Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Metin OLGUN. Enstitü Müdürü

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ANKARA PİYASASINDA SATIŞA SUNULAN KAŞAR PEYNİRLERİNDE OLASI AFLATOKSİN M 1 VARLIĞININ HPLC METODU İLE BELİRLENMESİ Tuba ÇETİN SÜT TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI ANKARA 2004 Her hakkı saklıdır

Yrd.Doç.Dr. Ayşe GÜRSOY danışmanlığında, Tuba ÇETİN tarafından hazırlanan bu çalışma 26/ 01/ 2004 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Süt Teknolojisi Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan: Prof. Dr. Atilla YETİŞMEYEN Prof. Dr. Sadi AKGÜN Yrd. Doç. Dr. Ayşe GÜRSOY Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Metin OLGUN Enstitü Müdürü

ÖZET Yüksek Lisans Tezi ANKARA PİYASASINDA SATIŞA SUNULAN KAŞAR PEYNİRLERİNDE OLASI AFLATOKSİN M 1 VARLIĞININ HPLC METODU İLE BELİRLENMESİ Tuba ÇETİN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Süt Teknolojisi Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Ayşe GÜRSOY Bu çalışmada Ankara piyasasından temin edilen toplam 25 adet Kaşar peyniri örneği aflatoksin M 1 yönünden analiz edilmiştir. Aflatoksin M 1 varlığının belirlenmesinde immino affinite kolon ile saflaştırma ve HPLC yöntemi kullanılmıştır. Analiz edilen örneklerin 14 ünde (%56) 0,010-0,400 µg/kg arasında değişen miktarlarda aflatoksin M 1 belirlenmiştir. Aflatoksin M 1 yönünden pozitif örneklerin yalnızca birinde belirlenen miktarın (0,400 µg/kg) Türkiye de peynirler için kabul edilen maksimum tolerans limiti olan 0,250 µg/kg ı aştığı saptanmıştır. 2004, 34 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Kaşar peyniri, aflatoksin M 1, HPLC i

ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF POSSIBLE AFLATOXIN M 1 PRESENCE BY HPLC METHOD IN KASAR CHEESES MARKETTED IN ANKARA Tuba ÇETİN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Milk Technology Supervisor: Asst. Prof. Dr. Ayşe GÜRSOY In this study, total 25 Kaşar cheese samples obtained from marketed in Ankara was examinated for Aflatoxin M 1. Immino affinity column clean-up and HPLC method were used to investigate of aflatoxin M 1 incidence. Aflatoxin M 1 was determined in 14 (%56) of examined samples at the level of varied from 0,010 to 0,400 µg/kg. The only one of the positive was determined that exceed maximum tolerance limit (0,25 µg/kg) accepted by Turkey. 2004, 34 pages Key Words: Kaşar cheese, aflatoxsin M 1, HPLC ii

TEŞEKKÜR Tez çalışmam süresince önerileri ile beni yönlendiren danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Ayşe GÜRSOY a,yardım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Araş. Gör. Orgun DEVECİ ye ve Araş. Gör. Filiz YILDIZ a, bana her zaman destek olan aileme sonsuz teşekkürler. Tuba ÇETİN Ankara, Ocak 2004 iii

İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT...... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ....v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ...1 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ...4 2.1. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Varlığı...4 2.2. Sütü İşleme Yöntemlerinin Aflatoksin M 1 Stabilitesine Etkisi...6 2.3. Peynirde Aflatoksin M 1 Varlığı ve Stabilitesi...10 2.4. Diğer Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Varlığı ve Stabilitesi...16 2.5. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Analizinde Kullanılan Yöntemler...18 2.6. Süt ve Süt Ürünlerinde Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin M 1 Düzeyleri...19 3. MATERYAL ve METOT...21 3.1. Materyal...21 3.2. Metot...21 3.2.1. Örneklerin hazırlanması......21 3.2.2. HPLC analizi ve hesaplama...22 3.2.3. Kaşar peyniri örnekleri için geri kazanım oranının hesaplanması.22 3.2.4. İstatistiksel değerlendirme...23 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA...24 5. SONUÇ...28 KAYNAKLAR...29 ÖZGEÇMİŞ...34 iv

SİMGELER DİZİNİ g Gram kg Kilogram mg Miligram ml Mililitre ng Nanogram µg Mikrogram ppb Milyarda bir kısım AFB 1 Aflatoksin B 1 AFM 1 Aflatoksin M 1 ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay FDA Food and Drug Administration FAO Food and Agriculture Organization HPLC High Performance Liquid Chromatography IAK Immino Affinite Kolon IARC International Agency for Research on Cancer TLC Thin Layer Chromatography WHO World Health Organization v

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1. AFM 1 içeriği negatif olan bir örneğe ait kromatogram...24 Şekil 4.2. AFM 1 içeriği en yüksek olan örneğe ait kromatogram...25 vi

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. AFB 1 'in sütte AFM 1 'e dönüşüm oranları...4 Çizelge 2.2. Pastörizasyon ve sterilizasyon işlemlerinin AFM 1 içeriğine etkisi...8 Çizelge 2.3. Farklı peynir çeşitlerinin yapımı sırasında AFM 1 'in dağılımı...15 Çizelge 2.4. Türkiye için süt ve süt ürünlerinde AFM 1 limitleri...19 Çizelge 2.5. Bazı ülkeler için süt ve süt ürünlerinde AFM 1 limitleri...20 Çizelge 3.1. Kromatografinin çalışma şartlar...22 Çizelge 3.2. Kaşar peyniri örnekleri için geri kazanım oranları..23 Çizelge 4.1. İncelenen Kaşar peyniri örneklerine ait AFM 1 düzeyleri...26 vii

1. GİRİŞ Gıdalarda uygun koşullarda bazı küflerin mikotoksinler olarak adlandırılan toksik metabolitler oluşturduğu bilinmektedir (Meerarani et al. 1997, Lin et al. 1998, Bakırcı 2001). Mikotoksinler çeşitli küf türleri tarafından sentezlenen, alındıkları zaman insan ve hayvanlarda toksikasyonlara (mikotoksikosiz) neden olan metabolitler olarak tanımlanmaktadırlar (Van Egmond ve Paulsch 1986, Arda vd 1997). Küf gelişen tüm besin veya besin hammaddelerinde oluşan küfün mikotoksin oluşturma yeteneği varsa ve koşullar da mikotoksin oluşumu için uygunsa yaygın bir bulaşmanın gerçekleşebileceği bildirilmektedir (Şahin ve Korukluoğlu 2000). Süt ürünleri, ürün üzerinde küflerin gelişmesi ile doğrudan ya da küf içeren yemin süt hayvanları tarafından tüketilmesi sonucunda ürüne işlenecek sütte mikotoksin oluşması ile dolaylı olarak mikotoksinlerle kontamine olabilirler. Süt ürünleri arasında özellikle peynirler küf gelişmesi için uygun substrattırlar (Van Egmond ve Paulsch 1986). Bilinen birçok farklı mikotoksinin laboratuvar hayvanları üzerinde toksik, mutajenik, kanserojenik, teratojenik vb. birçok biyolojik etkileri saptanmıştır (Van Egmond ve Paulsch 1986). Mikotoksinler arasında en toksik ve bilinen en güçlü kanserojen etkiye sahip olanı aflatoksinlerdir (Pittet 1998). Gıda ve yemlerin aflatoksin ile bulaşması problemi son 30 yıldır üzerinde durulan ve günümüzde de önemini koruyan bir sorundur (Rustom 1997). Aflatoksinler bazı Aspergillus türü küfler tarafından üretilen yüksek derecede toksik sekonder metabolitlerdir. Aflatoksin üreten başlıca türler Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ve Aspergillus nomius dur (Applebaum et al. 1982, Galvano et al. 1996, Meerarani et al. 1997, Rustom 1997, Kim et al. 2000). Aflatoksinlerin ilk bulunuşları oldukça eskiye dayanmaktadır. 1960 yılında İngiltere de 100.000 den fazla hindinin yeme katılan küflü yer fıstığı küspesi nedeniyle ölmesi sonucu etken olan küfün Aspergillus flavus olduğu tespit edilmiş ve bu küf türünün salgıladığı toksin Aflatoksin olarak adlandırılmıştır. Aflatoksin terimi Aspergillus un 1

ilk harfi A, flavus un ilk üç harfi fla ve zehir anlamına gelen toksin kelimesinin bir araya getirilmesiyle türetilmiştir (Rustom 1997). Aflatoksin üreten küfler özellikle su aktivitesi ve sıcaklık koşullarına bağlı olarak hemen her türlü tarımsal üründe ve gıda maddesinde gelişebilmektedirler. Bu nedenle de özellikle tropik ve subtropik ülkeler başta olmak üzere dünyanın bir çok ülkesinde üretilen gıda maddelerinde aflatoksin sorunu yaşanmaktadır (Bullerman 1984). Yapılan çalışmalar sonucu aflatoksinin birbirine yakın 17 türevi tespit edilmiştir. Bunlar arasında yer alan B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ve M 2 önemli aflatoksin türevleri olarak bilinmektedirler (Quinn et al. 1994, Rustom 1997, Pittet 1998). Aflatoksinlere verilen harfler ultra viyole (UV) ışını altında verdikleri floresan renkleri belirtmektedir. Mavi (blue) floresan verenler B, yeşil (green) floresan verenler G harfi ile gösterilmektedirler. M 1 ve M 2 aflatoksinin süte geçen türevleri olup bu nedenle de "Milk Toxin" anlamına gelen M harfi ile ifade edilmektedirler. Toksinlere verilen rakamlar ise toksisite derecesini göstermektedir. "1" rakamı ile simgelenenler yüksek toksisiteyi, "2" rakamı ile simgelenenler ise düşük toksisiteyi ifade etmektedirler (Pittet 1998, Akçelik vd 2000). Sütte görülen başlıca aflatoksin türevi aflatoksin B 1 in hidroksi metaboliti olarak bilinen aflatoksin M 1 dir (Applebaum et al. 1982, Van Egmond et al. 1997). Aflatoksin M 1, aflatoksin B 1 içeren yemleri tüketen süt hayvanlarının sütlerine salgıladıkları toksik ve kanserojenik bir mikotoksindir (Brackett ve Marth 1982, Karaıoannoğlou et al. 1989, Mayes ve MacDonald 1995, Lopez-Diaz et al. 1996, Meeraranı et al. 1997). Aflatoksin M 1 Süt Toksini olarak da bilinmektedir (Wiseman ve Marth 1983a, Galvano et al. 1996). Kanserojen, teratojen ve mutajen aktivite gösteren aflatoksinler arasında en toksik olanı aflatoksin B 1 dir. Süt ve süt ürünlerinde sıklıkla rastlanan aflatoksin M 1 in toksitite düzeyinin aflatoksin B 1 ile aynı olduğu buna karşın kanserojenite düzeyinin aflatoksin B 1 den daha düşük olduğu bildirilmektedir (Stoloff 1980, Barbieri et al. 1994, Meerarani et al. 1997, Martins ve Martins 2000). 2

Uluslararası Kanser Araştırma Enstitüsü (IARC) tarafından aflatoksin B 1 birinci dereceden, aflatoksin M 1 ise ikinci dereceden kanserojen bir bileşik olarak ilan edilmiştir (Bakırcı 2001). Süt ve süt ürünleri aflatoksin kalıntılarını içerme bakımından en riskli ürünlerden birisidir. Bütün bulgular göstermektedir ki; süt ve süt ürünlerinde aflatoksin varlığı halk sağlığını tehdit eden potansiyel bir tehlikedir (Galvano et al. 1996, Kim et al. 2000, Bakırcı 2001). Söz konusu tehlikeyi azaltmak için bir çok gelişmiş ülke süt ve süt ürünlerinde bulunabilecek aflatoksin miktarı ile ilgili olarak maksimum sınırlar belirlemişlerdir. Günümüzde bu yasal düzenleme sınırları gelişme derecesi ve ekonomik duruma bağlı olarak ülkeden ülkeye değişiklik göstermektedir (Galvano et al. 1996, Van Egmond et al. 1997). Bu çalışma Ankara piyasasında satışa sunulan Kaşar peynirlerinde olası aflatoksin M 1 varlığının ve seviyelerinin saptanması, elde edilen sonuçların ülkemizde yürürlükte bulunan maksimum tolerans limitleri ile karşılaştırılması amacıyla yapılmıştır. Çalışma önemli bir peynir çeşidinin aflatoksin M 1 yönünden mevcut durumunun ortaya konması ve buna bağlı olarak tüketici sağlığının korunması açısından önem taşımaktadır. 3

2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Varlığı Süt ve süt ürünleri aflatoksin kalıntılarını içerme bakımından en riskli ürünlerden birisidir. Aflatoksin M 1 süt ve süt ürünlerinde en fazla rastlanan toksin olup Süt Toksini olarak da bilinmektedir (Galvano et al. 1996, Kim et al. 2000). Sütte aflatoksin M 1 varlığı süt hayvanlarının aflatoksin B 1 ile kontamine olmuş yemlerle toksini almasından kaynaklanmaktadır. Aflatoksin B 1, uygun sıcaklık ve su aktivitesinde bazı aspergillus türü küfler tarafından yem materyalinde oluşturulmaktadır. Aflatoksin M 1 ise; hayvan metabolizmasının bir sonucu olarak karaciğerde aflatoksin B 1 in hidrolizasyonu yoluyla oluşmaktadır (Applebaum et al. 1982, Hassanin 1994, Van Egmond 1997). Alınan toksin miktarının % 90 ının 24 saat içinde gaita ve idrarla dışarı atıldığı, % 5-6 lık bir bölümünün de karaciğerde tutulduğu belirlenmiştir. Süte geçen toksinin miktarının ise; hayvan ırkına, laktasyon süresine ve süt üretim miktarına göre değişmekle birlikte alınan miktarın yaklaşık % 1-3 ü oranında olduğu bildirilmektedir (Applebaum et al. 1982, Van Egmond 1997). Çizelge 2.1 de çeşitli araştırmacılar tarafından yapılan çalışmalarda yemlerle alınan aflatoksin B 1 in aflatoksin M 1 olarak süte geçiş oranı ile ilgili elde edilen farklı veriler gösterilmektedir. Çizelge 2.1. AFB 1 ' in sütte AFM 1 ' e dönüşüm oranları Dönüşüm Oranı ( % ) %1 3 < %1 %17 30 %35 Kaynak: In: Applebaum et al. 1982 Kaynak Masri et al. (1969) Linda et al. (1965) Polen et al. (1974) Mebney et al. (1967) 4

Saf olarak aflatoksin B 1 in oral yolla alımından sonra 5 saat içerisinde ya da aflatoksin içeren yemin tüketilmesinden sonra iki gün içerisinde hayvanların sütlerinde afllatoksin M 1 görüldüğü bildirilmiştir. Buna karşın, kontamine yemin kesilmesinden sonra iki dört gün içerisinde sütte toksin belirlenemediği gözlenmiştir (Applebaum et al. 1982, Karaıoannoğlou et al 1989, Van Egmond 1997). Bir çok araştırmacı hayvanlar tarafından yemlerle alınan aflatoksin B 1 ve süte geçen aflatoksin M 1 arasında doğrusal bir ilişki olduğunu bildirmişlerdir. Aflatoksin B 1 hayvan tarafından yem ile küçük miktarlarda alınsa bile bu düzey süte geçen aflatoksin için önemli görülmektedir (Applebaum et al. 1982, Meerarani et al. 1997, Bakırcı 2001). Çünkü; aflatoksinler çok düşük dozlarda bile alındıklarında kanserojenik, teratojenik ve hepatotoksik etkiler gösterebilen mikotoksinlerdir (Mayes ve MacDonald 1995, Elden ve Tağı 2001). Polen vd. konsantre yemde aflatoksin B 1 içeriği 46 µg/kg ı aştığında sütte aflatoksin M 1 gözlendiğini belirlemişlerdir ( Applebaum et al. 1982). Başka bir çalışmada yemde bulunan 300 ng/g düzeyinde aflatoksin B 1 in sütte 1 ng/ml aflatoksin M 1 miktarı ile sonuçlandığı bulunmuştur (Stoloff 1980). Bir çok araştırmacı, süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 varlığında mevsimsel bir çeşitlilik olduğunu bildirmektedir. Bazı araştırmacılar kış aylarında hayvanların daha fazla karışık yemlerden, yaz ve bahar aylarında ise daha ziyade doğadan istifade etmeleri nedeniyle soğuk mevsimlerde sıcak mevsimlere göre daha yüksek oranda aflatoksin M 1 e rastlandığını ifade etmektedirler (Galvano et al. 1996, Bakırcı 2001). 1995 yılında İtalya da yapılan bir araştırmada; Kasım-Nisan periyodunda toplanan örneklerdeki kontaminasyon düzeyinin Mayıs-Ekim periyodunda toplanan örneklerdekinin dört katı olduğu bildirilmiştir. En sıcak ay olan Ağustos ta ise toplanan tüm örneklerde aflatoksin M 1 içeriğinin negatif olduğu saptanmıştır. Araştırma sonuçlarına göre yaz sonu dönemi aflatoksin M 1 için en düşük kontaminasyon periyodu olarak belirlenmiştir (Galvano et al. 1998). 5

Ülkemizde Bakırcı (2001) tarafından yapılan çalışmada Mart ve Nisan aylarına ait örneklerde belirlenen aflatoksin M 1 konsantrasyonları yüksek bulunmuştur. En düşük aflatoksin M 1 konsantrasyonu 1 Haziranda 0,0302 ppb ve en yüksek değer ise 15 Nisanda 0,0636 ppb olarak tespit edilmiştir. Araştırmada Haziran ayına ait olan örneklerin % 40 ında aflatoksin M 1 belirlenememiştir. Bir çok ülkede süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 varlığını sınırlandırmak için yemlerde bulunabilecek aflatoksin düzeylerine ilişkin yönetmelikler düzenlenmiştir. Özellikle kış aylarında süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 varlığını kontrol altına almak için en iyi yol yemde bulunabilecek aflatoksin B 1 in miktarını sınırlandırmaktır. Avrupa Birliği hayvan yemlerinde bulunabilecek aflatoksin B 1 için kabul edilebilir en yüksek limiti 10 µg/kg olarak belirlemiştir (Van Egmond ve Paulsch 1986, Van Egmond et al. 1997, Lopez et al. 2001). 2.2. Sütü İşleme Yöntemlerinin Aflatoksin M 1 Stabilitesine Etkisi Süt işlenmediği takdirde kısa süre içinde bozulan bir üründür. Gerek kalite muhafazasını artırmak gerekse tüketici taleplerini karşılamak amacıyla çok farklı şekillerde işlenerek tüketime sunulmaktadır. Sütün aflatoksin M 1 içeriğine işleme yöntemlerinin ve depolamanın farklı etkileri bulunduğu bildirilmektedir (Galvano et al. 1996). Aflatoksin M 1 in sütteki dağılımı homojen değildir. Kimyasal olarak yarı polar, suda çözünen bir bileşik olan aflatoksin M 1 in sütün protein fraksiyonu ile ilişkili olduğu belirtilmektedir. Aflatoksin M 1 in hidrofobik kısımlara sahip olan kazein moleküllerine yüksek affinite, serum proteinlerine ise daha düşük affinite gösterdiği düşünülmektedir. (Applebaum et al. 1982, Brackett ve Marth 1982, Bakırcı 2001). Krema separasyonunun aflatoksin M 1 in sütteki dağılımını etkilediği belirlenmiştir. Toksinin yaklaşık %80 inin sütün yağsız fraksiyonunda bulunduğu; bunun da yaklaşık %30 unun kazeinle ilişkili olduğu düşünülmektedir (Galvano et al. 1996) 6

Bir araştırmada aflatoksin M 1 in krema separasyonu sonrasında toksinle doğal yolla kontamine olmuş süt kullanıldığı zaman %84 oranında, yapay yolla kontamine olmuş süt kullanıldığı zaman ise %75 oranında yağsız sütte kaldığı belirlenmiştir (Applebaum et al. 1982). Süte uygulanan pastörizasyon ve sterilizasyon işlemlerinin sütte mevcut olan aflatoksin M 1 içeriğine ne şekilde etkili olduğu konusunda yapılmış çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Yapılan çalışmalar incelendiğinde birbirinden farklı sonuçlar elde edildiği görülmektedir. Farklı araştırmacılar tarafından yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçlar Çizelge 2.2 de gösterilmektedir. Wiseman ve Marth ısıl işlemin süt proteinleri ve tuzlarının çözünebilirliği üzerine olan etkisi nedeniyle aflatoksin M 1 içeriğini de değiştirebileceğini belirtirken, Allcrof ve Carnaghan adlı araştırmacılar ısıl işlemin aflatoksin M 1 içeriğine önemli bir etkisinin olmadığını vurgulamıştır (Wiseman ve Marth 1983a). Bakırcı (2001) yaptığı çalışmada pastörizasyonun aflatoksin M 1 miktarında %7,62 oranında azalmaya neden olduğunu tespit etmiştir. 7

Çizelge 2.2. Pastörizasyon ve sterilizasyon işlemlerinin AFM 1 içeriğine etkisi Sıcaklık-Süre Kombinasyonu Kontaminasyon Şekli * Azalma Oranı(%) Kaynak 62 C, 30 dakika D 32 Purchase et al.,1972 62 C, 30 dakika Y 0 Stoloff et al., 1975 62 C, 30 dakika Y 35 Kiermeier & Mashaley, 1977 71 C, 40 saniye Y 29 Kiermeier & Mashaley,1977 71 C, 40 dakika D 6-13 Kiermeier & Mashaley,1977 72 C, 45 saniye D 45 Purchase et al.,1972 74 C, 30 dakika Y 40 Kiermeier & Mashaley,1977 75 C, 40 saniye D 12 Kiermeier & Mashaley, 1977 77 C, 16 saniye D 0 Stoloff et al., 1975 80 C, 45 saniye D 64 Purchase et al.,1972 120 C, 15 dakika D 24 Kiermeier & Mashaley, 1977 120 C, 15 dakika Y 24 Kiermeier & Mashaley, 1977 Pastörizasyon D 24 Glesa & Buzzetti,1994 Kaynak: Rustom 1997. * D:Doğal, Y:Yapay Sütün konsantre edilmesinin aflatoksin M 1 içeriğini azaltıp azaltmadığı konusunda yürütülen araştırmalarda farklı sonuçlar elde edilmiştir. Bazı araştırmacılar koyulaştırmanın aflatoksin M 1 içeriğine herhangi bir etkisinin olmadığını belirtirken, bazıları da %60 70 arasında değişen oranlarda bir azalmadan söz etmektedirler (Galvano et al. 1996). Purchase vd çalışmalarında doğal olarak kontamine olmuş sütü 40 C de ve düşük basınçta %50 oranında koyulaştırmışlar ve sütün aflatoksin M 1 içeriğinde %64 oranında azalma olduğunu belirlemişlerdir (Applebaum et al.1982). 8

Kurutma işleminin ve kullanılan tekniklerin hammadde sütte varolan aflatoksin M 1 stabilitesine ne yönde etki ettiğine ilişkin sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmaların birinde Allcroft ve Carnaghan çalışmalarında doğal olarak kontamine olmuş sütü silindir yöntemiyle kurutmuşlar ve işlem sonucunda aflatoksin M 1 içeriğinde bir değişme olmadığını belirlemişlerdir (Wiseman ve Marth 1983a). Bir başka çalışmada ise Kiermeier ve Mashaley dondurarak kurutma tekniği uyguladıkları sütte aflatoksin M 1 içeriğinde %12 oranında azalma olduğunu belirlemişlerdir. Kurutulmuş sütte var olduğu bildirilen azalma sütte mevcut olan aflatoksin M 1 in geri alımındaki kayıpla açıklanabilmektedir (Wiseman ve Marth 1983a). McKinney vd doğal olarak kontamine olmuş sütü dondurarak -18 C de 120 gün depolamışlar ve aflatoksin M 1 stabilitesini incelemişlerdir. Araştırmacılar stabilitedeki azalmayı 30 günlük depolamada %14, 120 günlük depolamada ise %86 olarak belirlemişledir. Aynı araştırmacılar 0 C de 4 gün depolama sonrasında %40, 6 gün depolama sonrasında ise yaklaşık %80 oranında başlangıçta belirlenen aflatoksin M 1 miktarında azalma olduğunu tespit etmişlerdir. Stoloff vd. yapay olarak aflatoksin M 1 ile kontamine olmuş sütün toksin içeriğinin 4 C de 17 günlük depolama süresince stabil olduğunu belirlemişlerdir. Kiermeier ve Mashaley çalışmalarında, doğal ve yapay yolla kontamine olmuş çiğ sütlerin aflatoksin M 1 içeriklerinde 5 C de 1-3 günlük depolama sonrasında %11-25 oranında azalma olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca azalmanın doğal yolla kontamine olan örneklerde yapay yolla kontamine olan örneklerden daha hızlı gerçekleştiğini açıklamışlardır (Applebaum et al. 1982). Choudhary vd (1998) çalışmalarında 5±2 C de depolamanın aflatoksin M 1 içeriğinde kademeli olarak azalmaya neden olduğunu belirlemişlerdir. Araştırmacılar 2,79 mg/l olan başlangıç toksin içeriğinin 120 saat depolamadan sonra %45,87 oranında azalarak 1,5 mg/l ye, 168 saat depolamadan sonra ise %48,38 oranında azalarak 1,44 mg/l ye düştüğünü bulmuşlardır. 9

Sütü işleme yöntemlerinin aflatoksin M 1 in stabilitesine ne şekilde etkili olduğu hakkında cevaplanamayan bir çok soru vardır. Literatürlerde yer alan çalışmaların bazıları doğal olarak kontamine olmuş sütlerle bazıları ise yapay olarak kontamine olmuş sütlerle yapılmıştır. Aflatoksin M 1 in yapay ve doğal kontaminasyon durumlarında aynı şekilde tepki göstermediği; yapay yolla kontamine olmuş aflatoksinin elemine edilmesinin doğal olandan daha kolay olduğu bildirilmektedir (Applebaum et al. 1982, Rustom 1997). Aflatoksin M 1 in belirlenmesinde farklı ekstraksiyon metotları kullanıldığından benzer çalışmalarda farklı sonuçlar elde edilmiştir. Ekstraksiyon metotlarının mevcut toksinin geri alımında aynı derecede etkili olmadığı bildirilmektedir (Applebaum et al. 1982). 2.3. Peynirde Aflatoksin M 1 Varlığı ve Stabilitesi Uygun sıcaklık ve nem koşullarında peynirlerin küf gelişimi için çok iyi substrat oldukları bildirilmektedir (Bullerman 1981, Lopez-Diaz et al. 1996, Barrıos et al. 1997). Peynirlerde aflatoksin M 1 varlığı başlıca üç muhtemel sebebe bağlı olabilmektedir : 1- Süt hayvanları tarafından aflatoksin B 1 ile kontamine olmuş yemlerin tüketilmesinin bir sonucu olarak peynire işlenecek sütte aflatoksin M 1 in bulunması, 2- Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ve Aspergillus nomius gibi peynirlerde gelişebilen küfler tarafından üründe aflatoksin (B 1, B 2, G 1 ve G 2 ) sentezlenmesi, 3.Peynire işlenecek sütün zenginleştirilmesinde aflatoksin M 1 içeren süttozunun kullanımı (Trucksees ve Page 1986, Galvano et al.1996, Lopez et al. 2001). Demirer (1973) çalışmasında 102 adet peynir örneğinin de yer aldığı toplam 334 adet örneği ince tabaka kromatografisi tekniği (TLC) ni kullanarak analiz etmiştir. Analizler sonucunda örneklerin hiçbirisinin teşhis edilebilir miktarda aflatoksin M 1 içermediği saptanmıştır. 10

Aynı araştırmacı diğer bir çalışmasında 91 adet peynir örneğinden izole ettiği toplam 148 adet küfün 40 tanesini, aflatoksin oluşumu bakımından incelemiş ve analizler sonucunda hiç birisinin aflatoksin üretmediğini tespit etmiştir(demirer 1974). Çoksöyler ve Köşker (1980) toplam 13 adet peynir örneğini TLC yöntemini kullanarak analiz etmişler ve örneklerin hiçbirisinde teşhis edilebilir miktarda aflatoksine rastlamamışlardır. Bununla birlikte araştırmacılar aflatoksin tayininde kullandıkları metodun tespit edebildiği minimun aflatoksin miktarının 0,1 mg/kg olduğunu ve örneklerde bu düzeyin altında aflatoksin olabileceğini vurgulamışlardır. Almanya da yapılan bir piyasa araştırmasında 1972 Eylül ayından 1974 Aralık ayına kadar toplanan 80 adet taze peynir, 77 adet sert peynir ve 65 adet Camambert peyniri örnekleri olası aflatoksin M 1 varlığını belirlemek üzere analiz edilmiştir. Sert peynirlerin %75 i, Camambert peynirlerinin %51 i ve taze peynirlerin %34 ü aflatoksin M 1 içeriği yönünden pozitif olarak değerlendirilmiştir. Aflatoksin M 1 içeriği pozitif olan peynir örneklerinde belirlenen minimum miktar 0,1 mg/kg, maksimum miktar ise 1,3 mg/kg olarak tespit edilmiştir (Applebaum et al.1982). Yunanistan da yapılan bir araştırmada piyasadan alınan toplam 94 adet Teleme peyniri örneğinin hiçbirisinde aflatoksin belirlenememiştir. Ayrıca peynir örneklerinden ve işletme ortamından izole edilen toplam 22 adet Aspergillus türü küfün yalnızca birisinin aflatoksin üretme yeteneğine sahip olduğu belirlenmiştir (Zerfiridis 1985). Dağoğlu vd (1985) ELISA yöntemini kullanarak analiz ettikleri toplam 75 adet peynir örneğinin %42 sinde aflatoksin M 1 saptamışlardır. Truckness ve Page (1986) yaptıkları çalışmada toplam 118 adet peynir örneğini TLC yöntemini kullanarak olası aflatoksin M 1 içeriklerini belirlemek üzere analiz etmişlerdir. Analizler sonucunda toplam 8 adet peynir örneğinde 0,1-1,0 ng/g arasında değişen miktarlarda aflatoksin M 1 tespit edilmiştir. 11

Demirer vd (1989) Ankara piyasasından ve Türkiye nin bazı şehirlerinden sağladıkları gıda maddeleri örneklerinin genel küf içeriklerini ve mikotoksinler yönünden durumlarını inceledikleri araştırmalarında, toplam 5 adet peynir örneğini de aflatoksin yönünden analiz etmişlerdir. Analizler sonucunda örneklerin hiçbirisinde aflatoksine rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Karaıoannoğlou vd (1989) Yunanistan da yaptıkları çalışmalarında 127 adet peynir örneğini aflatoksin M 1 yönünden analiz etmişlerdir. TLC yönteminin kullanıldığı çalışmada analiz edilen örneklerin hiçbirisinde aflatoksin M 1 e rastlanmamıştır. Barbieri vd (1994) yaptıkları çalışmada toplam 200 adet Parmesan peynir örneğini HPLC yöntemini kullanarak analiz etmişlerdir. Analiz edilen örneklerin %9 unda 0,035-0,190 µg/kg arasında değişen miktarlarda aflatoksin M 1 belirlenmiştir. Lopez-Diaz vd (1996) çalışmalarında küflerle doğal olarak kontamine olmuş peynir örneklerinden izole ettikleri Aspergillus türü küflerin mikotoksin oluşturma yeteneklerini incelemişlerdir. Peynirlerden izole edilen Aspergillus türlerinden yalnızca birisinin aflatoksin M 1 üretme yeteneğinde olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca araştırmacılar mikotoksin yönünden analiz ettikleri peynir örneklerinin hiç birisinde aflatoksin M 1 e rastlamamışlardır. Barrios vd (1997) çalışmalarında analiz ettikleri toplam 52 adet peynir örneğinin 9 unda aflatoksin üretme yeteneğine sahip Aspergillus flavus türü küf tespit etmiştir. Kıvanç (1990) çalışmasında toplam 50 adet peynir örneğini küf içerikleri ve aflatoksin üretme yeteneği bakımından analiz etmiştir. Sonuçta örneklerin hiçbirisinde aflatoksine rastlanmamıştır. Ayrıca örneklerden izole edilen 6 Aspergillus izolatından hiçbirisinin aflatoksin üretme yeteneğine sahip olmadığı saptanmıştır. Oruç ve Sonal (2001) çalışmalarında Bursa ilinde tüketilen peynirlerde olası aflatoksin M 1 varlığını belirlemek üzere ELISA yöntemini kullanarak inceleme yapmışlardır. Araştırma sonucunda analiz edilen 57 adet peynir örneğinin % 89,47 sinde aflatoksin 12

M 1 saptanmıştır. Toksin içeriği pozitif çıkan peynir örneklerinin %12,28 inde aflatoksin M 1 düzeyinin Türkiye deki yasal limitlerin üzerinde olduğu belirlenmiştir. En yüksek aflatoksin M 1 konsantrasyonu (810 ng/kg) tam yağlı Beyaz peynirde, en düşük konsantrasyon ise (40 ng/kg) eski Kaşar peynirinde belirlenmiştir. Özkaya vd (2001) Ankara ve İzmir piyasasından topladıkları 49 adet peynir örneğini aflatoksin M 1 yönünden incelemişlerdir. Ankara piyasasından toplanan 29 adet Beyaz peynir örneğinin 19 unda 0,011-0,231 ppb arasında değişen miktarlarda aflatoksin M 1 bulunmasına karşın örneklerin hiçbirisinde belirlenen düzeyin Türkiye de kabul edilen limit değeri aşmadığını bildirmişlerdir. İzmir piyasasından alınan örneklerin ise 3 ünde aflatoksin M 1 bulunmuş ve bunlardan sadece birisinde limit değerin aşıldığı tespit edilmiştir. Ayçiçek vd (2002) yaptıkları çalışmada İstanbul ilinde satışa sunulan Beyaz peynirlerin aflatoksin M 1 içeriklerini belirlemek üzere ELISA yöntemi ile analiz etmişlerdir. Araştırma sonucunda analiz edilen 183 adet peynir örneğinin 121 inde 40-4890 ng/kg arasında değişen düzeylerde aflatoksin M 1 saptanmıştır. Araştırma sonuçlarına göre 85 adet peynir örneğinde toksin düzeyinin Türkiye deki yasal limitlerin üzerinde olduğu ortaya çıkmıştır. Aflatoksin M 1 peynirde süte göre daha yüksek oranda bulunmaktadır (Blanco et al. 1988, Mayes ve MacDonald 1995, Bakırcı 2001). Peynirde aflatoksin M 1 konsantrasyonundaki artış aflatoksin M 1 in hidrofobik kısımlara sahip olan kazein moleküllerine karşı affinite göstermesi ile ilişkilendirilmektedir (Van Egmond ve Paulsch 1986, Karaıoannoğlou et al. 1989). Aflatoksin M 1 konsantrasyonunun genellikle yapıldığı süte göre yumuşak peynirlerde 2,5-3,3 kat, sert peynirlerde ise 3,9-5,8 kat daha fazla olduğu bulunmuştur (Bakırcı 2001). Applebaum ve Marth (1982) araştırmalarında aflatoksin M 1 ile doğal olarak kontamine olmuş sütten Cottage peyniri üretmişler ve üretimden sonra toksin içeriğindeki değişimi incelemişlerdir. Araştırmacılar üretimden sonra pıhtıdaki aflatoksin M 1 miktarının hammadde süte göre yaklaşık 8 kat daha fazla olduğunu bulmuşlardır. 13

Brackett ve Marth (1982) çalışmalarında aflatoksin M 1 ile doğal yolla kontamine olmuş süt kullanarak Parmesan ve Mozzarella peyniri üretmişlerdir. Üretimde kullanılan sütte varolan toksin konsantrasyonunun Parmesan peynirinde 5,8 kat, Mozzeralla peynirinde ise 8,1 kat daha fazla olduğunu tespit etmişlerdir. Aynı araştırmacılar bir başka çalışmalarında Cheddar peyniri üretmişler ve üretimden sonra pıhtıda tutulan toksin miktarının süte göre 4,3 kat daha fazla olduğunu belirlemişlerdir. Aflatoksin M 1 ile kontamine olmuş sütten peynir üretildiği zaman sütte varolan aflatoksin M 1 in hem pıhtıya hem de peyniraltı suyuna taşındığı belirtilmektedir. Bununla birlikte, aflatoksin M 1 in serum proteinlerine karşı daha düşük affinite göstermesi nedeniyle peyniraltı sularının pıhtıya göre daha düşük oranda aflatoksin M 1 içerdiği belirlenmiştir (Bakırcı 2001). Marshaley vd ye göre %66,72, McKinney vd ye göre %80, El Deeb vd ye göre %7-77 arasında değişen oranlarda aflatoksin M 1 peynir yapımı sırasında pıhtıda tutulmaktadır. Bununla birlikte; literatürlerde aflatoksin M 1 in peynir yapımı sırasında büyük kısmının peyniraltı suyuna geçtiğini rapor eden araştırmacılara da rastlanmaktadır. Aflatoksin M 1 in peyniraltı suyuna geçiş oranını araştırmalarında Wiseman ve Marth %61, Blanco vd %66, Stoloff vd %86 olarak bildirmişlerdir (Galvano et al. 1996). Lopez vd (2001) çalışmalarında aflatoksin M 1 ile yapay yolla kontamine olmuş sütte bulunan aflatoksin M 1 in %40 ının pıhtıda tutulduğunu buna karşın %60 oranında peyniraltı suyuna geçtiğini tespit etmişlerdir. McKinney ve Cavanagh adlı araştırmacılar yaptıkları çalışmada aflatoksin M 1 'in % 75'inin pıhtıda kaldığını % 25'inin ise peyniraltı suyuna geçtiğini belirlemişlerdir. Ancak başka bir ekstraksiyon yöntemi kullandıklarında aflatoksin M 1 'in % 39,6'sının pıhtıda, %60,4'ünün ise peyniraltı suyunda kaldığını tespit etmişlerdir. Aflatoksin M 1 'in peyniraltı suyu ve pıhtı arasındaki dağılımı peynir çeşidine göre de değişebilmektedir (Galvano et al. 1996, Applebaum et al. 1982). Çizelge 2.3'de Taze peynir, Camambert 14

ve Tilsit peynirlerinin üretimi sırasında süt, pıhtı ve peyniraltı suyunda belirlenen aflatoksin M 1 miktarları gösterilmiştir. Çizelge 2.3. Farklı peynir çeşitlerinin yapımı sırasında AFM 1 'in dağılımı Taze peynir Camembert Tilsit Ürün µg/kg % µg/kg % µg/kg % Süt 2,6 100,0 2,5 100,0 2,5 100,0 Peynir altı suyu 1,3 38,5 1,3 41,7 1,3 50,7 Pıhtı 8,3 59,4 8,2 57,2 9,3 47,4 Geri alınan toplam AFM 1 97,9 98,9 98,1 Kaynak: Applebaum et al. 1982 Araştırmacılar; kontaminasyon şekli ve düzeyi, sütün bileşimindeki ve süt kalitesindeki faklılıklar, peynir üretim tekniği, peynir çeşidinin farklı olması, peynirlerin kimyasal kompozisyonuna bağlı olarak geri alınan aflatoksin M 1 miktarındaki farklılıklar, aflatoksin M 1 tespitinde farklı analitik tekniklerin kullanılması gibi bir çok nedene bağlı olarak benzer çalışmalarda farklı sonuçlar elde edildiğini vurgulamışlardır (Applebaum et al. 1982, Blanco et al. 1988, Galvano et al. 1996, Lopez et al. 2001). Peynir yapımı sırasında kullanılan sütü pıhtılaştırıcı maddelerin aflatoksin M 1 içeriğine ve dağılımına olan etkisi yapılan bir çalışmada incelenmiştir. Sabit sıcaklıkta yapılan denemelerde elde edilen sonuçlara göre ne rennet miktarının artırılmasının ne de pıhtılaştırma için kullanılan organik asitlerin aflatoksin M 1 dağılımına etki etmediği gözlenmiştir. Bununla birlikte rennet miktarı sabit tutulup pıhtı sıcaklığının değiştirilmesi pıhtıda tutulan aflatoksin M 1 oranını etkilemiştir. Peynirde aflatoksin M 1 düzeyinin tam olarak belirlenebilmesi için aflatoksin M 1 ve protein arasındaki ilişki ile ilgili olarak daha fazla çalışma yapılması ve en uygun analitik yöntemin kullanılması gerektiği bildirilmektedir (Applebaum et al. 1982). 15

2.4. Diğer Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Varlığı ve Stabilitesi Grant ve Carlson çalışmalarında aflatoksin M 1 ile yapay yolla kontamine olmuş kremadan tereyağı üretimi sırasında aflatoksin M 1 in dağılımını incelemiştir. Araştırmacılar aflatoksin M 1 in %60 ının yayıkaltında, %30 unun da yıkama suyunda bulunduğunu; %10 dan daha az oranda ise süt yağında tutulduğunu tespit etmişlerdir (Applebaum et al. 1982). Kontamine kremadan tereyağı üretimi sırasında aflatoksin M 1 in dağılımının incelendiği bir başka çalışmada başlangıçta bulunan aflatoksin M 1 in büyük kısmının yine yayıkaltına geçtiği tespit edilmiştir. Araştırmacılara göre bu beklenen bir sonuçtur. Çünkü, aflatoksin M 1 kazein ile ilişkilidir ve süt proteinleri yayıkaltında tereyağına göre daha fazla oranda bulunmaktadır (Wiseman ve Marth 1983b). Yousef ve Marth a göre tereyağı üretimi sırasında yağ globülleri etrafındaki protein membran kırılmakta ve serum faz ayrılmaktadır. Aflatoksin M 1 in kimyasal yapısı ve kazeine olan ilgisine bağlı olarak da aflatoksin M 1 protein fraksiyonuna adsorbe olmakta, dolayısıyla tereyağı kremaya göre daha düşük konsantrasyonda aflatoksin M 1 içermektedir (Bakırcı 2001). Yoğurt üretiminin aflatoksin M 1 konsantrasyonuna etkisinin ortaya konduğu çalışmaların bazılarında aflatoksin M 1 miktarının üretim sırasında stabil kaldığı ifade edilirken bazı çalışmalarda ise üretilen yoğurtlarda aflatoksin M 1 düzeyinin hammadde süte göre arttığı gözlenmiştir. Blanco vd. tarafından yapılan bir araştırmada aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ve M 1 ) ile kontamine olmuş süt kullanılarak yoğurt üretilmiş ve üretilen yoğurtların aflatoksin miktarlarındaki değişim incelenmiştir. Araştırma sonucunda yoğurt üretiminden hemen sonra aflatoksin M 1 içeriğinde %20 lik bir artış olduğu tespit edilmiştir. Depolamanın 3. ve 7. günlerinde ilk katım oranına eşit miktarda aflatoksin M 1 tespit edilirken; depolamanın 12. ve 21. günlerinde başlangıç miktarına göre %9 luk bir azalma olduğu belirlenmiştir. Araştırmacılar benzeri pek çok çalışmada depolama sırasında aflatoksin M 1 miktarında düşüş ve bazen de stabil kalma eğiliminin olduğunu bildirmişlerdir. Bunu aflatoksin M 1 in kazeine olan ilgisine bağlamışlardır. 16

Kazein, özellikle de β-kazein, depolama sırasında disosiye olmaktadır. Kazeinin çözünürlüğündeki bu değişimin de aflatoksin M 1 dağılımını etkilediği düşünülmektedir (Blanco et al. 1993). Van Egmond vd. tarafından yapılan bir başka çalışmada yoğurtta aflatoksin M 1 içeriğinde hammadde süte göre çok az bir artış olduğu tespit edilmiştir. Bu artışın, fermentasyondan sonra yoğurttan geri alınan aflatoksin M 1 miktarının artmasından kaynaklandığı bildirilmiştir. Araştırmacılara göre; yoğurttaki asitlik protein yapısını etkilemekte ve böylelikle kazeinden ekstrakte edilen aflatoksin M 1 miktarı değişmektedir. Ayrıca bu durum; yoğurt yapımında kullanılan starter kültürün davranışındaki farklılık, sütün bileşimindeki çeşitlilik ve kullanılan ekstraksiyon yönteminin farklı olması ile de açıklanmaktadır (Wiseman ve Marth 1983b). Süttozu ve bebek mamalarında aflatoksin M 1 varlığı ile ilgili literatür verileri az olmakla birlikte, elde edilen sonuçlar sağlık yönünden tehlikeli görülmemektedir. Kazakistan da (Nikov et al. 1991), İtalya da (Finoli ve Rondinini 1989), İsviçre ve Almanya da (Galvano et al. 1998), Thai de (Saitanu 1997) ve Kore de (Kim et al. 2000) bebek maması yapımında kullanmak ve diğer ürünlere işlemek amacıyla üretilen süttozlarının aflatoksin M 1 içeriklerini belirlemeye yönelik piyasa araştırmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar incelendiğinde süttozları ve bebek mamalarında aflatoksin M 1 varlığının sağlığı tehdit edecek düzeyde olmadığı (0,01 0,10 µg/kg) görülmektedir. Dondurmanın yapımı ve depolanması sırasında aflatoksin M 1 stabilitesini belirlemek için yapılan bir çalışmada, dondurma miksinde bulunan aflatoksin M 1 düzeyi kullanılan kontamine krema ve sütteki aflatoksin M 1 düzeyi ile eşdeğer bulunmuştur. Aynı araştırmada dondurmanın aflatoksin M 1 içeriğinin 8 aylık depolama süresinin sonunda stabil kaldığı tespit edilmiştir. (Wiseman ve Marth 1983c). 17

2.5. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Analizinde Kullanılan Yöntemler Süt ve süt ürünlerinde aflatoksinlerin varlığı ve seviyelerini tespit etmek için HPLC (High Performance Liquıd Chromatography), TLC (Thin Layer Chromatography) ve ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) yöntemleri kullanılmaktadır (Applebaum et al. 1982). Son 10 yılda mikotoksinlerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi için uygulanan teknikler arasında kromatografi geniş ölçüde kabul görmüştür. Bu teknikler arasında yer alan HPLC özellikle aflatoksinlerin belirlenmesinde tercih edilen yöntemdir. Pahalı bir teknik olmasına karşın, HPLC ile ayırma ve miktarca belirleme işlemlerinin otomasyonu sağlanmaktadır (Lin et al. 1998, Şahin ve Korukluoğlu 2000). Uluslararası standartlar da süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 in kromatografik yöntem ile belirlenmesinde ters fazlı, fluoresans dedektörlü HPLC yöntemini önermektedirler (ISO 1998). Süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 in belirlenmesi için HPLC ile birlikte immino affinite kolon (IAK) kullanımının başarılı sonuçlar verdiği ifade edilmektedir. Bu yeni, hızlı ve kolay metodun, peynirlerde bulunabilecek küçük miktardaki aflatoksin M 1 in belirlenmesini sağladığı bildirilmektedir (Dragacci et al. 1996). Petri et al. yaptıkları çalışmada HPLC ile IAK nun birlikte kullanımı sonucunda peynirde aflatoksin M 1 için belirleme limitinin 0,05 µg/kg olduğunu bulmuşlardır (Kim et al. 2000). Özkaya vd (2001) süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 analizinde HPLC ile birlikte yüksek oranda ekstraksiyon sağlayan IAK nun birlikte kullanımı sonucunda belirleme limitinin 0,005-0,5 ng/ml düzeyine indiğini bildirmişlerdir. 18

2.6. Süt ve Süt Ürünlerinde Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin M 1 Düzeyleri Aflatoksinlerin yüksek toksisiteye sahip olmalarından dolayı bir çok ülkede gıdalarda bulunabilecek aflatoksin düzeyleri ile ilgili olarak yönetmelikler bulunmaktadır (Van Egmond et al. 1997). Bu konuda ilk yasal düzenleme faaliyeti 1965 yılında FDA (Food and Drug Administration) tarafından gerçekleştirilmiş ve gıdalarda bulunabilecek maksimum toplam aflatoksin miktarı en fazla 30 mg/kg olarak belirlenmiştir. Daha sonraki yıllarda aflatoksinin yüksek toksik etkisinin anlaşılmasıyla bu düzey FDA tarafından 20 mg/kg a düşürülmüştür. FDA nın sütte bulunabilecek toplam aflatoksin için belirlediği tolerans düzeyi ise 0,5 mg/kg dır (Rustom 1997). FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization) eksper komitesi, gıdalarda bulunması muhtemel aflatoksin düzeyinin minimum değere düşürülmesini önermektedir. Minimum değer, gıdadaki bir madde konsantrasyonunun daha fazla azaltılamayacağı değer olarak tanımlanmaktadır. FAO/WHO eksper komitesi süt ve süt ürünlerinde en fazla bulunabilecek aflatoksin M 1 değerini 0,05 µg/kg olarak belirlemiştir (Rustom 1997). Türkiye de süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen aflatoksin M 1 in limit değerleri Çizelge 2.4 de gösterilmektedir. Çizelge 2.4. Türkiye için süt ve süt ürünlerinde AFM 1 limitleri Aflatoksin Gıda maddesi Limit (µg/kg) M 1 Peynir 0,25 M 1 Süt ve süt ürünleri 0,05 M 1 Bebek mamaları ve devam formülleri 0,02 Kaynak : Anonymous 1997 Bazı ülkelerde süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen aflatoksin M 1 in limit değerleri Çizelge 2.5 de gösterilmektedir. 19

Çizelge 2.5. Bazı ülkeler için süt ve süt ürünlerinde AFM 1 limitleri Ülke Ürün AFM 1 (µg/kg) A.B.D Süt 0,5 Arjantin Süt ve süttozu Süt ürünleri 0,05 0,5 Avustralya Hollanda Kaynak : Kardeş 2000 Çocuk gıdaları Süt Peynir Pastörize süt (çocuklar için) Süt ve süttozu Peynir Tereyağı 0,02 0,05 0,25 0,01 0,05 0,2 0,02 20

3.MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Araştırmada materyal olarak Ankara marketlerinde vakumlu ambalajlarda satışa sunulan farklı üreticilere ait taze Kaşar peynirleri kullanılmıştır. Toplam 25 adet Kaşar peyniri örneği olası aflatoksin M 1 içerikleri belirlenmek üzere analiz edilmiştir. Örnekler analiz öncesinde rendelenerek cam kavanozlara konmuş ve 18 o C de yaklaşık 1-3 ay süreyle muhafaza edilmiştir. 3.2. Metot 3.2.1. Örneklerin hazırlanması Örnekler Mayes ve MacDonald (1995) a göre analize hazırlanmıştır. Peynir örnekleri homojen bir şekilde karıştırılarak 250 ml lik behere 40 gr tartılmıştır. Tartılan örnek üzerine Celite 545 (10 gr), doymuş sodyum klorür (2 ml, 6M) ve kloroform (150 ml) çözeltisi eklenmiştir. Karışım orta hızda ultra turax (Janke&Kunkel Ultra Turax T25) ile 2-3 dakika karıştırılmıştır. Elde edilen karışım Watman-4 ten süzülmüştür.toplanan filtrat kloroformu uzaklaştırmak için 30 o C de vakum altında Heidoph VV 2000 marka rotary evaporatörde evapore edilmiştir. Elde edilen kalıntıya 2 ml metanol, 100 ml PBS (phosphate buffer saline) çözeltisi (0,2 gr KCl, 0,2 gr KH 2 PO 4, 1,16 gr Na 2 HPO 4, 8,0 gr NaCl, 900 ml su karıştırılıp karışımın ph sı 7.4 e ayarlanır), 70 ml Hekzan eklenmiş ve karıştırılarak ayırma hunisine alınmıştır. Ayırma hunisinde oluşan alt fazın 50 ml si IAK (VICAM Afla M 1 ) dan geçirilerek saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Adı geçen kolon katı destek materyaline bağlı spesifik monoklonal antikorlar içermektedir. Örnek, kolondan geçerken seçici antikorlar aflatoksin M 1 ile bağlanmakta ve antijen antikor kompleksi oluşturmaktadır. Ardından kolondan 20 ml su geçirilmek suretiyle diğer tüm bileşenler kolondan uzaklaştırılmıştır. Son olarak kolondan 2 ml asetonitril geçirilerek aflatoksin M 1 elue edilmiş ve eluate 21

uygun hacimli viale alınmıştır. Son eluate içindeki asetonitril azot gazı altında uçurulmuş ve örneklere 1:1 oranında hazırlanmış su:asetonitril karışımından 500 µl ilave edilerek enjeksiyona hazır hale getirilmiştir. 3.2.2. HPLC analizi ve hesaplama Örnekler manuel enjektörlü (Man. Inj. G1328A), kuarterner pompalı (Quat pump G1311A), floresans dedektörlü (FLD G1321A), degaze üniteli (Degasser G1322A) Hewlett Packard (HP) 1100 series marka cihaz ile analiz edilmiştir. Kromatografik şartlar Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1.Kromatografinin çalışma şartları Kolon 250 x 4.6 (mm, i.d) Paket materyali Hicrom 5 C-18 Kolon sıcaklığı 25 ο C Mobil faz Acetonitril:Su:Metanol (60:30:10) Akış oranı 1ml/dak Enjeksiyon hacmi 100 µl Analiz edilen örneklerin aflatoksin M 1 içerikleri aşağıdaki eşitlik ile hesaplanmıştır (ISO 1998). W C = M A. (V f / V i ).(1/m) burada; M A : Örneğin pik alanına göre belirlenen AFM 1 içeriği (ng) V i : Enjekte edilen örnek miktarı (µg) V f : Örnek eluatesinin son hacmi (µg) m : Hazırlanan test çözeltisinin 50 ml sindeki peynir miktarı (g) 3.2.3. Kaşar peyniri örnekleri için geri kazanım oranının hesaplanması Geri kazanım oranının belirlenebilmesi için AFM 1 içeriği negatif olarak saptanan 2 Kaşar peyniri örneği kullanılmıştır. Örneklere 0,25 µg/kg toksin katılmış ve örnekler 22

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bu çalışmada Ankara piyasasında satışa sunulan farklı üreticilere ait toplam 25 adet Kaşar peyniri örneğinde olası aflatoksin M 1 varlığı ve seviyeleri araştırılmıştır. Elde edilen verilere göre analiz edilen örneklerin %56 sında 0,01-0,40 µg/kg arasında değişen düzeylerde aflatoksin M 1 saptanmıştır. Aflatoksin M 1 içeriği pozitif olan örneklerin yalnızca birisinde belirlenen değerin Türkiye de peynirler için kabul edilen maksimum tolerans düzeyini (0,25 µg/kg) aştığı tespit edilmiştir. Aflatoksin M 1 içeriği negatif olan bir örneğe ait kromatogram Şekil 4.1 de, en yüksek olduğu tespit edilen örneğe ait kromatogram da Şekil 4.2 de gösterilmektedir. Farklı firmalara ait Kaşar peyniri örneklerinin aflatoksin M 1 düzeyleri Çizelge 4.1 de verilmiştir. Şekil 4.1.AFM 1 içeriği negatif olan bir örneğe ait kromatogram. 24

Şekil 4.2. AFM 1 içeriği en yüksek olan örneğe ait kromatogram. 25

Çizelge 4.1. İncelenen Kaşar peyniri örneklerine ait AFM 1 düzeyleri Firma no AFM 1 içeriği(µg/kg) Firma no AFM 1 içeriği(µg/kg) 1 0,147 14 0,000 2 0,187 15 0,000 3 0,000 16 0,000 4 0,400 17 0,000 5 0,069 18 0,000 6 0,187 19 0,016 7 0,011 20 0,034 8 0,000 21 0,033 9 0,096 22 0,010 10 0,016 23 0,000 11 0,072 24 0,000 12 0,016 25 0,000 13 0,000 En Düşük 0,010 En Yüksek 0,400 Standart Sapma 0,1090 Genel Ortalama 0,0924 Çizelge 4.1 den de görüldüğü gibi; aflatoksin M 1 saptanan örnekler arasındaki en düşük değer 0,010 µg/kg ve en yüksek değer 0,400 µg/kg olarak tespit edilmiştir. Genel ortalama 0,0924 µg/kg ve örneklerin standart sapması 0,1090 olarak belirlenmiştir. Demirer vd (1989) Ankara piyasasından ve Türkiye nin bazı şehirlerinden temin ettikleri 5 adet peynir örneğinin de bulunduğu gıda maddelerini aflatoksin yönünden analiz etmişler ve analizler sonucunda örneklerin hiçbirisinde aflatoksine rastlamamışlardır. Dağoğlu vd (1995) ELISA yöntemini kullanarak analiz ettikleri toplam 75 adet peynir örneğinin %42 sinde aflatoksin M 1 varlığını tespit etmişlerdir. 26

Kıvanç (1990) çalışmasında toplam 50 adet peynir örneğini aflatoksin içeriklerini belirlemek üzere analiz etmişler ve analizler sonucunda örneklerin hiçbirisinde aflatoksine rastlamamışlardır. Oruç ve Sonal (2001) çalışmalarında Bursa piyasasında satışa sunulan toplam 57 adet peynir örneğinin aflatoksin M 1 içeriklerini ELISA yöntemini kullanarak incelemişlerdir. Araştırma sonucunda analiz edilen örneklerin %89,47 sinde aflatoksin M 1 saptanmıştır. Toksin içeriği pozitif olan örneklerin % 12,28 inde belirlenen düzeyin Türkiye deki yasal limitlerin üzerinde olduğu tespit edilmiştir. Özkaya vd (2001) Ankara piyasasından toplanan 29 adet Beyaz peynir örneğinin 19 unda 0,011-0,231 ppb arasında değişen miktarlarda aflatoksin M 1 belirlemişler ancak örneklerin hiçbirisinde belirlenen düzeyin Türkiye deki yasal limitleri aşmadığını bildirmişlerdir. Ayçiçek vd (2002) çalışmalarında İstanbul piyasasından topladıkları 183 adet peynir örneğinin 121 inde aflatoksin M 1 belirlemişlerdir. Araştırma sonuçlarına göre toksin içeriği pozitif olan örneklerin 85 inde belirlenen düzeyin Türkiye deki yasal limitleri aştığı tespit edilmiştir. 27

5.SONUÇ Ankara piyasasında satılan Kaşar peynirlerinin aflatoksin M 1 içeriklerini belirlemeye yönelik yapılan bu araştırmada analiz edilen örneklerin % 56 sında aflatoksin M 1 (0,01-0,40 µg/kg) tespit edilmiştir. Toksin içeriği pozitif örneklerin yalnızca birisinde (4 nolu örnek) belirlenen düzeyin Türkiye deki yasal limiti (0,25 µg/kg ) aştığı saptanmıştır. Bilimsel veriler göz önüne alındığında kontaminasyon seviyeleri çok ciddi düzeylerde olmasa da süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 varlığı güncel bir problemdir. Süt hayvanlarının yemlerle vücutlarına aldıkları aflatoksin B 1 in fizyolojik sentezle aflatoksin M 1 olarak süte geçtiği, süt ve dolaylı olarak da süt ürünlerinin toksin ile kontamine oldukları bilimsel bir gerçektir. Halk sağlığının korunmasında önem taşıyan bu konuda alınacak ilk tedbir yemlerde oluşan aflatoksin B 1 in kontrol altına alınmasıdır. Ayrıca süt ve süt ürünlerinin aflatoksin yönünden kontrolleri düzenli olarak yapılmalı, yasal limitleri aşanların tüketimine izin verilmemelidir. 28

KAYNAKLAR Akçelik, M., Ayhan, K., Çakır, İ., Doğan, H. B., Gürgün, V., Halkman, A. K., Kaleli, D., Kuleaşan, H., Özkaya, D. F., Tunail, N., Tükel, Ç. 2000. Gıda Mikrobiyoloji ve Uygulamaları. Mikrobiyel Enfeksiyonlar ve İntoksikasyonlar. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Müh. Bölümü, 522 s., Ankara. Anonymous. 1997. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği. 16 Kasım 1997 tarihli, 23172 sayılı Resmi Gazete, 124 s. Applebaum, R.S., Brackett, R.E., Wiseman, D.W., Marth, E.H. 1982. Aflatoxin: Toxicity to dairy cattle and occurence in milk and milk products a review. Journal of Food Protection, 45(8); 752-777. Applebaum, R.S. and Marth, E.H. 1982. Fate of aflatoxin M 1 in Cottage cheese. Journal of Food Protection, 45(10); 903-904. Arda, M., Minbay, A., Aydın, N., Akay, Ö., İzgür, M., Leloğlu, N., Kahraman, M., Ilgaz, A., Diker, K.S. 1997. Özel Mikrobiyoloji - Epidemoloji, Bakteriyel ve Mikotik İnfeksiyonlar. Mikotoksikosiz ler. Medisan, 362 s, Türkiye. Ayçiçek, H., Yarsan, E., Sarımehmetoğlu, B., Çakmak, O., 2002. Aflatoksin M 1 in White cheese and butter consumed in Istanbul, Turkey. Vet Human Toxical, 44(5); 295-296. Bakırcı, I. 2001. A study on the occurence of aflatoxin M 1 in milk and milk products produced in Van province of Turkey. Food Control, 12; 47-51. Barbieri, G., Bergamını, C., Orı, E, Resca, P. 1994. Aflatoxin M 1 in Parmesan cheese: HPLC determination. Journal of Food Science, 59(6);1313-1331. Barrios, N. J., Medina, L. M., Cordoba, M. G., Jordano, R. 1997. Aflatoxin producing strains of Aspergillus flavus isolated from cheese. Journal of Food Protection, 60(2);192-194. Blanco,J.L., Dominguez, L., Gomez-Lucia, E., Garayzabal, J.F.F.,Goyache,J., Suarez. 1988.Behavior of aflatoxin during the manufacture, ripening and storage of Manchego-type Cheese. Journal of Food Science, 53(5); 1373-1376. Blanco, J.L., Carrion, B.A., Liria, N., Diaz, S., Garcia, M.E., Domingues, L., Suarez, G. 1993. Behavior of aflatoxins during manufacture and storage of yoghurt. Milchwissenschaft, 48 (7); 385-387. 29

Brackett, R.E. and Marth, E.H. 1982. Fate of aflatoxin M 1 in Cheddar cheese and in process cheese spread. Journal of Food Protection, 45(6); 549-552. Bullerman,L. B. 1981.Public health significance of molds and mycotoxins in fermented dairy products. Journal of Dairy Science, 64; 2439-2452. Bullerman, L. B., Schroeder, L.L., Park, K.Y. 1984. Formation and control of mycotoxins in food. Journal of Food Protection, 47 (8); 637-646. Choudhary, P.L., Sharma, R.S., Borkhartria, V.N. 1998. Effect of chilling and heating on aflatoxin M 1 content of contaminated Indıan cow s milk. Egyptıan Journal of Dairy Science, 26(1); 223-229. Çoksöyler, N., Köşker, Ö. 1980. Süt ve mamüllerinde aflatoksin oluşumu üzerinde araştırmalar. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Diploma Sonrası Yüksek Okulu İhtisas Tez Özetleri, 1; 436-456. Dağoğlu, G., Keleş, O., Yıldırım, M. 1995. Peynirlerde aflatoksin düzeylerinin ELISA testi ile araştırılması. İ.Ü. Vet. Fak. Derg., 21(2); 313-317. Demirer, M.A. 1973. Süt ve süt mamüllerinde aflatoksin M 1 ve B 1 aranması üzerinde araştırmalar. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, XX (2-3); 421-443. Demirer, M.A. 1974. Bazı peynirlerimizden izole ettiğimiz küfler ve bunların aflatoksin yeteneklerinin araştırılması. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, XXI (1-2); 180-189. Demirer, M. A.,Dinçer, B., Kaymaz, Ş., Alperden, İ., Yalçın, S., Özer, E.,1989. Bazı gıda maddelerinde mikroflora ve mikotoksin araştırmaları. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 36(1);85-107. Düzgüneş, O., Kesici, T., Kavuncu, O., Gürbüz, F. 1987. Araştırma ve deneme metotları (İstatistik Metotları II). Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları: 2021, 381 s, Ankara. Dragacci, S. and Fremy, J.M. 1996. Application of immuno affinity column clean-up aflatoxin M 1 determination and survey in cheese. Journal of Food Protection, 59(9);1011-1013. Elden, E., Tağı, Ş. 2001.Tarımsal ürünlerde mikotoksinlerin önemi. Ekin (Türk-Koop), (17); 38-43. 30