EK-3 GDO ANALİZLERİ İÇİN METOT PERFORMANS KRİTERLERİ GİRİŞ

EK-3 GDO ANALİZLERİ İÇİN METOT PERFORMANS KRİTERLERİ GİRİŞ Güvenilir gıdanın halka arzında önemli rol oynayan Gıda Kontrol Laboratuvarlarının daima alanındaki son teknolojiyi takip ederek, en son teknolojinin gerektirdiği cihazlarla ve tecrübeli personeliyle hizmet verebilmesi için tüm analiz alanlarında ulusal ve uluslararası anlamda uygunluk sağlanması için güvenilir analitik metotlarına ihtiyacı vardır. Bu belge, genetiği değiştirilmiş organizmaların saptanmasında ve miktar tayininde kullanılan polimeraz zincir reaksiyonu temelli metotları işaret etmektedir. Laboratuvarlar gerekli kalitede bilgiyi sağlayabilmek için aşağıdaki önlemleri almalıdır: Analizlerde geçerliliği kabul gören metotlar kullanılmalı, İç kalite kontrol prosedürleri uygulanmalıdır, Yeterlilik testlerine katılım sağlanmalıdır, Uluslararası bir standarda (ISO/IEC 17025) göre akredite olmalıdır. Bu nedenle GDO analizi yapan yetki almış laboratuvarlarda, verifikasyon çalışmaları yapılmalı, metotlar için uygulamaya alınmadan önceki metot performans kriterleri belirlenmelidir. 1. PERFORMANS KRİTERLERİ 1.Uygulanabilirlik Tanım: Metodun uygulanabileceği bileşenleri, matriksleri ve konsantrasyonları tanımlar. Kabul Kriteri: Uygulanabilirlik raporumetodun amacı hakkında bilgi vermeli ve başvurusu yapılan bileşenler hakkında yeterli bilgiyi içermelidir. Tanım ayrıca başka bileşenlerden gelebilecek karışıklıklara, matrikslerden kaynaklanan uyumsuzluklara karşı gerekli uyarıları içermelidir. 2.Yapılabilirlik Tanım: Çalışmanın kolaylığı, uygulamanın geçerliliği ve verimi, metodun maliyetini tanımlar. Kabul Kriteri:Analizmetodu, benzer amacı olan diğer metotlara da uygulanabilir olmalıdır. Diğer bir deyişle, aşağıdaki belirtilen durumlarda metottercih edilmemesi önerilir; Yeni bir teçhizat veya pahalı bir ekipmana ihtiyaç duyulması durumunda, Metodun uygulanması için gerekli olan kaynakların (zaman, iş gücü, reaktifler, maliyet) aynı amaçla çalışan diğer metotlardan daha fazla olması durumunda. 1

Aşağıdaki çalışmalara ait ham datalar izlenebilirliği sağlanacak şekilde kayıt altına alınmalıdır. Laboratuarlara analiz için gönderilen test örnekleri için iş akış Şekil 1 de gösterilmiştir. Verifikasyon raporlarında, bu izlenebilirliği sağlayacak çalışan personelin isimleri, çalışma tarihleri, elde edilen Ct değerleri, v.b.datalar yer almalıdır. Ayrıca cihaz çıktıları da söz konusu rapora eklenmelidir. 3. DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması Prosedür: Metot daha önceden valide edilmişse DNA ekstraksiyonu en az 2 defa ve her seferinde ayrı test porsiyonu olacak şekilde mümkünse ayrı günlerde ve değişik operatörlerle yapılmalıdır. DNA ekstraksiyonun tek bir matrikste yapılması başka bir matriks için geçerli olmayabilir. Aynı prosedür değişik matrikslerde de yapılmalıdır. Matrikslerin GDO içermesi zorunlu değildir. Yem, tohum ve gıdalarda (işlenmiş ve işlenmemiş) her bir ürün grubundan en az bir matriks olmak koşuluyla, ayrı günlerde (en az 3 farklı günde) 6 tekrar ekstraksiyon yapılarak sonuçların ortalama değeri, standart sapma ve RSD hesaplanır.(3gün x 6 tekrar x 4 matriks = 72 ) Bu çalışma (72 ekstraksiyon) personel sayısına bölünerek yapılabilir. STSapma s RSD% s x 100 n i 1 ( x x) i n 1 2 3.1. DNA Konsantrasyonu Prosedür : Rutin analizlerde DNA ekstraktlarınınkonsantrasyonu ölçülmelidir. Kabul Kriteri :Verifikasyonda elde edilen sonuçlar aynı matriksle yapılan validasyon çalışmasındaki kadar ürün eldesini sağlamalıdır. Metot en azından pratik LOD/LOQ seviyesini sağlayacak uygun DNA miktarı sağlamalıdır. Eğer DNA miktarı yeterli olmazsa pratik LOD değeri etkilenecektir. DNA miktarının 10ng/µl ve üzerinde olması beklenir. DNA miktarı 10ng/µl nin altında veya ürün hayvansal orijinli olup DNA miktarı 10ng/µl nin üzerinde ise bitki spesifik gen kontrolü yapılır. 3.2. DNA Ekstraktında İnhibitör Kontrolü Prosedür: Herhangi bir matriksten elde edilen DNA lardan (inhibisyon riski en fazla olan örnek tercih edilmelidir) en az bir tanesi inhibisyon testine tabi tutulmalıdır. Bu amaçla DNA ekstraktı çalışma konsantrasyonunaayarlanır (ör: 40 ng/µl). Bu çalışma dilüsyonundaen az 4 noktalı dilüsyon serisi (1:4, 1:16, 1:64, 1:256) oluşturulur. Her bir dilüsyondan en az 2 PCR tekrarı çalışılır. Bu dört dilüsyondan kalibrasyon eğrisi oluşturulur. 2

Hesaplamanın yapılabilmesi için sırasıyla her bir dilüsyon faktörü için ölçülen Ct değerleri yazılır. Bu değerlerin her bir çift için ortalaması alınır. Ct, ardışık dilüsyonlarınct ortalamalarının farkı ile bulunur. Dilüsyon faktörünün logaritmaları alınır ve Ctortalamları ile logaritmik değerin eğrisi çizilir. Eğrinin eğimi ve varyasyon katsayısı hesaplanır.bu çalışma tarama kiti, bitki spesifik,takson spesifik PCR yöntemlerinden herhangi biri ile yapılabilir. Bu durumda her döngüde %100 verim ile teorik olarak -3,32 eğim oluşturan amplifikasyonun oranıdır. Reaksiyonun verimi aşağıdaki şekilde hesaplanır; Verim: 10 (-1/eğim) -1 Tablo 1 Dilüsyon Faktör Ortalama Ct(Ref) 1 : 4 24 1 : 4 24 1 : 16 26 1 : 16 26 1 : 64 28 1 : 64 28 1 : 256 30 1 : 256 30 Örnek Kodu: Ortalama Ct(Hed) ΔCt Logaritma 24 26 28 30 0,00 0,00 0,00 0,00-0,6021-1,2041-1,8062-2,4082 Çalışma Dilüsyonu Ölçülen Ct Ortalama Ct Extrapolated Ct 22 22 22 0 Extrapolated Ct- Mean Ct OK 32 30 y = -3,3219x + 22 R 2 = 1 28 26 Ct 24 22-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,5 0,0 log(1/dilüsyon faktör) 20 3

Kabul kriteri: Ortalama fark ( Ct), ölçülen Ct değeri ile ekstrapolect değeri arasındaki fark <0,5 olmalıdır. Kalibrasyon eğrisinin eğimi -3,6 ile -3,1 arasında olmalıdır. R 2 değeri 0.98 olmalıdır. Eğer ekstrakte edilen DNA inhibitör içeriyorsa DNA saflaştırılmalı veya inhibisyonun ortadan kaldırıldığı noktaya kadar dilüe edilmelidir. (AB ve ISO 24276/ 2013 de PCR İnhibisyon Kontrolü zorunlu değildir. Ayrıca şuanda kullanılan kalitatif analizlerdeki kitlerde her numune için inhibisyon kontrolü yapılmaktadır). 4. Dinamik aralık, R 2 katsayısı ve Amplifikasyon Verimliliği Prosedür: Dinamik aralık, R 2 katsayısı ve amplifikasyon verimliliği standart eğri üzerinden değerlendirilen ve gerçeklik ve kesinlik parametreleri sırasında doğrulanan bir parametredir. En az iki standart eğrinin değerlerinin ortalaması alınmalıdır. Deney deseni 1: 5 kalibrasyon noktasında her bir noktada en az 2 paralel 2 kalibrasyon eğrisi oluşturulur. (Tavsiye Edilen) Deney deseni 2: 5 kalibrasyon noktasında her bir noktada 2 paralel 4 kalibrasyon eğrisi oluşturulur Deney deseni 3: 8 kalibrasyon noktasında (LOD ve LOQ yu içeren) her bir noktada 5 paralel 2 kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Kabul Kriteri: Dinamik aralık için; dinamik aralık %GDO veya kopya sayısı olarak kullanım için gerekli aralığı içermelidir. Amplifikasyon verimliliği için; kantitatif metotlar için eğrinin eğimi -3,1 Eğim -3,6 aralığında olmalıdır bu aralık %90-110 amplifikasyon verimliliğine (-3,1 %110, -3,6 %90) karşılık gelir. Verimlilik= (10 (-1/eğim) -1)x100 formülü ile uygulamanın verimi ispatlanmalıdır. R 2 katsayısı için; Ortalama değer R 2 için 0,98 olmalıdır. 5. Gerçeklik (Trueness) Prosedür: Verifikasyonun diğer adımlarında kullanılan referans materyalden başka, bir hedef DNA konsantrasyonu bilinen referans materyal ile yapılır. Eğer bu mevcut değilse spike yapılarak yapay referans materyal oluşturulabilir. Eğer gerçeklik,crm ile belirlenememişse yeterlilik testlerine katılımlada hesaplanabilir. En az iki konsantrasyondareferans materyal ile çalışılmalıdır. Bu konsantrasyonlardan biri LOQ seviyesine yakın olmalı (ör: %0,1), diğeride etiketleme seviyesinde olmalıdır. Üçüncü olarak farklı bir konsantrasyonseviyesinde çalışma önerilir ve bu seviye yüksek konsantrasyonda olmalıdır (ör; %5). Alternatif olarak yüksek seviyede CRM denspike yapılarak referans örnek oluşturulabilir. 4

Bunun için GM pozitif ve negatif örneklerdeki referans gen miktarı aynı kalibrasyoneğrisinde okunarak belirlenir ve aşağıdaki formülle dilüsyon faktörü hesaplanır. X= Dilüsyon faktörü A= GM pozitif DNA ekstraktındaki referans gen kopya sayısı B= GM negatif DNA ekstraktındaki referans gen kopya sayısı Y= Teorik dilüsyon faktörü(ör:%10gm den %0,1GM hazırlanırsa Y=100x) Test koşulları rutin analiz şartları ile aynı olmalıdır. En az 16 PCR tekrarı ile elde edilmelidir. Deney deseni 1: 2 DNA ekstraksiyonu her bir GM seviyesinde, 2 PCR paraleli her bir ekstraksiyondan 4 plakada çalışıldığında 16 test sonucu ve 8 GM değerlendirmesi yapılır. 1 GM seviyesi X 2 DNA ekstraksiyonu X 2 PCR paraleli X 4 Plaka = 16 test sonucu (Laboratuvarda çalışılacak genlerden herhangi biri için tüm personel çalışmaları yapar. Her bir kişinin verileri kabul kriterlerini karşılıyorsa diğer genlerin verifikasyonu tek bir kişi tarafından yapılabilir.) (Şekil 2) Deney deseni 2: 2 DNA ekstraksiyonu her bir GM seviyesinde, 4 PCR paraleli her bir ekstraksiyondan 2 plakada çalışıldığında 16 test sonucu ve 4 GM değerlendirmesi yapılır. 1 GM seviyesi X 2 DNA ekstraksiyonu X 4 PCR paraleli X 2 Plaka = 16 test sonucu (Şekil 3) Kabul kriteri: Gerçek referans değerden ±%25 sapma olabilir veya z skoru yeterlilik testi sonucunda 2 ile -2 aralığında olmalıdır. é E X ù ë ê Y û ú» x y + x Var(y) y 3 é Var X ù ë ê Y û ú» æ ç xö 2 æ è yø ç è Var(x) x 2 + Var(y) y 2 ö ø sd [ X /Y] = Var [ X /Y] GM = j å i=1 GM i / j j æ j ö sd GM = å (n i -1)sd 2 i / çån i - k è ø i=1 i=1 5

RSD r = sd GM GM 100 j = kullanılan GM sayısı n = her bir ekstraksiyondaki tekrar saysısı k = havuz yapılacak ayrı hesaplanan stan dartsapma sayısı 6. Kesinlik (Precision) Kesinlik çalışması tekrarlanabilirlik ile hesaplanır. 6.1Tekrarlanabilirlik Prosedür: Gerçeklik ile aynı koşullarda yapılan çalışmalardır.tekrarlanabilirlik koşulları altında PCR tekrarları ile hesaplanmaktadır. Tekrarlanabilirlik test edilen tüm GM- seviyeleri için yapılmalıdır. Test koşulları rutin analiz şartları ile aynı olmalıdır. En az 16 PCR sonucu elde edilmelidir. Kabul kriteri: Dinamik aralık içerisinde relativetekrarlanabilirlik standart sapması %25 olmalıdır. 7.Ölçüm Limitinin Hesaplanması (LOQ) Prosedür: Metot kalitatif amaçla kullanılacaksa LOQ gerekli değildir. Kopya sayısının RSD sinin %25 i sağladığı en düşük konsantrasyondur. LOQ relatif (%) veya absolut (kopya sayısı) olarak hesaplanabilir. Relatif LOQ (LOQ rel ): Pozitif kontrol materyali örneğin %0,1 konsantrasyonunda 10 PCR tekrarı olacak şekilde analiz edilir. 10 tekrar hedef GM ve 10 tekrarda referans gen analiz edilir. Gerçek LOQ rel belirlenebilmesi için düşük GM yüzdesinde dilüsyonlar yapılmalıdır. Absolut LOQ (LOQ abs ):Bilinen pozitif kontrolden (ör:%1) dilüsyon serileri oluşturulur ve 10 PCR tekrarı yapılır (ör; 80,60,40,20,10,5 ve 1 kopya). LOQ abs RSD nin<%25 olduğu son dilüsyon serisidir. 8. Tespit Limitinin Hesaplanması (LOD) Prosedür: LOD relatif (%) veya absolut (kopya sayısı) olarak hesaplanabilir. Relatif LOD (LOD rel ): Düşük GM seviyesindeki pozitif kontrol materyalin 10 PCR tekrarı ile ölçülmesi ve tüm tekrarların pozitif olduğu seviyenin bulunmasıdır. Buradan LOD rel pozitif kontrol seviyesine eşit veya daha altında anlamı çıkarılır. Absolut LOD (LOD abs ): %95 güven aralığındalod abs un belirlenebilmesi için60 PCR paraleli gereklidir. Ancak pratikte 1 kopya zorunlu olmak üzereen az 3 farklı seviyede (Beklenen LOD, Üstü ve Altı)10 paralel çalışılır (ör; 20,10,5, ve 1 kopya). Yanlış negatif oranı %5 den az olmalıdır. 6

Bu durumda tüm 10 paralelinde pozitif olması gerekir. LOD tüm 10 değerin de pozitif bulunduğu son dilüsyon olarak kabul edilir. Yanlış negatif oranı tanımlaması pozitif bilinen örneklerin metot ile negatif olarak klasifiye edilmesidir. Yanlış negatif oranı analit miktarının LOD seviyesine yaklaştığı miktarlarda görülür. Dilüsyon serileri seçilirken daha önceki bilgiler ışığında beklenen LOD abs seviyenin üzerinde ve altında konsantrasyonlar kullanılmalıdır. Pratik LOD analiz edilen örnekle bağlantılı olduğu için her bir örnek yapısı için ayrı olarak hesaplanmalıdır. 9. Yanlış Pozitif Oranı %(Kalitatif) Prosedür:Bu parametre her nekadar validasyon parametresi olsa da laboratuvarlardaki personelin konu hakkındaki yetkinliğinin arttırılması için verifikasyonda da istenmektedir. Bu bilinen negatif bir numunenin kullanılan metotla pozitif olarak tanımlanması olasılığıdır. Bu oran yüzdesel olarak ifade edilebilir. İstenilen güvenilirlik seviyesi çalışmada kullanılan örneklerin sayısına bağlıdır.yem, tohum ve (işlenmiş ve işlenmemiş) gıdalarda her bir ürün 2 ekstraktta 5 tekrarlı çalışma yapılmalıdır. (2 ekstraksiyon X 4 ürün X 5 tekrar ) Bu aşamada toplam 40 çalışma tüm personele dağıtılır. % Yanlış Pozitif Sonuç=(Yanlış tanımlanmış bilinen negatif örnek sayısı/bilinen tüm negatif örneklerin sayısı) X 100 10. Yanlış Negatif Oranı %(Kalitatif) Prosedür: Bu parametre her ne kadar validasyon parametresi olsa da laboratuvarlardaki personelin konu hakkındaki yetkinliğinin arttırılması için verifikasyonda da istenmektedir.bu bilinen pozitif bir numunenin kullanılan metotla negatif olarak tanımlanması olasılığıdır. Bu oran yüzdesel olarak ifade edilebilir. İstenilen güvenilirlik seviyesi çalışmada kullanılan örneklerin sayısına bağlıdır. Yem, tohum ve (işlenmiş ve işlenmemiş) gıdalarda her bir ürün 2 ekstraktta 5 tekrarlı çalışma yapılmalıdır.verifikasyonu yapılan gen bölgelerini içerecek şekilde seçilen seviyesi % 0,1 olan CRM veya CRM lerlespike yapılarak elde edilen pozitif numune çalışılır.(2 ekstraksiyon X 4 ürün X 5 tekrar ) Bu aşamada toplam 40 çalışma tüm personele dağıtılır. % Yanlış Negatif Sonuç=(Yanlış tanımlanmış bilinen pozitif örnek sayısı/bilinen tüm pozitif örneklerin sayısı) X 100 7

11. Sağlamlık (Robustness) Eğer verifiye edilen metot valide metodun her şeyi ile aynı ise (ekipman, referans materyal, kimyasallar dahil) sağlamlığın yapılmasına gerek yoktur. Eğer prosedür valide prosedürden sapıyorsa ( reagentler, konsantrasyon vb.) sağlamlık doğrulanmalıdır. Örneğin primerve probkonsantrasyonunda % 20 değişiklik yapıldıysa, referans materyalin iki farklı konsantrasyonunda kalitatiflerde 3 kantitatiflerde 5 tekrarlı çalışma ile sağlamlık gösterilir. Kabul kriteri: Kantitatif metotlarda: Kopya sayısı %30 dan fazla değişmiyorsa Kalitatif metotlarda: Değişkenlere rağmen hala tespit edilebiliyorsa metot sağlam demektir. Tablo 2 GDO analizleri için yapılması gereken çalışmalar Parametre Kalitatif metotlar Kantitatif metotlar 1- DNA ekstraksiyonu, saflığı ve inhibisyon testi 2- Dinamik aralık, R 2 katsayısı ve Amplifikasyon verimliliği 3- Gerçeklik (Trueness) Gerektiğinde (DNA ekstraksiyoninhibisyon kontrolünde çalışılmamışsa R 2 ve amplifikasyon verimliliği) Dinamik aralık yok (Yeterlilik testi) 4- Kesinlik (Precision) Zorunlu değil 5- Ölçümlimitinin hesaplanması (LOQ) 6- Tespit limitinin hesaplanması (LOD) 7- Yanlış Pozitif Oranı % Zorunlu değil Zorunluğu Değil Gerektiğinde (valide edilmemişse ve yeni GM) 8- Yanlış Negatif Oranı % Gerektiğinde (valide edilmemişse ve yeni GM) 9- Sağlamlık (Robustness) Gerektiğinde (valide metot değilse) Gerektiğinde (valide metot değilse) 8

12. İç ve Dış Kalite Kontrolleri İç kalite kontrolleri aşağıdaki tabloya göre her çalışmada yapılmalıdır. (ISO 24276) Tablo 3 * Pozitif ekstraksiyon kontrolü DNA izolasyon kitinin Lot numarası değiştikçe yapılır. ( 13. VerifikasyonunYenilenmesi 13.1. Tarama Analizleri 13.1.1. Personel Yetkilendirme:Yetkilendirilecek personel için madde 6 da belirtilen LOD çalışması yapılır.(çalışmalar eksraksiyondan başlamalıdır.) 13.1.2. Yeni Cihaz: Kullanılan cihazdan farklı marka veya model cihaz kullanıma alınmadan önce madde 8 da belirtilen LOD çalışması yapılır. 13.1.3 Yeni Kit Kullanımı: DNA eksraksiyon ve PCR kiti kullanıma alınmadan önce yeni kitle verifikasyon yapılır. 13.1.4. Alan değişikliği: İç kontrol parametreleri kontrol edilir. Parametrelerde bir değişiklik olursa düzeltici faaliyet başlatılır. Faaliyetin değerlendirmesine göre verifikasyon veya parametre yenilenir. 13.2. Miktar Analizi: 13.2.1 Personel Yetkilendirme:Personelin yetkilendirilmesi yapılırken mevcut yetkilendirilmiş bir personel ile bir gen karşılıklı çalışılır. Her genin verifikasyonu en az bir personel tarafından yapılmış olması gerekir. Verifikasyon tek personel tarafından yapılmış ise o personel ayrılması durumunda o genlerin verifikasyonu yenilenir.(örneğin 1. Kişi (1-2-3 nolu geni), 2.kişi (4-5-6 nolu 9

geni) her ikisi 7 nolu geni çalışmışsa 1. Kişi laboratuvardan ayrılırsa (1-2-3 nolu genlerin verifikasyonu yenilenir.) 13.2.2. Yeni Cihaz: Kullanılan cihazdan farklı marka veya model cihaz kullanıma alınmadan önce çalışılan bir genle 2 seviyede (Biri LOD seviyesinde) sağlamlık çalışılarak karşılaştırma yapılır. 13.2.3 Alan değişikliği: İç kontrol parametreleri kontrol edilir. Parametrelerde bir değişiklik olursa Düzeltici faaliyet başlatılır. Faaliyetin değerlendirmesine göre verifikasyon veya parametre yenilenir. Kaynaklar: 1-JRC Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. EUR 24790 EN-2011 2- CAC/GL 74-2010.Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection, identifcation, and quantification of specific DNA sequences and specific proteins in foods. 3- Zel J.,Milavec M., Morisset D., Plan D., Eede GV., Gruden K. How to reliably test for GMOs. Springer 2012 4- PD CEN/ TS 16707: 2014 Foodstuffs-Methods Of Analysis For The Detection Of GMO And Derived Products PCR Based Screening Strategies 10