ÜLKEMİZDE GELENEKSEL YÖNTEMLER İLE ÜRETİLEN PEYNİR ÇEŞİTLERİNDE LACTOBACİLLUS CİNSİ BAKTERİLERİN STARTER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI.

ÜLKEMİZDE GELENEKSEL YÖNTEMLER İLE ÜRETİLEN PEYNİR ÇEŞİTLERİNDE LACTOBACİLLUS CİNSİ BAKTERİLERİN STARTER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Samira EBRAHİMİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ESNTİTÜSÜ AĞUSTOS 2013 ANKARA

Samira EBRAHİMİ tarafından hazırlanan ÜLKEMİZDE GELENEKSEL YÖNTEMLER İLE ÜRETİLEN PEYNİR ÇEŞİTLERİNDE LACTOBACILLUS CİNSİ BAKTERİLERİN STARTER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Yavuz BEYATLI Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı... Yrd. Doç. Dr. Derya ÖNAL DARILMAZ 2. Tez Danışmanları, Biyoloji Anabilim Dalı Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Aysel UĞUR Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, G.Ü Prof. Dr. Yavuz BEYATLI Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Doç. Dr. Hikmet KATIRCIOĞLU Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı. G.Ü. Yrd. Doç. Dr. Derya ÖNAL DARILMAZ Biyoloji Anabilim Dalı, Aksaray Üniv......... Tez Savunma Tarihi: 26/08/2013 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü..

TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Samira EBRAHİMİ

iv ÜLKEMİZDE GELENEKSEL YÖNTEMLER İLE ÜRETİLEN PEYNİR ÇEŞİTLERİNDE LACTOBACİLLUS CİNSİ BAKTERİLERİN STARTER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI (Yüksek Lisans Tezi) Samira EBRAHİMİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ağustos 2013 ÖZET Laktik asit bakterileri (LAB) gıda süt ürünlerinin üretiminde kullanılan bakterilerdir. LAB ler Lactobacillus, Lactococcus, tetracoccus, Leuconostoc ve Bifidiobacteria gibi çok sayıda bakteri cinsini kapsamaktadır. LAB nin en önemli cinslerinden birisi Lactobacillus dur. Bu cins içindeki mikroorganizmalar gastrointestinal sistemden başka fermente gıdalarda da bulunabilmektedirler. Laktobasiller, starter ve/veya destek kültür ya da starter olmayan mikroflora olarak peynir olgunlaşması ve lezzetinin oluşumu ile de ilişkilidirler. Bu çalışmada, daha önce izole edilen ve 16sRNA ile tanımlanan 18 adet Lactobacillus bakterilerin starter özellikleri; lipolitik ve proteolitik aktivite düzeyleri ve bazı patojen test bakterilerden olan ( Esericihae coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus RSKK 863, Salmonella enteritidis ATCC 13076) bakteriler üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri, incelenmiştir. Ayrıca, bakterilerin Hidrojen Sülfür üretim yeteneği de belirlenmiştir. Araştırmada kullanılan 18 adet Lactobacillus türlerinin 6 adedi Lb. rhamnosus, 5 er adedi Lb. fermentum ve Lb. Brevis ile birer adedi Lb. helveticus ve Lb. casei.

v Lactobacillus suşlarının proteolitik aktiviteleri MRS ve %10 luk Skim Milk besiyerinde disk difüzyon yöntermi ile belirlenmiştir. Bu bakterilerin MRS besiortamında proteolitik aktiviteleri 1.26 2.09 cm zon çapları arasında tesbit edilirken, Skim milk de 1.09 1.33 cm zon çapları ile belirlenmiştir. Lactobacillus suşlarının lipolitik aktiviteleri YSB Agar besiortamında disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir. Lactobacillus suşlarının yalnız 8 adedinde lipolitik aktivite gözlenmiştir. Bu suşların lipolitik aktiviteleri 0.97 1.27 mm zon çapları arasında bulunmuştur. Lactobacillus suşlarının hiçbirinin TSI besiortamında H 2 S üretmemiştir. Lactobacillus suşlarının antimikrobiyal aktiviteleleri agar diffüzüyon yöntemi ile ( Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis RSKK 863, Salmonella enteritidis ATCC 13076) patojen bakteriler üzerinde araştırılmıştır Lb. brevis KIR3 suşun dışıdaki tüm Lactobacillus türlerinin test edilen patojen bakteriler üzerinde genel inhibisyon gösterdiği tesbit edilmiştir. Lb. fermentum BP5 suşun E. coli ATCC 3528 üzerinde laktik asit dışındaki inhibitör maddelerin etkisi gözlenmiştir. Diğer lactobacillus suşlarının denenen tüm test bakteriler üzerinde laktik asit dışındaki diğer inhibitör maddelerin etkisi bulunmamiştir. Bilim Kodu : 203.1.023 Anahtar Kelimeler : Lactobacillus sp.,, Peynir, Starter Özellik Sayfa Adedi : 55 Tez Yöneticileri : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI, Yrd. Doç. Dr. Derya ÖNAL DARILMAZ

vi A RESEARCH OF STARTER PROPERTIES OF LACTOBACILLUS BACTERIA ISOLATED FROM TRADITIONAL TURKISH CHEESE SAMPLES (M. Sc. Thesis) Samira EBRAHİMİ GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES August 2013 ABSTRACT Lactic acid bacteria (LAB) are bacteria used in the production of food dairy products. LAB include large number of bacteria types such as Lactobacillus, Lactococcus, Tetracoccus, Leuconostoc, and Bifidiobacteria.. One of the most important types of LAB is Lactobacillus. The microorganisms in this type can be found in fermented foods other than the gastrointestinal system. Lactobacillis are associated with the formation of cheese ripening and flavor as starter and / or support culture or non-starter microflora. In this study, the starter features of 18 units of Lactobacillus bacteria which are previously isolated and identified by 16sRNA; its hydrogen peroxide, lipolytic, proteolytic activity levels and its antimicrobial activity on some pathogenic test bacteria (Esericiha e coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus RSKK 863, Salmonella enteritidis ATCC 13076) are examined. Furthermore, its ability to produce hydrogen sulfide was detected. 6 of the 18 Lactobacillus species used in the study are Lb. Rhamnosus, 5 strains Lb. Fermentum, 5 strains Lb. Brevis and strains Lb. helveticus and Lb. casei. The proteolytic activities of Lactobacillus strains were determined in MRS and in 10% Skim Milk medium with disk diffusion method. The Proteolytic activity

vii zone diameters of these bacteria in MRS medium was 1.26 2.09 cm, and in Skim Milk medium were 1.09 to 1.33. Lipolytic activities of Lactobacillus strains were determined in YSB agar medium bydisc diffusion method. Only in 8 of the Lactobacillus strains the lipolytic activity was observed. None of the Lactobacillus strains have produced H 2 S in TSI medium. The antimicrobial activities of Lactobacillus strains were searched on pathogenic bacterias by agar diffusion method (Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis RSKK 863, Salmonella enteritidis ATCC 13076). It was determined that all Lactobacillus species other than Lb. brevis KIR3 has a general inhibition on tested pathogenic bacteria. The effect of inhibitory substances except of lactic acid were only observed in Lb. fermentum BP5 on E. coli ATCC 3528. Science Code : 203.1.023 Key Words : Lactobacillus, Cheese, Starter Characteristic Page Numbers : 55 Supervisor : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI, Yrd. Doç. Dr. Derya ÖNAL DARILMAZ

viii TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım boyunca değerli ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, tecrübe ve eşsiz bilgilerinden yararlandığım sayın hocalarım Prof. Dr. Yavuz BEYATLI ve Yrd. Doç. Dr. Derya ÖNAL DARILMAZ 'a sonsuz teşekkür ederim. Kıymetli bilgilerinden faydalandığım sayın hocalarım Prof. Dr. Aysel UĞUR ve Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ a, tez çalışmalarım boyunca desteğini, bilgi ve yardımlarını esirgemeyen, tüm Biyoteknoloji Laboratuvarı çalışanlarına, manevi ve maddi destekleriyle hayatım boyunca yanımda olan aileme teşekkür ederim.

ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR...viii İÇİNDEKİLER... ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ.....xii RESİMLERİN LİSTESİ...xiii SİMGELER VE KISALTMALAR... xiv 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI... 3 2.1. Peynir Teknolojisinde Laktobasiller... 2 2.2. Laktik Asit Bakterilerin Peynirlerdeki Önemi ve Peynirlerin Yapısı... 3 2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri ve Etki Mekanizmaları... 4 2.4. Lactobacillus Bakterilerinin Genel Özellikleri... 6 2.5. Peynir Üretiminde Kullanılan Starter Kültür... 8 2.6. Laktik Asit Bakterilerin Probiyotik Özellikleri... 9 2.6.1. Probiyotik olarak laktobasiller... 10 2.6.2. Probiyotik mikroorganizmalarda bulunması gereken özellikler... 11 2.6.3. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar... 12 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Aktiviteleri... 13 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktiviteleri... 14

x Sayfa 2.9. Hidrojen Sülfür Üretimlerinin Belirlenmesi... 15 2.10. Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyal Aktiviteleri... 16 3. MATERYAL VE METOT... 17 3.1. Materyal... 17 3.1.1. Bakteri... 17 3.1.2. Besiyerleri... 18 3.1.3. Bakterilerin muhafazası... 20 3.1.4. Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları... 20 3.1.5. Araştırmada kullanılan test bakterileri... 20 3.2. Metot... 21 3.2.1. Bakterilerin muhafazası... 21 3.2.2. Hidrojen sülfür üretiminin tespiti... 22 3.2.3. Proteolitik aktivite nin tespiti... 22 3.2.4. Bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesi... 22 3.2.5. Laktik asit bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri... 23 4. DENEYSEL BULGULAR... 25 4.1. Proteolitik Aktivite Düzeylerinin Belirlenmesi... 25 4.2. Bakterilerin Lipolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi... 30 4.3. Hidrojen Sülfür Üretiminin Tespiti... 34 4.4. Lactobacillus Suşlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri... 35 5. TARTIŞMA VE SONUÇ... 40 KAYNAKLAR... 45 ÖZGEÇMİŞ... 55

xi ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Beyaz peynir üretiminde kullanılan starter bakteriler... 9 Çizelge 2.2. Laktobasillerin kullanıldığı bazı probiyotik peynir geliştirme çalışmaları... 11 Çizelge 2.3. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar... 13 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan laktik asit bakterisi kültürleri... 17 Çizelge 3.2. MRS besiyeri (Man Rogosa and Sharpe)(Merck)... 18 Çizelge 3.3. TSI besiyeri (Triple Sugar Iron Agar )... 18 Çizelge 3.4. Skim Milk Agar besiyeri... 19 Çizelge 3.5. Nutrient sıvı besiyeri (Merck)... 19 Çizelge 3.6. Test bakterileri, temin edildiği kaynaklar ve inkübasyon sıcaklığı... 21 Çizelge 4.1. Lactobacillus suşlarının MRS besiyerinde proteolitik aktivite sonuçları (zon çapı cm)... 26 Çizelge 4.2. Skim Milkde lactobacillus suşlarının proteolitik aktivite sonuçları (zon çapı cm)... 28 Çizelge 4.3. Lactobacillus suşlarının Lipolitik aktivite sonuçları(zon çapı mm)... 31 Çizelge 4.4. Lactobacillus suşlarının hidrojen sülfür üretimleri... 34 Çizelge 4.5. Lactobacillus suşlarının test bakteriler üzerinde inhibisiyon etkileri... 36 Çizelge 4.6. Patojenlerin Mac Farland 0.5 de koloni sayım sonuçları (Log kob/ml)... 39

xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Laktik asit bakterilerin ayrımı... 5 Şekil 4.1 Lactobacillus suşlarının MRS besiyerinde proteolitik aktivite düzeyleri... 27 Şekil 4.2. Skim milkde lactobasillus suşlarının proteolitik aktivite düzeyleri... 29 Şekil 4.3. Lactobacillus suşlarının Lipolitik aktivite yeteneği... 32 Şekil 4.4. Lactobacillus suşlarının test bakteriler üzerinde inhibisiyon etkileri... 37 Şekil 4.5. Patojenlerin Mac Farland 0.5 de koloni sayım grafiği... 39

xiii RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 2.1. Lactobacillus brevis... 6 Resim 2.2. Lactobacillus rhamnosus... 7 Resim 2.3. Lactobacillus helveticus... 7 Resim 2.4. Lactobacillus fermentum... 7 Resim 4.1. Lactobacillus fermentum IP5 suşunun Skim Milk besiyerinde proteolitik aktivite yeteneği... 30 Resim4.2. Lactobacillus rhamnosus MP1 suşunun Skim Milk besiyerinde proteolitik aktivite yeteneği... 30 Resim4.3. Lactobacillus rhamnosus BTM4 suşunun Lipolitik aktivite yeteneği... 33 Resim4.4. Lactobaciillus brevis YG9 suşunun Lipolitik aktivite yeteneği... 33

xiv SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılan bazı simgeler ve kısaltmalar, aşağıda açıklamaları ile birlikte sunulmuştur. Simgeler Açıklama 0 C Santigrat derece Cm et al. g l ml mg mm nm Santimetre Ve arkadaşları Gram Litre Mililitre Miligram Milimetre Nanometre µg Mikrogram µl Mikrolitre ph sp subsp vd vs Asitlik Bazlık Birimi Species Subspecies (Alt Tür) Ve diğerleri Ve saire % Yüzde

xv Kısaltmalar Açıklama Bkz. dak. dev. Eş. L.b LAB M.Ö. MRS OD PAS PBS Rpm Bakınız Dakika Devir Eşitlik Lactobacillus Laktik Asit Bakterileri Milattan Önce Man Rogosa Sharp besiyeri Optikal Dansite Peynir Altı Suyu Fosfat Tampon Çözeltisi Dakikada Devir Sayısı

1 1. GİRİŞ Dünyada probiyotik fermente gıdaların üretimi gün gittikçe önemini artırmakta ve bu konuda yoğun araştırmalar sürdürülmektedir. Bu gıdaların besin ve sağlık değerlerinin yüksek nitelikte olduğu çalışmalarla kanıtlanmıştır. Ülkemizde 11 milyon ton süt tüm peynir çeşitlerin üretiminde kullanılmaktadır. Geleneksel olmayan peyirlerin üretimi %10-15 oranında olup, üretimde starter laktik asit bakterileri (LAB) ler kullanılmamaktadır. Bu tip peynirlerin üretiminde standart üretim modeli uygulanmamakta ve peynir üretimi çiğ sütten gerçekleştirilmektedir. Bu tip peynirler kendisine özgün tad ve aroma göstermektedir ve yaklaşık olarak ülkemizde 160 çeşidi vardır. Ülkemizde probiyotik fermente süt ürünlerin üretimi üzerinde yapılan çalışmalar sınırlıdır. Birçok ülkede yeni geliştirilen probiyotik fermente süt ürünlerin özellikle peynirlerin üretiminde doğal kaynaklardan elde edilen üstün nitelikte starter ve probiyotik özelliği gösteren bazı Lactobacillus bakteri türlerinden yararlanılmaktadır. Ülkemizde probiyotik peynirlerin üretimi, geliştirilme çalışmaları üzerindeki çalışmalar arzu edilen düzeyde değildir. Ülkemizde geleneksel olmayan peynir çiştlerinin üretiminde yurt dışından temin edilen starter bakteriler ile yapılmaktadır. Geleneksel peynirlerin üretiminde starter bakterileri kullanılmamakta, sütte doğal kontaminant laktik asit bakterileri ile bu ürünlerin üretimi sağlanmaktadır. Bu tip peynirlerde birçok farklı laktik asit bakterileri ile özellikle Lactobacillus bakterileri de görev almaktadır. Ülkemizde üretilen geleneksel ve geleneksel olmayan peynirlerde Lactobacillus cinsi bakteri türlerinin tür düzeyindeki dağılımları bilinmemektedir. Ayrıca, ülkemize özgül olabilen bu bakterilerin starter ve probiyotik özellikleride aydınlatılmamıştır. Bu amaçla yapılacak olan bu çalışmada ülkemizde üretilen geleneksel ve gelenksel olmayan birçok peynir örneklerinden daha önceden izole edilen ve tanımlanan bazı Lactobacillus cinsi bakterilerin starter özelliklerinin araştırılması hedeflenmiştir. Lactobacillus bakterilerin starter özellkileri bu bakterilerin (proteolitik, liplitik, antimkrobiyal, bakteriosin, hidrojen peroksit) yetenekleri gibi faktörlerle incelenmektedir [1-5].

2 Araştırmada kullanılan Lactobacillus cinsi bakterilerin probiyotik özellikleri bir diğer çalışmada belirlenmiştir [6]. Bu çalışma ile Lactobacillus cinsi bakterilerin starter özellkileri belirlenip, daha önceden belirlenen bakterilerin probiyotik özellikleri ülkemizde üsütün nitelikte peynirlerin üretimi hedeflenecektir. Bu şekilde diğer ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de probiyotik sağlıklı peynirlerin üretiminin yaygınlaşmasınıa ve dünya ticaretinde de yer almasına katkı sağlayacaktır.

3 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Peynir Teknolojisinde Laktobasiller Peynir üretiminde starter kültür olarak kullanılan ya da bir çok peynir çeşidinin starter olmayan mikroflorasında dominant mikroorganizmalar olarak bulunabilen homofermentatif ve heterofermentatif laktik asit bakterileri bir çok peynir çeşidinin olgunlaşmasında önemli rol oynamaktadır [7-11]. Aralarında Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, L. acidophilus, L. plantarum, L. delbrueckii subsp. lactis inde bulunduğu bir çok laktobasil peynir üretiminde kültür ya da destek kültür olarak kullanılabilmektedir [7,9,10,12-15]. Aynı zamanda laktobasiller özellikle çeşitli peynir tiplerinde starter olmayan mikrofloranın önemli bir kısmını oluşturmaktadırlar [8,15-18]. Peynir lezzeti üzerine etkili bileşiklerin önemli bir bölümü starter bakterilerin etkileriyle oluşmaktadırlar. Starter bakterilerin erken lizisi, hücre içi enzimlerin substratlara daha kolay ulaşmasını sağlamakta ve bu durum peynir lezzetinin gelişimini hızlandırabilmektedir [19,20]. Bu güne kadar starter bakterilerin lizis ini arttırmak için kullanılan yaklaşımlardan birisi otolitik stater bakterilerin seçimidir [21]. Laktobasillerin bazı otolitik suşları peynir teknolojisinde olgunlaşmayı hızlandırmak ve lezzet gelişimini arttırmak amacıyla kullanılabilmektedir [19]. İsviçre tipi peynir yapımında starter olarak kullanılan ve erken lizise uğrayan L. helveticus un lizisi daha çok litik bakteriyofajlarla ilgili bulunmuştur. 2.2. Laktik Asit Bakterilerin Peynirlerdeki Önemi ve Peynirlerin Yapısı Genel bir tanımla peynir, sütün ısıtılması, starter kültür ilave edilmesi, proteolitik enzimlerle muamele edilerek pıhtılaştırılması, pıhtının süzülerek peynir altı suyundan (PAS) ayrılması, telemenin tuzlanarak ve baskılanarak şekillendirilmesi ile elde edilen, taze veya olgunlaşmış halde tüketilen besleyici bir süt ürünüdür. Her peynir çeşidinin kendine özgü renk, koku, tat, yapı, gözenek, kabuk gibi özelliklerinin oluşmasında bazı unsurlar vardır. Bunlar kullanılan ham madde, uygulanan tekniklerdir.

4 Jamal S.Y. Haddadin, (2005) yaptıkları çalışmalarında 18 adet geleneksel beyaz peynirlerde bulunan heterofermentatif Lactobacillus türlerinin bulunma sıklıklarını ve starter olma özelliklerini araştırmışlardır. Bu peynirlerde bulunan bakterilerin Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei ve Lactococcus lactis bakterileri olduğunu belirtmişlerdir [22]. Peynirlerin olgunlaşması çeşitli enzimlerin ve mikroorganizmaların etkisiyle karmaşık biyokimyasal reaksiyonların gerçekleştiği bir süreçtir [23]. Salamura beyaz peynir koyun sütünden, koyun ve inek sütü karışımından yapılabildiği gibi sırf inek sütünden de üretilebilir. Son yıllarda inek sütü kullanımı daha yaygındır [24]. Araştırmalarda pastörize sütten elde edilen peynirlerin üretiminde starter olarak Lactobacillus paracasei + Lactobacillus plantarum karışık kültürlerin kullanımı araştırılmıştır. Elde edilen serbest amino asitler ile uçuçu aromatik bileşiklerin olumlu yönde arttığını gözlemlemişlerdir [25]. Kaşar peynirlerde rastlanılan Lactobacillus bakterilerin varlığı üzerinde de yapılan bir araştırmada 60 adet Lactobacillus cinsine dahil olan bakteriler kaşar peynirlerden izole edilmiştir Bu izolatların 40 adedi Lactobacillus curvatus subsp. curvatus olarak tanımlanırken, diğer 20 adedi Lb. casei, Lb. paracasei ve Lb. coryniformis olarak belirlenmiştir [26]. 2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri ve Etki Mekanizmaları Gram pozitif ve gram negatif mikroorganizmaların önemli bir kısmı antimikrobiyel bileşenler üretmelerine rağmen, gıdaların biyokontrolünde laktik asit bakterilerinin ayrı bir önemi vardır. Bu bakteriler fermentasyon teknolojisinin tipik bakterileri olup, gıdalarda uzun yıllardan beri güvenli bir şekilde kullanılmaktadırlar [27-29]. Laktik asit bakterileri, sağlık ve beslenmedeki faydaları ve fermentatif kabiliyetlerinden dolayı endüstriyel öneme sahip mikroorganizmalar olarak kabul edilirler [30]. Laktik

5 asit bakterileri son ürün olarak laktik asit üretimleriyle tanımlanan gram pozitif, prokaryotik bakterileridir. Laktik asit bakterileri glikozu laktik asite çevirmeleri ile karakterize edilirler. Laktik asit bakterilerini genel olarak Lactobacillus, Tetracoccus, Leuconostoc, Enterococcus ve Streptococcus kapamaktadır [31,32]. Laktik asit bakterileri organik asitler, hidrojen peroksit, diasetil, bakteriyosin ve benzeri bileşikler üretebilirler [33]. Laktik asit bakterilerinin oluşturduğu antimikrobiyel etmen ve özellikleri, ph'nın ve peptid olmayan inhibitörlerin oluşumu,antibakteriyel etkiye sahip H 2 O 2 ile asetik, ketoglutarik, melonik asit gibi organik asitleri içeren diğer bileşiklerin oluşumu ve bakteriyosinlerden kaynaklanmaktadır [34]. Laktik asit bakterilerinin çoğu karbohidrattan laktik asit ve asetik asit gibi organik asitleri üretebilmektedir. Gıda kaynaklı patojen olan veya olmayan kontaminantların büyük bir kısmı bu asitlere ve dolayısıyla ph düşüşüne karşı hassastır. Laktik asit bakterilerinin antagonistik aktivite mekanizmaları içerisinde son yıllarda üzerinde en fazla durulan bir diğeri de, bazı laktik asit bakterileri tarafından üretilen "bakteriyosin ve bakteriyosin benzeri" bileşiklerdir [35]. Laktik astit bakterilerin ayrımı Şekil 2.1. de gösterilmiştir. Şekil 2.1. Laktik asit bakterilerin ayrımı [36].

6 2.4. Lactobacillus Bakterilerinin Genel Özellikleri Lactobacillus cinsi bakteriler düz ya da hafif kıvrık çubuk şekilli bir morfolojiye sahiptir. Hücreleri tek tek ya da zincir şeklinde bulunur. Gram-pozitif, katalaz negatif, anaerobik, mikroaerofilik ya da fakültatif anaerobiktirler. Lactobacillus biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri açısından oldukça fazla çeşitlilik içeren üyelere sahip bir cinstir. Beslenme istekleri de oldukça kompleksdir. Lactobacillus cinsinin önemli bir üyesi olan Lactobacillus bulgaricus, Weiss ve ark nın önerisiyle Lactobacillus delbrueckii subspbulgaricus ismiyle anılmaya başlanmıştır [37,38]. L. bulgaricus (L. delbrueckii subsp. bulgaricus) homofermentatiftir. Bu türün tüm varyeteleri 45 ºC de iyi bir şekilde gelişirken, bazıları 48-52 ºC de gelişebilmektedir. Lactobacillus ların optimum gelişmeleri ph 5.2-5.5 arasındadır.bu bakterilerin proteolitik aktiviteleri farklıdır. Lactobacillus lar Laktozu fermente etme yeteneği yüksektir ve laktozun yanısıra glukoz, fruktoz, galaktozu da kullanabilir [38,39]. DNA daki %G+C düzeyi 49-51 arasında değişmektedir. Genom büyüklüğünün 2.0-2.3 Mbp arasında olduğu belirlenmiştir [40]. Diğer laktobasil türlerinde bir veya birkaç adet plazmite rastlanmasına karşılık, L. bulgaricus un hiç plazmit içermediği [40], ve ya bu bakteride antibiyotiklere karşı dirençlilik sağlayan plazmit varlığı bildirilmiştir [41].Bazı Lactobacillus türlerinin morfolojik görünümleri [Resim 2.1,2.2,2.3,2.4] de verilmiştir. Resim 2.1. Lactobacillus brevis [115]

7 Resim 2.2. Lactobacillus rhamnosus [116] Resim 2.3. Lactobacillus helveticus [117] Resim 2.4. Lactobacillus fermentum [118]

8 2.5. Peynir Üretiminde Kullanılan Starter Kültür Endüstriyel Beyaz peynir, pastörize süt kullanılarak üretilmektedir. Pastörize sütten üretilen peynirlerin üretiminde starter kültür seçimi en önemli aşamalardan biridir [42]. Peynir üretiminde starter kültür kullanımı; starter aktivitesi, starterın pıhtıda alıkonması, peynir verimi, peynir kuru maddesi ve peynirde asitlik gelişimi ve olgunlaşma sırasında meydana gelen biyokimyasal değişimler gibi birçok faktör üzerinde etki göstermektedir [43]. Peynir üretiminde kullanılan starter kültürün tipi ve aktivitesi ürünün güvenliği ve kalitesi açısından önem taşımaktadır. Ayrıca, koliform grubu bakterilerin kontrolü, telemede alıkonan laktoz miktarının düşürülmesi ve ortam ph sının arzulanan düzeye ulaşması açısından da üretimde kullanılan starter kültürlerin aktivitesi önemlidir [42]. Olgunlaştırılan sert peynir çeşitleri için genellikle proteolitik aktivitesi yüksek suşlar seçilirken, olgunlaştırılmadan taze olarak tüketilen peynirler için proteolitik suşlar tercih edilmemektedir. Beyaz peynir üretimi için az düzeyde proteolitik ve lipolitik aktivite istenmektedir [44]. Günümüzedeki yapılan çalışmalarda Beyaz peynir üretiminde, Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, Str. thermophilus, Lb. sake, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. helveticus bakterilerinden oluşan termofilik ve/veya mezofilik starter kültür kombinasyonları kullanılmıştır [Çizelge 2.1]. Bununla birklikte, Beyaz peynir üretiminde starter olarak, Lc. lactis ssp. Lactis ve Lc. lactis ssp. cremoris bakterilerinden oluşan kambinasyonların kullanımı tavsiye edilmektedir [45]. Ancak, söz konusu bakterilerin tuza dirençlerinin düşük olması, alternatiflerinin aranmasını zorunlu kılmaktadır [44]. Uysal (1996), Beyaz peynir üretiminde starter kültür (Lc. lactis ssp. lactis ve Lc. lactis ssp. cremoris) kullanarak ürettiği peynirlerde olgunlaşma periyodu (90 gün) boyunca titrasyon asitliği, tuz, suda çözünen azot miktarı ve olgunlaşma indeksi değerlerinin yükseldiğini, ph ve toplam azot düzeyinin düştüğünü, üretimde kullanılan starter kültür seviyesinin artmasıyla birlikte peynirde proteoliz düzeyinin de arttığını bildirmiştir.

9 Beyaz peynir üretiminde kullanılan starter bakteriler Çizelge 2.1. de gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Beyaz peynir üretiminde kullanılan starter bakteriler Starter kültür bileşiminde yer alan bakteriler Lc. lactis ssp. cremoris+ Lc. lactis ssp. Lactis Lc. lactis ssp. lactis + Lb. Casei Lc. lactis + Lb. Casei Lc. lactis ssp.lactis + Lc.lactis ssp. cremoris+ Lb. Sake Lc. lactis ssp. lactis 4SM7 +Lc.lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis + Lb Lc. lactis 30R7 ssp. lactis+ Lb. casei ve/veya Lb. Plantarum Lc. lactis ssp. lactis + Lc. lactis ssp. cremoris + Lb. Helveticus Lc. lactis ssp. lactis + Lc. lactis ssp. cremoris R-707 Lc. lactis ssp. lactis+ Lc. lactis ssp. Cremoris Lc. lactis ssp. lactis + Lc. lactis ssp. cremoris + Str. Thermophilus 2.6. Laktik Asit Bakterilerin Probiyotik Özellikleri Probiyotik Yunanca da yaşam için anlamına gelen ve uzun yıllardan beri çeşitli şekillerde kullanılan bir kelimedir [46]. Bir probiyotik en basit şekilde sağlık için yararlı canlı bir mikrobiyal gıda ingrediyenti olarak tanımlanabilir [47-49].McNaught ve MacFie (2001) tarafından probiyotikler; tüketici sağlığına bireylerin intestinal mikrobiyal dengesini koruyarak veya geliştirerek yararlı olan canlı mikrobiyal gıda katkılarıdır şeklinde tanımlanmaktadır. Dünyada değişik yörelerde farklı fermente ürünlerin üretiminde kullanılan probiyotik bakterilerin insan sağlığı ve beslenmesi açısından oldukça önemli terapötik ve diyetetik özellikleri olduğu bilinmektedir. Probiyotik bakteriler kullanılarak yapılan süt ürünlerinin; antimikrobiyal aktivite, kolesterol düşürücü etki, laktoz intoleransı hafifletici etki, immün sistemin aktivasyonu, karaciğer rahatsızlıklarında olumlu etki, antikanserojenik etki, L (+) laktik asit üretimi gibi bir çok yararlı etkisinin olduğu çok sayıda literatürde bildirilmektedir [50-53]. Probiyotiklerin bir çoğu patojen olmayan mikroorganizmalardır ve Laktobasiller, Bifidobakteriler ve Enterokoklar gibi insanların sindirim sisteminde doğal olarak bulunmaktadırlar [48,54]. Bazı probiyotik ürünler aktif bakteri türü olarak enterokokları içerebilmektedir. Örneğin

10 ticari probiyotik bir ürün olan Causido kültürü Enterococcus faecium u aktif bakteri türü olarak içermektedir [55]. Probiyotik bakteriler bir çok peynir çeşidinin üretiminde başarıyla kullanılmaktadırlar. Peynirlere probiyotik bakterilerin ilavesindeki başarı; kullanılan tür ve suş, üretimde kullanılan laktik asit bakterilerinin aktivitesi, peynir kompozisyonu, üretim ve olgunlaşma koşulları gibi faktörlere bağlı olarak değişmektedir. 2.6.1. Probiyotik olarak laktobasiller İlk olarak 1954 yılında Ferdinand Vergin tarafından antibiyotik ve flora üzerindeki diğer antimikrobiyal maddelerin patojen olmayan bakterilerin yararlı ( Probiotika ) etkileriyle ilişkisinin anlatıldığı Anti- und Probiotika isimli makalede kullanılan Probiyotik terimi [56]. 1989 yılında Roy Fuller tarafından tüketici sağlığına bireylerin intestinal mikrobiyal dengesini koruyarak veya geliştirerek yararlı olan canlı mikrobiyal gıda katkıları olarak tanımlanmıştır [57]. Probiyotiklerle ilgili olarak günümüze kadar en çok kabul görmüş olan bu tanım, 1998 yılında Salminen ve arkadaşları tarafından insan ve hayvanların sağlığını geliştirmek için tasarlanan gıda, yemler ya da besinsel katkılardaki canlı mikrobiyal preparatlar olarak değiştirilmiştir [58]. Probiyotik terimi genellikle fermente süt ürünleri ya da diyet katkısı olarak alınabilen biyolojik aktiviteleri ve intestinal sistemde canlılıklarını sürdürme ve yaşama kabiliyetleriyle tanımlanan Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. ve Enterococcus spp. gibi seçilmiş laktik asit bakterilerini ifade etmek için kullanılmaktadır [59].Günümüzde kullanımda L. acidophilus, L. delbrueckii, L. jonhsonii, L. casei ve L. paracasei subsp. paracasei dikkati çeken laktobasil türleri arasındadır. L. paracasei subsp. paracasei suşları genel olarak probiyotik mikroorganizmalardır [62]. Yapılan çalışmalarda L. paracasei F19 suşunun yetişkin ve çocukların bağırsak mukozasına iyi yapışma özelliğinde olduğu tespit edilmiştir [63]. Yine Holzapfel and Schillinger (2002) L. paracasei nin immun sistemin modulasyonu ve gastrointestinal rahatsızlıkların tedavisinde (özellikle diyareler) probiyotik olarak olumlu sonuçlar verdiğini belirtmektedirler.probiyotik bakterilerin

11 ürünlere ilavesindeki başarı; kullanılan tür ve suş, üretimde kullanılan laktik asit bakterilerinin aktivitesi, peynir kompozisyonu, üretim ve olgunlaşma koşulları gibi faktörlere bağlı olarak değişmektedir. Peynirlere probiyotik laktobasillerin ilavesi ile ilgili olarak yapılan bazı çalışmalar Çizelge 2.2 de verilmiş ve bu çalışmalardan bazıları aşağıda özetlenmiştir.en yaygın olarak kullanılan probiyotikler laktobasiller dir [60]. Buna gerekçe olarak probiyotiklerin olumlu etkilerine ait ilk bilimsel teorilerin laktobasil ler ile ilgili olması gösterilmektedir [60-61]. Laktik asit bakterileri ve özellikle laktobasiller 1915 yılından beri bağırsak florasını düzenlemek ve enfeksiyonları önlemek için kullanılmaktadırlar [39]. Klein et al. (1998) probiyotik uygulamalarda kullanılan laktobasilleri; L. acidophilus grubu, L. casei grubu ve L. reuterifermentum grubu olmak üzere 3 alt grupta incelemiştir. Bunlardan L. casei grubu; L. casei, L. paracasei ve L. rhamnosus olmak üzere başlıca üç bakteriyi kapsamakta ve bu üç tür de insan ve hayvanlarda probiyotik olarak kullanılabilmektedir. Çizelge 2.2. Laktobasillerin kullanıldığı bazı probiyotik peynir geliştirme çalışmaları Kaynak Kullanılan probiyotik bakteri suşu Atanassova et al., 2001 L. paracasei M3 Gardiner et al., 1998 L. paracasei NFBC 338 Stanton and Ross, 2000 L. paracasei NFBC 364 Gomes et al., 1995; Gomes et al., 1998 L. acidophilus Ki Yılmaztekin et al., 2004 L. acidophilus LA-5 Gomes and Malcata, 1998 L. acidophilus Vinderola et al., 2000 L. acidophilus A-1, A-2 Vinderola et al., 2000 L. casei C-1, C-2 Gummalla and Broadbent, 1999 L. casei LC301 Peynir çeşidi Sarı renkli Bulgar peyniri Cheddar Gouda Salamura beyaz peynir Yarı sert keçi peyniri Fresco Fresco 2.6.2. Probiyotik mikroorganizmalarda bulunması gereken özellikler Mikroorganizmaların probiyotik olarak seçilmesini ve daha sonra bu susların ticari olarak kullanılmasını sağlayan bir takım kriterler mevcuttur [64-66]. Laktik asit bakterilerinin probiyotik olarak kullanılmalarını sağlayan seçim kriterleri aşağıdaki şekilde özetlenebilir [67]: Toksik ve patojen olmama

12 Mide ve ince bağırsak asidine tolerans Safra tuzlarına direnç Sindirim kanalında veya üregenital kanalda canlı kalabilme ve üreyebilme Antimikrobiyal madde üretebilme Epitel yüzeylere yapışma Patojen bakterilerin tutunma ve kolonizasyonunu engelleme Klinik olarak kanıtlanmış ve belgelenmiş sağlık etkilerine sahip olma Ucuz kültivasyon Yüksek yoğunlukta üretimde kolaylık Dondurularak kurutmada kararlılık Üretim sürecine dayanıklılık Ürün haline getirildikten sonra dayanıklılık [52,65,68]. 2.6.3. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Probiyotikler esas olarak laktik asit bakterileridir. Yoğurt yapımında kullanılan mikroorganizmalar (Lactobacillus bulgaricus ve Streptococcus thermophilus) dışında tum laktik asit bakterileri bağırsak florası elemanlarıdır. Bir probiyotik urun, bu organizmalardan bir ya da birkaçını içerebilmektedir [69]. Probiyotik olarak en sıklıkla kullanılan bakteriler laktik asit bakterileri (Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus) ve Bifidobacterium strainleridir. Ancak bu türlerin tum strainleri probiyotik olarak kullanmak için uygun değildir. Probiyotik bakteriler türe değil, suşa bağlıdır. Bir probiyotik bakterinin sağlık üzerine yararlı etkisi sadece o suşa aittir. Bunlar bağırsaklarda ve birçok fermente süt ürünlerinde doğal olarak bulunmaktadır [39,70,71]. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Çizelge 2.3 de verilmiştir [57,62,66,72].

13 Çizelge 2.3. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Diğerleri Laktik Asit Bakterileri Bacillus spp. Streptococcus Enterococcus spp. spp. Saccharomyces S. cremoris Ent.faecalis Cerevisiae Saccharomyces S. salivarus Ent.faecium boulardii) E. coli S. diacetylactis Propionibact S. intermedius i Aspergillus Bifidobacterium spp. B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infantis Lactobacillus spp. L. acidophilus L. casei L. delbrueckii subspp. L. cellobiosus B. thermophilum L. curvatus B. longum L. fermentum L. lactis L. plantarum L. reuteri L. brevis 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Aktiviteleri Laktik asit bakterilerinde lipolizis olayı metilketon ve çeşitli alkoller gibi aroma ile ilişkili bileşiklerinden prekürsörleri olan serbest yağ asitlerinin oluşumu ile sonuçlanmaktadır [73]. Laktik bakterilerin metabolik sistemleri ile ilgili olarak yapılan çalışmalara bakıldığında lipolitik esterolitik aktivitelerinin diğer bir ifade ile lipaz esteraz sistemlerinin daha az dikkate alınmıştır. L. helveticus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus gibi starter olarak kullanılan zorunlu homofermentatif laktobasiller de laktokoklar gibi esterazlar üretebilmektedirler. Fakültatif heterofermentatif olan ve birçok peynir çeşidinin starter olmayan mikrofloralarındaki dominant laktobasiller olarak tespit edilen L. casei, L. paracasei ve L. plantarum gibi laktobasillerin lipolitik aktiviteleri zayıftır. Suşa bağlı olmakla birlikte genel bir kabul olarak lipolitik aktiviteleri her ne kadar zayıf olsa da, laktobasiller bazı peynir çeşitlerinin lipolitik olgunlaşmasında son derece önemli rol oynamaktadırlar. Örneğin dondurarak şoklanmış L. casei T nin lipolitik aktivitesinin yüksek olduğu ve

14 Cheddar peynirinin olgunlaşmasında önemli olabileceği bildirilmektedir [74]. Laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık göstermektedir. Yapılan çalışmalarda Leu. mesenteroides spp. dextranicum un en yüksek lipolitik aktiviteye sahip olan tür olduğu belirtilmiştir. Laktik bakterilerde lipolizis olayında ilk etapta trigliseritlerden digliseritler oluşmaktadır, digliseritlerden monogliseritler bunlardan da serbest yağ asitleri ve gliserin oluşmaktadır [39]. 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktiviteleri Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit oluşturma fonksiyonu hem de ürünün duyusal nitelikleri açısından önemlidir. Bu özelliğin belirlenmesinde Hull yönteminden yararlanılır ve kazeinin paçalanması sonucu serbest kalan tirosin ve triptofan belirlenir. Sonuçlar ise tirosin ekivalenti olarak verilir. Laktik asit bakterileri, gelişebilmeleri için ortamda bazı serbest amino asitlerin bulunmasına gerek duyarlar. Streptococcus türleri, ekstrasellüler proteinaz enzimiyle özellikle hücre zarına bitişik olan kazeini peptitlere parçalar. Bu peptitler, bakteri hücresi tarafından alınır ve intrasellüler olarak hidrolize edilirler [75]. de Giori ve arkadaşları [76], laktik asit bakterilerinde bulunan proteolitik enzimlerin peynir aromasının ve belli ürünlerin kokusunun oluşmasında etkili olduğunu belirtilmiş ve proteolitik aktivite de ph ve ısının etkili olduğunu gösterilmiştır [77]. Rasic ve Kurmann, proteolitik aktivitenin bakterilerin logaritmik gelişme fazında meydana geldiğini, S. thermophilus' un yalnızca endosellüler enzim ürettiğini, L. bulgaricus' un ise endosellüler ve az miktardada ekzosellüler enzim oluşturduğunu bildirmişlerdir. Ekzosellüler enzimlerle proteinlerin, küçük parçalara ayrılarak hücre içine daha fazla girmesinin sağlandığını ileri sürmüşlerdir. Streptokokların spesifik proteolitik aktivitelerinin 0,1' in (µg kristal tripsin eşdeğeri/ml hücresel DNA) altında, laktobasillerin aktivitesinin 0,2-3,2 arasında

15 değiştiği bildirilmiştir. Ayrıca, L. bulgaricus hücrelerinin yüksek proteolitik aktivite gösterdiği belirtilmiştir [78,79]. Yapılan araştırmalarda, laktik asit bakterilerinde, laktik asit üretimi ve proteolitik aktivitenin cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterdiği belirlenmiştir [76-80]. 2.9. Hidrojen Sülfür Üretimlerinin Belirlenmesi Hidrojen sülfür çok etkili toksik bir maddedir. Hidrojen sülfüre kükürtlü hidrojen de denir. Kükürdün hidrojenle oluşturduğu renksiz, çok zehirli gaz halindeki bir bileşiktir. Hidrojen sülfür, karakteristik çürük yumurta kokusunda bir gazdır. Termodinamik bakımdan kararlı olmasına rağmen çok yüksek sıcaklıklarda ayrışması mümkündür [81]. 2 H 2 S 4H + 2S Sülfatların bakteriler tarafından redüksiyonu ve proteinlerin parçalanması sonucunda hidrojen sülfür oluşur. Laktik asit bakterileri aracılığı ile besi yerindeki kükürtlü amino asitleri kullanarak hidrojen sülfür oluştururlar. Bu amino asitler sistein, sistin ve metiyonindir [82]. Bazı laktik asit bakterilerinin değişik miktarlarda hidrojen sülfür ürettikleri belirlenmiştir [81,82-84]. Lactobacillus plantarum, L. viridescens ve L.coryneformis türlerinin peptonlu demir agarda hidrojen sülfür oluşturduğu bildirilmiştir [85]. Sharpe ve Franklin [86], bir çok laktobasil suşunun anaerobik şartlar altında ve düşük sıcaklık derecelerinde hidrojen sülfür oluşturduklarını açıklamışlardır. Ayrıca, besi yerinde karbon kaynağı az olduğunda da hidrojen sülfürün meydana geldiğini belirtmişlerdir.

16 2.10. Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyal Aktiviteleri Laktik asit bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri bakteriyosin ve bakteriyosin benzeri bileşikler laktik asit,hidrojen peroksit,diasetil gibi maddelerden kaynaklanmaktadır.probiyotik olarak kullanılan LAB leri, organik asitler (örneğin; laktik asit ve asetik asit), hidrojen peroksit, bakteriyosinler, farklı düşük-moleküler ağırlıklı peptitler, antifungal peptitler veya proteinler ve yağ asitleri gibi çok sayıda antimikrobiyal bileşikler üretmektedirler. LAB leri tarafından başlıca üretilen organik asitlerden laktik asit ve asetik asit, mide-bağırsak yolunda ph yı düşürerek patojenler üzerinde bakterisidal veya bakteriostatik etki göstermektedirler. Laktik asit in gram negatif patojen bakterilere karşı etkili olduğu bildirilmiştir [87, 88]. Ayrıca, LAB lerin ürettiği antimikrobiyal maddelerin intestinal enfeksiyonlarında koruyucu rol aldığı tespit edilmiştir [89, 90]. Laktik asit bakterileri antimikrobiyal aktivitelerinden dolayı ortamda bulunan Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria sp., Clostridium sp. ve Vibrio cholera gibi gıda kaynaklı kontaminant ve patojen mikroorganizmaların gelişimini engellemekte ve ölümlerine neden olmaktadırlar [91].

17 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal 3.1.1. Bakteri kültürleri Gazi Üniversitesi biyoteknoloji labaratuvar kültür kolleksiyonunda bulunan ve Türkiye ye özgü çeşitli geleneksel yöntemlerle yapılmış peynirlerden izole edilen 18 adet lactobacillus suşu kullanılmıştır. Beyaz peynirlerden izole edilmiş olan suşların izolasyon kaynakları ve kodları Çizelge 3.1. de verilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan laktik asit bakterisikültürleri Çalışma Kodu İzole Edildiği Kaynak BTM4 Balıkesir Tulum Peyniri 2 EDS4 MP1 MP4 CEP1 BSP1 BP5 FKK3 IP2 IP5 BT1 KIR3 KIR12 YG7 YG9 MNK3 EMP2 Edremit Sepet Peyniri Balıkesir Mihaliç peyniri Balıkesir Mihaliç peyniri Çanakkale Ezine peyniri Balıkesir Sepet peyniri Bursa Dil Peyniri Kirşehir Peyniri(Filiz kök) İzmir Tulum peyniri İzmir Tulum Peyniri Balıkesir Tulum Peyniri Kırşehir Çökelek Peyniri Kırşehir Çökelek Peyniri Elazığ Şafak Peyniri Elazığ Şafak Peyniri Manyas Kelle Peyniri Erzincan Tel Çökelek peyniri

18 3.1.2. Besiyerleri Lactobacillus suşlarını üretmek amacıyla MRS besiyeri kullanılmıştır. Çizelge 3.2. MRS besiyeri (Man Rogosa and Sharpe)(Merck) Maddeler g/l Maddeler g/l Pepton 10,0 K2HPO4 2,0 Beef ekstrakt 8,0 Sodyum asetat.3 H2 O 5,0 Yeast ekstrakt 4,0 di-amonyum hidrojen sitrat 2,0 Glukoz 20,0 MgSO4.7 H2 O 0,2 Tween 80 1,0 ml MnSO4.4 H2 O 0,04 Yukarıdaki çizelgedeki miktarlara uygun olacak şekilde maddeler tartılıp bir miktar distile su da eritilip 1000 ml ye tamamlanmıştır. Gerektiğinde deneyin amacına göre besiyerine %1,5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. 0,01 M HCl ve/veya 0,01 M NaOH ph ayarlamak için kullanılmış ve ph 6,2±0,2 ye ayarlanarak, besiyeri 121 ºC de 15 dk otoklavda sterilize edilmiştir. [92] Laktobacillus suşlarını hidrojen sülfür üretmek için TSI besiyeri kullanılmıştır. Çizelge 3.3. TSI besiyeri (Triple Sugar Iron Agar ) Maddeler g/l Maddeler g/l Pepton 15,0 Lactose 10,0 Beef ekstrakt 3,0 Sucrose 10,0 Yeast ekstrakt 3,0 Ferrose Sulphata 2,0 Protease pepton 5,0 Sodium Chloride 5,0 Dextrose 10,0 Phenol Red 0,024 Agar 12.0 Sodium Thiosulphate 0.3

19 Maddeler 1 litre distile suda çözülerek PH 7,4±0,2 ye 0,01 N H 2 SO 4 ve 0,01 N Na OH le ayarlanmıştır ve121 ºC de 15 dk otoklavda sterilize edilmiştir. Proteolitik tayini için Skim Milk agar besiyeri kullanılmıştır. Çizelge 3.4. Skim Milk Agar besiyeri Maddeler g/l Peptone from casein 5,0 Yeast extract 2,5 Skim Milk Powder 1,0 Glucose 1,0 Agar 10,5 Dehidre besiyeri, 20,0 g/l olacak şekilde soğuk damıtık su içine tartılır, 15 dakika kendi halinde bırakılır. Sonra ısıtılarak eritilip, otoklavda 121 C'da 15 dakika sterilize edilir ve steril Petri kutularına 12,5'er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeri berrak ve hafifçe opalesent (meneviş, yanardöner) sarımsı renktedir ve 25 C'da ph'sı 7,0±0,2'dir. Araştırmada kullanılan kontaminant ve patojen test bakterilerin aktifleştirilmesinde ise Nutrient sıvı besiyeri kullanılmıştır [93]. Çizelge 3.5. Nutrient sıvı besiyeri (Merck) Maddeler g/l Lab-Lemco Powder 1,0 Yeast ekstrakt 2,0 Pepton 5,0 Sodyum klorür 5,0 Maddeler yukarıdaki çizelgede belirtilen miktarlarda olacak şekilde tartılıp bir miktar distile su da eritilip 1000 ml ye tamamlanmıştır

20 Deneyin amacına göre besiyerine %1,5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. 0,01 M HCl ve/veya 0,01 M NaOH kullanılarak ph 7,0 ± 0,2 ye ayarlanarak, 121 ºC de 15 dak otoklavda sterilize edilmiştir. [93]. 3.1.3. Bakterilerin muhafazası 1,5 ml lik ağzı kapaklı tüplere yaklaşık 800 µl gliserol aktarılarak, 121 ºC de 15 dak. sterilize edilmiştir. Bakteriler uygun sıvı besiortamında iki kez ard arda aktifleştirilip, aktif kültürlerden 200 µl gliserol içeren steril tüplere paralelli olarak aktarılmıştır. Suşlar derin dondurucuda -80 ºC de muhafaza edilmiştir. Muhafazaya alınan stoklar iki ayda bir aktifleştirilerek yenilenmiştir.[94] 3.1.4. Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları Lactobacillus'ların geliştirilmesi ve aktifleştirmesinde MRS sıvı besiyeri kullanılmıştır. Tüm deneysel çalışmalar bakterilerin 30 ± 1oC de 18-24 saat inkübe edilerek gerçekleştirilmiştir [95-97]. 3.1.5. Araştırmada kullanılan test bakterileri Araştırmada kontaminant ve patojen test bakterileri olarak Escherichia coli ATCC 35218, Bacillus cereus RSKK 863, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve kullanılmıştır. Test bakterileri uygun sıvı besiortamında 24 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Test bakterilerin temin edildikleri kaynak ve inkübasyon dereceleri Çizelge 3.6 de verilmiştir.

21 Çizelge 3.6. Test bakterileri, temin edildiği kaynaklar ve inkübasyon sıcaklığı Bakteriler Temin Edildiği kaynak İnkubasyon Sıcaklığı Escherichia coli ATCC 35218 R.S.K.K 37oC Kontaminant ve Patojen Bakteriler Bacillus cereus RSKK 863 R.S.K.K 37oC Salmonella enteritidis ATCC 13076 A.Ü.G.M 37oC Staphylococcus aureus ATCC25923 H.Ü. 37oC R.S.K.K. : Refik Saydam Hıfzısıhha Merkez Başkanlığı Kültür Koleksiyonu H.Ü. : Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı A.Ü.G.M : Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü 3.2. Metot 3.2.1. Bakterilerin muhafazası Lactobacillus bakterileri MRS sıvı besiyerinde iki kez aktifleştirilmiştir. 800 µl gliserol kapaklı cryo tüplerine ilave edilerek, otoklavda 121 C de 15 dak. sterilize edilmiştir. 2. aktifleştirmeden sonra aktif kültürlerden 200 µl alınarak steril gilserol içeren ortama ilave edilmiştir. Daha sonra gliserol içindeki bakteriler -80 C de muhafaza edilmiştir. Muhafazaya alınan stoklar altı ayda bir yenilenmiştir [95,98,99].

22 3.2.2. Hidrojen sülfür üretiminin tespiti İzole edilen Lactobacillus suşlarının Hidrpjen Sülfür (H 2 S) üretimleri TSI (Triple Sugar Iron Agar ) katı besiyerinde gerçekleştirilmiştir [100]. Lactobacillus suşları MRS besiyerinde, 30±1 C 'de 24 saatte aktivleştirilmiştir. aktif kültürlerden plaklara 0.5 ml, ilave edilerek drigalski saptülü ile homojen bir şekilde yayılmştır.örnekler 30 C 'de 21 gün anaerobik şartlar altında inkübasyona bırakılmıştır.inkübasyon sonunda kültürlerin oluşturduğu H 2 S,kolonilerin siyahlaşmasina neden olurken, H 2 S oluşturmayan kültürlerin koloni renginin siyahlaşmadığı gozlenmiştir. besiyerindeki kararmanın görsel olarak az ve ya çokluğu o suşun oluşturduğu H 2 S miktarı hakkında kalitatif olarak bilgi vermiştir [101]. 3.2.3. Proteolitik aktivite nin tespiti Lactobacillus suşları MRS ve %10 luk skim milk, 24 saat 37 o C de inkübe edilmişlerdir. %10 luk Skim milk agar besiyeri içeren petriler bir gece etüvde bekletilerek steril durumları kontrol edilmiştir. Besiyerinin üzerinde 6 mm çapında boş steril diskler yerleştirilmiştir. Aktif kültürlerden Skim milk agar üzerinde bulunan disklere 10 µl inoküle emdirilerek 37ºC de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda disklerin çevresinde oluşan zon çapları kumpas ile ölçülmüştür [102]. 3.2.4. Bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesi Spot Agar testi:ysb Agar %10 YSB, %1,5 Agar besiyerinin üzerine 6 mm çaplı steril diskler yerleştirilmiştir. Lipolitik aktiviteleri yönünden test edilecek bakteriler ile 24 saatlik aktif kültürlerinden disklerin üzerine gelecek şekilde 10'ar µl inoküle edilmiş ve 24 saat inkübasyona bırakılmışlardır. İnkübasyon sonunda yapılan kontrollerde süt proteinini hidroliz etmeleri sonucu koloni etrafında zon oluşturan test bakterileri pozitif olarak kabul edilmiş, kıyaslama yapabilmek amacıyla da koloni çapları kumpas (digital caliper) ile ölçülmüştür [103].

23 3.2.5. Laktik asit bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri Laktik asit bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri bir çok yöntemle tespit edilmektedir. Yöntemlerin katı veya yarı katı besiyerinde bulunan indikatör organizmaların üremelerini difüzyon yoluyla inhibe etmesi esasına dayanır [104]. Çalışmamızda her bir suş 3 farklı ortamda geliştirilmiştir. Bunlar; A: Anaerobik inkübasyon ve inkübasyon sonrası ph 6,2 ile 6,5 arasında ayarlandı (Okisjen negatif ve asit negatif) B: Aerobik inkübasyon ve inkübasyon sonrası ph 6,2 ile 6,5 arasında ayarlandı (oksijen pozitif ve asit negatif) C: genel inhibisyon için aerobik inkübasyon yapıldı ve ph ayarlaması yapılmadı ancak kültürlerin son kültür phları kayıt edildi (oksijen pozitif ve asit pozitif). A,B ve C tüpleri 5000 rpm de 10 dk. Santrifüj sonunda oluşan berrak kısım (süpernatant) steril şartlar altında 0,45 µm lik tek kullanımlık steril filtre ile mikrofiltrasyon yolu ile sterilize edilmiştir. Elde edilen filtratların inhibisyon etkisi Warminska-Radyo ve ark., 2002 ye göre belirlenmiştir.[105] İnhibisyon zonunun tespiti için, test bakterileri olarak Escherichia coli ATCC 35218 Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Bacillus cereus RSKK 863 kullanılmıştır. Test bakterileri Nutrient sıvı besiortamında aktifleştirilmiş ve 37 C ±1 de geliştirilmiş 24 saat lik aktif kültürler %0,875 lik serum fizyolojik çözeltisi ile 2 kez yıkanarak hücre yoğunlukları 0,5 nolu Mc Farland standartına göre ayarlanmıştır. 0,5 Mc Farland yoğunluğuna ayarlan bakteri süspansiyonundan steril plaklara 100 µl aktarılmıştır. Bu işlemden sonra daha önceden hazırlanıp, 121 C de 15 dk otoklavda steril edilmiş olan ve yaklaşık olarak 50 C ye kadar soğutulmuş olan Nutrient katı besiyerinden 20 ml ilave edilip, besiortamı ve test bakterilerinin homojen bir şekilde

24 karışması sağlanmıştır. Homojenlik sağlandıktan sonra petri kabı içerisindeki Nutrient katı besiyerinin donması için buzdolabında 2 saat süre bekletilmiştir. Donan katı besiyeri üzerinde 0,6 cm çapındaki steril çubukla kuyular açılmıştır. Kuyuların tabanları steril agarla tekrar sıvanmış ve bu kuyulara A,B ve C nin steril filtratlarından 100 µl ilave edilmiş ve 37 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda kuyu çevresinde oluşan zonların çapı kumpas ile ölçülmüştür. Bakteriosin Test Metodu: Çalışmamızda, izole edilen suşların bakteriosin üretimleri oksijensiz ortam kullanarak, modifiye edilerek tespit edilmiştir [106]. Önceden hazırlanan 10ml 0.002lik şekerli MRS besiyerlerinde %2 oranında aktif kültürle alınıp, anaerobik jarda 30ºCde 24 saat inkübasiyona bırakılmıştır. İnkübasiyondan sosnunda suşların inhibisyon etkileri Bölüm 3.2.5de gösterildiği şekilde saptanmıştır.

25 4. DENEYSEL BULGULAR 4.1. Proteolitik Aktivite Düzeylerinin Belirlenmesi MRS'de geliştirilen tüm bakteri suşları proteolitik aktivite gösterirken, en yüksek proteolitik aktiviteyi Lb.rhamnosus BTM4 (2,09±0,01) ve Lb. fermentum FKK3 (2,08±0,0), en düşük proteolitik aktiviteyi ise Lb. rhamnosus CEP1 (1,26±0,21) ve Lb. brevis KIR3 (1,27±0,19) göstermiştir (Çizelge 4.1. ve Şekil 4.1). Skim Milkde suşların proteolitik aktiviteleri, en yüksek proteolitik aktiviteyi Lb. rhamnosus MP1 (2,38±0,0) ve Lb. brevis BT1 (2,36±0,21), en düşük proteolitik aktiviteyi ise Lb. brevis KIR12 (1,09±0,03) ve Lb.casei EMP2 (1,33±0,04) suşları göstermiştir. (Çizelge 4.2. ve Şekil 4.2). Lb. Fermentum IP5 ve Lb. Rhamnosus MP1 bakterilerinin Skim Milk besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar (Resim 4.1 ve 4.2) de gösterilmiştir.

26 Çizelge 4.1. Lactobacillus suşlarının MRS besiyerinde proteolitik aktivite sonuçları (zon çapı cm) Suşlar Son kültür ph Proteolitik aktivite Lb. rhamnosus BTM1 3,93±0,02 1,79±0,04 Lb. rhamnosus BTM4 4,05±0,12 2,09±0,01 Lb. rhamnosus EDS4 4,61±0,05 1,60±0,02 Lb. rhamnosus MP1 4,21±0,04 1,81±0,01 Lb. rhamnosus MP4 3,97±0,05 1,94±0,07 Lb. rhamnosus CEP1 4,31±0,02 1,26±0,21 Lb. fermentum BSP1 4,32±0,01 1,42±0,01 Lb. fermentum BP5 4,45±0,04 1,92±0,40 Lb. fermentum FKK3 4,26±0,04 2,08±0,0 Lb. fermentum IP2 4,31±0,02 1,86±0,04 Lb. fermentum IP5 4,30±0,03 1,49±0,03 Lb. brevis BT1 4,23±0,08 1,93±0,02 Lb. brevis KIR3 5,41±0,01 1,27±0,19 Lb. brevis KIR12 4,33±0,05 1,31±0,11 Lb. brevis YG7 4,32±0,01 1,71±0,01 Lb. brevis YG9 4,33±0,04 1,83±0,03 Lb. helveticus MNK3 3,95±0,04 1,66±0,08 Lb. casei EMP2 3,99±0,04 1,62±0,11

Şekil 4.1 Lactobacillus suşlarının MRS besiyerinde proteolitik aktivite düzeyleri. 27

28 Çizelge 4.2. Skim Milkde lactobacillus suşlarının proteolitik aktivite sonuçları (zon çapı cm). Suşlar Son kültür PH Proteolitik aktivite Lb. rhamnosus BTM1 4,37±0,12 2,04±0,01 Lb. rhamnosus BTM4 4,16±0,01 1,70±0,13 Lb. rhamnosus EDS4 5,21±0,31 2,22±0,06 Lb. rhamnosus MP1 4,39±0,04 2,38±0,0 Lb. rhamnosus MP4 4,04±0,01 1,99±0,03 Lb. rhamnosus CEP1 5,28±0,02 1,61±0,18 Lb. fermentum BSP1 5,28±0,14 2,10±0,02 Lb. fermentum BP5 5,60±0,17 1,96±0,08 Lb. fermentum FKK3 5,36±0,07 2,16±0,22 Lb. fermentum IP2 5,36±0,01 1,70±0,16 Lb. fermentum IP5 5,43±0,03 1,44±0,04 Lb. brevis BT1 5,14±0,11 2,36±0,21 Lb. brevis KIR3 5,43±0,15 2,08±0,11 Lb. brevis KIR12 5,71±0,06 1,09±0,03 Lb. brevis YG7 5,34±0,02 1,95±0,08 Lb. brevis YG9 5,71±0,02 1,71±0,03 Lb. helveticus MNK3 5,23±0,18 2,19±0,80 Lb. casei EMP2 4,93±0,18 1,33±0,04

Şekil 4.2. Skim milkde lactobasillus suşlarının proteolitik aktivite düzeyleri. 29

30 Resim 4.1. Lactobacillus fermentum IP5 suşunun Skim Milk besiyerinde proteolitik aktivite yeteneği. Resim4.2. Lactobacillus rhamnosus MP1 suşunun Skim Milk besiyerinde proteolitik aktivite yeteneği. 4.2. Bakterilerin Lipolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi YSB Agar'da EDS4, CEP1, BSP1,BP5, FKK3,IP2,IP5,KIR3,KIR12,YG9 suşların dışındakı diğer lactobacillus suşlarının Lipolitik aktivite gösterdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.3, Şekil 4.3.).

31 Lb. rhamnosus BTM4 ve Lb. brevis YG9 suşlarının YSB agardaki lipolitik aktiviteleri(resim 4.3 ve resim 4.4) de gösterilmiştir. Çizelge 4.3. Lactobacillus suşlarının Lipolitik aktivite sonuçları(zon çapı mm). Suşlar Son kültür ph Lipolitik aktivite Lb. rhamnosus BTM1 3,93±0,02 1,01±0,01 Lb. rhamnosus BTM4 4,05±0,12 1,27±0,06 Lb. rhamnosus EDS4 4,61±0,05 - Lb. rhamnosus MP1 4,21±0,04 1,01±0,03 Lb. rhamnosus MP4 3,97±0,05 0,97±0,05 Lb. rhamnosus CEP1 4,31±0,02 - Lb. fermentum BSP1 4,32±0,01 - Lb. fermentum BP5 4,45±0,04 - Lb. fermentum FKK3 4,26±0,04 - Lb. fermentum IP2 4,31±0,02 - Lb. fermentum IP5 4,30±0,03 - Lb. brevis BT1 4,23±0,08 1,22±0,01 Lb. brevis KIR3 5,41±0,01 - Lb. brevis KIR12 4,33±0,05 - Lb. brevis YG7 4,32±0,01 1,25±0,01 Lb. brevis YG9 4,33±0,04 - Lb. helveticus MNK3 3,95±0,04 1,03±0,0 Lb. casei EMP2 3,99±0,04 1,03±0,01 (-) ; Lipolitik aktivite gözlenmemiştir.

Şekil 4.3. Lactobacillus suşlarının Lipolitik aktivite yeteneği. 32

33 Resim4.3. Lactobacillus rhamnosus BTM4 suşunun Lipolitik aktivite yeteneği. Resim4.4. Lactobaciillus brevis YG9 suşunun Lipolitik aktivite yeteneği.

34 4.3. Hidrojen Sülfür Üretiminin Tespiti Lactobacillus suşlarının hiçbirinin TSI besiortamında H 2 S üretimi gözlenmemiştir. Çizelge 4.4. Lactobacillus suşlarının hidrojen sülfür üretimleri Suşlar H 2 S Lb. rhamnosus BTM1 - Lb. rhamnosus BTM4 - Lb. rhamnosus EDS4 - Lb. rhamnosus MP1 - Lb. rhamnosus MP4 - Lb. rhamnosus CEP1 - Lb. fermentum BSP1 - Lb. fermentum BP5 - Lb. fermentum FKK3 - Lb. fermentum IP2 - Lb. fermentum IP5 - Lb. brevis BT1 - Lb. brevis KIR3 - Lb. brevis KIR12 - Lb. brevis YG7 - Lb. brevis YG9 - Lb. helveticus MNK3 - Lb. casei EMP2 - (-) ; H 2 S üretimi yoktur. Pozitif kontrol olarak: Salmonella enteritidis ATCC 13076. Negatif kontrol olarak: Escherichia coli ATCC 35218

35 4.4. Lactobacillus Suşlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri Lactobacillus suşlarının antimikrobiyal aktiviteleri laktik asit, hidrojen peroksit ve inhibitör maddelerden kaynaklanmaktadır. Bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri belirlemek amacıyla 3 farklı test uygulanmıştır. A: Laktik asit ve Hidrojen Peroksit dışındaki inhibitör maddelerin etkisi. Bakteriler anaerobik koşullarda inkübe edilmiştir, inkübasyon sonrası üreyen kültür ortamının ph 6,2 ile 6,5 arasında ayarlanmıştır. (Okisjen negatif ve asit negatif). B: Laktik asit dışındaki (hidrojen peroksit ve inhibitör) maddelerin etkisi. Bakteriler aerobik koşullarda inkübe edilmiştir, inkübasyon sonrası üreyen kültür ortamının ph sı 6,2 ile 6,5 ayarlanmıştır (oksijen pozitif ve asit negatif). C: Genel inhibisyon, Laktik asit, hidrojen peroksit ve inhibitör maddlerin etkisi. Bakteriler aerobik koşullarda inkübe edilmiştir, üreyen kültür ortamının ph ı ayarlanmamıştır. Son kültür ph ları kayıt edilmiştir (oksijen pozitif ve asit pozitif). Test bakterisi olarak kullanılan patojenlerin deneyden önce yoğunlukları Mac Farland 0.5 e ayarlanıp ve koloni sayımı için petrilere ekilmiştir.. Lactobacillus suşlarının antimikrobiyal aktivitele sonuçları (Çizelge 4.5, Şekil 4.4) gösterilmiştir. Lb. brevis KIR3 suşun dışıdaki tüm Lactobacillus türlerinin test edilen patojen bakteriler üzerinde genel inhibisyon gösterdiği tesbit edilmiştir. Lb. fermentum BP5 suşun E. coli ATCC 3528 üzerinde laktik asit dışındaki inhibitör maddelerin etkisi gözlenmiştir. Diğer lactobacillus suşlarının denenen tüm test bakteriler üzerinde laktik asit dışındaki diğer inhibitör maddelerin etkisi gözlenmemiştir.

Çizelge 4.5. Lactobacillus suşlarının test bakteriler üzerinde inhibisiyon etkileri. E. coli ATCC 35218 S. aureus ATCC 25923 B. cereus RSKK 863 S. enteritidis ATCC 13076 Suşlar A B C A B C A B C A B C Lb. rhamnosus BTM1 - - 0,76±0,05 - - 0,79±0,01 - - 0,81±0,02 - - 0,51±0,01 Lb. rhamnosus BTM4 - - 0,61±0,18 - - 0,45±0,04 - - 0,65±0,01 - - 0,39±0,04 Lb. rhamnosus EDS4 - - 0,60±0,03 - - 0,41±0,01 - - 0,41±0,03 - - 0,55±0,01 Lb. rhamnosus MP1 - - 0,59±0,01 - - 0,53±0,10 - - 0,80±0,11 - - 0,64±0,08 Lb. rhamnosus MP4 - - 0,72±0,08 - - 0,55±0,04 - - 0,70±0,11 - - 0,43±0,01 Lb. rhamnosus CEP1 - - 0,73±0,13 - - 0,67±0,01 - - 0,41±0,07 - - 0,68±0,08 Lb. fermentum BSP1 - - 0,69±0,04 - - 0,58±0,00 - - 0,69±0,01 - - 0,58±0,14 Lb. fermentum BP5 0,39±0,01 0,36±0,06 0,65±0,07 - - 0,50±0,00 - - 0,66±0,06 - - 0,61±0,01 Lb. fermentum FKK3 - - 0,65±0,04 - - 0,59±0,07 - - 0,73±0,01 - - 0,51±0,04 Lb. fermentum IP2 - - 0,58±0,06 - - 0,92±0,08 - - 0,77±0,07 - - 0,72±0,06 Lb. fermentum IP5 - - 0,79±0,01 - - 0,76±0,08 - - 0,80±0,03 - - 0,72±0,03 Lb. brevis BT1 - - 0,63±0,04 - - 0,52±0,03 - - 0,87±0,01 - - 0,50±0,08 Lb. brevis KIR3 - - - - - - - - - - - - 36

Çizelge 4.5. (Devam) Lactobacillus suşlarının test bakteriler üzerinde inhibisiyon etkileri. E. coli ATCC 35218 S. aureus ATCC 25923 B. cereus RSKK 863 S. enteritidis ATCC 13076 Suşlar A B C A B C A B C A B C Lb. brevis KIR12 - - 0,65±0,01 - - 0,48±0,03 - - 0,69±0,04 - - 0,54±0,06 Lb. brevis YG7 - - 0,57±0,01 - - 0,64±0,08 - - 0,70±0,00 - - 0,58±0,00 Lb. brevis YG9 - - 0,64±0,03 - - 0,51±0,04 - - 0,51±0,01 - - 0,62±0,06 Lb. helveticus MNK3 - - 0,65±0,01 - - 0,42±0,06 - - 1,02±0,03 - - 0,41±0,01 Lb. casei EMP2 - - 0,78±0,09 - - 0,80±0,03 - - 0,86±0,08 - - 0,82±0,06 (-); inihibisiyon gözlenmemiştir. 37

Şekil 4.4. Lactobacillus suşlarının test bakteriler üzerinde inhibisiyon etkileri. 38

39 Patojen test bakteilein Mac Farland 0.5 de koloni sayım sonuçları Çizelge 4.6 ve Şekil 4.5 de verilmiştir. Çizelge 4.6. Patojenlerin Mac Farland 0.5 de koloni sayım sonuçları (Log kob/ml) Suş Adı Patojenlerin Mac Farland 0.5 de koloni sayım sonuçları (Log kob/ml) E. coli ATCC 35218 9,61±0,45 S. aureus ATCC 25923 10,4±0,47 B. cereus RSKK 863 6,95±0,49 S. enteritidis ATCC 8,59±0,91 Şekil 4.5. Patojenlerin Mac Farland 0.5 de koloni sayım grafiği