COZART Kokain Metabolit EIA Oral Sıvı Uygulaması Cozart RapiScan Toplayıcısı M150R5 (Mayıs 2003) Amaçlanan Kullanım Oral Sıvı için Cozart Bioscience Kokain Metabolit EIA seti klinik ve adli laboratuarlarda kullanım için Cozart RapiScan Oral Sıvı toplama sistemiyle birlikte kullanılmak üzeredir. Bu toplama sistemiyle 10 ng/ml lik kesme konsantrasyonunda insan ağzı sıvısındaki Kokain ve metabolitlerinin takibi için niteliksel sonuçlar sağlar. Toplama sistemi örneğin 1:3 lük seyreltilmesini içerdiğinden, bu seyreltilmemiş insan ağzı sıvısındaki 30 ng/ml ye eşittir. Bu belgenin geri kalanı 10 ng/ml lik kesme konsantrasyonundan bahsedecektir. Bu tahlil sadece bir ön analitik test sonucu sağlar. Test sonuçlarını, özellikle de pozitif bir ön sonuç alacak şekilde, istismar eden bütün ilaçlar hakkında klinik değerlendirme ve profesyonel yargıya başvurulmalıdır. Daha kesin bir analitik sonuç elde etmek için daha özel bir kimyasal metot alternatifi kullanılmalıdır. Gaz kromatografisi/kütle spektrometrisi (GC-MS) tercih edilen kesinleştirme yöntemidir. Bu ürünün işyeri testi için gerekli kriterleri sağladığını belirlemek organizasyonların sorumluluğudur. Giriş Kokain (benzoylmetilekgonin), benzoic asit ve ekgoninin bir esteri olup, doğal kaynaklı en güçlü uyarıcıdır. Güney Amerika daki And Dağları nda yetişen koka bitkisinin (Erythroxylon coca) yapraklarından elde edilir. Kokainin ana metaboliti, benzoylekgonin, kimyasal ve enzime bağlı hidroliz sonucu metil esterden oluşur. Diğer metabolitler norkokain, ekgonin metil ester ve ekgonindir. Anhidroekgonin metil ester (AEME), kokain içilmesiyle oluşur ve metabolizmanın değil, ısıl bozunmanın (pirolizin) sonucudur. Kokaetilen de, yalnızca kokain kullandığı sırada alkol alan kişilerde, bir metabolit olarak bulunabilir. Testin Prensibi Oral Sıvı için Cozart Kokain Metabolit EIA seti insan ağzı sıvısındaki kokain ve metabolitlerinin tespiti için rekabetçi bir enzim bağışıklık sistemi tahlilidir. Mikrotitre şeritlerinin çukurları anti-benzoylekgonin antikorlarıyla kaplıdır. İlk kuluçka sırasında yaban turpu peroksidazıyla (HRP) etiketlenmiş benzoylekgonin, mikrotitre şeritlerindeki anti-benzoylekgonin antikorlarının bağlanma yerleri için hasta örneğindeki serbest kokain ve metabolitleri ile yarışır. TMB substrat çözeltisinin eklenmesinden önce çukurlar fazla enzim materyalinin kaldırılması için yıkanır. Durdurma çözeltisinin eklenmesi tepkimeyi durdurur ve soğurganlıklar spektrofotometresel olarak 450 nm'de okunur. Reaktif Maddeler M150R5-5 tabaklı set Anti-Kokain Kaplı Levha- (5 levha) Kırılmaya hazır 12 x 8 çukur şerit. Kuru formdaki polistiren levha üzerinde sabitlenmiş anti-kokain tek klon fare antikorları. Serbest BSE kaynağından elde edilen BSA 0.001% içerir. Enzim Eşleniği (55 ml) Yaban turpu peroksidazıyla <0.1% (v/v) etiketlenmiş ve protein matriste dengeleyicilerle seyreltilmiş Kokain türevi. Koruyucular içerir. Yıkama Tampon Çözeltisi (50 ml) 30 x konsantre, 0.1% (v/v) yüzey etkin madde. Kullanımdan önce her şişeyi 1500 ml ye kadar saf suyla seyreltin. Substrat Çözeltisi (55 ml) <0.05% 3,3, 5,5 - tetramethylbenzidine içeren bir şişe. Durdurma Çözeltisi (55 ml) 1 mol/l sülfürik asit içeren bir şişe. Bu çözeltiyi aşındırıcı olarak kullanın. Negatif Kalibratör (2 ml) Benzoylekgonin için negatif oral sıvı matrisi. Pozitif Kalibratörler (bütün seviyelerde 2 ml) 5 ng/ml Benzoylekgonin içeren oral sıvı matrisi. 10 ng/ml Benzoylekgonin içeren oral sıvı matrisi. 50 ng/ml Benzoylekgonin içeren oral sıvı matrisi. Reaktiflerin Saklanması ve Kararlılığı 1 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
Açılmış/ açılmamış bütün reaktifleri 2-8 C sıcaklıkta saklayınız. Reaktifler, reaktif etiketleri üzerinde belirtilen son kullanma tarihlerine kadar kararlıdır. Mikrotitre şeritlerinin fazlası hemen kurutuculu mühürlenebilir folyo keseyle yeniden paketlenmelidir. Saklama koşullarını yerine getirme konusunda başarısızlık tahlil performansını olumsuz etkileyebilir. Saklama halinde yıkama tamponunda kristaller oluşabilir. Yıkama tamponunu seyreltirken bütün bunların transfer edildiğinden emin olun. Substratın rengi berrak olmalıdır. Herhangi bir mavi renklenme reaktifin kirlendiğini ve atılması gerektiğini gösterir. Substratı ışığa maruz bırakmayınız. Herhangi bir set bileşeninde bulanıklık veya çökelme, bozulmaya işaret eder ve bileşen atılmalıdır. Toplanması ve Saklanması Lütfen Cozart RapiScan Toplayıcısıyla örnek toplama prosedürünü anlatan talimatlara (CD101) başvurunuz. hemen analiz edilemezse, 28 güne kadar 2-8 C sıcaklıkta veya daha uzun süre için -20 C sıcaklıkta saklayınız. Örneğin kirlenmesinden şüpheleniliyorsa yeni bir örnek elde ediniz. Oral sıvı örneğinin toplanmasından önce yiyecek veya içecek tükettiğinizde 10 dakika bekleyiniz. Bütün örnekleri potansiyel olarak enfekte olabileceklerini düşünerek kullanınız. Uyarılar ve Önlemler 1. Set reaktifleri civarında yiyecek ve içeceklerin bulundurulması tavsiye edilmez. 2. Bütün deri şikayetleri, kesikler ve yıpranmalar uygun şekilde korunmalıdır. 3. Kalibratörler sentetik oral sıvı kullanılarak hazırlanmıştır. Ancak, kalibratörler ve bütün oral sıvı örnekleri potansiyel olarak enfekte oldukları düşünülerek kullanılmalıdır. 4. Bazı tahlil reaktifleri bakır veya kurşun boru tesisatlarıyla reaksiyona girerek potansiyel olarak patlayıcı metal azidleri oluşturabilecek olan sodyum azid içerir. Bu reaktifleri elden çıkarırken azid birikmesini önlemek için her zaman büyük miktarda suyla yıkayınız. 5. Pipet reaktifleri ağzınıza almayınız. 6. Sodyum azidi örneklere koruyucu olarak eklemeyiniz. 7. Mikrobik kirlenmeleri önlemek için bütün kapları kullanılmadıkları zaman kapalı tutunuz. 8. Reaktifleri son kullanım tarihlerinden sonra kullanmayınız. 9. Farklı setlerden, üreticilerden veya parti numaralarından reaktifleri karıştırmayınız. 10. Reaktifleri dondurmayınız. 11. Reaktiflerin mümkün olduğu kadar doğrudan günışığından uzak tutulması tavsiye edilir. 12. Durdurma Çözeltisi aşındırıcıdır; özenle kullanınız. 13. eklenmesi 30 dakikadan fazla sürmemelidir. 2 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
Prosedür Tahlil Prosedürü kalibratörden daha düşük veya yüksek soğurganlığa sahip değillerse, tahlil sonuçları geçersizdir. Tahlil tekrar edilmelidir, kontrol sonuçları hala yukarıda belirtilen limitlerin dışındaysa in Teknik Servis i ile temasa geçiniz. Yıkama Tamponunu 1:30 oranında saf suyla seyrelterek hazırlayınız. Not: Kullanımdan önce bütün reaktifleri oda sıcaklığına (20-27 C ) getiriniz. Operatörün takdir yetkisine bağlı olarak bütün örnekler, kalibratörler ve kontroller kopyalarıyla test edilebilir. 1. Her çukura örneğin, kalibratörün veya kontrolün 25 µl sini ekleyiniz. (Yukarıdaki not 13 e bakınız.) 2. Her test çukuruna 100 µl Enzim Eşleniği ekleyiniz. 3. 30 dakikalığına kuluçkaya yatırınız. 4. Levhayı levha yıkayıcısını kullanarak 350 µl Yıkama Tampon Çözeltisiyle dört kere yıkayınız. 5. Her çukura 100 µl Substrat Çözeltisi ekleyiniz ve 30 dakikalığına kuluçkaya yatırınız. 6. Her çukura 100 µl Durdurma Çözeltisi ekleyiniz. 7. 450 nm de 15 dakikadaki soğurganlığı ölçün. Gerekli Olan ama Sağlanmayan Materyaller 1. Pozitif ve negatif kontroller. 2. 450nm filtreli otomatik mikrotitre levhası okuyucusu. 3. Tek kullanımlık uçlu hassasiyet pipetleri. Kirlenmeyi önlemek için her reaktif için temiz uçlar kullanınız. 4. Otomatik mikrotitre levhası yıkama makinası, manuel mikrotitre levhası yıkayıcı veya seyreltilmiş yıkama tamponu çözeltisini dağıtmak için 350μL sekiz kanallı pipet. 5. 30 dakikalık süreleri tutmak için süre ölçer. 6. Yıkama tamponu konsantresinin seyreltilmesi için temiz ölçme silindiri. 7. Saf veya iyonsuzlaştırılmış su. Kalite Kontrol Her tahlilde kalibratörler dahil edilmelidir. Durdurulmuş tahlil 15 dakika içinde okunmalıdır. Kontroller setle birlikte sağlanmamıştır ama kullanıcılar dış kalite kontrollerin uygulanmasıyla ilgili uygun kurallara uymalıdırlar. Negatif kontrol, 10ng/mL kalibratörden daha yüksek bir soğurganlığa sahip olmalıdır. Pozitif kontrol, 10ng/mL kalibratörden daha düşük bir soğurganlığa sahip olmalıdır. Pozitif veya negatif kontroller sırasıyla 10ng/mL 3 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
Sonuçların Değerlendirilmesi Pozitif Sonuç 10ng/mL Kesme Kalibratörü nden küçük veya ona eşit soğurganlığa sahip bütün örnekler pozitif olarak değerlendirilir. Negatif Sonuç 10ng/mL Kesme Kalibratörü nden büyük soğurganlığa sahip bütün örnekler negatif olarak değerlendirilir. Not: Reaktiflerin saflığının bozulması, gerekli yeterliklere sahip olmayan enstrümanların kullanılması veya etiketteki talimatları takip etme konusundaki diğer başarısızlıklar, performans karakteristiklerini ve etikette belirtilen veya ima edilen iddialarını etkileyebilir. Yetersizlikler Bu tahlilden elde edilen pozitif sonuç GC/MS gibi başka bir genel olarak kabul gören bağışıklık harici metotla kesinleştirilmelidir. Test yalnızca insan oral sıvısıyla kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Burada listelenmemiş başka maddelerin ve/ya faktörlerin testle etkileşme ve teknik veya prosedürel hatalar gibi yanlış sonuçlar ortaya çıkarma ihtimali vardır. Cihazın analitik performansında bozulma veya setin taşıma sırasında zarar görmesi durumunda lütfen Cozart Bioscience Ltd. ın Teknik Servis i ile temasa geçiniz. Kesinlik Dört kalibratör (0, 5, 10 ve 50ng/mL) ve üç örnek (0, 5 ve 15ng/mL), yirmi gün boyunca her gün özdeş ve çiftli olarak test edilmiştir. Soğurganlık ölçümleri için test içi, gün içi, testler arası, günler arası ve toplam kesinlik aşağıda gösterilmiştir. Tahliller Arası Kesinlik Tahliller Arası Kal 1 2.229 0.14 6.4 Kal 2 1.438 0.10 7.1 Kal 3 1.096 0.09 7.9 Kal 4 0.412 0.03 8.3 1 2.194 0.14 6.3 2 1.588 0.11 7.0 3 1.007 0.08 7.5 Günler Arası Kal 1 2.229 0.13 5.7 Kal 2 1.438 0.09 6.5 Kal 3 1.096 0.07 6.6 Kal 4 0.412 0.03 6.6 1 2.194 0.13 5.8 2 1.588 0.11 6.7 3 1.007 0.07 7.1 Tahlil İçi Kesinlik Tahlil İçi Kal 1 2.261 0.04 1.9 Kal 2 1.459 0.03 2.1 Kal 3 1.113 0.05 4.2 Kal 4 0.418 0.02 4.0 Alçak 2.227 0.06 2.6 Orta 1.612 0.04 2.8 Yüksek 1.019 0.03 2.6 Gün İçi Kal 1 2.291 0.09 3.8 Kal 2 1.476 0.06 4.1 Kal 3 1.127 0.07 6.4 Kal 4 0.424 0.03 6.9 Alçak 2.254 0.09 3.8 Orta 1.634 0.06 3.6 Yüksek 1.034 0.04 3.7 Toplam Kesinlik Toplam Kesinlik Kal 1 2.229 0.16 7.1 Kal 2 1.438 0.11 7.9 Kal 3 1.096 0.11 9.6 Kal 4 0.412 0.04 10.7 Alçak 2.194 0.16 7.1 Orta 1.588 0.12 7.6 Yüksek 1.007 0.08 8.1 Özgüllük Yirmi dokuz potansiyel olarak engelleyici ilgisiz madde Cozart Kokain Oral Sıvı Seti nde çapraz tepkirlik için teste edilmiş ve hiçbirinin çapraz tepkimeye girmediği gözlenmiştir. Dört ilgili bileşik test edilmiştir ve üçünün bir derece çapraz tepkirlik gösterdiği gözlenmiştir. Tahlilden önce maddeler negatif oral sıvı örneği içinde hazırlanmıştır. 4 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
Her bir örneğin konsantrasyonunu tahmin etmek için dört kalibratör kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi çizilmiştir. Bileşik ng/ml Test edilen Görünür Kokain ng/ml % Çapraz Tepkirlik Cocaine 5 7 146 10 13 126 100 68 68 Cocaethylene 1 5 519 5 15 308 10 29 293 Lidocaine 0 2 0.002 Ecognine Methyl Ester 10,000 5 0.048 0 42 0.042 Amphetamine Morphine Temazepam Methamphetamine Chloroquine Diazepam THC COOH Fenfluramine Amitriptyline HCl Dextromethorphan Ranitidine Ascorbic acid DL-Propranolol (+) Ephedrine (-) Ephedrine (+) Pseudo Ephedrine (-) Pseudo Ephedrine Caffeine Acetylsalicylic acid (Aspirin) Acetaminophen (Paracetamol) 0 5 0.005 5 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
Quinalbarbitone Methylphenidate Buprenorphine 10,00 Phenylpropanolami ne Phenobarbital Oxycodone Nicotine LSD Cotinine Analitik Hassaslık Cozart EIA Kokain Metabolit Oral Sıvı Seti nin analitik hassaslığı, sıfır kalibratörü tek bir tahlilde yirmi kere test ederek hesaplanmıştır. Dört kalibratör kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi çizilmiştir. Ortalama soğurganlık eksi iki standart sapma hesaplanmıştır. Hassaslık, kalibrasyon eğrisinden bu soğurganlık değeri okunarak hesaplanmıştır. Bu tahlilin hassaslığı 1.8ng/mL dir. Doğruluk ve Korelasyon 177 oral sıvı örneği, Cozart EIA Kokain Oral Sıvı Seti paket ilavesine göre kullanılarak kokain ve metabolitleri için test edilmiştir. Bunlardan 77 tanesi (49 tanesi uyuşturucu kullanmayan gönüllülerden ve 28 tanesi uyuşturucu kullandığı bilinen kişilerden olmak üzere) kokain ve metabolitleri için negatif sonuç vermiştir. GC/MS ile bunlardan 71 inin negatif olduğu onaylanmıştır. 6 eş sonuç vermeyen örnekten 5 inin kesme (31ng/mL ve 36ng/mL arasında) civarında olduğu ve 6. nın da 54ng/mL den biraz fazla olduğu görülmüştür. 177 örnekten uyuşturucu bağımlılığı bölümlerine devam eden uyuşturucu kullanıcılarına ait olan 100 tanesi pozitif sonuç vermiştir. Bunların pozitif olduğu GC/MS ile onaylanmıştır. Test edilen 171 örnekten 15 i kesme konsantrasyonunun - %50 si ve 4%50 si arasındadır. Cozart EIA Kokain Oral Sıvı Seti ve GC/MS sonuçları arasında toplamda %96 uyum vardır. Yeni Cihaz GC/M S Negs Kesme ye Yakın GC/MS Neg* Kesme ye Yakın GC/MS Poz** GC/ MS Poz* ** GC/MS ile Yüzde Uyuşma Poz 100 0 0 4 100 100 Ne 77 71 6 5 6 92 g * -%50 Kesme ve Kesme Arasında ** +%50 Kesme ve Kesme Arasında *** Pozitiflerin toplam sayısı (kesmeye yakın örnekleri de içerir). Bibliografi 1. Urine Testing for Drug of Abuse. National Institute on Drug Abuse (NIDA) Research Monograph 73, 1986. 2. Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs. National Institute on Drug Abuse. Federal Register Vol. 53, No 69 pp 11970 (1988). 3. D.Simpson et al. Screening for drugs of abuse (II): cannabinoids, lysergic acid diethylamide, buprenorphine, Cocaine, barbiturates, benzodiazepines and other drugs. Ann Clin Biochem (1997); 34 : 460-510. Daha fazla bilgi için: COZART Bioscience Ltd 45 Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, 6 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)
OX14 4RU, UK. Telephone: +44 (0) 1235 861483 Fax: +44 (0) 1235 835607 www.cozart.co.uk 7 Cocaine Metabolite (Oral Fluid)