir Genotip 1b de Viral yük fazla infeksiyon ağır gidişli IFN a yanıt daha az Kronikleşme fazla Siroz ve HCC oluşumu fazla Genotip 2 ve 3: daha benign seyirli Tedavi öncesi genotipin tayin edilmesi; tedavi süresi, ribavirin dozu ve SGK için gereklidir

HCV Genotiplendirme Metotları Sekans analizi 5 NC bölgesi ve NS5B bölgesi Trugene 5 NC HCV Genotyping Kit, Bayer HealthCare INNO LiPA HCV v2 (Innogenetics) Real-time PCR (Abbot)

Ülkemizde Genotiplerin Dağılımı Araştırıcı Yıl Sayı Genotip % 1a 1b 2a 3a 4 K* T** D*** Abacıoğlu 1995 89 19 75 3 2 Bozdayı 1996 60 12 80 5 1.5 1.5 Sönmez 1996 59 70 5 25 Tuncer 1996 58 21 72 5 2 Türkoğlu 1996 79 8.8 46.8 5 14 25 Uzunalimoğlu 1996 37 5.4 83.7 10.8 Ülgen 1996 6 100 Arslan 1998 59 45 16.9 17.7 57.6 66.6-4.4 5.1 6.6 20.3 4.4 Akkız 1999 118 8.8 88 1 1 Yalçın 1999 28 100 Eyigün 2000 30 10 90 Şahin 2000 58 3 93 3 Bozdayı 2002 36 22 78 Erensoy 2002 50 30 60 10 *K: karışık genotipler, **T: tiplendirilemeyen, ***D: diğer genotipler

Rutin HCV Genotiplendirme Sonuçlarımız Son 18 ay NS5b bölgesi, Sekanslama metodu kullanıldı Toplam 233 örnek 225 (% 96,7) genotip 1 Çoğu genotip 1b 4 (% 1,7 ),, 3 IV ilaç hikayesi 3 (% 1,2 ),, 4 1 (% 0,4 ),, 2 Kr.Böbrek hastası

Sonuç Gereken hassasiyette testler kullanılmalı HBV 60 IU/ml =300 kopya/ml, mümkünse 10-15 IU/ml HCV 50 IU/ml Kantitasyon aralığı geniş (10-10 9 ) Direnç düşünülen durumlarda İNNO-LİPA ve sekans analizi HCV de genotip saptanması için Sekans analizi, real-time PCR ve İNNO-LİPA

Teşekkürler

Direnç tesbiti ve Miks genotiplerin belirlenmesi -1 Margeridon-Thermet S ve ark. Ultra-deep pyrosequencing of hepatitis B virus quasispecies from nucleoside and nucleotide reverse-transcriptase inhibitor (NRTI)-treated patients and NRTI-naive patients. J Infect Dis 2009;199:1275-85 11 oral nükleozid anoloğu alan ve 17 naiv hastada mutasyon aramışlar Standart direkt sekans analizi ve ultra-deep pyrosequencing (UDPS) kullanmışlar Tedavi alan 5 hastanın 10 örneğinde fazladan mutasyon saptamışlar Lamivudin direnci V173L (5 örnek) Entecavir direnci T184S (2 örnek), S202G (1 örnek) Adefovir direnci N236T (1 örnek) Lamivudin ve adefovir direnci V173L, L180M, A181T ve M204V (1 örnek) Ayrıca direk sekans analizinde genotip G olarak belirlenen 3 hastada genotip A koenfeksiyonu saptamışlar

Direnç tesbiti ve Miks genotiplerin belirlenmesi - 2 Solmone M ve ark. Use of massively parallel ultradeep pyrosequencing to characterize the genetic diversity of hepatitis s B virus in drug-resistant resistant and drug-naive patients and to detect minor variants in reverse transcriptase and hepatitis B S antigen. J Virol. 2009;83(4):1718 83(4):1718-26. 8 oral nükleozid n anoloğu u alan ve 5 naiv hastada mutasyon aramış ışlar Pyrosequencing metodunu LİPA L ve direkt sekans analizinden daha hassas bulmuşlar lar Aynı çalışma sonucunda genotip D nin D genotip A dan A daha hetorojen olduğunuda unuda saptamış ışlar

Direnç tesbiti ve Miks genotiplerin belirlenmesi - 3 Ijaz S ve ark. Dynamics of lamivudine-resistant hepatitis B virus during adefovir monotherapy versus lamivudine plus adefovir combination therapy. J Med Virol. 2008 Jul;80(7):1160-70. Lamivudin dirençli 8 hastada mutasyon aramış ışlar Pyrosequencing metodunu ile viral popülasyondaki % 2 lik 2 mutasyon varlığı ığını gösterebilmişlerler