ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Özgür FIRAT Oreochromis niloticus TA METAL (Zn, Cd) VE METAL KARIŞIMININ (Zn+Cd) KAN DOKUSUNDA FİZYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE ETKİSİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Oreochromis niloticus TA METAL (Zn, Cd) VE METAL KARIŞIMININ (Zn+Cd) KAN DOKUSUNDA FİZYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE ETKİSİ Özgür FIRAT DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza:... İmza:... İmza:... Prof. Dr. Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Prof. Dr. Seyhan TÜKEL DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza:... Doç. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ ÜYE İmza:... Doç. Dr. Bedii CİCİK ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2006D16 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ DOKTORA TEZİ Oreochromis niloticus TA METAL (Zn, Cd) VE METAL KARIŞIMININ (Zn+Cd) KAN DOKUSUNDA FİZYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE ETKİSİ Özgür FIRAT ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Ferit KARGIN Yıl: 2007, Sayfa 248 Jüri: Prof. Dr. Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Prof. Dr. Seyhan TÜKEL Doç. Dr. Bedii CİCİK Doç. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ Bu araştırmada farklı sürelerde çinko, kadmiyum ve çinko+kadmiyumun farklı ortam derişimlerine bırakılan Oreochromis niloticus un kan parametreleri üzerine metallerin etkisi incelenmiştir. Balıklar 0.5 ve 5.0 mg/l Zn ve 0.1 ve 1.0 mg/l Cd ve 0.5 mg/l Zn+0.1 mg/lcd ve 5.0 mg/l Zn+1.0 mg/l Cd karışımlarına 7, 14 ve 28 günlük sürelerle bırakılarak kan dokusunda metal birikimi ile fizyolojik ve biyokimyasal parametreler belirlenmiştir. Deney süresince balıklarda ölüm gözlenmemiştir. Kan dokusunda metal birikimi ortamda metal derişiminin artışı ve etkide kalınan sürenin uzamasıyla artmıştır. Metallerin kan dokusunda birikimi metallerin tek tek etkisiyle karşılaştırıldığında metal karışımında daha düşük olduğu belirlenmiştir. O. niloticus da Zn, Cd ve Zn+Cd karışımı kan ve serum parametrelerinde değişikliğe neden olmuştur. Etkide kalınan süre ve ortam derişiminin artışıyla alyuvar, akyuvar, hematokrit, hemoglobin, kolesterol, trigliserid, Ca, Na ve Cl düzeyleri ile ChE aktivitesi azalmış, CAT, G6PD, ALT, AST, ALP, LDH ve LP aktivitesi ile GSH, serum albumin, transferrin, seruloplazmin, IgA, IgG, kortizol, glukoz, total protein ve K düzeyleri artış göstermiştir. İncelenen bütün kan parametreleri üzerine metallerin etkisinin düşük derişimlerine oranla yüksek derişimlerinde daha fazla ve bu etkilerinin Zn+Cd>Cd>Zn şeklinde olduğu saptanmıştır. O. niloticus un hemoglobin ve plazma proteinleri Selüloz Asetat Elektroforez yöntemiyle belirlenmiştir. Çalışılan tüm konsantrasyonlarda hemoglobinde 3 band ve plazmada ise 8 protein bandı saptanmıştır. hemoglobin bandlarından (hb1, hb2, hb3), 2 si anodic, 1 katodik olarak belirlenmiştir. Plazma proteinlerinde 60-94 kda arasında orta molekül ağırlıkta (OMAP) 4 band ve 120-273 kda arasında yüksek molekül ağırlıkta (YMAP) 4 band saptanmıştır. 60, 78 ve 94 kda OMAP ve 120, 132 ve 176 kda YMAP bandlarının protein yoğunluğunun arttığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler : Çinko, Kadmiyum, Oreochromis niloticus, Kan Parametreleri, Elektroforez I

ABSTRACT PhD THESIS EFFECTS OF METAL (Zn, Cd) AND METAL MIXTURES (Zn+Cd) ON PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS IN BLOOD TISSUES OF Oreochromis niloticus Özgür FIRAT DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor: Prof. Dr. Ferit KARGIN Year: 2007, Pages: 248 Jury: Prof. Dr.Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Prof. Dr. Seyhan TÜKEL Assoc. Prof. Dr. Bedii CİCİK Assoc. Prof. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ In this study, effects of zinc, cadmium and zinc+cadmium on blood parameters of Oreochromis niloticus were investigated at varying concentrations of metal in the medium and over different periods of time. Fish were exposed to 0.5 and 5.0 mg/l Zn, 0.1 and 1.0 mg/l Cd and 0.5 mg/l Zn+0.1 mg/l Cd and 5.0 mg/l Zn+0.1 mg/l Cd mixtures for 7, 14 and 28 days to observe metal accumulation and physiological and biochemical parameters in blood tissue. Cadmium and zinc accumulation in blood tissue were determined using atomic absorbtion spectrofotometric, serum and blood parameters were measured using spectrophotometric and electrophoretic techniques. No mortality was observed during the experiments. Metal accumulation in blood tissue increased with increasing concentrations of metal in the medium and with increasing exposure periods. Blood tissue accumulation of metals were lower when exposed to the mixture of metals compared with single metal. In O. niloticus, blood and serum parameters were altered by exposure Zn, Cd and Zn+Cd mixtures. Increasing exposure metal concentrations and periods caused a decrease in the levels of RBC, WBC, hematocrit hemoglobin, cholesterol, triglyceride, Ca, Na and Cl and in the ChE activity, and an increase in the activity of CAT, G6PD, ALT, AST, ALP, LDH and LP and in the levels of GSH, serum albumin, transferrin, ceruloplasmine, IgA, IgG, cortisol, glucose, total protein and K. The effects of metals on all blood parameters were always higher in the high concentrations than in the low concentrations and the order of their effects found Zn+Cd>Cd>Zn. Hemoglobin and plasma proteins of O. niloticus were determined by Celulose Acetate Electrophoresis. In all concentrations tested electrophoretic pattern of hemoglobin and plasma proteins consist of 3 and 8 bands, respectively. The 3 bands for hemoglobin (Hb1, Hb2, Hb3) are 2 anodic and 1 cathodic bands. The 8 bands for plasma proteins between 60-94 kda medium molecular weight proteins (MMWP) for 4 bands and between 120-273 kda high molecular weight proteins (HMWP) for 4 bands. Plasma protein density of 60, 78 and 94 kda MMWP bands and 120, 132 and 176 kda HMWP bands a significant increase were determined. Key Words : Zinc, Cadmium, Oreochromis niloticus, Blood Parameters, Electrophoresis II

TEŞEKKÜR Öncelikle çok sevdiğim, kendileriyle çalışmaktan her zaman onur duyduğum, Yülsek Lisans ve Doktora çalışmalarımda bana hep destek olup yol gösteren ve beni bu akademik süreçte yetiştiren Sayın Hocam Prof. Dr. Ferit KARGIN a sonsuz teşekkür ederim. Çalışmalarımda bilgi ve görüşlerinden faydalandığım Sayın Prof. Dr. Seyhan TÜKEL e ve Doç. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ e çok teşekkür ederim. Deneysel çalışmalarımda laboratuar olanaklarından yararlandığım ve yapıcı eleştirileri ve desteklerini gördüğüm Ç. Ü. Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Kıymet AKSOY a ve Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarı sorumlusu Sayın Yrd. Doç. Dr. Tamer İNAL a içtenlikle teşekkür ederim. Yine yardımları ve destekleri için Biyokimya Anabilim Dalı ve Merkez Laboratuarının değerli çalışanlarına özellikle de Sayın Ali SÖNMEZ e ve Sayın Ebru YELLİ ye teşekkür ederim. Çalışmalarımda büyük ilgi ve desteğini gördüğüm, her zaman bende ayrı bir yeri olacak olan Araş. Gör. Hikmet Y. ÇOĞUN a içtenlikle teşekkür ederim. Yine yardımları için Araş. Gör. Tüzin A. YÜZEREROĞLU na teşekkür ederim. Doğduğum günden bu yana hayatımın her anında olan, eşsiz sevgileri ve destekleriyle beni onurlandıran ve her zaman çocukları olmaktan gurur duyduğum Sevgili annem Vahide FIRAT ve babam Haydar FIRAT a ve diğer aile üyelerime özellikle de canım ablam Zeliha FIRAT ve abim Gülabi FIRAT a sonsuz teşekkür ederim. Ayrıca her sıkıntımda, sevincimde yanımda olan can dostum Sayın Akan KIRGIL a da teşekkür ederim. Sadece çalışmalarımda değil her an yanımda olan büyük ilgi, sevgi ve desteğini gördüğüm, bu dünyadaki tek hazinem Sayın Özge ÖZDİŞ e içtenlikle teşekkür ederim. Ayrıca çalışmalarımızı maddi olarak destekleyen Ç. Ü: Araştırma Fonuna da teşekkür ederim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKLER IV ÇİZELGE DİZİNİ.VII ŞEKİL DİZİNİ..XIV SİMGELER VE KISALTMALAR...XXIV 1. GİRİŞ...1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR..12 3. MATERYAL VE METOD.23 3.1. Kan Örneklerinin Alınması ve İncelenmesinde Kullanılan Yöntemler 24 3.1.1. Tam Kanda İncelenecek Parametrelerin Analiz Yöntemleri.25 3.1.1.1. Fizyolojik Parametreler 25 3.1.1.2. Elektroforez Deneyleri ve Eritrositte Enzimatik Antioksidan Sistemler için Örneklerin Hazırlanması......25 3.1.1.2.(1). Plazma Protein Elektroforezi..26 3.1.1.2.1.(1).Protein Bandlarının Moleküler Ağırlığının Hesaplanması.27 3.1.1.2.(1).(2). Protein Bandlarının Dansitometrik Ölçümleri...27 3.1.1.2.(2). Hemoglobin Elektroforezi (Kohn, 1969) 27 3.1.1.2.(2).(1). Hemoglobin Bandlarının Dansitometrik Ölçümleri..29 3.1.1.2.(3). Glukoz 6-fosfat Dehidrojenaz Aktivite Tayini...29 3.1.1.2.(4). Katalaz Aktivite Tayini...31 3.1.1.3. Redükte Glutatyon Düzeyinin Tayini...34 3.1.1.4. Hemaolizatta Hemoglobin Tayini.36 3.1.1.5. Metal (Zn ve Cd) Düzeyinin Tayini..36 3.1.2. Serum Parametrelerinin Analiz Yöntemi..37 3.2. İstatistik..38 4. BULGULAR...39 4.1. Metal Düzeyleri..39 IV

4.1.1 Çinko Düzeyi....39 4.1.2. Kadmiyum Düzeyi 43 4.2. Metal ve Metal Karışımlarının Kanın Fizyolojik Parametreleri Üzerine Etkileri..47 4.2.1. Alyuvar Sayısı...47 4.2.2 Akyuvar Sayısı...52 4.2.3. Hemoglobin Düzeyi..56 4.2.4. Hematokrit Düzeyi 60 4.3. Metal ve Metal Karışımının Kan Dokusunda Elektroforetik Separasyonlar Üzerine Etkisi..65 4.3.1. Hemoglobin Elektroforezi.65 4.3.2. Protein Elektroforezi.75 4.4. Metal ve Metal Karışımlarının Kan Dokusunda Enzimatik Antioksidant Aktivitesine Etkileri...89 4.4.1. Katalaz Aktivitesi..89 4.4.2. G6PD Enzim Aktivitesi.94 4.5. Metal ve Metal Karışımının Kan Dokusundaki Enzimatik Olmayan Antioksidant Düzeyi Üzerine Etkisi...98 4.5.1. Glutatyon Düzeyi.98 4.5.2. Serum Albumin Düzeyi..103 4.5.3. Transferrin Düzeyi..107 5.4.4. Seruloplazmin Düzeyi.112 4.5.5. Serum IgA Düzeyi...116 4.5.6. Serum IgG Düzeyi...120 4.6. Metal ve Metal Karışımlarının Serum Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkileri.124 4.6.1. AST Aktivitesi 124 4.6.2 ALT Aktivitesi.....128 4.6.3. ChE Aktivitesi....132 4.6.4. LDH Aktivitesi 136 4.6.5. ALP Aktivitesi.140 V

4.6.6. LP Aktivitesi...144 4.7. Metal ve Metal Karışımının Serum Elektrolit Düzeylerine Etkileri...148 4.7.1. Kalsiyum Düzeyi...148 4.7.2. Sodyum Düzeyi...153 4.7.3. Potasyum Düzeyi.157 4.7.4. Klor Düzeyi..161 4.8. Metal ve Metal Karışımının Diğer Serum Bileşenlerine Etkisi...165 4.8.1. Kortizol Düzeyi 165 4.7.3. Total Protein Düzeyi...170 4.7.4. Glukoz Düzeyi.174 4.7. 5. Kolesterol Düzeyi...179 4.7.6. Trigliserid Düzeyi...183 5. TARTIŞMA VE SONUÇ..188 KAYNAKLAR..213 ÖZGEÇMİŞ...248 VI

ÇİZELGE DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Eritrositte G6PD aktivite tayini için örneklerin hazırlanması.. 30 Çizelge 3.2. Eritrositte CAT aktivite tayini için örneklerin hazırlanması. 33 Çizelge 3.3. Eritrositte GSH düzeyinin tayini için tüplerin hazırlanışı. 35 Çizelge 3.4. O. niloticus ta her bir serum parametresinin hangi otoanalizatörde okunduğu ve cihazın bir parametreyi okuması sırasında gereksinim duyduğu serum miktarı (µl)... 38 Çizelge 4.1. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki çinko düzeyi (µg/ml kan)... 40 Çizelge 4.2. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki kadmiyum düzeyi (µg/ml kan).. 44 Çizelge 4.3. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta alyuvar sayısı (10 6 /µl) üzerine çinkonun etkisi 48 Çizelge 4.4. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta alyuvar sayısı (10 6 /µl) üzerine kadmiyumun etkisi 49 Çizelge 4.5. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta akyuvar sayısı (10 3 /µl) üzerine çinkonun etkisi... 53 Çizelge 4.6. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta akyuvar sayısı (10 3 /µl) üzerine kadmiyumun etkisi 54 Çizelge 4.7. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemoglobin düzeyi (g/dl) üzerine çinkonun etkisi.. 57 Çizelge 4.8. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemoglobin düzeyi (g/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 58 Çizelge 4.9. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemotokrit düzeyi (%) üzerine çinkonun etkisi. 61 VII

Çizelge 4.10. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemotokrit düzeyi (%) üzerine kadmiyumun etkisi 62 Çizelge 4.11 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus taki hemoglobin bandlarının elektroforetik protein analizi 67 Çizelge 4.12 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus taki hemoglobin bandlarının elektroforetik protein analizi 68 Çizelge 4.13 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 7 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 78 Çizelge 4.14 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 14 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 78 Çizelge 4.15 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 28 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 79 Çizelge 4.16 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 7 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 80 Çizelge 4.17 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 14 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 80 Çizelge 4.18 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 28 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi 81 Çizelge 4.19 28. günde yüksek Zn, Cd ve Zn+Cd ortam derişiminin etkisinde O. niloticus un plazmasındaki elektroforetik bandların protein yoğunluğunda kontrol grubuna oranla gözlenen yüzde (%) artışlar. 81 VIII

Çizelge 4.20 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki CAT aktivitesi (U/mg Hb) üzerine çinkonun etkisi 90 Çizelge 4.21 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki CAT aktivitesi (U/mg Hb) üzerine kadmiyumun etkisi... 91 Çizelge 4.22 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki G6PD aktivitesi (U/g Hb) üzerine çinkonun etkisi 95 Çizelge 4.23 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki G6PD aktivitesi (U/g Hb) üzerine kadmiyumun etkisi.. 96 Çizelge 4.24 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki GSH düzeyi (µmol/g Hb) üzerine çinkonun etkisi 99 Çizelge 4.25 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki GSH düzeyi (µmol/g Hb) üzerine kadmiyumun etkisi 100 Çizelge 4.26 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum albumin düzeyi (g/dl) üzerine çinkonun etkisi 104 Çizelge 4.27 Kadmiyumun ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum albumin düzeyi (g/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 105 Çizelge 4.28 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum transferrin düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi 108 Çizelge 4.29 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum transferrin düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 109 Çizelge 4.30 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. IX

niloticus ta seruloplazmin düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi 113 Çizelge 4.31 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta seruloplazmin düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 114 Çizelge 4.32 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum IgA düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi. 117 Çizelge 4.33 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum IgA düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 118 Çizelge 4.34 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum IgG düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi. 121 Çizelge 4.35 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum IgG düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 122 Çizelge 4.36 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum AST aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi 125 Çizelge 4.37 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum AST aktivitesi (U/L) üzerine kadmiyumun etkisi.. 126 Çizelge 4.38 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum ALT aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi 129 Çizelge 4.39 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum ALT aktivitesi (U/L) üzerine kadmiyumun etkisi.. 130 Çizelge 4.40 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum ChE aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi 133 Çizelge 4.41 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine X

bırakılan O. niloticus ta serum ChE aktivitesi (U/L) üzerine kadmiyumun etkisi.. 134 Çizelge 4.42 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum LDH aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi 137 Çizelge 4.43 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum LDH aktivitesi (U/L) üzerine kadmiyumun etkisi 138 Çizelge 4.44 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum ALP aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi 141 Çizelge 4.45 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum ALP aktivitesi (U/L) üzerine etkisi 142 Çizelge 4.46 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum LP aktivitesi (U/L) üzerine çinkonun etkisi... 145 Çizelge 4.47 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum LP aktivitesi (U/L) üzerine kadmiyumun etkisi.. 146 Çizelge 4.48 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kalsiyum düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi 149 Çizelge 4.49 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kalsiyum düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 150 Çizelge 4.50 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum sodyum düzeyi (mmol/l) üzerine çinkonun etkisi 153 Çizelge 4.51 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum sodyum düzeyi (mmol/l) üzerine kadmiyumun etkisi.. 154 Çizelge 4.52 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. XI

niloticus ta serum potasyum düzeyi (mmol/l) üzerine çinkonun etkisi. 158 Çizelge 4.53 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum potasyum düzeyi (mmol/l) üzerine kadmiyumun etkisi.. 159 Çizelge 4.54 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum klor düzeyi (mmol/l) üzerine çinkonun etkisi 162 Çizelge 4.55 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum klor düzeyi (mmol/l) üzerine kadmiyumun etkisi.. 163 Çizelge 4.56 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kortizol düzeyi (µg/dl) üzerine çinkonun etkisi 166 Çizelge 4.57 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kortizol düzeyi (µg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 167 Çizelge 4.58 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum total protein düzeyi (g/dl) üzerine çinkonun etkisi 171 Çizelge 4.59 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum total protein düzeyi (g/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 172 Çizelge 4.60 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum glukoz düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi 175 Çizelge 4.61 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum glukoz düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 176 Çizelge 4.62 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kolesterol düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun XII

etkisi 180 Çizelge 4.63 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum kolesterol düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 181 Çizelge 4.64 Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum trigliserid düzeyi (mg/dl) üzerine çinkonun etkisi... 184 Çizelge 4.65 Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta serum trigliserid düzeyi (mg/dl) üzerine kadmiyumun etkisi.. 185 XIII

ŞEKİL DİZİNİ SAYFA Şekil 4.1. Çinko derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki.. 39 Şekil 4.2. 7. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko birikimi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 42 Şekil 4.3. 14. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko birikimi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 42 Şekil 4.4. 28. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko birikimi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 43 Şekil 4.5. Kadmiyum derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki. 43 Şekil 4.6. 7. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum birikimi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 46 Şekil 4.7. 14. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum birikimi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 46 Şekil 4.8. 28. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum birikimi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 47 Şekil 4.9. 7. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi.. 50 Şekil 4.10 14. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi.. 51 Şekil 4.11 28. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi.. 51 Şekil 4.12 7. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi.. 55 Şekil 4.13 14. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 55 Şekil 4.14 28. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 56 XIV

Şekil 4.15 7. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 59 Şekil 4.16 14. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 59 Şekil 4.17 28. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 60 Şekil 4.18 7. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 63 Şekil 4.19 14. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 63 Şekil 4.20 28. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 64 Şekil 4.21 Hemoglobin moleküllerinin Selüloz Asetat Elektroforezi ile analizi. 65 Şekil 4.22 7. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 69 Şekil 4.23 7. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 69 Şekil 4.24 7. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 69 Şekil 4.25 7. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 70 Şekil 4.26 7. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 70 Şekil 4.27 7. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 70 Şekil 4.28 7. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 71 Şekil 4.29 14. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 71 Şekil 4.30 14. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin XV

bandlarının dansitometrik ölçümleri... 71 Şekil 4.31 14 günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 72 Şekil 4.32 14. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 72 Şekil 4.33 14. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 72 Şekil 4.34 14. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 73 Şekil 4.35 14. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 73 Şekil 4.36 28. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 73 Şekil 4.37 28. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 74 Şekil 4.38 28. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 74 Şekil 4.39 28. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 74 Şekil 4.40 28. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 75 Şekil 4.41 28. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 75 Şekil 4.42 28. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri... 75 Şekil 4.43 Plazma porteinlerinin Selüloz Asetat Elektroforezi ile analizi... 76 Şekil 4.44 7. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri. 82 Şekil 4.45 7. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 82 Şekil 4.46 7. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki XVI

Şekil 4.47 Şekil 4.48 Şekil 4.49 Şekil 4.50 Şekil 4.51 Şekil 4.52 Şekil 4.53 Şekil 4.54 Şekil 4.55 Şekil 4.56 Şekil 4.57 Şekil 4.58 Şekil 4.59 Şekil 4.60 Şekil 4.61 protein bandlarının dansitometrik ölçümleri... 82 7. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 83 7. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 83 7. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 83 7. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 84 14. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 84 14. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 84 14. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 85 14 günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri. 85 14. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 85 14. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 86 14. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri. 86 28. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 86 28. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 87 28. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 87 28. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki XVII

Şekil 4.62 Şekil 4.63 Şekil 4.64 Şekil 4.65 Şekil 4.66 Şekil 4.67 Şekil 4.68 Şekil 4.69 Şekil 4.70 Şekil 4.71 Şekil 4.72 protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 87 28. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 88 28. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 88 28. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri.. 88 7. günde O. niloticus un kan dokusunda CAT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 92 14. günde O. niloticus un kan dokusunda CAT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 93 28. günde O. niloticus un kan dokusunda CAT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 93 7. günde O. niloticus un kan dokusunda G6PD aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 97 14. günde O. niloticus un kan dokusunda G6PD aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 97 28. günde O. niloticus un kan dokusunda G6PD aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 98 7. günde O. niloticus un kan dokusunda GSH düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 101 14. günde O. niloticus un kan dokusunda GSH düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 102 XVIII

Şekil 4.73 28. günde O. niloticus un kan dokusunda GSH düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 102 Şekil 4.74 Şekil 4.75 Şekil 4.76 Şekil 4.77 Şekil 4.78 Şekil 4.79 Şekil 4.80 7. günde O. niloticus ta serum albumin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 106 14. günde O. niloticus ta serum albumin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 106 28. günde O. niloticus ta serum albumin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 107 7. günde O. niloticus ta serum transferrin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 110 14. günde O. niloticus ta serum transferrin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 111 28. günde O. niloticus ta serum transferrin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 111 7. günde O. niloticus ta serum seruloplazmin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 115 Şekil 4.81 14. günde O. niloticus ta serum seruloplazmin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 115 Şekil 4.82 28. günde O. niloticus ta serum seruloplazmin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 116 Şekil 4.83 Şekil 4.84 Şekil 4.85 7. günde O. niloticus ta serum IgA düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 119 14. günde O. niloticus ta serum IgA düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 119 28. günde O. niloticus ta serum IgA düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 120 Şekil 4.86 7. günde O. niloticus ta serum IgG düzeyi üzerine çinko, XIX

kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 123 Şekil 4.87 Şekil 4.88 Şekil 4.89 14. günde O. niloticus ta serum IgG düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 123 28. günde O. niloticus ta serum IgG düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 124 7. günde O. niloticus ta serum AST aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 127 Şekil 4.90 14. günde O. niloticus ta serum AST aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 127 Şekil 4.91 28. günde O. niloticus ta serum AST aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 128 Şekil 4.92 7. günde O. niloticus ta serum ALT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 131 Şekil 4.93 14. günde O. niloticus ta serum ALT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 131 Şekil 4.94 28. günde O. niloticus ta serum ALT aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 132 Şekil 4.95 7. günde O. niloticus ta serum ChE aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 135 Şekil 4.96 14. günde O. niloticus ta serum ChE aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 135 Şekil 4.97 28. günde O. niloticus ta serum ChE aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin XX

etkisi 136 Şekil 4.98 7. günde O. niloticus ta serum LDH aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 139 Şekil 4.99 14. günde O. niloticus ta serum LDH aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 139 Şekil 4.100 28. günde O. niloticus ta serum LDH aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 140 Şekil 4.101 7. günde O. niloticus ta serum ALP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 143 Şekil 4.102 14. günde O. niloticus ta serum ALP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 143 Şekil 4.103 28. günde O. niloticus ta serum ALP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 144 Şekil 4.104 7. günde O. niloticus ta serum LP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 147 Şekil 4.105 14. günde O. niloticus ta serum LP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 147 Şekil 4.106 28. günde O. niloticus ta serum LP aktivitesi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 148 Şekil 4.107 7. günde O. niloticus ta serum kalsiyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 151 Şekil 4.108 14. günde O. niloticus ta serum kalsiyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 152 Şekil 4.109 28. günde O. niloticus ta serum kalsiyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 152 Şekil 4.110 7. günde O. niloticus ta serum sodyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 155 Şekil 4.111 14. günde O. niloticus ta serum sodyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 156 Şekil 4.112 28. günde O. niloticus ta serum sodyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 156 XXI

Şekil 4.113 7. günde O. niloticus ta serum potasyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 160 Şekil 4.114 14. günde O. niloticus ta serum potasyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 160 Şekil 4.115 28. günde O. niloticus ta serum potasyum düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 161 Şekil 4.116 7. günde O. niloticus ta serum klor düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 164 Şekil 4.117 14. günde O. niloticus ta serum klor düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 164 Şekil 4.118 28. günde O. niloticus ta serum klor düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 165 Şekil 4.119 7. günde O. niloticus ta serum kortizol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 168 Şekil 4.120 14. günde O. niloticus ta serum kortizol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 169 Şekil 4.121 28. günde O. niloticus ta serum kortizol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 169 Şekil 4.122 7. günde O. niloticus ta serum total protein düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 173 Şekil 4.123 14. günde O. niloticus ta serum total protein düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 173 Şekil 4.124 28. günde O. niloticus ta serum total protein düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 174 Şekil 4.125 7. günde O. niloticus ta serum glukoz düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 177 Şekil 4.126 14. günde O. niloticus ta serum glukoz düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 178 Şekil 4.127 28. günde O. niloticus ta serum glukoz düzeyi üzerine çinko, XXII

admiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 178 Şekil 4.128 7. günde O. niloticus ta serum kolesterol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 182 Şekil 4.129 14. günde O. niloticus ta serum kolesterol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 182 Şekil 4.130 28. günde O. niloticus ta serum kolesterol düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 183 Şekil 4.131 7. günde O. niloticus ta serum trigliserid düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 186 Şekil 4.132 14. günde O. niloticus ta serum trigliserid düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 187 Şekil 4.133 28. günde O. niloticus ta serum trigliserid düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 187 XXIII

SİMGELER VE KISALTMALAR CAT: Katalaz G6PD: Glukoz-6-Fosfat Dehidrojenaz GSH: Glutatyon ALT: Alanin Aminotransferaz AST: Aspartat Aminotranferaz ALP: Alkalen Fosfataz LDH: Laktat Dehidrojenaz ChE: Kolinesteraz LP: Lipaz OMAP: Orta Molekül Ağırlıkta Protein YMAP: Yüksek Molekül Ağırlıkta Protein hb: Hemoglobin bandı MT: Metallothionein MBP: Metal Bağlayıcı Protein IgA: İmmünoglobulin A IgG: İmmünoglobulin G CAE: Selüloz Asetat Elektroforezi EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetikasit NADPH: Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat XXIV

1. GİRİŞ Özgür FIRAT 1. GİRİŞ Günümüzde çevreye verilen toksik maddeler, doğanın ekolojik dengesini bozacak düzeye ulaşmıştır. Antropojenik aktivitenin yoğun olduğu kentsel alanlardan ve çeşitli endüstri kuruluşlarından ortama yayılan toksik maddeler, çevre kirliliğine neden olmaktadır. Meydana gelen bu kirliliğin önemli kaynaklarından birini de ağır metaller oluşturmaktadır. Yeryüzünde belirlenmiş olan en tehlikeli 20 toksik maddeden beşini Cd, Cr, Hg, Pb ve As gibi ağır metaller oluşturmaktadır (ATSDR, 2006). Doğal ya da antropojenik kaynaklarla su ekosistemlerine giren ağır metaller, besin zincirinde birikebilmekte, ekolojik zararlara neden olmakta ve hatta insan sağlığını tehdit edebilmektedir (Adams ve ark., 1992; Ermosele ve ark., 1995). Birçok insan hastalıklarının artan ağır metal kirliliğiyle ilişkili olduğu bilinmektedir; örneğin, Hg nörolojik etkilere, Cd ve Pb kanserojenik etkilere, Sr kemik dokularında patolojiye ve Cu ise anemiye neden olmaktadır (Kovalsky, 1974; Alabaster ve Lloyd, 1982; Foulkes, 1990; IPCS,1992). Su ekosistemlerinin ağır metallerle kirlenmesi en kritik çevresel sorunlardan biridir. Endüstriyel ve evsel atıklar ve diğer kirleticilerin ortama gelişigüzel boşaltılması çevrenin kirlenmesine ve hedef organizmaların fizyolojik ve biyokimyasal aktivitelerinin olumsuz etkilenmesine neden olmaktadır. Ortamda bulunan ağır metal iyonları canlılar için oldukça toksiktir. Aşırı metal konsantrasyonları: 1. Hücre zarlarının geçirgenliğini değiştirerek 2. sülfidril (-SH) gruplarıyla tepkimeye girerek 3. Fosfat grupları ve aktif ADP ya da ATP gruplarına tepkime ilgisiyle 4. Gerekli iyonlarla yer değiştirerek toksisiteye neden olmaktadır (Patra ve ark., 2004). Bununla birlikte metallerin toksik etkileri; metalin kimyasal formuna, biyolojik bulunurluğuna, alınım yoluna, metalin aksiyon etkisine ve metabolizmasına, diğer metallerle etkileşimine, metalin kısa ve uzun dönemli etkisine, toksik etkisini göstereceği hedef bölgeye, hücre içi fizyolojik proseslere ve genetik adaptasyonlara bağlıdır. Metallerin bu toksik etkilerine karşı gösterilen yanıt mekanizmaları; 1. Özel olarak üretilen organik bileşiklerce metallerin depolanması 2. 1

1. GİRİŞ Özgür FIRAT Hücreler tarafından detoksifikasyon mekanizmasıyla 3. Metal iyonlarının tekrardan dışarı atılmasıyla olmaktadır. Zn, hücre bölünmesi, büyüme ve immün sistemde bütünleyici bir rol oynadığından (Coleman, 1992; Prasad, 1995; Cousins, 1998) tüm canlı organizmalar için gerekli bir iz elementtir (Eisler, 1993). Zn aynı zamanda, karbonik anhidraz, alkalen fosfataz ve alkol dehidrojenaz gibi Zn-bağlı spesifik enzimlerin aktivitelerinin düzenlenmesinde (Moore ve Ramamoorthy, 1984) ve yağ asidi, protein, karbonhidrat ve nükleik asitlerin metabolizmasında rol oynayan (Hogstrand ve Wood, 1996) 300 den fazla proteinin fonksiyonlarını yerine getirmesinde de görev yapan bir elementtir (Vallee ve Falchuk, 1993). Zn hem doğal (erozyon gibi) hem de antropojenik kaynaklardan (metal alaşımları, otomotiv üretiminde, ilaç yapımı gibi) (Shuilleabhain ve ark., 2004) su ekosistemlerine karışmaktadır. Balıklar çinkoyu solungaçları ve barsakları aracılığıyla almakta (Carino ve ark., 1987) ve kan yoluyla depolanacak organlara taşımaktadırlar (Grober-van Heerden ve ark., 1991). Kan dokusunda çinkonun yaklaşık %99 u proteinlere bağlanmaktadır; bu bağlanmanın yaklaşık %85 i gevşek bir şekilde albuminlere, %15 i sıkı bir şekilde α 2 -makroglobulinlere olmaktadır (Naber ve ark., 1994). Geriye kalan %1 lik kısmı ise düşük molekül ağırlıklı hücre bileşenlerine bağlanmaktadır (Akahori ve ark., 1999). Balık kanındaki total Zn düzeyi 13 (Grober-van Heerden ve ark., 1991) 1.15 mm (Lovegrove ve Eddy, 1982) arasında değişmektedir. Çinkonun balıklar tarafından alınım düzeyi, derişime, etki süresine, balığın büyüklüğüne, suyun sertliğine ve balığın beslenme düzeyine bağlı olarak değişiklik göstermektedir (Sorensen, 1991). Çinko solungaç, karaciğer, böbrek, kalp ve beyin gibi dokularda önemli miktarlarda birikim göstermektedir (Seghal ve Saxena, 1986). Zn hücresel fonksiyonların yerine getirilmesi için eser düzeyde gerekli bir metaldir. Ancak belirli bir konsantrasyondan sonra balıkları da içeren sucul organizmalar için oldukça toksik olmaya başlamaktadır. Zn çeşitli enzimlerin bağlanma bölgelerinde bulunan diğer metallerle yer değiştirerek (Roche ve Boge, 1993), tiyol ve/veya bazı aminoasitlere bağlanıp polipeptid zincirinde yapısal değişikliklere yol açarak (Kellogg ve Hof, 1996), hücrelerin enerji metabolizmasını etkileyerek (Borghesi ve Lynes, 1996) ve tüm zarlardaki iyon-taşıma kanallarıyla 2

1. GİRİŞ Özgür FIRAT etkileşime girerek (Mc Geer ve ark., 2000) biyokimyasal düzeylerde toksik etkilerini göstermektedir. Cd, yüksek derecedeki toksik etkisi (Faroon ve ark., 1994), çevredeki geniş yayılımı (Cinier ve ark., 1999) ve düşük düzeylerde bile organizmalara olumsuz etkileri (Cope ve ark., 1994) nedeniyle çevresel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan toksik bir ağır metaldir. Cd endüstriyel aktiviteler (boya sanayisi, plastikler ve akümülatör üretiminde) (Drastichova ve ark., 2004), madencilik ve uygulamaları ve pestisid olarak tarımsal kullanımına bağlı olarak (Chowdhury ve ark., 2004) antropojenik kaynaklardan su ortamlarına karışmaktadır. Balıklar ağır metalleri, suyla ilk temas halinde olması nedeniyle daha çok solungaçları aracılığıyla almaktadır. Cd solungaçlarda, Ca +2 kanallarıyla alınmaktadır (Wood, 2001). Solungaç epitelyumunu geçtikten sonra Cd daha yüksek omurgalılarda da olduğu gibi kan plazmasındaki taşıyıcı proteinlere bağlanmakta (Zalups ve Ahmad, 2003) ve depolama, detoksifikasyon ve atılımın yapılacağı iç organlara dolaşım sistemiyle taşınmaktadır (Roesijadi ve Robinson, 1994). Cd, çevredeki en toksik ağır metallerden biri olup (Dunnick ve Fowler, 1988), 1993 te insanlar için 1. dereceden kanserojenik elemanlar grubuna dahil edilmiştir. Cd nin balıklarda farklı organ sistemleri üzerine çeşitli yapısal ve fonksiyonel hasarlara neden olduğu bilinmektedir. Cd biyokimyasal düzeyde DNA, RNA ve ribozom sentezini olumsuz etkileyerek (Gerhard ve ark., 1998), bazı enzim aktivitesini engelleyerek (Doi ve ark., 1993), ozmotik ve iyon dengesini bozarak (Heath, 1987) ve immün yanıtlarda değişikliğe neden olarak (Saxena ve ark., 1992) toksik etkisini göstermektedir. Cd nin neden olduğu toksik etkilerin süresi ve yoğunluğu; çalışılan balık türüne, derişime ve etki süresine bağlıdır (Sörensen, 1991; Heath, 1995). Cd dokularda önemli bir birikime sahip olması, çok uzun bir süre vücutta kalabilmesi ve atılımının az olması nedeniyle detoksifikasyonu oldukça yavaştır (Pitter, 1999). Bu nedenle Cd doku ve organlarda önemli hasarlara neden olmaktadır. Artan endüstriyel ve tarımsal faaliyetler sonucunda hem iz hem de toksik ağır metallerin su ekosistemlerindeki düzeyi artmıştır. Ortama verilen atık sularda bir çok metal iyonları birlikte yani karışım halinde bulunmaktadır (Dethloff ve ark., 1999). 3

1. GİRİŞ Özgür FIRAT Bu nedenle akuatik organizmalar bu metal karışımlarının yüksek ortam derişimlerinin etkisinde kalmaktadır (van Dyk ve ark., 2007). Metal karışımlarının balıklar üzerine olan toksik etkileri, spesifik kompozisyonlarına, derişimlerine ve etki sürelerine bağlıdır (Kazlauskiene ve ark., 1996; Vosyliene ve ark., 2004). Cd ve Zn gibi metaller akuatik ortamlarda sıklıkla birlikte bulunmaktadır (Glynn, 2001). Balıklarda Cd ve Zn en toksik etkilerini solungaç epitelyumundaki iyon taşıma sistemini bozarak solungaçlar üzerinde göstermektedir (Hogstrand ve ark., 1994). Laboratuar çalışmaları, Zn nin, Cd toksisitesine karşı balıkları belirli bir dereceye kadar koruduğunu göstermektedir (Klaverkamp ve ark., 1984; Hamilton ve Mehrle, 1986). Cd ve Zn alındıktan sonra metal bağlayıcı proteinler özellikle de metallothioneninlerin (MT) sistein artıklarına bağlanarak dokularda birikim göstermektedir. Cd metabolizması, Zn metabolizmasıyla yakından ilişkili olduğundan MT ler hem Cd hem de Zn bağlanmasından ve taşınmasından sorumludur (El-Demerdash ve ark., 2004). Cd bazı önemli reaksiyonlarda Zn ile yer değiştirerek enzim aktivitesini bozmakta yada durdurmaktadır (Moore ve Ramamoorthy, 1984). Balıklar, ağır metalleri de içeren çevresel kirleticiler için biyoindikatör türler olarak akuatik sistemlerin kalitesinin değerlendirilmesinde geniş çapta kullanılan organizmalardır (Kock ve ark., 1996). Hayvanlardaki kan kimyası parametrelerinin değerlendirilmesi, rutin ve klinik uygulamalarda oldukça yararlıdır. Bu parametrelerin değerlendirilmesi hayvanın fizyolojik durumu hakkında önemli bilgiler sağlamaktadır (Chen ve ark., 2003). Balıklarda çoğu çevresel faktörler; örneğin, ortam faktörleri (sıcaklık, ışık, yoğunluk, tuzluluk gibi), fizyolojik faktörler (üreme peryodu, yaş, besin) (Chen ve ark., 2003) ve ağır metaller (Lauren ve Mc Donald, 1985; Munoz ve ark., 1991) balık kan parametrelerini etkilemektedir. Akuatik ortamlara giren toksik ağır metal katyonlarının çoğu, subletal düzeylerde bile akuatik organizmaların iç dinamiklerinde değişikliklere neden olmaktadır. Çevresel kirleticilerin subletal etkileşiminde balıkların kanında meydana gelen fizyolojik ve biyokimyasal değişikliklerin ölçülmesi, balığın hayatta kalma, üreme ve büyüme gibi prosesleri hakkında yararlı bilgiler sağlamaktadır (Nussey ve ark., 1995). Bu nedenle kan parametreleri, iç yada dış değişikliklere balıkların 4

1. GİRİŞ Özgür FIRAT fizyolojik yada subletal stres yanıtlarının belirteçleri olarak geniş çapta kullanılmaktadır (Cataldi ve ark., 1998). Balığın fizyolojik durumunun izlenmesi ve hastalıklarının tanısı için balık kan biyokimyasının, hücrelerinin ve hormonlarının incelenmesi oldukça önemlidir (Stoskopf, 1993). Toksik bileşenler (Van Vuren, 1986) ve metallerin (Van der Merwe, 1992) birer belirteci olarak hematolojik değişikliklerin kullanılması değişen dış çevre koşullarına karşı balığın verdiği fizyolojik yanıtın belirlenmesine olanak sağlamaktadır (Nussey ve ark., 1995). Araştırıcılar çevresel kirleticilere balığın verdiği fizyolojik yanıtlar üzerine hematolojik parametrelerin yararlı bilgiler sağlayabilmesini şu önemli nedenlere bağlamışlardır: 1. dış ortamla dolaşım sisteminin yakın ilişkide olması 2. ortamdaki değişikliklere karşı duyarlı olması 3. balık kanının kolay elde edilmesi (Houston, 1997; Lohner ve ark., 2001; Gabriel ve ark., 2004). Hematolojik parametrelerdeki değişiklikler, balığın türüne, yaşına ve sağlık durumuna bağlıdır (Golovina, 1996; Luskova, 1997; Hrubec ve ark., 2001). En çok kullanılan hematolojik parametreler; alyuvar, akyuvar, hemoglobin ve hematokrit olup kan dokusunda önemli görevler yerine getirmektedirler. Alyuvarlar, diğer hücrelere oranla balık kanında en fazla sayıda bulunan kan hücresi olup en önemli görevleri içerdikleri hemoglobin sayesinde solungaçlardan dokulara O 2 ve dokulardan solungaçlara CO 2 taşımalarıdır. Akyuvarlar, vücudun hastalıklara karşı önemli bir savunma mekanizmasını oluşturmaktadır. Alyuvarların %33 ünü oluşturan ve bir solunum pigmenti olan hemoglobin O 2 ve CO 2 taşıma dışında kan ph nın sabit tutulmasında tampon görevi de yapmaktadır. Hematokrit ise kanın şekilli elemanlarının plazmaya oranını ifade eden bir değer olup genellikle aneminin belirlenmesinde kullanılmaktadır. Balıkların alyuvar, akyuvar ve hemoglobin gibi hematolojik parametreleri iç ve dış ortam faktörlerinden etkilenebilmektedir (Nespolo ve Rosenmann, 2002; Rios ve ark., 2002), Laboratuar koşullarında balık hematolojisi üzerine ağır metallerin toksik etkilerini belirlemeye yönelik bir çok çalışma (Harikrishnan ve ark., 2003; Riberio ve ark., 2006) yapılmıştır. Çoğu çalışmalarda alyuvar, hemoglobin ve hematokrit düzeylerinde ağır metallerin etkisinde düşüşlerin gözlendiği ve bunun da 5

1. GİRİŞ Özgür FIRAT anemiye neden olduğu rapor edilmiştir ( Haney ve ark., 1992; Greenburg, 1996; Hendy ve ark., 2001). Ağır metallerin olumsuz etkilerinden biri de oksidatif reaksiyonları katalizleme ve böylece reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumuna neden olmasıdır. ROT lar; süperoksit, singlet oksijen, hidrojen peroksit ve hidroksil radikallerinden oluşmaktadır. ROT lar oldukça yüksek reaktif bileşikler olup DNA, protein ve lipid gibi hücresel yapılara saldırarak fonksiyonlarını bozmaktadır (Yu, 1994). ROT un zararlı etkileri antioksidan savunma sistemleri tarafından nötralize edilmektedir. Daha yüksek omurgalılarda olduğu gibi balıklarda da antioksidan savunma sistemleri; hem süperoksid dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glukoz 6 fosfataz dehidrojenaz (G6PD) gibi enzimatik olan hem de glutatyon (GSH), spesifik proteinler (serum albumin, transferin, seruloplazmin) ve vitaminler gibi enzimatik olmayan iki savunma mekanizması tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu savunma sistemleri tüm dokular gibi kanında önemli bir savunma sistemini oluşturmaktadır. Antioksidanlar, ROT oluşumunu önleyerek ya da ROT ları etkisiz hale getirerek etkilerini göstermektedir (Benzie, 2000). Kirleticilerin etkisine yanıtta antioksidan sistem aktivasyonu çeşitli balık türlerinde belirlenmiştir (Filho, 1996; Hai ve ark., 1997; Ahmad ve ark., 2000). Enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidan sistemler, metal iyonları tarafından oluşturulan oksidatif strese karşı biyolojik savunmada önemli roller oynamaktadır (Lopes ve ark., 2001). Balıklarda oksidatif stres biyomarkırları özellikle de antioksidan enzimler sulardaki kirliliğin indikatörleri olarak kullanılmaktadır (Pandey ve ark., 2003). CAT, hidrojen peroksiti (H 2 O 2 ) su ve oksijene katalizleyen önemli bir antioksidan enzimdir. Katalizlediği reaksiyon 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 şeklindedir. H 2 O 2 membran lipitlerinde lipit peroksidasyonuna, SOD un aktivitesinin engellenmesine ve DNA hasarlarına neden olmakta (Joence, 1989; Lunec, 1990) ve Fenton reaksiyonlarıyla daha tehlikeli ve reaktif olan hidroksil radikalini oluşturmaktadır (Fe +2 + H 2 O 2 OH - + OH + + Fe +3 ) (Dantas ve ark., 1996). Bu nedenle CAT, antioksidan savunma sisteminde önemli bir rol oynamaktadır. CAT enzim aktivitesindeki artışlar kirleticilerin etkisindeki organizmalarda gözlenmiştir (Dimitrova ve ark., 1994; Gül ve ark., 2004). 6

1. GİRİŞ Özgür FIRAT Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (EC 1.1.1.49, G6PD), pentoz fosfat yolunun ilk enzimi olup glukoz-6-fosfatın 6-fosfoglukonata oksidasyonunu katalizleyerek NADPH üretimini sağlar. NADPH, redükte glutatyonun (GSH) sentezinde rol oynayan glutatyon redüktaz enzimi için bir koenzim görevi görmesi (Griffith, 1999) ve lipit biyosentezinde rol almasıyla (Kurutas ve ark., 1999) hücre için oldukça gerekli bir bileşiktir. Oksidatif stres etkisinde artan G6PD aktivitesi rapor edilmiştir (Garcia-Alfonso ve ark., 1995). Organizmalar antioksidan enzim aktivitelerini artırarak ROT üretimindeki artışlara adaptasyon sağlamaktadırlar (Stephensen ve ark., 2002). Glutatyon ( L - γ -glutamil-sistenil-glisin, GSH), sülfidril bakımından zengin bir tripeptid olup metal alınım ve atılım oranlarını değiştirerek (Foulkes, 1993), hücre içi metal şelatörü olarak davranıp metal iyonlarının hücre için önemli olan yapılarla etkileşime girmesini engelleyerek (Meister, 1985), metal katalizli redoks reaksiyonları sonucunda oluşan oksidatif strese karşı koruma göreviyle (Sugiyama, 1994), metallerin neden olduğu bozulmalara karşı hücresel Ca +2 homeostazisini düzenlemede rol alarak (Thomas ve Juedes., 1992) ve metallothioneinler (MT) gibi tiyol bakımından zengin proteinlerin sentezini etkileyerek (Maracine ve Segner, 1998) toksik metallerle etkileşime girmekte ve metallerin toksik etkilerini önlemektedir. Hüre içi GSH düzeyinin korunması normal hücre fonksiyonları için gereklidir (Li ve ark., 2003). Bu amaçla GSH, ya γ -glutamil sistein sentetaz enzimi aracılığıyla doğrudan sentezlenmekte ya da pentoz yolunda oluşturulan NADPH ın kullanılmasıyla GR tarafından okside glutatyonun (GSSG) redükte glutatyona dönüştürülmesiyle sağlanmakatdır (Meister ve Anderson, 1983; Carlberg ve Mannervik, 1985). GSH ın antioksidan savunma sistemindeki en önemli rollerinden birisi oldukça reaktif olan hidroksil radikaliyle doğrudan etkileşime girerek daha az zararlı ve başka antioksidanların kullanabileceği ürünlere dönüştürme yeteneğidir (Arteel ve Sies, 2001); GSH + OH H 2 O + GS (1.1) GS + GSH GSSG - + H + (1.2) GSSG - + O 2 GSSG + O 2 - (1.3) 2 O 2 - + 2H + SOD H 2 O 2 + O 2 (1.4) CAT 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (1.5) 7

1. GİRİŞ Özgür FIRAT Metallerin organizmaya alındıktan sonra iç organlara taşınması kan yoluyla olmaktadır. Plazma proteinleri hem omurgalılarda (Putnam, 1975) hem de omurgasızlarda (Martin ve Rainbow, 1998) metal taşınmasından sorumlu olan esas elemanlardır (Nair ve Robinson, 1999). Omurgalılarda serum albumin Zn, Cd ve Ca nın taşınmasından sorumlu olan esas proteindir (Scott ve Bradwell, 1984). Yine histidin bakımından zengin glikoprotein, α 2 -makroglobulin, transferrin, IgA, IgG ve prealbumin omurgalıların diğer önemli plazma proteinleri olup Cd bağlama yeteneğine sahiptirler (Guthans ve Morgan, 1982; Scott ve Bradwell, 1984). Seruloplazmin ise Cu nun taşınmasından sorumlu olan bir önemli plazma proteinidir (Linder ve Hazegh-Azam, 1996). Balık plazmasındaki metal bağlayıcı proteinler hakkında fazla bir bilgi yoktur. Bununla birlikte transport mekanizmasının memelilerdekine benzer olduğu öne sürülmektedir (De Smet ve ark., 2001). Yapılan çalışmalarda Zn nin Pseudopleuronectes americanus ta esas olarak albumine (Fletcher ve Fletcher, 1979), Cd nin de Cyprinus carpio da transferrine bağlandığı (De Smet ve ark., 2001) belirtilmiştir. Akuatik organizmalardaki metabolik ve enzimatik aktivitelerin çalışılması, tatlı su ve deniz ortamına giren kirleticilerin ekolojik etkilerini anlamaya olanak verdiği için önemlidir. Fizyolojik ve biyokimyasal belirteçler olan enzimler, akuatik organizmaların sağlığının ciddi bir şekilde kirleticilerden etkilenmeden önce olası bir çevre kirliliğinin belirlenmesinde kullanılmaktadır (Jiminez ve Stegeman, 1990). Enzim yanıtlarının çoğu ikincil stres yanıtları olup hücresel hasarlarla ortaya çıkmakta ve kirleticilerin daha yüksek biyolojik mekanizmalara geri dönüşümsüz zarar vermeden önce stresin erken tanısına olanak sağlamaktadır (Barnhoorn ve van Vuren, 2004). Enzimler üzerine kirleticilerin etkileri ya spesifik yada spesifik olmayan düzeylerde olmaktadır. Spesifik etkiler, moleküler düzeyde meydana gelen doğrudan bir etkiye bağlı olarak oluşurken (örneğin, enzimlerin SH foksiyonel gruplarının ağır metaller tarafından inhibe edilmesi gibi) spesifik olmayan etkiler, diğer fizyolojik ve biyokimyasal sistemlerdeki enzimler üzerine dolaylı bir etkinin sonucunda ortaya çıkmaktadır (Golovanova ve ark., 1999). Serum enzim aktivitelerinin ölçülmesi balıklar üzerine sudaki kirleticilerin etkisini belirlemede önemlidir (Bucher ve Hofer, 1990). Bu nedenle serum enzimleri 8

1. GİRİŞ Özgür FIRAT (kolinesteraz, alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz, laktat dehihrojenaz ve alkalen fosfataz gibi) çeşitli araştırıcılar (Cajaraville ve ark., 2000; Hamed ve ark., 2003) tarafından hem kirleticilerin biyokimyasal belirteçleri hem de su ekosistemlerindeki kirleticilerin varlığı için duyarlı parametreler olarak kabuledilmektedir. Kolinesterazlar, asetilkolin ve diğer kolin-esterleri hidroliz eden polimorfik enzimlerdir. Omurgalı dokularında karakterize edilmiş iki türü vardır; asetilkolinesteraz (AChE, EC 3.1.1.7) ve butirilkolinesteraz (BChE, EC 3.1.1.8) (Sanchez-Chavez ve Salceda, 2001). Alanin aminotransferaz (EC 2.6.1.2, ALT) ve aspartat aminotranferaz (EC 2.6.1.1, AST), aminoasit metabolizmasına katılan en önemli enzimlerdir (Cowey ve Walton, 1988). Çevresel kirleticilerin olumsuz etkileri ALT ve AST enzim aktivitelerinin ölçülmesiyle gösterilmiştir (Nemcsok ve ark., 1987). Plazmadaki ALT ve AST aktivitelerindeki artışların başta karaciğer olmak üzere diğer organların (böbrek ve/ya da solungaç) zarar görmesi sonucu oluştuğu belirtilmektedir (Nemcsok ve Hughes, 1988). Alkalen fosfataz (EC 3.1.3.1, ALP) (bazı organlardaki hücre ölümlerinden sonra kana girmektedir) ve laktat dehidrojenaz (EC 1.1.1.27, LDH) da önemli serum enzimleridir ve karaciğer ve böbrek doku hasarlarının belirteci olarak kullanılmaktadır (Nemcsok ve Boross, 1982; Kalender ve ark., 2005). Lipazlar (EC 3.1.1.3 LP), trigliseridlerdeki alifatik asitlerin ester bağlarını hidroliz eden çoğu türlerde bulunan bir enzimdir (Lopez ve ark., 2003). LP, yağların sindirimi, alınımı ve lipoprotein metabolizmasında önemli roller oynamaktadır (Sharma ve ark., 2001). Kan plazması yada serumun biyokimyasal analizi, iç organlar (karaciğer ve böbrek gibi), proteinler (albuminler, globulinler), besleyici ve metabolik parametreler (kolesterol, trigliserid, glukoz gibi) ve elektrolitler (Na, Cl, K, Ca, P) hakkında bilgiler sağlamaktadır (Jain, 1986; Allen, 1988; Duncan ve ark., 1994). Bu nedenle plazma/serum parametreleri ağır metallerin toksik etkilerinin belirteçleri olarak kullanılmaktadır (Bergdahl ve ark., 1997). İyonlar (Na, Cl, K ve Ca gibi) balıkların büyümeleri ve iyon dengelerinin sağlanması için gerekli olup çoğu sudan solungaçlar aracılığıyla alınmaktadır (Eddy, 1982). Sudaki ağır metallerle etkileşimde iyon alınımı hasar görmekte ve iyon dengesi bozulmaktadır (McDonald ve Wood, 1993). Yapılan çalışmalarda Cd nin en 9

1. GİRİŞ Özgür FIRAT çok Ca (Reid ve McDonald, 1988) ve Na metabolizmasını (Giles, 1984) etkilediği belirlenmiştir. Yapılan diğer bir çalışmada (McGeer ve ark., 2000) Cd etkisinde balıklarda tüm vücut yada plazma iyon regülasyonunun bozulduğu rapor edilmiştir. Kortizol, glukoz, total protein, kolesterol ve trigliserid serumun diğer önemli bileşenleri olup kirleticilerin etkisindeki balıklarda fizyolojik durum ve doku hasarları hakkında bilgiler sağlamaktadır. Kortizol, doğrudan ve/ve ya dolaylı olarak balıkların iç metabolizma, iyonik ve ozmotik regülasyon, büyüme, stres ve immün fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır (McCormick, 1995; Wendelaar Bonga, 1997; Mommsen ve ark., 1999). Ağır metallerin balıklarda meydana getirdiği olumsuzluklarla organizmanın mücadele edebilmesi için enerji gereksinimi oldukça önemlidir. Glukoz, stres metabolitlerine karşı dokuların gereksinimi olan enerjiyi sağlamaktadır. Bir stres hormonu da olan kortizol balıklarda glukoneojenez ve glikojenoliz yoluyla glukoz üretimini artırdığı ve bu yolla plazma glukoz düzeyinde artışlara neden olduğu bilinmektedir (Iwama ve ark., 1999). Total protein, kolesterol ve trigliserid organizmadaki beslenme durumunun belirteçleridir (Yang ve Chen, 2003). Serum total proteini karaciğerde sentezlenen esas serum proteinleri olup karaciğer hasarının bir belirteci olarak ifade edilmektedir. Kolesterol akut ve kronik stres etkisindeki balıklarda çevresel stres yapıcıların etkilerini değerlendirmek için yararlıdır (Wedemeyer ve McLeay, 1981). Yapılan çalışmalarda (O Neill, 1981; Cyriac ve ark., 1989; Munoz ve ark., 1991) bazı metallerin hemoglobin, hematokrit, plazma protein, iyon düzeyi, kortizol, glukoz ve kan enzimlerini ya arttırdığı yada azalttığı rapor edilmiştir. Plazma glukoz düzeyleri derişime bağlı olarak Cu etkisinde alabalıklarda arttığı gözlenmiştir (Lauren ve Mc Donald, 1985). Ellsaesser ve Clem (1987), Ictalurus nebulosus ta normal ve akut streste kan serum kimyasının ölçümlerinde serum enzimlerinde, serum bileşenlerinde ve serum elektrolitlerinde değişikliklerin meydana geldiğini gözlemlemişlerdir. Balıklar, insanlar ve diğer organizmaların önemli bir besin kaynağı olması nedeniyle metallerin balıklar üzerine neden olacağı herhangi bir olumsuz etki insanları ve diğer organizmaları da etkileyecektir. Bu nedenle hem iz hem de toksik metallerin balıklarda neden olacağı olası fizyolojik ve biyokimyasal değişikleri 10

1. GİRİŞ Özgür FIRAT belirlemek ekosistemin geleceği açısından önemlidir. Çevresel kirleticilerin etkisinde kan hücreleri, kan biyokimyası ve hormonları gibi kan parametrelerinde değişiklikler organizmanın fizyolojik durumunun belirlenmesine olanak sağlamaktadır. Harr (2002), organizmada meydana gelen spesifik hasarları belirlemek için plazma enzim düzeyleri ve kan biyokimyasal parametrelerinin çalışılmasının bir gereklilik olduğunu belirtmiştir. Metal toksisitesini araştıran çalışmaların çoğu metallerin kısa süreli toksik konsantrasyonları (Chapman, 1978; Allien, 1993) ve/ve ya tek bir metalin etkisi üzerine (Baatrup, 1991; Sörensen, 1991; Hogstrand ve ark., 1994) yoğunlaşmıştır. Oysaki balıklar doğal ortamlarında tek bir metalin değil birden çok metal karışımının etkisinde kalmaktadırlar. Tek bir metalin etkisiyle karşılaştırıldığında metal karışımlarının etkileriyle ilgili çalışmalar (Finlayson ve Verrue, 1982; Buhl ve Hamilton, 1990; Hickie ve ark., 1993) oldukça sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışmada tatlı su ekosistemlerinde sıklıkla birlikte bulunan çinkonun ve kadmiyumun tek başına ve birlikte Oreochromis niloticus un hematolojisi (alyuvar, akyuvar, hemoglobin ve hematokrit), kan antioksidan enzimleri (CAT ve G6PD) ve serum enzimlerinin (ALT, AST, ChE, ALP, LDH ve LP) aktiviteleri, metal taşıyıcı plazma proteinleri, enzimatik olmayan antioksidanlar (glutatyon, serum albumin, serulopolazmin ve transferrin), serum immünoglobulin A ve G, serum elektrolitleri (Na, Cl, K, ve Ca) ve diğer serum bileşenleri (kortizol, glukoz, total protein, kolesterol ve trigliserid) gibi kan biyokimyası üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 11

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Martin ve ark. (1977), Carcinus maenas (Decapod, Crustacea) nın hemolenf dokusunu elektroforetik separasyonu ve diğer test teknikleri kullanılarak incelemişlerdir. kan dokusunda bakırın büyük bir çoğunluğunun hemosiyanine Zn nin ise üç farklı kan bileşenine (%68 i hemosiyanine, %10 u kan hücreleri; lipitler ve karotenoidlere; %15 i ise hemolifte) bağlandığı saptanmıştır. Araştırıcılar, C. maenas ın serumunda spesifik Zn-bağlayıcı proteinlerinin bulunmadığını bununla birlikte Zn nin hemosiyaninlerdeki yüksek molekül ağırlıklı proteinlere bağlandığını belirlemişlerdir. Arillo ve ark. (1984), Salmo gairdneri yi 4 ay süreyle 1 ve 10 µg/l Cd ve 30 ve 100 µg/l Cu derişiminin etkisine bıraktıkları çalışmalarında biyokimyasal parametrelerdeki değişimleri incelemişlerdir. Metale duyarlı bazı enzim aktivitelerinde (kan katalaz ve karbonik anhidraz) Cu nun düşük ve yüksek; Cd nin ise yalnızca yüksek derişimlerinin etkisinde önemli değişikliklerin meydana geldiği saptanmıştır. Sjöbeck ve ark. (1984), kadmiyum kontamine olmuş Eman Nehrinde (İsveç) yakalanan tatlı su levreği (Perca fluviatilis) üzerinde yaptıkları biyokimyasal ve hematolojik çalışmada kadmiyumlu bölgelerdeki balıklarda anemi ve plazma karbonhidrat ve iyon kompozisyonunda bozukluklar belirlemişlerdir. Araştırıcılar, alan çalışmalarında kadmiyumun neden olduğu bu etkilerin laboratuar çalışmalarındaki etkilerine benzer olduğunu vurgulamışlardır. Viale ve Calamari (1984), Cd, Cr ve Cu nun düşük ortam derişimlerinin etkisine 4 ay süreyle bıraktıkları Salmo gairdneri de immün yanıtların oluştuğunu ve metallerin balıklarda immün sistemi etkilediğini belirlemişlerdir Hilmy ve ark. (1985), Mugil cephalus un kan, karaciğer, solungaç ve kalp dokularındaki aspartat aminotransferaz, alanin aminotransferaz, alkalen fosfataz ve laktat dehidrojenaz gibi enzim aktiviteleri üzerine Cd nin toksik etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada Cd etkisindeki balıkların farklı dokularındaki enzim aktiviteleriyle ilgili farklı duyarlılıklar saptanmıştır. Solungaç ALT ve AST enzimleri 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT Cd etkisine en duyarlı enzimler olup, karaciğer ALP ve kalp LDH aktivitesi yüksek Cd derişimlerinin etkisinde oldukça yüksek bir azalma göstermiştir. Suzuki ve ark. (1986), albumin eksikliği olan sıçanlara intraperitonal olarak enjekte ettikleri bakırın taşınması ve dağılımını incelemişlerdir. Albumin eksikliği olan bireylerinin kan ve karaciğer dokularında kontrol grubuna (albumin eksikliği olmayan bireyler) oranla Cu düzeyi daha düşük saptanmış ve bu durumun kanda Cu taşınmasında albuminin önemli bir rol oynadığını kanıtlamıştır. Benson ve ark. (1987), tatlı su balığı Notemigonus crysoleucas ı 96 saat süreyle 1.35 ve 2.40 mg/l Cd derişimlerinin etkisine bırakarak kan biyokimyası parametrelerindeki değişimleri incelemişlerdir. Cd nin kan glukoz, ALT ve AST düzeyinde istatistiksel bakımdan önemli değişikliklere neden olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar glukoz ve transaminazların akuatik organizmalardaki Cd etkisinin belirleme testleri için yararlı olabileceğini vurgulamışlardır. Tort ve ark. (1987), Scyliorhinus canicula da hematolojik parametreleri üzerine bakırın etkilerini incelemişlerdir. Çok düşük Cu derişimlerinde hemoglobin düzeyi değişmezken eritrosit ve hematokrit düzeyinde azalma, yüksek Cu derişimlerinde ise incelenen tüm hematolojik parametrelerin düzeylerinde azalmaların olduğu saptanmıştır. Benson ve ark. (1988), kadmiyumun etkisine bırakılan N. crysoleucas daki glukoz, hematokrit ve aminotransferazları içeren hematolojik ve biyokimyasal parametreleri incelemişlerdir. Kadmiyum etkisi, hematokrit düzeyinde önemli bir değişikliğe neden olmamışken glukoz, ALT ve AST düzeylerinde önemli değişikliklere neden olmuştur. Nath ve Kumar (1988), Colisa fasciatus ta karbonhidrat metabolizması üzerine kromun etkilerini incelemişlerdir. subletal Cr derişimlerinin etkisindeki balıklarda 3 saat süre sonunda karaciğer glikojen düzeyinde önemli azalışların; 6 saat sonrada kan glukoz düzeyinde önemli artışların olduğu ve 72 saatlik etki süresinin sonunda ise kan glukoz düzeyinin pik yaptığı saptanmıştır. Ruparelia ve ark. (1989), 7, 14 ve 21 günlük sürelerle 18.0, 24.0 ve 3 mg/l Pb nin etkisine bıraktıkları O. mossambicus un kan dokusundaki biyokimyasal parametrelerdeki değişiklikleri incelemişlerdir. İncelenen parametrelerden plazma 13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT kolesterol düzeyi kurşunun etkisindeki balıklarda kontrol grubuna oranla önemli düzeylerde azalmalar göstermiştir. Bentley (1991), I. punctatus ta yaptığı bir çalışmada kan dokusunda Zn ye ilgisi yüksek bir metal bağlayıcı protein belirlemiştir. Devam eden analizlerle Znbağlayıcı bu proteinin bir serum albumin olabileceği ve proteindeki Zn bağlama bölgelerinin 35x10-8 M Zn/mg protein bağlama kapasitesine sahip olduğu rapor edilmiştir. Araştırıcılar, bu proteinin insan, tavuk ve tavşan albuminlerine oranla Zn için daha fazla ilgi ve bağlama kapasitesi gösterdiğini vurgulamışlardır. Gwozdziski ve ark. (1992), insan ve bir deniz balığı olan Dicentrarchus labrax ın eritrositlerinde CAT, SOD, peroksidaz, GPx gibi enzimlerin aktiviteleri ve eritrosit hemolizi üzerine CuSO 4 ve HgCl 2 nin etkilerini araştırmışlardır. Her iki metalin eritrositlerdeki antioksidan enzim aktivitelerine ve hemoliz üzerine etkileri insanlara oranla balıklarda daha fazla olduğu belirlenmiştir. Kargın ve Erdem (1992), O. niloticus u Zn (200 ppm), Cu (60 ppm) ve Zn+Cu (100+30 ppm) etkisine 24, 48, 72 ve 96 saatlik sürelerle bırakarak karaciğer, solungaç ve kas dokularındaki metal (Zn,Cu) birikimini çalışmışlardır. Deneyde gözlenen balık ölümlerinin bakır ve çinkoya oranla çinko+bakır karışımının etkisinde daha fazla olduğu saptanmıştır. Belirlenen süreler sonunda en yüksek bakır birikimi karaciğerde, en yüksek çinko birikimi ise solungaçlarda gözlemlenmiştir. Araştırıcılar, bakır birikimin çinko varlığında azaldığını ancak ortamda bulunan bakırın dokulardaki çinko birikimini etkilemediğini vurgulamışlardır. Nikinmaa (1992), kadmiyumu da içeren çevresel kirleticilerin balıklarda alyuvarların fonksiyonlarında önemli değişikliklere neden olduğunu, bu nedenle de alyuvarlardaki iyon düzeyinin ve eritrositlerdeki enzim aktivitelerinin belirlenmesinin çevresel kirliliğin izlenmesi çalışmalarına önemli katkılar sağlayacağını vurgulamıştır. Allien (1993), 1 ve 7 günlük sürelerle O. aureus u Cd ve Pb nin etkisine bıraktıkları çalışmalarında metallerin hematolojik parametreler üzerine etkilerini incelemişlerdir. Araştırmada plazma osmolalitesinin en duyarlı kan parametresi olduğu ve diğer kan parametrelerinden önce metallerden etkilendiği, Cd nin Pb ye oranla daha toksik ve kan parametreleri üzerine olumsuz etkilere neden olduğu 14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT belirlenmiştir. Buna ek olarak Cd nin toksik etkilerinin erken tanısında hemoglobin düzeylerinin izlenmesinin yararlı olacağı rapor edilmiştir. Filho ve ark. (1993), farklı ekolojik karaktere sahip altı farklı deniz balığının kan, kalp, karaciğer ve kas dokularındaki CAT, SOD ve glutatyon peroksidazı içeren enzimatik antioksidan savunma mekanizmalarını araştırmışlardır. Çalışmada katalazın en yüksek kan dokusunda olduğu (300-1000 pmol/ghb) bunu karaciğerin (100-250 pmol/g y.a.) izlediği belirlemişlerdir. Araştırıcılar, kan, kalp, karaciğer ve kas dokularındaki antioksidan enzim düzeyinin balıkların yüzme ve metabolik aktiviteleriyle doğrudan ilişkili olduğunu da belirtmişlerdir. Rombout ve ark (1993), C. carpio nun serum ve mukus örneklerinin elektroforetik separasyonları sonucunda farklı yapısal özelliklere sahip (tetramerik, dimerik ve monomerik formda) immünoglobulinleri saptamışlardır. Albergoni ve Viola (1995), I. melas da 10, 20 ve 30 µg/l CdCl 2 etkisinde kan dokusunda meydana gelen immün yanıtları incelemişlerdir. İki haftalık etki süresinden sonra Cd nin İmmünoglobulinlerin düzeyinde artışlara neden olduğu belirlenmiştir. Balint ve ark. (1995), C. Carpio ları birer insektisit olan methidathion ve deltamethrine maruz bıraktıkları çalışmalarında biyokimyasal ve hücresel düzeyde meydana gelen değişmeleri incelemişlerdir. 6 saatlik uygulamadan sonra serum glukoz düzeyi %30 düzeyinde artış; 72 saatlik uygulamadan sonra ise serum LDH aktivitesi 2.5 katlık bir artış; AchE aktivitesi ise %20 düzeyinde bir azalış göstermiştir. Nussey ve ark. (1995), 0.16 ve 0.40 mg/l Cu etkisine 4 ve 28 günlük sürelerle bıraktıkları O. mossambicus ta hematolojik parametrelerde ve osmoregülasyonda değişikliklerin meydana geldiğini rapor etmişlerdir. Bakır etkisinden kan hücreleri olumsuz etkilenmiş ve plazma Na, K, Ca ve Cl düzeyleri azalış göstermiştir. Serra ve ark. (1995), Cd nin etkisine bıraktıkları Scapharca inaequivalvis deniz tarağının dokularında Cd düzeyini ve metal bağlayıcı proteinleri çalışmışlardır. Cd nin özellikle böbrek, solungaç, kas ve kan gibi dokularda biriktiği gözlenmiştir. Cd nin dokularda metal bağlayıcı proteinlere bağlandığı ve belirlenmiştir. Jel 15

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT filtrasyonu, bu Cd-bağlayıcı proteinin 10 kda ağırlığında olup bir MT olabileceğini göstermiştir. İyon değiştirici kromatografiği ile bu proteinin en az iki Cd bağlayıcı izoformlarının olduğunu saptanmıştır. Bainy ve ark. (1996), Billing Barajının (Sao Paulo, Brezilya) kirlenmiş bölgelerinden yakalanan O. niloticus un karaciğer, böbrek, solungaç ve eritrositlerinde oksidatif stresi çalışmışlardır. Eritrositlerde oksidatif stres ve buna bağlı olarak oksidatif zararların meydana geldiği; G6PD, SOD ve glutatyon peroksidaz aktivitesinin artığı, CAT aktivitesi ve GSH düzeyinin ise azaldığı belirlenmiştir. Hai ve ark. (1997), C. Carpio ve I. nebulosus taki antioksidan enzimler ve diğer oksidatif ve redoks parametreleri üzerine bir organofosfat insektisit olan Diklorvosun etkilerini araştırmışlardır. Araştırmada doku (karaciğer, böbrek, solungaç, kalp, beyin ve kas) homojenatlarındaki CAT, SOD, AChE ve glutatyon peroksidaz aktivitesindeki, GSH, süperoksit ve hidroksit radikalleri düzeylerindeki değişimler ve lipit peroksidasyonu çalışılmıştır. Araştırıcılar, organofosfatın balıklarda oksidatif strese neden olduğunu ve bu strese bağlı olarak da incelenen parametrelerde önemli değişikliklerin meydana geldiğini vurgulamışlardır. Akahori ve ark. (1999), in vitro koşullarda C. carpio eritrositlerini çinko derişimlerinin etkisine bırakarak hücrede meydana gelen fiziksel ve kimyasal değişimleri incelemişlerdir. Çinkonun sazan eritrosit zarlarındaki lipitlerin akışkanlığını azalttığı ve hücrelerin hemolize dirençliliğini önemli ölçüde engellediği saptanmıştır. Nair ve Robinson (1999), Mytilus edulis in hemolenfinde kadmiyumları bağlayan histidin bakımından zengin glikoproteinleri karakterize etmişlerdir. İmmobilize metal-iyon ilgi kromatografisiyle elde ettikleri bu metal bağlayıcı proteinin 63 kda molekül ağırlığa sahip ve pi sının 4.8 olduğu saptanmıştır. Molekül özelliği (M A ve pi), karbonhidrat içeriği (%11.6), zengin histidin içeriği (%13.7) ve iyi bir Cd bağlayıcı özlliği (log K 5.4) bu proteinin memelilerdeki histidin bakımından zengin glikoproteinlere benzediğini göstermiştir. Rodriquez-Ariza ve ark. (1999), bakır, paraquat, malathion gibi çevresel kirleticilerin etkisine bıraktıkları Sparus aurata da oksidatif stres biyomarkırlarını 16

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT çalışmışlardır. İncelenen oksidatif stres parametrelerinden G6PD aktivitesinin paraquat etkisindeki balıkların karaciğerinde artığı belirlenmiştir Vosyliene ve Kazlauskiene (1999), Oncorhynchus mykiss i Cu+Zn+Cr+Ni+Fe nin 005+01+025+05+05 mg/l karışımının etkisine 10 gün süreyle bıraktıkları çalışmalarında alyuvar sayısı ve hemoglobin düzeyi gibi kanın fizyolojik parametrelerinde azalışların meydana geldiği ve metal karışımının balıklardaki homeostazisi bozduğu rapor edilmiştir. Kirby ve ark. (2000), Ukrayna Körfezindeki nörotoksik kirlenmenin bir belirteci olarak dil balığının (Platichthys flesus) kas dokusundaki kolinesteraz (ChE) aktivitesini incelemişlerdir. körfezin kirlenmiş bölgelerinde yakalanan balıklarda ChE aktivitesinde kontrol bölgelerindekine oranla azalışların olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar, ChE aktivitesindeki azalışların bir kirletici etkisinin belirteci olabileceğini vurgulamışlardır. De la Tore ve ark. (2000), genç C. carpio ları kadmiyumun etkisine maruz bıraktıkları çalışmalarında subletal kadmiyum derişimlerinin ozmotik regülasyonu ve iyon dengesini bozarak sazanlarda stres meydana getirdiğini saptamışlardır. Travacio ve ark. (2000), Cr (VI) nın etkisine bıraktıkları farelerin beyin dokusundaki enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidan sistemlerdeki değişimleri incelemişlerdir. Cr (VI) nın CAT ve SOD gibi enzimatik antioksidan aktivitesini kontrol grubuna göre sırasıyla %74 ve %72 düzeyinde artırdığı; vitamin E ve sülfidril grupları gibi enzimatik olmayan antioksidan düzeylerini ise sırasıyla %35 ve %32 düzeyinde azalttığı belirlenmiştir. Araştırıcılar, antioksidan enzim aktivitesindeki artışların oksidatif strese karşı bir adaptasyon yanıtını gösterdiğini, enzimatik olmayan antioksidan düzeyindeki azalışların ise oluşan ROT ların olumsuz etkilerinin sonucu olduğunu vurgulamışlardır. Rie ve ark. (2001), Chrysemys picta üzerinde yaptıkları çalışmalarında Cd nin kan, karaciğer, böbrek, pankreas ve gastrointestinal gibi dokularda biriktiği ve başta karaciğer olmak üzere dokulardaki metal bağlayıcı protein sentezini artırtığı belirlenmiştir. Araştırıcılar, metal bağlayıcı protein sentezindeki artışın Cd etkisine karşı adaptasyon yanıtı olarak oluştuğunu vurgulamışlardır. 17

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT Cerqueira ve Fernandes (2002), 96 saatlik bakır etkisinden sonra Prochilodus scrofa da alyuvar, hematokrit, hemoglobin ve plazma K düzeylerinin artığını bununla birlikte plazma Na ve Cl düzeylerinin ise düştüğünü gözlemlemişlerdir. Pillet ve ark. (2002), Halichoerus grypus un kan lökositlerini in vitro koşullarda çinko ve kadmiyumunun etkisine maruz bırakarak MT lerin indüksiyonunun incelemişlerdir. Araştırıcılar, in vitro Zn ve Cd etkisinde lökosit hücrelerinde iki tane MT izoformunun (MT1 ve MT2) sentezinin meydana geldiğini ve metallerin regülasyonunda bu proteinlerin önemli roller üstlendiğini belirtmişlerdir. Teresa ve ark. (2002), C. carpio ları ZnSO 4 (1-1.0 mm) ün etkisine 20 saat süreyle bırakarak eritrositlerin lipit bileşimi üzerine çinkonun etkisini incelemişlerdir. Sonuçlar, yüksek çinko derişimlerinin sazan eritrositlerinin membran lipitlerinin yapısını ve bileşimini önemli ölçüde değiştirdiğini göstermiştir. Campana ve ark. (2003), Halobatrachus didactylus un kan, karaciğer ve böbrek dokularındaki metal ve metallothionein düzeyleri, lipid peroksidasyonu ve ALA-D aktivitesi üzerine kurşunun etkisini inceledikleri çalışmalarında dokulardaki kurşun düzeyinin böbrek > karaciğer > kan şeklinde olduğunu rapor etmişlerdir. Hamed ve ark. (2003), çevresel ve endüstriyel atıklarla kirlenmiş Nil Nehrinin (Mısır) bazı bölgelerinden yakalanan balık türlerinde kirliliğin indikatörleri olan çeşitli antioksidan enzim aktivitelerindeki değişimleri çalışmışlardır. İncelenen türlerden O. niloticus un karaciğer ve böbrek dokularındaki GR, GST ve GPx aktivitesinin kirlenmiş bölgelerdeki balıklarda kontrol grubu balıklarına oranla daha yüksek olduğu gözlenmiştir. SDS-PAGE ile O. niloticus ve Clarias lazera nın karaciğer ve böbrek örneklerinin elektroforetik separasyonuyla elde edilen metal bağlayıcı proteinlerin yoğunluğunda artışlar saptanmıştır. Lionetto ve ark. (2003), İtalya deniz kıyı sahasındaki M. galloprovincialis ve Mullus barbatus türlerinde yaptıkları çalışmada AChE ve antioksidan enzimlerinin (katalaz ve glutatyon peroksidaz) kimyasal kirleticilerin olası etkilerinin belirlenmesi için deniz kıyılarının incelenmesinde yararlı parametreler olabileceğini vurgulamışlardır. 18

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT Pandey ve ark. (2003), Yamuna Nehrindeki (Hindistan) Wallago attu da oksidatif stres biyomarkırlarını çalışmışlardır. Nehrin kirli bölgelerinde toplanmış olan balıkların karaciğer ve solungaç dokularındaki CAT ve G6PD enzim aktivitesinde artışlar olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar ayrıca, oksidatif stres biyomarkırlarının kullanımının, akuatik ekosistemlerdeki kirliliğin izlenmesinde önemli olacağını da vurgulamışlardır. Piao ve ark. (2003), sıçanların çeşitli doku ve organlarında çinkonun kısa süreli toksik etkilerini inceledikleri çalışmalarında serum kortizol düzeyinin çinkonun etkisinde artığı saptamışlardır. Sonuçlar, daha önceki çalışmalarla paralel olarak yüksek çinko derişimlerinin hematopoietik, sitogenetik, biyokimyasal ve endokrin sistemler düzeyinde doku ve organlarda toksik etkilere neden olduğunu göstermiştir. Sayeed ve ark. (2003), bir insektisit olan deltametrinin etkisindeki Channa punctatus balığında oksidatif stresin meydana geldiğini ve buna bağlı olarak da karaciğer, böbrek ve solungaç dokularındaki glutatyon miktarının önemli düzeylerde artığını belirtmişlerdir Tandon ve ark. (2003), Cd nin sıçanlarda neden olduğu oksidatif stresi inceledikleri çalışmalarında Cd etkisindeki sıçanların kan dokusunda CAT ve SOD aktivitesinde ve beyin, karaciğer ve kan dokularındaki redükte glutatyon (GSH) ve okside glutatyon (GSSH) düzeylerinde artışların olduğu saptanmıştır. Yang ve Chen (2003), C. carpio ları 2.0, 4.0 ve 8.0 mg/l gallium derişimlerinin etkisine 28 günlük süreyle bıraktıkları çalışmalarında kan dokusunun biyokimyasal parametrelerdeki değişimleri incelemişlerdir. Kontrol grubuna oranla metal etkisindeki balıkların glukoz, kolesterol ve trigliserid gibi serum parametrelerinde önemli değişikliklerin ve eritrosit hücrelerinde hasarların olduğu saptanmıştır. Gül ve ark. (2004), Seyhan Baraj Gölündeki (Türkiye) Cyprinidae familyasına ait tatlı su balıklarında antioksidan sistemlerin kirlenmiş bölgelerle ilişkisini araştırmışlardır. Çalışmada CAT, G6PD, SOD, GST, MDA ve LDH aktivitesinin istatistiksel bakımdan önemli ölçüde ortamda bulunan kirleticilerden etkilendiği rapor edilmiştir. 19

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT Wu ve Chen (2004), Litepenaeus vannamei türü karideslerde osmoregülasyon ve oksijen tüketimi üzerine kadmiyum ve çinkonun etkilerini inceledikleri çalışmalarında Zn ve Cd nin kontrol grubuna göre oksijen tüketimini %75.9 ve %91.3 düzeyinde engellediği ve osmoregülasyonda bozukluklara neden olduğu saptanmıştır. Shah ve Altındağ (2005), Tinca tinca kadife balıklarının kan dokusundaki immünolojik parametreler üzerine Cd, Hg ve Pb nin etkilerini araştırmışlardır. Toplam lökosit sayısının Cd ve Hg etkisinde önemli derece azaldığı saptanmıştır. Alves ve Wood (2006), kalsiyum ve kurşun içeren besinlerle beslenen O. mykiss de Pb nin kronik etkisi üzerine Ca +2 etkisini incelemişlerdir. çalışmada eritrositlerde biriken Pb miktarının plazmada biriken miktarından 100 kat daha fazla ve Pb ve Ca nın etkisindeki balıklarda plazma Na ve Ca düzeyinde azalmaların olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar, kalsiyumun balıklardaki kurşun birikimini azalttığını ve kurşunun olumsuz etkilerine karşı bir koruma görevi yaptığını rapor etmişlerdir. Fulladosa ve ark. (2006), S. sabra nın kan hücrelerini in vitro koşullarda Cd, Pb ve Cr nin farklı subletal derişimlerinin etkisine bıraktıkları çalışmalrında HSP70 gibi stres proteinlerinin önemli ölçüde sentezlendiği ancak MT indüksiyonunun fazla olmadığı belirlenmiştir Araştırıcılar, balık kan hücrelerinin özellikle çevresel kirlilik durumlarında deneysel ve toksikolojik uygulamalar için biyolojik modeller olabileceğini vurgulamışlardır. Ribeiro ve ark. (2006), kirleticilerin balık sağlığı üzerindeki çeşitli etkilerinin belirlenmesi için hematolojik parametrelerdeki değişmeleri inceledikleri çalışmalarında Hoplias malabaricus u metilciva, inorganik kurşun ve tributiltin içeren besinlerin etkisine bırakmışlardır. Araştırma sonuçları eritrosit, lökosit, hemoglobin ve hematokrit düzeylerinde kirleticilerin etkisinde değişikler meydana geldiğini göstermiştir. Vosyliene ve Jankaite (2006), 6 farklı metalden oluşan karışımın etkisine bıraktıkları O. mykiss de biyolojik parametrelerdeki değişiklikler araştırılmıştır. Balıklar Cu+Zn+Pb+Ni+Cr+Mn nin 0.874+0.93+4.7+0.66+0.33+18.0 mg/l sinin etkisine bırakıldığı çalışmada kan parametrelerinin (hematokrit düzeyi, eritrosit ve 20

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT lökosit sayısı) olumsuz etkilendiği ve özellikle eritrosit sayısında önemli azalışların meydana geldiği rapor edilmiştir. Abebe ve ark. (2007), deniz midyesi M. edulis in hemolenfinde metal bağlayıcı bir protein olan histidin-bakımından zengin bir glikoproteini (HRG) saptamışlardır. HRG nin total plazma proteinlerinin miktar olarak %41-61 ini oluşturduğu ve kabukluların hemolenfindeki metal bağlanmasında sorumlu esas protein olduğu belirtilmiştir. Agrahari ve ark. (2007), C. punctatus un organofosfat türü bir pestisit olan azodrinin (monokrotofos) subletal derişimlerinin (0.96 ve 1.86 mg/l) etkisine 15 ve 60 günlük sürelerle bırakmışlar ve kan dokusundaki biyokimyasal değişikleri incelemişlerdir. İncelenen tüm biyokimyasal parametrelerde derişime bağlı olarak önemli değişiklikler meydana gelmiştir. Karaciğer doku hasarının oluştuğunun göstergesi olan artan bir GOT, GPT, asit ve alkalen fosfataz aktivitesi plazmada gözlenmiştir. Plazma LDH aktivitesi ve trigliserid düzeyi ise ortam derişimlerinin etkisinde azalış göstermiştir. Araştırıcılar, kirlilik izleme programı çalışmalarında balık kanındaki biyokimyasal parametrelerin incelenmesinin yararlı olabileceğini vurgulamışlardır. Artacho ve ark. (2007), Cygnus melanocoryphus ta kötü beslenmeye bağlı olarak kan biyokimyası parametrelerindeki değişimleri inceledikleri çalışmalarında glukoz, total protein, albumin, globulin, üre, ürik asit, trigliserid gibi plazma bileşenlerinin ve aspartat aminotransferaz ve kreatin kinaz gibi plazma enzim aktivitelerinin incelenmesinin, organizmaların sağlık durumları hakkında bilgi sağlayacağından oldukça önemli olduğunu vurgulamışlardır. Hoyle ve ark (2007), C. gariepinus balığını besin yoluyla verilen bakırın etkisine 30 gün süreyle bıraktıkları çalışmalarında barsaktaki glutatyon düzeyinin deney süresinin sonunda kontrol grubuna oranla Cu etkisindeki balıklarda iki kat artığı saptanmıştır. Liu ve ark. (2007), sıçanlar üzerinde yaptıkları bir çalışmada kan plazmasında transkupreinler adı verilen spesifik makroglobulinleri incelemişlerdir. Araştırıcılar, bu proteinlerin kan dokusunda yalnızca Zn taşınmasından değil Cu taşınmasından da sorumlu olduğunu ve Cu ve Fe nin varlığında sentezlerinin artığını belirtmişlerdir. 21

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özgür FIRAT Loumbourdis ve ark. (2007), Rana ridibunda türü kurbağalarda kromun tek başına ve krom + kadmiyum karışımının etkisinde karaciğer, böbrek ve barsaklardaki metal (Cr, Cd) birikimini ve MT sentezini çalışmışlardır. Her iki metalin incelenen dokular arasında en çok böbreklerde biriktiği ve bu dokuda saptanan Cr düzeyinin Cr + Cd karışımının etkisinde kromun tek başına etkisinde oranla iki kat daha fazla olduğu gözlenmiştir. MT sentezinin Cr + Cd karışımının etkisindeki organizmalarda kontrol grubuna oranla 2-6 katlık artış gösterdiğini saptamıştır. Araştırıcılar, barsakta gözlenen bu yüksek MT sentezindeki artışın, bu proteinlerin metal iyonlarının barsaktan kan dokusuna geçişinde etkili olmasından kaynaklandığını belirtmişlerdir. Schmitt ve ark. (2007), kurşun ve çinko madenlerinin bulunduğu Güneydoğu Missouri (Amerika) bölgesindeki üç balık türünde (Campostoma oligolepis, Lepomis megalotis, Hypentelium nigricans) yaptıkları çalışmalarında balıkların kan dokusundaki metal düzeylerinin özellikle de kurşun düzeyinin çok yüksek olduğunu ve karaciğer dokusunda MT indüksiyonun özellikle çinkonun etkisinde artığını belirlemişlerdir. Van Dyk ve ark. (2007), O. niloticus tatlı su çupralarının 18+0.16 mg/l ve 3+0.3 mg/l Cd+Zn (CdCl 2 +ZnCl 2 ) karışımlarının etkisine 24 ve 672 saat sürelerle bıraktıkları çalışmalarında metal karışımının etkisinde karaciğer dokusundaki histopatolojik değişiklikleri incelemişlerdir. Araştırıcılar, her iki metal karışımının ortam derişimlerinin etkisinde de benzer histolojik değişiklerin meydana geldiğini ve bu değişikliklerin; hyalinizasyon, hepatositlerde vakuol oluşumu, hücresel şişme ve kan damarlarındaki aşırı kan akışı şeklinde olduğunu saptamışlardır. Urena ve ark. (2007), doğal ortamlarındaki ve yetiştirme havuzlarındaki Anguilla anguilla nın kan, karaciğer, böbrek ve kas dokularında Zn, Cd, Cu, Hg, Fe, Pb ve Mn gibi metallerin ve MT düzeylerinin belirlenmesine yönelik çalışmalarında en yüksek Cd düzeylerine yetiştirme havuzlarındaki balıkların karaciğer ve böbreklerinde saptanırken, doğal ortamlarında yakalanan balıkların kanında Pb, böbreklerinde ise Zn düzeyleri yüksek düzeylerde bulunmuştur. Yetiştirme havuzlarındaki balıkların böbreklerinde Cd ile MT; doğal ortamdaki balıkların ise karaciğerinde Cu ile MT arasında doğrusal bir ilişki saptanmıştır. 22

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT 3. MATERYAL VE METOD Araştırmada kullanılan Nil tilapiası O. niloticus, Ç. Ü. Su Ürünleri Fakültesi balık yetiştirme havuzlarından alınarak kontrollü ortam koşullarındaki laboratuara getirilmiş ve her biri 40x140x40 cm boyutlarında olan içerisinde 120 L dinlenmiş çeşme suyu bulunan 21 stok cam akvaryum içerisinde iki ay süre ile bekletilerek ortam koşullarına adaptasyonları sağlanmıştır. Bu süre içerisinde deneyde kullanılacak balıklar 17.12±0.8 cm boy ve 80.49±0.9 g ağırlığa ulaşmıştır. Kan dokusunda incelenecek olan fizyolojik ve biyokimyasal parametreler, yaş, boy ve ağırlığa bağlı olarak değişim gösterdiğinden çalışmada aynı yaşta ve boy ve ağırlık olarak da birbirine yakın balıklar kullanılarak, bu faktörlerin etkisinin minimum düzeye indirilmesi amaçlanmıştır. Deneyler 25±1 o C sıcaklıkta yürütülmüş, akvaryumlar merkezi havalandırma sistemi ile havalandırılmış ve günde sekiz saat aydınlanma (8 saat gündüz-16 saat gece) periyodu uygulanmıştır. Balıklar, laboratuar koşullarına adaptasyonları süresince hazır balık yemiyle (Pınar Balık Yemi, Türkiye) beslenmiştir. Denemeler başlamadan iki gün önce yem kesilmiş, denemeler süresince balıklar vücut ağırlıklarının %2 si kadar yem ile günde iki defa beslenmiştir. Deney ortam suyunun kimyasal özellikleri; Toplam sertlik: 349.12 ± 2.24 ppm CaCO 3 ph: 8.12 ± 8 Çözünmüş oksijen: 7.38 ± 6 mg/l Su sıcaklığı: 21.09 ± 0.22 o C Deneyler çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının ortam derişimleri dikkate alınarak üç seri olarak yürütülmüştür. Balıklar birinci seride çinkonun 0.5 ve 5.0 ppm; ikinci seride kadmiyumun 0.1 ve 1.0 ppm ve üçüncü seride ise çinko + kadmiyumun 0.5+0.1 ve 5.0+1.0 ppm derişimlerinin etkisine 7, 14 ve 28 gün sürelerle bırakılmıştır. Deneylerin her bir serisinde 40x140x40 cm boyutlarında ve her birinin içerisinde 24 balık bulunan 7 cam akvaryum kullanılmıştır. Deneylerde birinci seride yedi akvaryumun ilk altısına her derişim için üç akvaryum kullanılmak üzere 23

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT çinkonun 0.5 ve 5.0 ppm lik çözeltileri; ikinci seride kadmiyumun 0.1 ve 1.0 ppm lik çözeltileri; üçüncü seride ise çinko + kadmiyum karışımının 0.5+0.1 ve 5.0+1.0 ppm lik çözeltilerinden 120 şer litre ve serilerdeki son akvaryumlar ise kontrol grubu olarak kullanılarak içerisine aynı hacimde (120 L) dinlendirilmiş çeşme suyu konmuştur. Deneyler altı tekrarlı olarak yürütülmüş ve her tekrarda dört balık kullanılmıştır. Deneylerde kullanılan çinko (ZnCl 2 ) ve kadmiyum (CdCl 2 X H 2 O) çözeltilerinin akvaryumlarda homojen dağılması ve akvaryum tabanına çökmesini önlemek amacıyla Trisodyumsitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7 x 2H 2 O) çözeltisi kullanılmıştır. Deney akvaryumlarında kullanılan metal çözeltilerinin derişimlerinde buharlaşma, adsorbsiyon ve akümülasyon gibi nedenlerle değişim olabileceği dikkate alınarak çözeltiler her gün taze hazırlanan stok çözeltilerden uygun seyreltmeler yapılarak değiştirilmiştir. 3.1. Kan Örneklerinin Alınması ve İncelenmesinde Kullanılan Yöntemler Belirlenen her sürenin sonunda deney akvaryumlarından rast gele alınan balıklar, çeşme suyu ile iyice yıkanarak temizlenmiş kurutma kağıdı ile yüzeylerinde bulunan su damlacıkları alınmış ve boy ve ağırlıkları saptanarak kan alınımına hazır hale getirilmiştir. Kan alımı öncesinde anestezik maddelerin kan parametreleri üzerindeki azaltıcı ve hücreleri hemoliz edici etkileri dikkate alınarak (Hattingh, 1975; Smith ve Hattingh, 1980) balıklara her hangi bir anestezi uygulanmamıştır. Balıklarda kan, vücut ve ekstremitelerine dorsal aorta ve onun kollarından gitmektedir. Solungaçların hemen arkasında yer alan aorta yayları birleşip tek olarak dorsale uzanır ve dorsal aortayı oluşturur. Dorsal aorta da omurganın ventralinde bulunur ve kuyruk bölgesinde hemal yaylar içinde yoluna devam eder (Sarıhan, 1990). Bu durum dikkate alınarak balıklar, kuyruk bölgesinden (kaudal pedinkül) kesilerek dorsal aortadan kanları alınmıştır. Kan örnekleri, tam kanda incelenecek parametrelerin (alyuvar, akyuvar, hemoglobin, hematokrit, CAT, G6PD, GSH, plazma proteinleri) analizi için içinde pıhtılaşmayı engelleyen antikuagülan madde (EDTA) bulunan tüplere; serum parametrelerinin (kortizol, total protein, glukoz, 24

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT kolesterol, trigliserid, kalsiyum, sodyum, potasyum, klor, ALT, AST, ChE, LDH, ALP, LP, serum albumin, seruloplazmin, transferin, IgA, IgG) analizi içinse içinde her hangi bir madde bulunmayan içi boş düz tüplere alınmıştır. EDTA lı tüplerde bulunan kan örneklerinden metal (Zn, Cd), alyuvar, akyuvar, hemoglobin, hematokrit, GSH düzeyleri, protein ve hemoglobin elektroforezi ile CAT ve G6PD enzim aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla hemolizat hazırlanması kan örneklerinin alındığı gün yapılırken CAT ve G6PD aktivitesinin belirlenmesi de sonraki ilk üç gün içerisinde yapılmıştır. Düz tüplerde bulunan kan örneklerinden serumların elde edilmesi ve bu serumlarda incelenecek parametrelerin düzeylerinin belirlenmesi de yine kan örneklerinin alındığı gün yapılmıştır. 3.1.1. Tam Kanda İncelenecek Parametrelerin Analiz Yöntemleri 3.1.1.1. Fizyolojik Parametreler Kan örneklerinin alyuvar ve akyuvar sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeyleri, Ç. Ü. Tıp Fakültesi Balcalı hastanesi Merkez Laboratuarında Coulter LH 750 Analyser aletinde belirlenmiştir. 3.1.1.2. Elektroforez Deneyleri ve Eritrositte Enzimatik Antioksidan Sistemler için Örneklerin Hazırlanması Denenen tüm süre ve derişimlerdeki kan örneklerinin her birinden 400 µl kan alınarak santrifüj tüplerine aktarılmış ve 4 o C de 5000 rpm de 10 dakika süre ile santrifüj (Sorvall RC-2BB) edilerek protein elektroforezi için plazmaları eppendorf tüplere alınarak -20 o C de saklanmıştır. Geriye kalan eritrosit pelletleri üzerine %0.85 lik soğuk serum fizyolojik eklenmiş ve tüpler alt üst edilerek dikkatle karıştırılmış ve tekrar santrifüj edilip süpernatant atılmıştır. Süpernatant aspire edilirken üst kısımda tabaka oluşturan lökosit-trombosit içeriği de uzaklaştırılmıştır. 25

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT İşlem en az üç kez (tamamen berrak süpernatant oluşana dek) tekrarlanmış ve analiz çeşidine göre hemolizat hazırlanmıştır (Wdzieczak ve ark., 1982). 3.1.1.2.(1). Plazma Protein Elektroforezi (Helena Laboratories, 1974) Prensip: Elektroforez yüklü koloit, partikül ve iyonların dışarıdan sağlanan bir akım aracılığıyla oluşturulan elektriksel alanda göç ettirilmesidir. Plazma proteinleri de elektriksel ortamda kendilerini oluşturan amino asitlerinin yan zincirlerinin (-) ve (+) elektrik yük farklılıklarından dolayı anot ya da katoda göç ederler. Bu şekilde protein fraksiyonları birbirinden ayrılmaktadır. Selüloz asetat membran, elektroforetik ayrım için çok homojen bir ortam sağlamakta ve kolayca saydam bir yüzey meydana getirmektedir. Ayrıca plazma proteinlerinin çok küçük miktarlarında yeterli bir ayrım da sağlamaktadır. Ayıraçlar: 1. Elektroforez tamponu, Barbital tamponu (ph 8.6; iyonik kuvvet 45): Bileşimi g Barbital 7.36 Sodyum Barbital 41.20 Yaklaşık bir litre sıcak saf suda çözülür, soğutulur, 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılarak ph ı 8.6 ya ayarlandıktan sonra dört litreye saf suyla tamamlanır. Üzerine koruyucu olarak %5 lik izopropil alkoldeki timol çözeltisinden 20 ml konur. 2. Ponceau-S boyası: Kapsül içeriği (Gelman, bir kapsül 500mg boya içerir) %5 lik trikloroasetik asit içinde çözülür ve aynı solüsyonla 100 ml ye tamamlanır. 3. Yıkama çözeltisi: %5 asetik asit 4. Selüloz asetat şeritler (Gelman Sephraphore III) Yöntem: Elektroforez tankına 200 ml kadar tampon konur, tank 45 o lik açıyla eğilerek her iki küvetteki tampon miktarı eşitlenir. 2.5x15 cm boyutlarındaki selüloz asetat şeritler el değmeden kesilerek ikiye bölünür. Tüm işlemler sırasında şeritlerin üst yüzeyinin sürekli üstte kalmasına dikkat edilir. Kullanmadan önce özel elektroforez 26

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT kalemi ile şeritlere, anot ve katot bölgeleri, aplikasyon noktası ve çalışılacak örneklerin adları kaydedilir. Daha sonra şeritler, tampon içerisinde 5-10 dakika bekletilerek ıslanmaları sağlanır. İki süzgeç kağıdı arasında iyice kurutulup Whatman I üzerine alınır. 1 µl lik aplikatör ile plazmalar uygulanır. Şeritler tanka katodik olarak yerleştirilir, tankın kapağı kapatılır ve akım verilir. Elektroforetik koşullar; a. Köprü aralığı: 4.5 cm b. Akım şiddeti: 0.6 ma/cm şerit c. Süre: 45-50 dakika esas alınarak sürdürülmüştür. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra tanktan alınan şeritler, 10 dakika Ponceau S boyasında bekletilerek fraksiyonların boyanması sağlanır. Sonra artık boyalardan arındırmak amacıyla yıkama işlemi yapılır. Bu amaçla üç ayrı %5 lik asetik asit çözeltisinde sırasıyla bekletilir. 3.1.1.2.(1).(1). Protein Bandlarının Moleküler Ağırlığının Hesaplanması Selüloz asetat elektroforezinde yapılan ayrımdan sonra ortaya çıkan protein bandları tespit edilmiş ve markır protein (Bovine serum albumine 68 kda) ile bu proteinlerin selüloz asetattaki göç etme mesafeleri karşılaştırılarak moleküler ağırlıkları yaklaşık olarak hesaplanmıştır (Rhyum ve ark., 1994). 3.1.1.2.(1).(2). Protein Bandlarının Dansitometrik Ölçümleri Plazma örneklerinin selüloz asetat elektroforezindeki ayrımından sonra ortaya çıkan protein band örneklerindeki protein miktarları Cliniscan 2-1261 model Scaning Dansitometre kullanılarak 525 nm dalga boyunda ölçülmüştür. 3.1.1.2.(2). Hemoglobin Elektroforezi (Kohn, 1969) Prensip: Elektroforezde kullanılan tamponun belli bir ph sı vardır. Hemoglobinler bu ph da izoelektrik noktasına göre (-) ya da (+) yükle yüklenirler. Tampona elektrik 27

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT akımı uygulandığında oluşan elektriki alanda hemoglobinler yüklerine göre belirli bir hızda ilerlerler. Ayıraçlar: 1. Katot tamponu, ph 8.6: Bileşimi g Na-Barbital 5.15 Barbital 0.92 Bir litre saf suda çözülür. 2. Anot tamponu, ph 9.1: Bileşimi g Tris 25.2 EDTA 2.5 Borik asit 1.9 Bir litre saf suda çözülür. 3. Boya çözeltisi (Ponceau S): 500 mg Ponceau S 100 ml %5 lik trikloroasetik asitte çözülür. 4. Yıkama çözeltisi: 5 ml asetik asit alınır 100 ml saf suya tamamlanır. Yöntem: EDTA lı tüplere alınan kan örnekleri santrifüj edilerek plazmasından ayrılır. Geriye kalan eritrositler serum fizyolojik ile üç defa yıkanır. Hemoliz edici olarak 800 µl saf su 60 µl eritrosit üzerine eklenerek hemolizat hazırlanır ve aşağıda belirtildiği gibi elektroforez işlemine geçilir. Elektroforez tankında anot ve katoda 200 er ml anot ve katot tamponu konur. Selüloz asetat kağıdı eşit hacimdeki anot ve katot tamponu (100 ml + 100 ml) içerisinde 10 dakika ıslatıldıktan sonra filtre kağıdının arasında hafifçe kurutularak üzerine hazırlanan hemolizatlar uygulanır. Örnek uygulaması katodik yapılır. Elektroforez koşulları; a. Köprü aralığı: 4.5 cm b. Akım şiddeti: 0.75 ma/cm şerit c. Süre: 60 dakika alınarak sürdürülmüştür. 28

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Elektroforez bitiminde kağıtlar 5 dakika Ponceau S içerisinde boyanır. Boya artıkları %5 lik asetik asit ile temizlenir. 3.1.1.2.(2).(1). Hemoglobin Bandlarının Dansitometrik Ölçümleri Kan örneklerinin selüloz asetat elektroforezi ile ayrıştırılmasından sonra ortaya çıkan hemoglobin band örneklerindeki protein miktarları Cliniscan 2-1261 model Scaning Dansitometre kullanılarak 525 nm dalga boyunda ölçülmüştür. 3.1.1.2.(3). Glukoz 6-fosfat Dehidrojenaz Aktivite Tayini Prensip: Glukoz- 6fosfattan 6-fosfoglukonat oluşması sırasında indirgenen NADP miktarı bu tepkimeyi katalizleyen G6PD enziminin aktivitesi ile doğru orantılıdır. Enzim aktivitesi ölçülmesi, in vitro koşullara uyarlanan tepkime sırasında oluşan NADPH ın 340 nm dalga boyunda birim zamanda verdiği absorbans farkının saptanması esasına dayanır (Beutler, 1975). Ayıraçlar: 1. 1 M Tris tamponu (ph 8.0): Bileşimi g Tris baz 5.30 Tris HCl 8.84 Saf suyla 100 ml ye tamamlanır. 2. 0.1 M MgCl 2 : 0.95 g MgCl 2 alınır ve 100 ml ye saf suyla tamamlanır. 3. 2 mm G6P,Na (günlük hazırlanır): 169 g G6P alınır, 10 ml ye saf suya tamamlanır. 4. 6 mm NADP (günlük hazırlanır): 153 g NADP alınır ve 10 ml ye saf suyla tamamlanır. 5. %2 Digitonin: 2 g Digitonin alınır ve 100 ml ye saf suyla tamamlanır. 29

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT 6. 5 mm Na-P tamponu (ph 7.0) hazırlanması: A. Stok tamponu: 5 M Na-P tamponu: Bileşimi g NaH 2 PO 4. H 2 O 3.12 Na 2 HPO 4 4.26 Saf suyla 1000 ml ye tamamlanır. B. Seyreltik tampon: 5mM Na-P tamponu: Bileşimi Stok tampon 100mL Na 2,EDTA 392 mg NADP 15.3 mg Β-merkaptoetanol 7 ml Bir miktar saf su ilave edildikten sonra Ph sı kontrol edilir ve saf suyla 1000 ml ye tamamlanır. Yöntem: 1 hacim eritrosit pelleti üzerine 1 hacim fosfat tamponu ve 2 hacim digitonin ilave edilerek hemolizat hazırlanır. Hazırlanan hemolizattan da hemoglobin ve enzim aktivite tayini yapılır. G6PD aktivite tayini için iki tüp alınır ve Çizelge 3.1 de belirtilen işlemler uygulanır. Çizelge 3.1. Eritrositte G6PD aktivite tayini için örneklerin hazırlanması Çözeltiler Kör (ml) Örnek (ml) NADP, 2 mm 0.3 0.3 G6P, 6 mm 0.3 0.3 Tris Tampon, 1 M ph 8.0 0.3 0.3 MgCl 2 0.3 0.3 Saf su 1.80 1.75 Hemolizat - 5 30

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Hazırlanan örnek tüplerindeki tepkime 37 o C de 1 cm ışık yolu olan kuvars küvetlerde 10 dakika süreyle spektrofotometrede (Shimadzu UV-260) 340 nm dalga boyunda izlenir. 0., 5. ve 10. dakikalardaki absorbans ölçülür ve doğrusal artış gösteren zaman sürecindeki optik dansite (OD) değerlerinden yararlanılarak aşağıdaki formülden G6PD enzim aktivitesi hesaplanır. Hesaplama: G6PD Aktivitesi (Ü/mL)= ODxVT(3.0mL) 6.22xVH(5mL) ΔOD: Dakikadaki optik dansite değişimi V T : Toplam hacim V H : Hemolizat hacmi 6.22: 1 µmol NADPH ın 1 cm lik ışık yolunda verdiği optik dansite değeri. Ü/mL biriminden ölçülen G6PD aktivitesi daha sonra hemolizatta saptanan hemoglobin (Hb) değerine bölünerek enzimin spesifik aktivite sonucu Ü/g Hb biriminden verilir. G6PD Spesifik Aktivitesi (Ü/g Hb)= G6PDAktivitesi( U / ml) Hb( g / ml) 3.1.1.2.(4). Katalaz Aktivite Tayini Prensip: Katalaz, H 2 O 2 nin yıkımını kataliz eder. H 2 O 2 nin katalaz tarafından yıkım hızı, H 2 O 2 nin 230 nm de ışığı absorbe etmesinden yararlanılarak spektrofotometrik olarak ölçülebilir (Beutler, 1975). Ayıraçlar: 1. 1 M Tris-HCl, 5 mm Na 2 EDTA tamponu, ph 8.0: Bileşimi g Tris-Baz 5.358 Tris-HCl 8.787 31

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Na 2 EDTA 0.1461 Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. 2. 1 M Fosfat tamponu, ph 7.0: Bileşimi g K 2 HPO 4 6.723 KH 2 PO 4 8.344 Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. 3. 10 mm H 2 O 2 : %30 luk peroksitten 10 µl alınır ve 9990 µl saf suyla tamamlanır. 4. Stabilize edici çözelti: 5 ml Β-merkaptoetanol alınır ve %10 luk Na 2 EDTA ile 10 ml ye tamamlanır. 5. Etanol (%95 lik) Yöntem: CAT aktivite tayini için eritrosit pelleti 1:20 oranında stabilize edici çözelti ile hemoliz edilir ve bu hemolizattan hemoglobin tayini yapılır. Hazırlanan hemolizat 1:10 oranında saf su ile sulandırılır ve 1 ml sine 20 µl etanol gelecek şekilde ilave edilir, karıştırılır ve aktivite tayini yapılır. Deneye başlamadan önce günlük olarak hazırlanan 10 mm H 2 O 2 konsantrasyonunun doğru ayarlanıp ayarlanmadığı fosfat tamponu ile kontrol edilir. Bunun için fosfat tamponu 1:10 oranında saf su ile sulandırılır, 1 ml lik küvete 900 µl konur ve havaya karşı 230 nm dalga boyunda okunarak absorbansı kaydedilir (OD 1 ). Ölçülen fosfat tamponunun içine hazırlanan 10 mm lık peroksitten konur ve havaya karşı aynı dalga boyunda okunarak absorbansı kaydedilir (OD 2 ). Sonuç, OD 2 -OD 1 =71 olduğunda, hazırlanan peroksitin konsantrasyonu tam 10 mm dır denir ve deney çizelge 3.2 de gösterildiği şekliyle yapılır. 32

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Çizelge 3.2. Eritrositte CAT aktivite tayini için örneklerin hazırlanması Çözeltiler Kör (µl) Örnek (µl) 1 M Tris HCl, 5mM Na 2 EDTA, ph 50 50 8.0 10 mm H 2 O 2-900 Saf su 930 30 37 o C de 10 dakika inkübe edilir Hemolizat 20 20 Optik dansitedeki düşüş 37 o C de spektrofotometrede (Shimadzu UV-260) 230 nm dalga boyunda köre karşı 10 dakika boyunca ölçülür. Enzim aktivitesinin hesaplanması aşağıdaki formüle göre yapılır. Hesaplama: CAT Aktivitesi (Ü/mL) = ODxVT(1.0mL) 71xVH(2mL) ΔOD: Dakikadaki optik dansite değişimi V T : Toplam hacim V H : Hemolizat hacmi 71: 10 mm H 2 O 2 yıkım hızının verdiği optik dansite değeri. Ü/mL biriminden ölçülen CAT aktivitesi daha sonra hemolizatta saptanan hemoglobin (Hb) değerine bölünerek enzimin spesifik aktivite sonucu Ü/mg Hb biriminden verilir. CATAktivitesi( U / ml) CAT Spesifik Aktivitesi (Ü/mg Hb) = Hb( mg / ml) 33

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT 3.1.1.3. Redükte Glutatyon Düzeyinin Tayini Prensip: Hemen hemen eritrositlerin bütün nonprotein sülfidril grupları, indirgenmiş GSH şeklinde bulunur. 5,5 -ditiyo-bi [2-nitrobenzoik asit] (DTNB), sülfidril bileşikleri tarafından redükte edilmiş bir disülfit bileşiğidir. Oldukça sarı renkli anyon oluşturur. Örnek ile DTNB nin oluşturduğu sarı renkli kompleksin renk şiddeti ortamdaki GSH konsantrasyonu ile doğru orantılıdır; 412 nm de spektrofotometrik olarak değerlendirilir (Beutler, 1975). Ayıraçlar: 1. Çöktürücü çözelti: Bileşimi g Galsiyel metafosforik asit 1.67 Disodyum EDTA 0.20 NaCl 3 Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. 2. 0.3 M Na 2 HPO 4 : 42.59 g Na 2 HPO 4 alınır ve saf su ile 100 ml ye tamamlanır. 3. %2 DTNB çözeltisi: 20 mg DTNB alınır ve %1 lik sodyum sitrat ile 100 ml ye tamamlanır. Yöntem: 200 µl kan üzerine 2 ml saf su ilave edilerek hemolizat hazırlanır ve 200 µl si hemoglobin tayini için kullanılır. GSH tayini için iki tüp alınır ve çizelge 3.3 te belirtilen ayıraçlar ilave edilir. 34

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Çizelge 3.3. Eritrositte GSH düzeyinin tayini için tüplerin hazırlanışı Çözeltiler Kör (ml) Örnek (ml) Hemolizat - 2 Saf su 2 - Çöktürücü 3 3 5 dakika bekletilir, örnek filtre kağıdından süzülür; Süzüntü 2 2 0.3 M Na 2 HPO 4 8 8 412 nm de köre karşı okunur (OD 1 ). Tüplere; %2 DTNB 1 1 İlave edilir 412 nm de köre karşı okunur (OD 2 ). Hesaplama: Kanda GSH miktarı µmol/g Hb biriminden hesaplanır. C ( OD2 OD1) = 1000 13600 11 5 100 x x x 2 2 Hb C (µmol/g Hb) = ( OD2 OD1) x101 Hb( g / dl) 13600: GSH ve DTNB etkileşimi sırasında oluşan sarı rengin molar ekstinksiyon katsatyısı. Hb: Hemoglobin (g/dl) 1000: µmol e dönüşüm katsayısı C: µmol glutatyon OD 1 : DTNB ilave edilmeden önce 412 nm dalga boyunda ölçülen optik dansite OD 2 : DTNB ilave edildikten sonra 412 nm dalga boyunda ölçülen optik dansite 11/2 ve 5/2: Sulandırma katsayısı. 35

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT 3.1.1.4. Hemaolizatta Hemoglobin Tayini Prensip: Hemolizatta hemoglobin tayini, siyanomethemoglobin yöntemi ile yapılmıştır. Hemolizat, potasyum siyanür ve potasyum ferrisiyanür ile muamele edildiğinde ferrisiyanür, hemoglobindeki demiri oksitler ve hemoglobini methemoglobine çevirir. Siyanür ise bunu 540 nm dalga boyunda absorbsiyon piki veren kararlı siyanomethemoglobine dönüştürür. Siyanomethemoglobin yöntemi ile bütün hemoglobin türevleri ölçülebilir (Beutler, 1975). Ayıraçlar: 1. Drabkin çözeltisi: Bileşimi g K 3 Fe(CN) 6 0.198 KCN 52 NaHCO 3 1.00 Yöntem: İki deney tüpü alınır; kör tüpüne 5 ml drabkin çözeltisi, örnek tüpüne ise 20 µl hemolizat ve 5 ml drabkin çözeltisi konur. Oda ısısında 15 dakika bekletilir ve spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda optik dansite okunarak standart eğriden hemoglobin miktarı saptanır. 3.1.1.5. Metal (Zn ve Cd) Düzeyinin Tayini Ayıraçlar: 1. %30 luk H 2 O 2 : %35 lik peroksitten 85.8 ml alınır ve saf suyla 100 ml ye tamamlanır. 2. HNO 3 Yöntem: Kan dokusundaki çinko ve kadmiyum düzeylerinin belirlenmesi amacıyla 200 µl taze kan alınarak deney tüplerine aktarılmış ve üzerlerine 0.5 ml (1:1 v/v) %30 luk H 2 O 2 ve HNO 3 (%60; d:1.53) eklenmiş ve su banyosunda 100 o C de bir saat süreyle tutularak tam bir yanmanın gerçekleştiğini gösteren berrak çözelti elde 36

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT edilinceye kadar yakılmıştır (Ince ve Kunc, 1988). Yakımı tamamlanan örnekler polietilen tüplere alınmış ve üzerleri saf suyla 2.5 ml ye tamamlanarak metal analizine hazır hale getirilmiştir. Hazırlanan kan örneklerindeki Zn ve Cd absorbans değerleri, Perkin Elmer AS 3100 marka Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresiyle saptanmıştır. 3.1.2. Serum Parametrelerinin Analiz Yöntemi Denenen tüm süre ve derişimlerde içinde her hangi bir antikuagülant madde bulunmayan tüplere alınan kan örnekleri, 3000 rpm de 10 dakika süreyle santrifüj (Hettich EBA 8S) edilmiştir. Bu şekilde kanın şekilli elemanlarının çöktürülmesi, serumun ise üst faza geçmesi sağlanmıştır. Elde edilen serum örnekleri eppendorf tüplerine alınmış ve analize hazır hale getirilmiştir. Serumda belirlenen parametrelerin analizi, Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarındaki otoanalizatör cihazlarında yürütülmüştür. Her bir serum parametresinin hangi otoanalizatörde okunduğu ve cihazın bir parametreyi okuması sırasında gereksinim duyduğu serum miktarı Çizelge 3.4. te verilmiştir. 37

3. MATERYAL VE METOD Özgür FIRAT Çizelge 3.4. O. niloticus ta her bir serum parametresinin hangi otoanalizatörde okunduğu ve cihazın bir parametreyi okuması sırasında gereksinim duyduğu serum miktarı (µl) OTOANALİZATÖRLER Modular DPP * Cobas Integra 800* Modular E-170* ALT (7.0) ChE (3.5) Kort (2) AST (7.0) Tran (2.0) ALP (5.0) IgA (5.0) LDH (5.0) IgG (2.0) LP (3.0) Srp (2) TP (4.0) Glu (2.0) Kol (2.0) Trig (2.0) SA (3.5) Ca (7.0) Na (5.0) K (5.0) Cl (5.0) * :ALT (alanin aminotransferaz), AST (aspartat aminotrnasferaz), ALP (alkalen fosfataz), LDH (laktat dehidrojenaz), LP (lipaz), TP (total protein), Glu (glukoz), Kol (kolesterol), Trig (trigliserid), SA (serum albumin), Ca (kalsiyum), Na (sodyum), K (potasyum), Cl (klor), ChE (kolinesteraz), Tran (Transferrin), IgA (immünoglobulin A), IgG (immünoglobulin G), Srp (seruloplazmin), Kort (kortizol). 3.2. İstatistik Deneylerden elde edilen verilerin istatistik analizleri Regresyon Analizi ve Student-Newman Keul s Test (SNK) testleri uygulanarak yapılmıştır (Rohlf ve Sokal, 1969; Sokal ve Rohfl, 1969). 38

4. BULGULAR Bu çalışmada O. niloticus çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının farklı ortam derişimlerinin etkisine 28 gün süreyle bırakılmış ve kan dokusundaki metal düzeyi (Zn, Cd), fizyolojik parametreler (alyuvar, akyuvar, hemoglobin, hematokrit), enzimatik antioksidanlar (CAT, G6PD), enzimatik olmayan antioksidanlar (GSH, serum albumin, seruloplazmin, transferin, IgA, IgG), plazma proteinlerinin ve hemoglobin molekülünün elektroforetik analizi, serum enzimleri (ALT, AST, ChE, ALP, LDH, LP), elektrolitleri (Ca, Na, K, Cl) ve diğer bileşenleri (kortizol, glukoz, total protein, kolesterol, trigliserid) üzerine çinko, kadmiyum ve bunların karışımlarının etkileri araştırılmıştır. 4.1. Metal Düzeyleri 4.1.1. Çinko Düzeyi O. niloticus un kan dokusundaki çinko düzeylerini belirlemek amacıyla çinko standartları ile absorbans arasındaki ilişkiyi gösteren regresyon doğrusu kullanılmıştır (Şekil 4.1). 0,16 0,14 Absorbans 0,12 0,10 0,08 Y=26X+03 0,06 0,04 0,02 0 1 2 3 4 5 6 Çinko Derişimi (ppm Zn) Şekil 4.1. Çinko derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki. 39

Çinko standartlarının absorbans değerlerinden Y= 26X+03 formülü bulunmuştur. Formülde X değeri çinko derişimini, Y değeri de absorbansı göstermektedir. O. niloticus da belirlenen her derişim ve sürede altı tekrarlı olarak saptanan çinko düzeylerinin aritmetik ortalamaları ve standart hataları ile farklı metal kombinasyonlarının ve etkide kalma sürelerinin doku birikimine etkisini saptamak amacıyla veriler SNK testi (Student Newman Keul s Test) ile analiz edilmiş ve sonuçlar Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelgede a,b ve c harfleri çinko ile karışım arasındaki ayrımı; x, y ve z harfleri ise dokulardaki metal birikimine sürenin etkisini belirtmek için kullanılmıştır. Çizelgede farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<5 düzeyinde istatistik ayrım vardır. Çizelge 4.1. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki çinko düzeyi (µg/ml kan) DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 77.37 ± 1.44 ax 79.34 ± 2.73 ax 80.88 ± 1.91 ax 0.5 Zn 100.31 ± 0.98 bx 116.50 ± 2.02 by 138.25 ± 3.06 bz 0.5 Zn+0.1 Cd 88.29 ± 2.23 cx 93.67 ± 1.87 cx 110.82 ± 0.34 cy 77.37 ± 1.44 ax 79.34 ± 2.73 ax 80.88 ± 1.91 ax 5.0 Zn 148.90 ± 1.22 bx 178.20 ± 1.02 by 211.29 ± 1.62 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 110.67 ± 2.28 cx 119.51 ± 1.78 cx 142.48 ± 2.27 cy * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir zaman süreci dikkate alındığında O. niloticus un kan dokusundaki çinko düzeyi, hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde artış göstermiştir (Çizelge 4.1; SNK, P<5). Denenen tüm süreler sonunda karışımın 40

etkisindeki balıklarla doğrudan çinkonun etkisine bırakılan balıkların kan dokusundaki çinko düzeyleri arasında önemli bir istatistik ayrım vardır (Çizelge 4.1; SNK, P<5). Belirli bir süre sonunda kan dokusundaki çinko düzeyi karışımın etkisindeki balıklara oranla doğrudan çinkonun etkisinde kalan balıklarda önemli derecede yüksektir. 28 günlük süre sonunda kandaki çinko düzeyi, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisindeki balıklarda kontrole göre sırasıyla, %163 ve %78 düzeyinde bir artış göstermiştir. Belirli bir ortam derişiminde etkide kalma süresi ile çinko düzeyi arasında doğrusal bir ilişki vardır. Sürenin uzamasıyla kandaki çinko düzeyi de artmıştır (Çizelge 4.1; SNK, P<5). Çinko + kadmiyum karışımının belirli bir ortam derişimin de ise 7 ve 14 günlük süreler sonunda kandaki çinko düzeyinde önemli bir değişme olmaz iken 28 günlük süre sonunda çinko düzeyi önemli bir artış göstermiştir. Kan dokusunda süreye bağlı olarak gözlenen çinko düzeyindeki artışlar, metal karışımına oranla çinkonun tek başına etkisinde daha yüksek olmuştur. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla kan dokusundaki çinko düzeyi, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde sırasıyla, %43 ve %30 düzeyinde artış göstermiştir. Belirli bir sürenin sonunda O. niloticus un kan dokusundaki çinko düzeyi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.2-4.4 te verilmiştir. Denenen tüm sürelerde çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimleri artıkça kan dokusundaki çinko düzeyi de artmıştır. Bu artış hem metal hem de metal karışımının tüm ortam derişimleri arasında istatistik önem taşımaktadır (Şekil 4.2-4.4; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda çinko ve çinko + kadmiyumun her birinin ortam derişimindeki 10 katlık bir artışta kan dokusundaki çinko düzeyi sırasıyla, %34 ve %29 düzeyinde bir artış göstermiştir. 41

160 5.0 140 Çinko Düzeyi (µg/ml Kan) 120 100 80 60 40 0.5 0.5+0.1 5.0+1.0 20 0 Zn Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.2. 7. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko düzeyi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 200 180 5.0 Çinko Düzeyi (µg/ml Kan) 160 140 120 100 80 60 40 0.5 0.5+0.1 5.0+1,0 20 0 Zn Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.3. 14. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko düzeyi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 42

240 220 5.0 200 Çinko Düzeyi (µg/ml) 180 160 140 120 100 80 60 0.5 5.0+1.0 0.5+0.1 40 20 0 Zn Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.4. 28. günde O. niloticus un kan dokusunda çinko düzeyi üzerine çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 4.1.2. Kadmiyum Düzeyi O. niloticus un kan dokusundaki kadmiyum düzeylerini belirlemek amacıyla kadmiyum standartları ile absorbans arasındaki ilişkiyi gösteren regresyon doğrusu kullanılmıştır (Şekil 4.5). 0,26 0,24 0,22 0,20 Absorbans 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Y=58X+04 0 1 2 3 4 5 Kadmiyum Derişimleri (ppm Cd) Şekil 4.5. Kadmiyum derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki. 43

Kadmiyum standartlarının absorbans değerlerinden Y=58X+04 formülü bulunmuştur. Formülde X değeri kadmiyum derişimini, Y değeri de absorbansı göstermektedir. O. niloticus da belirlenen her derişim ve sürede altı tekrarlı olarak saptanan kadmiyum düzeylerinin aritmetik ortalamaları ve standart hataları ile farklı metal kombinasyonlarının ve etkide kalma sürelerinin doku birikimine etkisini saptamak amacıyla veriler SNK testi (Student Newman Keul s Test) ile analiz edilmiş ve sonuçlar Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelgede a ve b harfleri kadmiyum ve karışım arasındaki ayrımı; x, y ve z harfleri ise dokudaki metal birikimine sürenin etkisini belirtmek için kullanılmıştır. Çizelgede farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<5 düzeyinde istatistik ayrım vardır. Çizelge 4.2. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki kadmiyum düzeyi (µg/ml kan) DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 0 0 0 0.1 Cd 0.102 ± 02 ax 0.130 ± 04 ay 0.198 ± 29 az 0.5 Zn+0.1 Cd 90 ± 03 bx 0.106 ± 02 by 0.125 ± 02 bz 0 0 0 1.0 Cd 0.212 ± 01 ax 0.261 ± 01 ay 0.357 ± 37 az 5.0 Zn+1.0 Cd 0.188 ± 02 bx 0.212 ± 01 by 0.285 ± 01 bz * : a ve b harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir süre sonunda O. niloticus un kan dokusundaki kadmiyum düzeyi hem kadmiyumun tek başına hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde artış 44

göstermiştir. Denenen süreler sonunda karışım etkisindeki balıklarla doğrudan kadmiyumun etkisine bırakılan balıkların kan dokusundaki kadmiyum düzeyi arasında önemli bir istatistik ayrım vardır (Çizelge 4.2; SNK, P<5). Belirli bir süre sonunda kan dokusunda kadmiyum birikimi, karışımın etkisindeki balıklara oranla doğrudan kadmiyumun etkisinde kalan balıklarda daha yüksek olduğu ve çinkonun varlığında azaldığı saptanmıştır. Tüm ortam derişimlerinde kan dokusundaki kadmiyum düzeyi, hem kadmiyumun tek başına hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde süreye bağlı olarak artış göstermiştir (Çizelge 4.2; SNK, P<5). Süreye bağlı olarak kan dokusunda gözlenen kadmiyum düzeyindeki artışlar, metal karışımına oranla doğrudan kadmiyum etkisine bırakılan balıklarda daha yüksek olmuştur. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla kan dokusundaki kadmiyum düzeyi, yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinde sırasıyla, %69 ve %52 düzeyinde artış göstermiştir. Belirli bir sürenin sonunda O. niloticus un kan dokusundaki kadmiyum düzeyi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.6-4.8 te verilmiştir. Denenen tüm sürelerde kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimleri artıkça kan dokusundaki kadmiyum düzeyi de artmıştır. Bu artış hem metal hem de metal karışımının tüm ortam derişimleri arasında istatistik önem taşımaktadır (Şekil 4.2-4.4; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda kadmiyum ve çinko + kadmiyumun her birinin ortam derişimindeki 10 katlık bir artışta kan dokusundaki kadmiyum düzeyi sırasıyla, %80 ve %128 düzeyinde bir artış göstermiştir. 45

0,25 1.0 Kadmiyum Düzeyi (µg/ml Kan) 0,2 0,15 0,1 0,05 0.1 0.5+0.1 5.0+1.0 0 Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.6. 7. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum düzeyi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 0,3 1.0 Kadmiyum Düzeyi (µg/ml Kan) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0.1 0.5+0.1 5.0+1,0 0 Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.7. 14. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum düzeyi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 46

0,4 0,35 1.0 Kadmiyum Düzeyi (µg/ml) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0.1 Cd 5.0+1.0 0.5+0.1 Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.8. 28. günde O. niloticus un kan dokusunda kadmiyum düzeyi üzerine kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 4.2. Metal ve Metal Karışımlarının Kanın Fizyolojik Parametreleri Üzerine Etkileri 4.2.1. Alyuvar Sayısı O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede çinko ve çinko + kadmiyum karışımının alyuvar sayısına etkileri Çizelge 4.3 te verilmiştir. 7 günlük süre sonunda yalnızca yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin, 14 ve 28 günlük süreler sonunda ise tüm ortam derişimlerinin etkisinde alyuvar sayısı azalmıştır (P<5). Alyuvar sayısında gözlenen bu azalma, çinkonun doğrudan etkisine bırakılan balıklara oranla çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan balıklarda daha fazla olmuştur. 28 günlük süre sonunda kandaki alyuvar sayısı yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde kontrole göre sırasıyla, %28 ve %38 düzeyinde azalma göstermiştir. Bu durum Zn+Cd karışımının, çinkoya oranla alyuvar sayısını daha fazla düşürdüğünü göstermektedir. 47

Kan dokusundaki alyuvar sayısı, hem çikonun hem de çinko + kadmiyum karışımının tüm ortam derişimlerinde süreye bağlı olarak azalmış ve bu azalmaların çinkonun tek başına etkisine oranla metal karışımının etkisindeki balıklarda daha yüksek olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.3; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla alyuvar sayısı, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %23 ve %28 düzeyinde azalma göstermiştir. Çizelge 4.3. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta alyuvar sayısı (10 6 /µl) üzerine çinkonun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 1.76 ± 2 ax 1.75 ± 2 ax 1.77 ± 5 ax 0.5 Zn 1.71 ± 3 ax 1.63 ± 4 bx 1.50 ± 5 by 0.5 Zn+0.1 Cd 1.70 ± 2 ax 1.48 ± 3 cy 1.25 ± 5 cz 1.76 ± 2 ax 1.75 ± 2 ax 1.77 ± 5 ax 5.0 Zn 1.64 ± 3 bx 1.54 ± 3 by 1.27 ± 8 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 1.52 ± 3 cx 1.19 ± 5 cy 1.10 ± 9 cy * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının alyuvar sayısına etkileri Çizelge 4.4 te verilmiştir. 7 günlük süre sonunda yalnızca yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin, 14 ve 28 günlük süreler sonunda ise tüm ortam derişimlerinin etkisinde alyuvar sayısı azalmıştır (P<5). Alyuvar sayısında gözlenen bu azalma, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının arasında 28 günlük süre sonunda önemli olduğu (P<5) ve bu süre sonunda kadmiyumun doğrudan etkisine (%33 düzeyinde azalış) 48

oranla metal karışımının etkisine bırakılan balıklarda (%38 düzeyinde azalış) alyuvar sayısındaki azalmanın daha fazla olduğu gözlenmiştir. Alyuvar sayısı hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımının tüm ortam derişimlerinde süreye bağlı olarak azalmış (P<5) ve bu azalmaların, kadmiyumun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisindeki balıklarda daha fazla olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.4). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla alyuvar sayısı, yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %22 ve %28 düzeyinde azalma göstermiştir. Çizelge 4.4. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta alyuvar sayısı (10 6 /µl) üzerine kadmiyumun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 1.76 ± 2 ax 1.75 ± 2 ax 1.77 ± 5 ax 0.1 Cd 1.68 ± 4 ax 1.54 ± 3 by 1.35 ± 6 bz 0.5 Zn+0.1 Cd 1.70 ± 2 ax 1.48 ± 3 by 1.25 ± 5 cz 1.76 ± 2 ax 1.75 ± 2 ax 1.77 ± 5 ax 1.0 Cd 1.54 ± 2 bx 1.22 ± 9 by 1.20 ± 8 by 5.0 Zn+1.0 Cd 1.52 ± 3 bx 1.19 ± 5 by 1.10 ± 9 cy * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir sürenin sonunda O. niloticus un kan dokusundaki alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve bunların karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.9-4.11 te verilmiştir. Denenen tüm sürelerde, ortamda bulunan çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum derişimi artıkça kan dokusundaki alyuvar sayısı azalma göstermiştir. Bu azalma hem metal hem de metal karışımının tüm ortam derişimleri arasında istatistik önem 49

taşımaktadır (P<5). Yüksek ortam derişimleri baz alındığında 28 günlük süre sonunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum etkisinde alyuvar sayısı sırasıyla, %28, %33 ve %38 düzeyinde azaldığı belirlenmiştir. Bu durum alyuvar sayısının azalışı üzerine metallerin etkisinin; çinko+kadmiyum>kadmiyum>çinko şeklinde olduğunu göstermektedir. Alyuvar Sayısı (10 6 /µl) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0.5 0.1 0.5+0.1 5.0 1.0 5.0+1.0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.9. 7. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 50

Alyuvar Sayısı (10 6 /µl) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0,2 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.10. 14. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 2 1,8 Alyuvar Sayısı (10 6 /µl) 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0,2 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.11. 28. günde O. niloticus ta alyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 51

4.2.2 Akyuvar Sayısı O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede çinko ve çinko + kadmiyum karışımının akyuvar sayısına etkileri Çizelge 4.5 te verilmiştir. 7 günlük süre sonunda yalnızca yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin, 14 ve 28 günlük süreler sonunda ise tüm ortam derişimlerinin etkisinde akyuvar sayısı azalmıştır (P<5). Akyuvar sayısında gözlenen bu azalma, yalnızca 28 günlük süre sonunda hem çinkonun tek başına hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan balıklarda birbirinden istatistiksel olarak bir ayrım göstermiştir (P<5).. 28 günlük süre sonunda kandaki akyuvar sayısı kontrole göre yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde sırasıyla, %27 ve %36 düzeyinde azalma göstermiştir. Bu durum çinkonun kadmiyum varlığında akyuvar sayısını daha fazla düşürdüğünü göstermektedir. Belirli bir ortam derişiminde balıklarda akyuvar sayısı hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde süreye bağlı olarak azalmış (P<5) ve bu azalmaların, çinkonun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisindeki balıklarda daha fazla olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.5). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla alyuvar sayısı, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %22 ve %29 düzeyinde azalma göstermiştir. 52

Çizelge 4.5. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta akyuvar sayısı (10 3 /µl) üzerine çinkonun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 47.80 ± 8 ax 48.07 ± 0.20 ax 47.94 ± 0.10 ax 0.5 Zn 48.97 ± 4 ax 42.21 ± 8 by 49 ± 7 by 0.5 Zn+0.1 Cd 45.23 ± 5 ax 40.42 ± 3 by 34.10 ± 4 cz 47.80 ± 8 ax 48.07 ± 0.20 ax 47.94 ± 0.10 ax 5.0 Zn 44.21 ± 2 bx 43 ± 5 by 34.61 ± 9 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 42.18 ± 6 bx 37.01 ± 8 by 30.12 ± 0.11 cz * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının akyuvar sayısına etkileri Çizelge 4.6 da verilmiştir. 7 günlük süre sonunda yalnızca yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin, 14 ve 28 günlük süreler sonunda ise tüm ortam derişimlerinin etkisinde akyuvar sayısı azalmıştır (P<5). Akyuvar sayısında gözlenen bu azalmanın, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımı arasında istatistiksel bir ayrım göstermediği belirlenmiştir (P>5). Belirli bir ortam derişiminde balıklarda akyuvar sayısı hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımınının etkisinde süreye bağlı olarak azalmış (P<5) ve bu azalmaların kadmiyum derişiminin etkisine oranla metal karışımının etkisindeki balıklarda daha fazla olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.6). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla akyuvar sayısı, yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %23 ve %29 düzeyinde azalma göstermiştir. 53

Çizelge 4.6. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta akyuvar sayısı (10 3 /µl) üzerine kadmiyumun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 47.80 ± 8 ax 48.07 ± 0.20 ax 47.94 ± 0.10 ax 0.1 Cd 45.12 ± 5 ax 40.27 ± 7 by 35.12 ± 6 bz 0.5 Zn+0.1 Cd 45.23 ± 5 ax 40.42 ± 3 by 34.10 ± 4 bz 47.80 ± 8 ax 48.07 ± 0.20 ax 47.94 ± 0.10 ax 1.0 Cd 43.02 ± 4 bx 37.27 ± 9 by 33.02 ± 6 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 42.18 ± 6 bx 37.01 ± 8 by 30.12 ± 0.11 bz * : a ve b harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir sürenin sonunda O. niloticus un kan dokusundaki akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve bunların karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.12-4.14 te verilmiştir. 7 günlük sürenin sonunda yalnızca yüksek çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinde, 14 ve 28 günlük süreler sonunda ise tüm metal ve metal karışımlarında ortam derişimindeki artışa paralel olarak akyuvar sayısı azalmıştır. Bu azalma yalnızca 28 günlük süre sonunda çinko ve çinko + kadmiyum karışımının ortam derişimleri arasında istatistiksel bir ayrım göstermiştir (P<5). Yüksek ortam derişimleri baz alındığında 28 günlük süre sonunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum etkisinde akyuvar sayısı sırasıyla, %28, %31 ve %38 düzeyinde azaldığı belirlenmiştir. Bu durum akyuvar sayısının azalışı üzerine metallerin etkisinin; çinko+kadmiyum>kadmiyum>çinko şeklinde olduğunu göstermektedir. 54

60 Akyuvar Sayısı (10 3 /µl) 50 40 30 20 10 0 0.5 5.0 0.1 0.5+0.1 1.0 5.0+1.0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.12. 7. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 60 Akyuvar Sayısı (10 3 /µl) 50 40 30 20 10 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.13. 14. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 55

60 Akyuvar Sayısı (10 3 /µl) 50 40 30 20 10 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.14. 28. günde O. niloticus ta akyuvar sayısı üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 4.2.3. Hemoglobin Düzeyi O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede çinko ve çinko + kadmiyum karışımının hemoglobin düzeyine etkileri Çizelge 4.7 de verilmiştir. Düşük ortam derişimlerinde çinkonun tek başına etkisinde hemoglobin düzeyi tüm sürelerde artarken çinko + kadmiyum karışımının etkisinde azalış göstermiştir. Yüksek ortam derişimlerinde ise çinkonun doğrudan etkisinde hemoglobin düzeyi 7. günde artmış 14 ve 28. günlerde ise azalmışken çinko + kadmiyum karışımının etkisinde denenen tüm sürelerde azalmıştır (P<5). 28 günlük süre sonunda yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde hemoglobin düzeyi sırasıyla, %17 ve %29 düzeyinde azalış göstermiştir. Bu durum çinko ve kadmiyumun birlikte hemoglobin düzeyini daha fazla düşürdüğünü göstermektedir. Hemoglobin düzeyi, süreye bağlı olarak 0.5 mg/l Zn ortam derişiminde artarken denenen diğer tüm ortam derişimlerinde azalma göstermiştir (Çizelge 4.7; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla hemoglobin 56

düzeyi, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %21 ve %26 düzeyinde azalış göstermiştir. Çizelge 4.7. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemoglobin düzeyi (g/dl) üzerine çinkonun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 8.43 ± 2 ax 8.39 ± 3 ax 8.41 ± 4 ax 0.5 Zn 8.61 ± 3 ax 8.75 ± 4 bx 9.64 ± 5 by 0.5 Zn+0.1 Cd 8.33 ± 3 ax 8.18 ± 3 ax 7.51 ± 6 cy 8.43 ± 2 ax 8.39 ± 3 ax 8.41 ± 4 ax 5.0 Zn 8.89 ± 5 bx 8.12 ± 3 by 7.01 ± 4 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 8.10 ± 4 cx 7.95 ± 5 cx 5.98 ± 8 cy * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının hemoglobin düzeyine etkileri Çizelge 4.8 de verilmiştir. Kadmiyum ortam derişimlerinin tek başına etkisinde hemoglobin düzeyi 14. günde artmış, 28. günde ise bir azalma gösterirken çinko + kadmiyum ortam derişimlerinde denenen tüm süreler sonunda azalma göstermiştir (P<5). 28 günlük süre sonunda yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde hemoglobin düzeyi sırasıyla, %27 ve %30 düzeyinde azalış göstermiştir. Hemoglobin düzeyi, süreye bağlı olarak yalnızca düşük kadmiyum ortam derişiminde önce artmış sonra da azalmışken diğer metal ve metal karışımının tüm ortam derişimlerinde azalma göstermiştir (Çizelge 4.8; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla hemoglobin düzeyi, yüksek kadmiyum ve 57

çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %30 ve %26 düzeyinde azalış göstermiştir. Çizelge 4.8. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemoglobin düzeyi (g/dl) üzerine kadmiyumun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 8.43 ± 2 ax 8.39 ± 3 ax 8.41 ± 4 ax 0.1 Cd 8.68 ± 3 ax 8.90 ± 4 bx 8.06 ± 5 by 0.5 Zn+0.1 Cd 8.33 ± 3 ax 8.18 ± 3 cx 7.51 ± 6 cy 8.43 ± 2 ax 8.39 ± 3 ax 8.41 ± 4 ax 1.0 Cd 8.71 ± 4 bx 8.06 ± 3 by 6.11 ± 5 bz 5.0 Zn+1.0 Cd 8.10 ± 4 cx 7.95 ± 5 bx 5.98 ± 8 by * : a, b ve c harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir sürenin sonunda O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve bunların karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.15-4.17 te verilmiştir. Denenen tüm sürelerde çinkonun düşük ortam derişiminin etkisinde hemoglobin düzeyleri artarken yüksek ortam derişiminin etkisinde 7. günde artmış 14 ve 28. günlerde ise azalmıştır. Kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde ise önce bir artış daha sonrada bir azalış gözlenmiştir. Çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde ise hemoglobin düzeyi azalma göstermiştir. Yüksek ortam derişimleri baz alındığında 28 günlük süre sonunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum etkisinde hemoglobin düzeyi sırasıyla, %17, %27 ve %29 düzeyinde 58

azalma göstermiştir. Bu durum hemoglobin düzeyinin azalışı üzerine metallerin etkisinin; çinko+kadmiyum>kadmiyum>çinko şeklinde olduğunu göstermektedir. 12 Hemoglobin Düzeyi (g/dl) 10 8 6 4 2 5.0 1.0 0.5 0.1 0.5+0.15.0+1.0 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.15. 7. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 12 Hemoglobin Düzeyi (g/dl) 10 8 6 4 2 0 0.5 0.1 5.0 1.0 0.5+0.15.0+1.0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.16. 14. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 59

12 Hemoglobin Düzeyi (g/dl) 10 8 6 4 2 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.17. 28. günde O. niloticus ta hemoglobin düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 4.2.3. Hematokrit Düzeyi O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede çinko ve çinko + kadmiyum karışımının hematokrit düzeyine etkileri Çizelge 4.9 da verilmiştir. Belirli bir zaman süreci dikkate alındığında çinkonun doğrudan etkisinde hematokrit düzeyleri kontrol düzeylerine göre bir artış gösterirken, çinko + kadmiyum karışımının etkisinde sadece azalma göstermiştir (P<5). 28 günlük süre sonunda yüksek çinko + kadmiyum karışımının etkisinde hematokrit düzeyi %30 oranında bir azalma göstermiştir. Hematokrit düzeyi, süreye bağlı olarak yüksek ortam derişimlerinde hem çinkonun hem de metal karışımının etkisinde azalma göstermiştir (Çizelge 4.9; SNK, P<5). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla hematokrit düzeyi, yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %25 ve %26 düzeyinde bir azalma göstermiştir (P>5). 60

Çizelge 4.9. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemotokrit düzeyi (%) üzerine çinkonun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 29.01 ± 0.10 ax 29.17 ± 9 ax 28.97 ± 4 ax 0.5 Zn 34.96 ± 0.15 bx 33.28 ± 0.14 bx 30.47 ± 0.11 ax 0.5 Zn+0.1 Cd 27.38 ± 0.13 ax 26.23 ± 6 ax 23.12 ± 0.10 bx 29.01 ± 0.10 ax 29.17 ± 9 ax 28.97 ± 4 ax 5.0 Zn 36.49 ± 0.34 bx 32.10 ± 0.19 ay 27.04 ± 0.23 az 5.0 Zn+1.0 Cd 26.99 ± 0.15 ax 24.05 ± 9 bx 20.21 ± 0.14 by * : a ve b harfleri derişimleri; x, y ve z harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının hematokrit düzeyine etkileri Çizelge 4.10 da verilmiştir. Belirli bir zaman süreci dikkate alındığında hematokrit düzeyleri hem kadmiyumun tek başına hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde azaldığı ve bu azalışların metal ve metal karışımlarının düşük ortam derişimlerinde 28 günlük süre sonunda yüksek ortam derişimlerinde ise 14. günden itibaren istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<5). 28 günlük süre sonunda yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisinde hematokrit düzeyi kontrole göre sırasıyla, %20 ve %30 düzeyinde azalma göstermiştir. Kadmiyumun doğrudan etkisine oranla çinko + kadmiyum un etkisinde hematokrit düzeyininin daha fazla azaldığı belirlenmiştir. Hematokrit düzeyi, süreye bağlı olarak yüksek ortam derişimlerinde hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde azaldığı ve bu azalışların kadmiyumun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisindeki balıklarda daha fazla olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.10; SNK, P<5). 28 günlük 61

süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla hematokrit düzeyi, yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisinde sırasıyla, %17 ve %26 düzeyinde bir azalma göstermiştir. Çizelge 4.10. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta hemotokrit düzeyi (%) üzerine kadmiyumun etkisi DERİŞİM (ppm) SÜRE (GÜN) 7 14 28 X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * 29.01 ± 0.10 ax 29.17 ± 9 ax 28.97 ± 4 ax 0.1 Cd 28.13 ± 0.12 ax 27.50 ± 0.10 ax 25.17 ± 0.15 bx 0.5 Zn+0.1 Cd 27.38 ± 0.13 ax 26.23 ± 6 ax 23.12 ± 0.10 bx 29.01 ± 0.10 ax 29.17 ± 9 ax 28.97 ± 4 ax 1.0 Cd 28.00 ± 9 ax 25.01 ± 5 by 23.12 ± 0.16 by 5.0 Zn+1.0 Cd 26.99 ± 0.15 ax 24.05 ± 9 by 20.21 ± 0.14 by * : a ve b harfleri derişimleri; x ve y harfleri süreler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<5). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir süre sonunda O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve bunların karışımlarının etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistiksel analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.18-4.20 de verilmiştir. Çinko ortam derişimlerinin etkisinde hematokrit düzeyi, kontrol değerlerine göre genelde bir artış gösterirken, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımında ise düşük derişimlerde 28. günde yüksek ortam derişimlerinde ise 14 ve 28. günde bir azalma göstermiştir. Yüksek ortam derişimlerinde çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisinde 28 günlük süre sonunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hematokrit düzeyi sırasıyla, %7, %20 ve %30 düzeyinde azalma göstermiştir. Bu durum hematokrit düzeyinin azalışı üzerine metallerin etkisinin; çinko+kadmiyum>kadmiyum>çinko şeklinde olduğunu göstermektedir. 62

Hematokrit Düzeyi (%) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0.5 5.0 0.1 0.5+0.15.0+1.0 1.0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.18. 7. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi Hematokrit Düzeyi (%) 35 30 25 20 15 10 5 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.19. 14. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 63

Hematokrit Düzeyi (%) 35 30 25 20 15 10 0.5 5.0 0.1 1.0 0.5+0.1 5.0+1.0 5 0 Zn Cd Zn+Cd Metal Derişimleri (ppm) Şekil 4.20. 28. günde O. niloticus ta hematokrit düzeyi üzerine çinko, kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişimlerinin etkisi 64

4.3. Metal ve Metal Karışımının Kan Dokusunda Elektroforetik Separasyonlar Üzerine Etkisi 4.3.1. Hemoglobin Elektroforezi O. niloticus ta kan dokusunun Selüloz Asetat Elektroforezi (CAE) ile separe edilmesi sonucunda, yoğunlukları farklı birçok hemoglobin bandı elde edilmiştir. 1 2 3 4 5 6 7 (-) hb3 hb2 hb1 Şekil 4.21. Hemoglobin moleküllerinin Selüloz Asetat Elektroforezi ile analizi (+) Şekil 4.21, hemoglobin moleküllerinin elektroforez sonuçlarını göstermektedir. Örnek sırası; 1- kontrol; 2-0.5 ppm Zn; 3-5.0 ppm Zn; 4-0.1 ppm Cd; 5-1.0 ppm Cd; 6-0.5+0.1 ppm Zn+Cd; 7-5.0+1.0 ppm Zn+Cd ortamlarındaki hemoglobin bandlarını (hb1, hb2 ve hb3) göstermektedir. 65

Denenen tüm derişim ve sürelerde balıkların kan dokusunda SAE ile 2 tane anodik, 1 tane de katodik bölgede olmak üzere 3 tane hemoglobin bandı (hb) elde edilmiştir (Şekil 4.21). Bu bandlar kontrol ve metallerin etkisindeki deney gruplarının tamamında gözlenmiştir. Elektroforez ortamındaki hızlarına göre bu hemoglobin bandları, en hızlı hareket edenden en yavaş hareket edene kadar sırasıyla; hemoglobin bandı 1 (hb1), hemoglobin bandı 2 (hb2) ve hemoglobin bandı 3 (hb3) olarak isimlendirilmiştir. Denenen her derişim ve sürede elektroforez sonucu elde edilen bu üç hemoglobin bandındaki protein yoğunluklarının dansitometredeki ölçümleri, şekil 4.22-42 de verilmiştir O. niloticus ta belirlenen her derişim ve süre için çinko ve çinko + kadmiyum karışımının hemoglobin bandlarındaki protein yoğunlukları üzerine etkileri çizelge 4.11 de verilmiştir. Denenen süreler dikkate alındığında hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde denenen tüm süreler sonunda protein yoğunluğu bakımından hb2 önemli bir değişim göstermemiş; hb1 azalırken; hb3 ise artış göstermiştir. Yüksek ortam derişimlerinde gözlenen hb1 deki azalışın ve hb3 deki artışın, çinkonun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisinde daha fazla olduğu belirlenmiştir. 28. günde yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde hemoglobin bandlarının protein yoğunluklarında ki değişimler kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hb1 in protein yoğunluğu sırasıyla,%40 ve %53 düzeyinde azalma; hb3 ün protein yoğunluğu ise sırasıyla, %89 ve %107 düzeyinde artış göstermiştir. Belirli bir ortam derişiminde etki süresine bağlı olarak hb1 in protein yoğunluğu çinkonun ve çinko + kadmiyum karışımının düşük ortam derişiminde önce bir artma sonrada bir azalma göstermiş, yüksek ortam derişlimlerinde ise sadece azalma göstermiştir. Hb3 ün protein yoğunluğu ise süreye bağlı olarak çinkonun ve metal karışımının etkisinde artış göstermiştir. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminde hb1 in protein yoğunlğu sırasıyla, %31 ve %24 düzeyinde azalma; hb3 ün protein yoğunluğu ise sırasıyla, %53 ve %138 düzeyinde artış göstermiştir. 66

Çizelge 4.11. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus taki hemoglobin bandlarının elektroforetik protein analizi 7. Gün 14. Gün 28. Gün Hemoglobin Bandları 1 2 3 1 2 3 1 2 3 28.5 51.5 2 28.5 51.5 2 28.5 51.5 2 Her bir 0.5 Zn 21.9 50.7 27.4 23.2 48.9 27.9 10.8 50.5 38.7 Hemoglobin 0.5 Zn+0.1 Cd 22.8 51.3 25.7 26.1 48.1 25.8 21.8 47.1 31.1 Bandındaki Protein Yüzdesi 5.0 Zn 28.5 24.8 51.5 51.3 2 24.6 28.5 22.4 51.5 47.2 2 30.4 28.5 17.0 51.5 49.2 2 37.8 5.0 Zn+1.0 Cd 17.4 52.9 29.7 15.4 45.7 38.9 13.3 45.3 41.4 O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının hemoglobin bandlarındaki protein yoğunlukları üzerine etkileri çizelge 4.12 de verilmiştir. Belirli bir zaman süreci dikkate alındığında hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde denenen tüm süreler sonunda protein yoğunluğu bakımından hb2 önemli bir değişim göstermemiş; hb1 azalırken; hb3 ise artış göstermiştir. Yüksek ortam derişimlerinde gözlenen hb1 deki azalışın ve hb3 deki artışın, kadmiyumun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisinde daha fazla olduğu belirlenmiştir. 28 günlük süre sonunda hemoglobin bantlarının protein yoğunluklarındaki değişimler kontrol grubuyla karşılaştırıldığında yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminin etkisinde hb1 in protein yoğunluğu sırasıyla, %37 ve %53 düzeyinde azalma; hb3 ün protein yoğunluğu ise sırasıyla, %66 ve %107 düzeyinde artış göstermiştir. Belirli bir ortam derişiminde etki süresine bağlı olarak hb3 ün protein yoğunluğu hem kadmiyum hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde artış göstermiştir. Yüksek ortam derişiminde süreye bağlı olarak gözlenen bu artışın, kadmiyumun doğrudan etkisine oranla metal karışımının etkisinde daha fazla olduğu belirlenmiştir. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminde hb3 ün protein yoğunluğu sırasıyla, %59 ve %138 düzeyinde artış göstermiştir. 67

Çizelge 4.12. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus taki hemoglobin bandlarının elektroforetik protein analizi 7. Gün 14. Gün 28. Gün Hemoglobin Bandları 1 2 3 1 2 3 1 2 3 28.5 51.5 2 28.5 51.5 2 28.5 51.5 2 Her bir 0.1 Cd 17.9 54.5 27.6 26.1 46.6 27.7 24.3 47.3 28.4 Hemoglobin 0.5 Zn+0.1 Cd 22.8 51.3 25.7 26.1 48.1 25.8 21.8 47.1 31.1 Bandındaki Protein Yüzdesi 1.0 Cd 28.5 20.8 51.5 53.8 2 25.4 28.5 24.4 51.5 47.6 2 28.8 28.5 18.0 51.5 48.9 2 33.1 5.0 Zn+1.0 Cd 17.4 52.9 29.7 15.4 45.7 38.9 13.3 45.3 41.4 68

Hemoglobin Bandları % 1 28.5 2 55.5 3 2 1 2 3 Şekil 4.22. 7. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 21.9 2 50.7 3 27.4 1 2 3 Şekil 4.23. 7. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 24.8 2 51.3 3 24.6 1 2 3 Şekil 4.24. 7. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 69

Hemoglobin Bandları % 1 17.9 2 54.5 3 27.6 1 2 3 Şekil 4.25. 7. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 20.8 2 53.8 3 25.4 1 2 3 Şekil 4.26. 7. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 22.8 2 51.3 3 25.7 1 2 3 Şekil 4.27. 7. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 70

1 17.4 2 52.9 3 29.7 1 2 3 Şekil 4.28. 7. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 28.5 2 51.5 3 2 1 2 3 Şekil 4.29. 14. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 23.2 2 48.9 3 27.9 1 2 3 Şekil 4.30. 14. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 71

Hemoglobin Bandları % 1 22.4 2 47.2 3 30.4 1 2 3 Şekil 4.31. 14 günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 26.1 2 46.6 3 27.7 1 2 3 Şekil 4.32. 14. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 24.4 2 47.6 3 28.8 1 2 3 Şekil 4.33. 14. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 72

1 26.1 2 48.1 3 25.8 1 2 3 Şekil 4.34. 14. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 15.4 2 45.7 3 38.9 1 2 3 Şekil 4.35. 14. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 28.5 2 51.5 3 2 1 2 3 Şekil 4.36. 28. günde kontrol balıklarının hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 73

1 10.8 2 50.5 3 38.7 1 2 3 Şekil 4.37. 28. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 17.0 2 49.2 3 37.8 1 2 3 Şekil 4.38. 28. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 24.3 2 47.3 3 28.4 1 2 3 Şekil 4.39. 28. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 74

Hemoglobin Bandları % 1 18.0 2 48.9 3 33.1 1 2 3 Şekil 4.40. 28. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 21.8 2 47.1 3 31.1 1 2 3 Şekil 4.41. 28. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri Hemoglobin Bandları % 1 13.3 2 45.3 1 2 3 Şekil 4.42. 28. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarda hemoglobin bandlarının dansitometrik ölçümleri 3 41.4 75

4.3.2. Protein Elektroforezi O. niloticus ta plazmanın Selüloz Asetat Elektroforezi (CAE) ile separe edilmesi sonucunda, yoğunlukları farklı birçok protein bandı elde edilmiştir. Bu proteinler, markır proteinine göre değerlendirilip molekül ağırlıkları yaklaşık olarak hesaplanmıştır. M 1 2 3 4 5 6 7 (-) 273 kda 176 kda 132 kda 120 kda 94 kda 87 kda 78 kda 68 kda 60 kda Şekil 4.43. Plazma porteinlerinin Selüloz Asetat Elektroforezi ile analizi (+) Şekil 4.43, plazma proteinlerinin elektroforez sonuçlarını göstermektedir. Örnek sırası; 1- kontrol; 2-0.5 ppm Zn; 3-5.0 ppm Zn; 4-0.1 ppm Cd; 5-1.0 ppm Cd; 6-0.5+0.1 ppm Zn+Cd; 7-5.0+1.0 ppm Zn+Cd ortamlarındaki protein bandlarını ve M harfi ise markır proteini olan serum albumini (68 kda) göstermektedir. Denenen tüm derişim ve sürelerde balıkların plazmasında CAE ile 60, 78, 87 ve 94 kda luk 4 tane orta molekül ağırlıkta ve 120, 132, 176 ve 273 kda luk 4 tane 76

de yüksek molekül ağırlıkta olmak üzere toplam sekiz protein bandı elde edilmiştir (Şekil 4.43). Bu bandlar kontrol ve metallerin etkisindeki deney gruplarının tamamında gözlenmiştir. Her derişim ve sürede plazma örneklerinin elektroforetik analizinden sonra oluşan bu 8 bandın protein yoğunluklarının dansitometredeki ölçümleri, şekil 4.44-64 te verilmiştir. Şekillerde görülen fraksiyon sıralaması (fraksiyon1 fraksiyon 8), aynı zamanda elektroforez ortamındaki büyüklüklerine göre en düşük molekül ağırlığına sahip bandan en yüksek molekül ağırlığına sahip banda kadar olan sıralamayı da (60 kda 273 kda) içermektedir. O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede elektroforetik separasyondan sonra oluşan plazma bandlarının protein yoğunlukları üzerine çinkonun ve çinko + kadmiyum karışımının etkileri çizelge 4.13-15 te verilmiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde protein yoğunluğu; 60, 78 ve 94 kda luk orta molekül ağırlıktaki protein (OMAP) bandlarında denenen tüm süreler; 120, 132 ve 176 kda luk yüksek molekül ağırlıktaki protein (YMAP) bandlarında ise 14 ve 28 günlük süreler sonunda kontrole göre artış göstermiştir. OMAP bandlarının yoğunluklarındaki en yüksek artışlar, 28. gün sonunda gözlenmiştir. Çizelge 4.18 de de görüldüğü gibi 28. gün sonunda yüksek ortam derişiminde OMAP ve YMAP bandlarının protein yoğunluklarında gözlenen artışlar hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde birbirine yakın değerlerde olup metal ve metal karışımı arasında önemli bir fark göstermemiştir. Belirli bir ortam derişiminde etki süresine bağlı olarak yalnızca 78 kda luk OMAP ve 132 kda luk YMAP bandının protein yoğunluğu hem çinkonun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde önemli düzeylerde artış göstermiştir. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla yüksek çinko ve çinko + kadmiyum ortam derişiminde protein yoğunluğu; 78 kda luk OMAP bandında sırasıyla, %85 ve %104; 132 kda luk YMAP bandında ise sırasıyla, %60 ve %50 düzeyinde artış göstermiştir. 77

Çizelge 4.13. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 7 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 13.0 1.4 27.9 11.9 11.7 11.6 15.1 7.9 0.5 Zn 14.4 1.6 24.7 15.1 12.0 10.6 14.2 7.5 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 15.2 1.8 14.4 19.4 12.8 11.5 17.0 7.7 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 5.0 Zn 13.0 16.1 1.4 2.7 27.9 23.6 11.9 15.2 11.7 12.7 11.6 9.2 15.1 13.4 7.9 7.2 5.0 Zn+1.0 Cd 16.9 2.4 12.8 19.5 12.8 10.8 17.0 6.9 Çizelge 4.14. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 14 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 12.1 1.5 29.4 11.2 11.2 10.6 14.2 9.8 0.5 Zn 14.9 1.9 14.2 16.3 14.1 13.9 17.7 8.0 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 14.7 3.7 5.0 20.6 15.2 15.4 19.5 5.7 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 5.0 Zn 12.1 17.2 1.5 4.0 29.4 7.4 11.2 18.9 11.2 17.1 10.6 13.6 14.2 17.2 9.8 4.4 5.0 Zn+1.0 Cd 16.1 3.5 8.7 20.7 15.7 13.5 17.7 4.2 78

Çizelge 4.15. Çinko ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 28 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 12.7 1.8 29.3 10.4 10.3 10.9 13.7 8.9 0.5 Zn 16.3 4.9 11.2 17.1 14.1 14.5 17.8 4.0 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 17.2 6.0 5.1 18.7 14.0 17.6 17.4 4.0 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 5.0 Zn 12.7 19.0 1.8 5.0 29.3 6.9 10.4 19.9 10.3 13.6 10.9 14.7 13.7 17.3 8.9 3.7 5.0 Zn+1.0 Cd 20.2 4.9 4.8 19.1 13.2 16.1 17.7 4.3 O. niloticus ta belirlenen her derişim ve sürede elektroforetik separasyondan sonra oluşan plazma bandlarının protein yoğunlukları üzerine kadmiyumun ve çinko + kadmiyum karışımının etkileri çizelge 4.16-18 de verilmiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde protein yoğunluğu; 60, 78 ve 94 kda luk OMAP bandlarında denenen tüm süreler; 120, 132 ve 176 kda luk YMAP bandlarında ise 14 ve 28 günlük süreler sonunda kontrole göre artış göstermiştir. OMAP bandlarının yoğunluklarındaki en yüksek artışlar, 28. gün sonunda gözlenmiştir. Çizelge 4.19 da da görüldüğü gibi 28. gün sonunda yüksek ortam derişiminde protein yoğunluğundaki artış; OMAP bandlarında kadmiyumun tek başına etkisine oranla metal karışımının etkisinde; YMAP bandlarında ise metal karışımının etkisine oranla kadmiyumun tek başına etkisinde daha fazla olduğu belirlenmiştir. Belirli bir ortam derişiminde etki süresine bağlı olarak yalnızca 78 kda luk OMAP ve 132 kda luk YMAP bandının protein yoğunluğu hem kadmiyumun hem de çinko + kadmiyum karışımının etkisinde önemli düzeylerde artış göstermiştir. 28 günlük süre sonunda 7 günlük süre sonuna oranla yüksek kadmiyum ve çinko + kadmiyum ortam derişiminde protein yoğunluğu; 78 kda luk OMAP bandında 79

sırasıyla, %66 ve %104; 132 kda luk YMAP bandında ise sırasıyla, %58 ve %50 düzeyinde artış göstermiştir. Çizelge 4.16. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 7 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 13.0 1.4 27.9 11.9 11.7 11.6 15.1 7.9 0.1 Cd 14.9 2.1 22.0 15.8 12.2 12.4 13.6 7.0 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 15.2 1.8 14.4 19.4 12.8 11.5 17.0 7.7 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 1.0 Cd 13.0 14.7 1.4 2.3 27.9 20.2 11.9 16.4 11.7 13.1 11.6 10.3 15.1 16.0 7.9 7.1 5.0 Zn+1.0 Cd 16.9 2.4 12.8 19.5 12.8 10.8 17.0 6.9 Çizelge 4.17. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 14 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 12.1 1.5 29.4 11.2 11.2 10.6 14.2 9.8 0.1 Cd 14.8 3.8 11.0 16.7 17.5 13.9 17.2 4.9 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 14.7 3.7 3.0 20.6 15.2 15.4 19.5 7.7 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 1.0 Cd 12.1 15.0 1.5 3.4 29.4 8.9 11.2 17.8 11.2 17.9 10.6 14.1 14.2 18.1 9.8 4.7 5.0 Zn+1.0 Cd 16.1 3.5 8.7 20.7 15.7 13.5 17.7 4.2 80

Çizelge 4.18. Kadmiyum ve çinko + kadmiyum karışımının etkisine bırakılan O. niloticus ta 28 günlük süre sonundaki plazma protein bandlarının elektroforetik protein analizi Fraksiyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8 12.7 1.8 29.3 10.4 10.3 10.9 13.7 8.9 0.1 Cd 16.0 5.6 12.5 15.2 13.3 14.1 18.8 5.0 Her bir 0.5 Zn+0.1 Cd 17.2 6.0 5.1 18.7 14.0 17.6 17.4 4.0 Fraksiyondaki Protein Yüzdesi 1.0 Cd 12.7 18.8 1.8 3.8 29.3 6.0 10.4 18.0 10.3 14.5 10.9 16.3 13.7 18.6 8.9 4.0 5.0 Zn+1.0 Cd 20.2 4.9 4.8 19.1 13.2 16.1 17.7 4.3 Çizelge 4.19. 28. günde yüksek Zn, Cd ve Zn+Cd ortam derişiminin etkisinde O. niloticus un plazmasındaki elektroforetik bandların protein yoğunluğunda kontrol grubuna oranla gözlenen yüzde (%) artışlar Protein Bandları (kda) METALLER (ppm) 5.0 Zn 1.0 Cd 5.0+1.0 Zn+Cd 60 50 40 60 78 178 111 172 94 91 73 84 120 32 41 28 132 35 50 48 176 27 36 29 81

Fraksiyon % 1 13.0 2 1.4 3 27.9 4 11.9 5 11.7 6 11.6 7 15.1 8 7.9 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.44. 7. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 14.4 2 1.6 3 24.7 4 15.1 5 12.0 6 10.6 7 14.2 8 7.5 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.45. 7. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 16.1 2 2.7 3 23.6 4 15.2 5 12.7 6 9.2 7 13.4 8 7.2 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.46. 7. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 82

Fraksiyon % 1 14.9 2 2.1 3 22.0 4 15.8 5 12.2 6 12.4 7 13.6 8 7.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.47. 7. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 14.7 2 2.3 3 20.2 4 16.4 5 13.1 6 10.3 7 16.0 8 7.1 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.48. 7. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 15.2 2 1.8 3 14.4 4 19.4 5 12.8 6 11.5 7 17.0 8 7.7 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.49. 7. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 83

Fraksiyon % 1 16.9 2 2.4 3 12.8 4 19.5 5 12.8 6 10.8 7 17.0 8 6.9 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.50. 7. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 12.1 2 1.5 3 29.4 4 11.2 5 11.2 6 10.6 7 14.2 8 9.8 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.51. 14. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 14.9 2 1.9 3 14.2 4 16.3 5 14.1 6 13.9 7 17.7 8 8.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.52. 14. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 84

Fraksiyon % 1 17.2 2 4.0 3 7.4 4 18.9 5 17.1 6 13.6 7 17.2 8 4.4 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.53. 14. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 14.8 2 3.8 3 11.0 4 16.7 5 17.5 6 13.9 7 17.2 8 4.9 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.54. 14 günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 15.0 2 3.4 3 8.9 4 17.8 5 17.9 6 14.1 7 18.1 8 4.7 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.55. 14. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 85

1 14.7 2 3.7 3 3.0 4 20.6 5 15.2 6 15.4 7 19.5 8 7.7 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.56. 14. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 16.1 2 3.5 3 8.7 4 20.7 5 15.7 6 13.5 7 17.7 8 4.2 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.57. 14. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 12.7 2 1.8 3 29.3 4 10.4 5 10.3 6 10.9 7 13.7 8 8.9 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.58. 28. günde kontrol balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 86 Fraksiyon %

1 16.3 2 4.9 3 11.2 4 17.1 5 14.1 6 14.5 7 17.8 8 4.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.59. 28. günde 0.5 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 19.0 2 5.0 3 6.9 4 19.9 5 13.6 6 14.7 7 17.3 8 4.3 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.60. 28. günde 5.0 ppm Zn etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 16.0 2 5.6 3 12.5 4 15.2 5 13.3 6 14.1 7 18.8 8 5.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.61. 28. günde 0.1 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 87

Fraksiyon % 1 18.8 2 3.8 3 6.0 4 18.0 5 14.5 6 16.3 7 18.6 8 4.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.62. 28. günde 1.0 ppm Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 17.2 2 6.0 3 5.1 4 18.7 5 14.0 6 17.6 7 17.4 8 4.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.63. 28. günde 0.5 + 0.1 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri Fraksiyon % 1 20.2 2 4.9 3 4.8 4 19.1 5 13.2 6 16.1 7 17.7 8 4.3 1 2 3 4 5 6 7 8 Şekil 4.64. 28. günde 5.0 + 1.0 ppm Zn + Cd etkisindeki balıklarının plazmasındaki protein bandlarının dansitometrik ölçümleri 88