ÖZEL EGE LİSESİ PANKREAS KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE DEGUELİN ETKİSİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Doğa DAĞ Semra Ece AKAT DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Cansel BARANSEL İZMİR 2017
İÇİNDEKİLER Sayfa 1. GİRİŞ..1 1.1. Kanser.. 1 1.2. Pankreas...1 1.3. Pankreas Kanseri.....1 1.3.1. Pankreas Tümörleri ve Yayılımı.2 1.3.2. Başvuru Semptomları ve Belirtiler.2 1.3.3. Semptomların Tedavisi... 2 1.4. Kanserli Kök Hücre.....2 1.5. Apoptoz...2 1.6. Projenin Amacı....2 2. YÖNTEM... 3 2.1. Mia Hücreleri...3 2.2. Hücre Kültürü.. 3 2.3. Deguelin...3 2.3.1. Deguelin ve 5-FU Doz Hesabı 4 2.4. Tripan Mavisi ve WST-I Canlılık Testi...5 2.5. Doğal Bileşiklerde Doğru Doz ve Doğu Ajan Seçimi. 5 2.6. CD133+ Mia Kök Hücrelerinin İzolasyonu....6 2.7. Akım Sitometri ile CD133 Pozitifliğinin Konfirmasyonu...7 2.8. 12 Well Plate İçinde LD50 Doz ve Kombinasyonlarının Uygulanması..7 2.9. Annexin ve PI Boyanması...7 3. BULGULAR...8 3.1. WST-1 Canlılık Testi Sonuçları... 8 3.2. Akım Sitometrik Analiz Sonucu.. 9 3.3. Apoptoz Sonuçları.....10 4. SONUÇ VE TARTIŞMA....14 5. ÖNERİLER.. 14 KAYNAKLAR....15
1. GİRİŞ: 1.1. Kanser Kanser vücudumuzun çeşitli bölgelerindeki hücrelerin kontrolsüz çoğalması ile oluşan 100'den fazla hastalık grubudur.çok çeşitli kanser tipleri olmasına rağmen, hepsi anormal hücrelerin kontrol dışı çoğalması ile başlar. Tedavi edilmez ise ciddi rahatsızlıklara, hatta ölüme dahi neden olabilir. Hepimizin vücudunda kanser hücrelerinin olduğunu önlemek size şaşırtıcı gelebilir. Kanser; hücrelerin normalden farklı davranmaya yani büyüyüp, çoğalıp yayılmaya başladıklarında oluşur. Bu durum vücut içindeki bir devrimi andırır; bir grup hücre, organizmanın kalanıyla uyum içinde çalışmayı bırakıp peş peşe isyan çıkarır. Hepimiz kanser hücresi üretiriz ve arada tek tük isyankâr hücrelerin çıkması da olağandır. Sağlıklı bir bireyin bağışıklık sisteminin yaptığı şey, böyle suçluları bir kitle ya da tümör oluşturmadan izole edilip ortadan kaldırmaktır. Kanserde ise bağışıklık sistemi yenik düşer ve kanser yayılır. Bunun nasıl ve neden oluştuğunu anlamak kanseri önlemenin anahtarıdır. [1] 1.2. Pankreas Pankreas, karın bölgesinde, midenin arkasında bulunur ve vücudun hayati organlarından biridir. Duodenuma (incebağırsağın ilk kısmı) ve safra kesesi ile ortak bir kanalla açılır. Pankreas iki ayrı fonksiyonu yerine getirir. Birincisi bağırsak kanalına akıtılan pankreas sıvısını yapmaktır. Bu sıvı sindirim enzimleri içerir. Pankreas ta sindirim enzimleri asinüs hücrelerinde yapılır. Bu enzimlerin ince bağırsağa olan akışı vagus siniri ile bağırsak mukozasında üretilen sekretin ve pankreozimin adlı enzimler tarafından denetlenir. İkincisi endokrin organ olarak insülin ve glukagon salgılayarak doğrudan kana verir. Bu hormonlar kan şekeri seviyesini düzenler.[2] 1.3. Pankreas Kanseri Pankreas kanseri, sindirimi bozan ve gerektiği gibi beslenmeyi engelleyen nadir bir kanser türüdür. Salgı fonksiyonu ile gıdanın bağırsaktan emilmesi, mide ve safra kesesinin düzenli çalışmasının organize edilmesi ve kan şekeri düzeylerinin ayarlanmasında rolü olan bu organın kanseri olan pankreas kanserine, Türkiye de her yıl yaklaşık 4.000 kişi yakalanmaktadır. Yakalanan erkek sayısı, kadın sayısından fazladır.[3] Risk faktörleri: Meyve ve sebzelerin az tüketimi, lifli besinlerin az tüketimi, kırmızı ve işlenmiş etten zengin beslenme, alkol, sigara ve tüm çalışmalarda aynı sonuca varılsa da muhtemelen aşırı kahve tüketimi. Önleme: Günlük alınması gerekenler; folat, C-A-E vitaminleri gibi antioksidanlar ve selenyumdur. Bunlara ek olarak meyve ve sebzeler bakımından zengin, az alkol ve et içeren bir beslenme şekli benimsenmelidir. Sigara içilmemeli ve kahve aşırı miktarda tüketilmemeli. Her gün en az 30 dakika egzersiz yapılmalı. Besin desteği: A vitamini, C vitamini, E vitamini ve selenyumun maksimum destek düzeyinde alınması önerilir (bir beslenme uzmanının belirlediği şekilde). Sindirim enzimleri ve özel olarak hazırlanan yemek, çorba ve meyve suları, sindirime yardım etmek ve besinlerin emilimi açısından gerekli olabilir. [1] -1-
1.3.1. Pankreas Tümörleri ve Yayılımı Pankreas tümör oluşumunun sık görüldüğü bir organdır. Çok ender olmakla birlikte iyi huylu tümörler de görülebilir. Bunlardan insülinom adı verilenler Langerhans adacıklardan kaynaklanır; bunlar metabolizma ve iç salgı sisteminde bozukluklarla ortaya çıkan bir tabloya yol açar. Kötü huylu pankreas tümörlerine daha sık rastlanır; bunlardan en sık görüleni pankreas karsinomudur. Kötü huylu tümörler pankreas dokusundan olduğu kadar başka organlardan da (örneğin; mide, kalınbağırsak, safra yolları) kaynaklanabilir. Doğrudan pankreas dokusundan kaynaklanan kötü huylu tümörler ile başka organlardan yayılan tümörleri, hastalığın evrelerinde birbirinden ayırmak olanaksız olabilir. En sık pankreas başında daha sonra gövde ve kuyrukta yer alır. Pankreas tümörleri sigara içenlerde içmeyenlere oranla 2-2.5 kat daha çok görülmektedir. Şeker hastalarında da daha sık görülür.[3] 1.3.2. Başvuru Semptomları ve Belirtiler Pankreas kanserinin ilk semptomları tesadüfîdir. Hastaların çoğu tanı koyulana kadar nonspesifik semptomlara sahiptir. Çoğu ameliyat edilememesine rağmen pankreas başındaki tümörler bazen safra kanalı obstrüksiyonuna ve oldukça erken evrede sarılığa sebep olur. Halsizlik, kilo kaybı, karın ve sırt ağrıları, sarılık, açık renkli gaita, koyu renkli idrar, kaşıntı, bulantı, kusma, erken tokluk hissi, glikoz intoleransı en sık görülen başvuru semptomlarıdır. Hastaların büyük bir yüzdesinde depresyon görülürken kan pıhtılaşmasının yüksek oluşundan dolayı bazı hastalarda tromboflebit meydana gelir. [8] 1.3.3. Semptomların Tedavisi Pankreas kanserinin tedavisi, kanserin aşaması ve sınıfına, oluştuğu ve büyüdüğü bölgeye, hastanın yaşı, medikal geçmişi ve tercih ettiği tedavi yöntemlerine göre değişiklik gösterebilir. [8] 1. Cerrahi Müdahale/Ameliyat a) Whipple Operasyonu b) Bütün Pankreatektomi c) Distal Pankreatektomi d) Cerrahi Safra Bypassı e) Endoskopik Stent Yerleştirilmesi f) Gastrik Bypass 2. Radyasyon Terapisi 3. Kemoterapi 4. Kemoradyoterapi 5. Hedeflenmiş Tedavi 1.4. Kanserli Kök Hücre Kanser Kök Hücresi (KKH), kendini yenileyebilme ve kanser kitlesini oluşturan hücrelere dönüşebilme kapasitesine sahip bir grup tümör hücresidir. Tümörlerde veya hematolojik kanserlerde görüldüğü için tümörijenik (tümör oluşturucu) olmayan diğer kanser hücrelerinin tersine tümörijeniktir. Ayrı bir nüfus oluşturarak tümörlerde kalıp nükse ya da metastaza neden olurlar. KKH ler, tümörün çok küçük bir kısmını oluşturduklarından, bu kök hücreler üzerinde etki eden ilaç tam olarak seçilemeyebilir. 1.5. Apoptoz Çok hücreli organizmalarda görülen, genetik materyal tarafından ne zaman gerçekleşeceğine karar verilen apoptoz hücre ölüm tiplerinden biridir ve programlı hücre ölümüdür. Apoptoza biyokimyasal tepkimeler sebep olur ve hücre buruşur, küçülür, kromatin (genetik materyal) parçalanır ve DNA kısım kısım ayrılarak ortama dağılır. -2-
1.6. Projenin Amacı Pankreas kanseri yaygın olarak görülen bir kanser türüdür. Tedavisi zor, hastalarda sağkalım düşüktür ve bu nedenle tehlikeli kanser türlerindendir. Kanser Kök Hücresi (KKH), kendini yenileyebilme ve kanser kitlesini oluşturan hücrelere dönüşebilme kapasitesine sahip bir grup tümör hücresidir. KKH ler, tümörün çok küçük bir kısmını oluşturduklarından, bu kök hücreler üzerinde etki eden ilaç tam olarak seçilemeyebilir. Bu nedenle kanser tedavisinde hedeflenirler. Bu çalışmanın amacı deguelin kullanarak kanser hücreleri ve KKH lerin çoğalmasını engellemek mümkünse apoptoz ile öldürmektir. 2.YÖNTEM 2.1. Mia Hücreleri Mia hücrelerinin özellikleri ve alınan canlıya ait özellikler aşağıda belirtilmiştir. Organizma: İnsan (Homo sapiens) Doku: Pankreas Morfoloji: Yüzen, yuvarlak hücrelere bağlı epiteliyal bağlar Kültür Özellikleri: Yapışkan, tek hücreler, gevşek bağlı kümeler Biyogüvenlik Seviyesi: 1 Hastalık: Kanser Yaş: 65 Cinsiyet: Erkek Köken: Kafkas 2.2. Hücre Kültürü Şekil 1. Mia hücrelerinin mikroskopta görüntüsü. Hücre kültürü; hücrelerin kontrollü şartlar altında yetiştirilmesi sürecine denir. a. Mia-Pa-Ca hücre hattı: Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) ortamı (% 1 Penisilin-Streptomisin [gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı], % 1 L-Glutamin, % 10 Fetal Bovin Serum (FBS) ilaveli), kültür koşulları 37 C % 5 CO2. b. CD133+ Mia Kök Hücreleri 2.3. Deguelin Formülü C23H22O6 olan, Mundulea sericea bitkisinden izole edilmiş doğal bir bileşiktir. Molar kütlesi 394,42 g/mol dür. Böcek öldürücü ilaçlarda bulunur. Birçok insan kanserine karşı ümit verici aktiviteye sahiptir. Meme, akciğer, multipl miyelom, gastrik kanser, hepatosellüler karsinom gibi kanser türlerinde etkinliği gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda -3-
Deguelin in anti-tümör etkinliğini arttırdığı (apoptotik hücre içerik artışı, migrasyonda yavaşlama, sitotoksisite) etkisini de hücre döngüsü arresti ve apoptoz indüklenmesi üzerinden gösterdiği bilinmektedir. [7] 2.3.1. Deguelin ve 5-FU Doz Hesabı Şekil 2. Deguelin yapısı WST-I canlılık yüzdeleri değerlendirildi. Buna göre de LD50 dozu belirlendi. Literatüre göre; dozlar 0,1-0,5 2 10-25 µm ve MA: 394,42 g/mol olarak bulundu. Buna göre dozlar 5- FU için 10-50 - 100 µm, Deguelin için 0,1-0,5-2 - 10-25 µm olarak belirlendi. a. Deguelin Doz Hesabı: 12 kuyucuklu kaplarda 4 denemeye yapılacağı için 48 kuyucuk dolduruldu. 48 200 hücre ekileceği için 9600 µl yani yaklaşık 10 ml ilaç gerekli olacağı tespit edildi. İlaçlardan 5 er ml hazırlandı. Stok Hazırlanması: Deguelin (deg): 25 µm deg, 5 ml çözücü, 5000 µl DMEM M=n /V=m/ MA/V ise; 25 10-6 M = m/394,42/5 10-3 ise 125 10-9 = m/394,42 m=49302,5 10-6 mg = 0,049 mg yaklaşık 0,05 mg bulundu. 1000 µl de 0,5 mg bulunduğundan 100 µl için 0,05 mg hesaplandı. Dozlara göre stoklar belirlendi; Deguelin 25 µm: 100 µl stok + 4500 µl % 1 FBS içeren DMEM (ortam) Deguelin 10 µm: 40 µl stok + 4960 µl DMEM eklendi. Deguelin 2 µm: 8 µl stok + 4992 µl DMEM eklendi. Deguelin 0,5 µm: 10 µl likten 250 µl alındı + 4750 DMEM eklendi. b. 5-FU Doz Hesabı 5-FU in doz hesabı yapılırken MA:130,077 bulundu. Dozlar da 10 50-100 µm olarak belirlendi. Ara Stok Hazırlanması: 2ml hazırlamak için 100 µm alındı. 100 10-6 M = m/130,077/2 10-3 ise m=0,026 mg bulundu. 1mM ara stok oluşturmak için 5,1 µl pipetle çekildi + 1995 µl ortam çekildi. Buna göre dozlar için kullanılacak olan ara stoklar belirlendi; 5-FU 100 µm: 200 µl ara stok + 1800 µl DMEM eklendi. 5-FU 50 µm: 100 µl ara stok + 1900 µl DMEM eklendi. 5-FU 10 µm: 20 µl ara stok + 1980 µl DMEM eklendi. -4-
Yapılan analizlerde belirlenen doz aralıkları canlılığı arttırdığı için daha yüksek doz aralığında çalışma tekrardan yapılmıştır. Yeni dozlar; 25 50 100-250 µm olarak belirlenmiştir. 2.4. Tripan Mavisi ve WST-I Canlılık Testi Tripan mavisi negatif yüklü bir boyadır. Hücrelerin canlılığı test edilir. Eğer ki hücre membranı zarar görmemiş ve canlı ise mavi renkle görüntülenmez. Ancak canlı olmayan hücreler maddeyi içine çeker ve mavi görünürler (Şekil 2). Şekil 2. Tripan mavisi ile belirlenen canlılık oranı WST-I ise sitotostik etki ve metabolik aktivitenin belirlenmesi için yapılan, canlı hücrelerden tetrazolium tuzlarının ayrıştırılmasına dayanan non-radyoaktif, spektrofotometrik, kolorimetrik bir testtir. 100 µl hücre başına / 10 µl WST-I konuldu. Folyoyla sarıldı. İnkübatörde 2 saat boyunca 37 C de bekletildi. Elisa okuyucuda absorbans ölçümü yapıldı. Cihazdan alınan verilerin her ilaç dozu için ortalaması alındı, kontrol grubu canlılığı ortalaması %100 alınarak diğer ilaç dozlarındaki canlılık %leri hesaplandı ve sonuçlar grafiğe çevrildi (Çizelge 1, Çizelge 2, Çizelge 3, Çizelge 4). 2.5. Doğal Bileşiklerde Doğru Doz ve Doğru Ajan Seçimi Bileşiklerde doğru doz ve doğru ajan seçilirken aşağıdaki maddelere dikkat edildi. Kanser hücresinin canlılığını arttırmayacak, mümkünse azaltacak. O kanser tipinde kullanılan kemoterapötik ajanın öldürücü etkisini bozmayacak. Kombine uygulandığında, tek tek gösterdikleri öldürücü etkiden daha az etki göstermeyecek. Mümkünse, sinerjistik etki gösterecek. (1+1=3) Normal (sağlıklı) hücreleri öldürmeyecek. -5-
2.6. CD133+ Mia Kök Hücreleri İzolasyonu Ön Hazırlık: İzolasyon tamponu hazırlama: ph:7.2-7.4, % 0,5 BSA (FBS), 2 mm EDTA lı steril PBS soğuk olarak 500 ml hazırlandı. Hücrelerin Hazırlanması: 1. Mia hücreleri üzerinden ortam uzaklaştırıldı. 2. 2 ml PBS eklendi, 1 dakika sonra uzaklaştırıldı. 3. 75 cm 2 lik flaskta bulunan bu hücrelere 4 ml Tripsin-EDTA solüsyonu eklendi. 37 C de 2 dakika bekletildi. 4. Yaklaşık 8 ml DMEM eklendi. 5. Hücre süspansiyonu pipetlenip 15 ml lik falkon tüpe aktarıldı. 6. 1300 rpm.de 5 dakika santrifüjlenerek hücrelerin çökmesi sağlandı. 7. Üstteki ortam uzaklaştırıldı. 8. Hücre pelleti üzerine 110 µl manyetik izolasyon tamponu eklendi. Hücrelerin Sayımı: 9. 10 µl hücre süspansiyonu üzerine 20 µl tripan mavisi eklendi. 10. Hücreler hücre sayım lamına 10 µl olacak şekilde aktarıldı. 11. Hücre sayım cihazına lam okutularak, gerekli odaklamalar ve netlik ayarı yapıldıktan sonra otomatik sayım gerçekleştirildi. 12. Hücre miktarı 8 x 10 6 tespit edildi. Manyetik İşaretleme: 13. FcR bloklayıcı reaktifi 100 µl alınıp, 100 µl hücre süspansiyonu üzerine eklendi. 14. Anti-CD133 manyetik özellikli monoklonal antikordan 100 µl alınıp hücrelere eklendi. 15. +4 C de 30 dakika bekletildi. 16. Süre sonunda bağlanmamış anti-cd133 leri uzaklaştırmak için 2 ml izolasyon tamponu ekleyip 300g de 10 dakika santrifüjlendi. 17. Üst kısım (süpernatant) uzaklaştırıldı. 18. Hücre pelleti 500 µl izolasyon tamponu içinde resüspanse edildi. Manyetik Ayırma: 19. MS kolon magnete takıldı. 20. Hücrelerin hareketini kolaylaştırmak için boş kolona 1 ml izolasyon tamponu eklendi. 21. Damlama sona erince kolona 500 ml lik hücre süspansiyonu verildi. 22. CD133- hücreler uzaklaştırıldı. 23. Hücrelerin bulunduğu tüpe tekrar 500 ml izolasyon tamponu eklendi ve kolondan geçirildi. 24. CD133+ Mia kök hücreleri toplamak için kolon magnetten çıkarıldı. 25. Boş bir 15 ml lik falkon tüpe kolon yerleştirildi. 26. Kolonun kendi enjeksiyon pompası ile 1 ml izolasyon tamponu eklenmiş olan kolona basınç uygulanarak hücreler toplandı. 27. 26. adım tekrarlandı. 28. Hücreler 1300 rpm. 5 dakika santrifüjlendi. 29. Süpernatant uzaklaştırıldı. Hücre pelleti 4,2 ml % 1 FBS içeren kültür ortamında resüspanse edildi (Şekil 3). -6-
Şekil 3. Manyetik ayırma yöntemi ile CD133+ ve CD133- Mia kök hücrelerinin ayrılması 2.7. Akım Sitometri ile CD133+ Pozitifliğinin Konfirmasyonu 1. İzole edilen CD133+ Mia kök hücrelerin saflığını göstermek amacıyla akım sitometri ile analiz yapıldı. 2. 10 µl FITC bağlı anti-cd133 100 µl tamponda bulunan hücre süspansiyonuna eklendi. 3. Karanlık ortamda, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edildi. 4. Bağlanmayan antikorları uzaklaştırmak için 1 ml PBS eklenip 1300 rpm.de 5 dakika santrifüjlendi. 5. Süpernatant uzaklaştırıldı. 6. Pellet 500 µl non-steril PBS içinde resüspanse edildi. Not 1: Her örnek için, doğru kapılama yapmak amacıyla bir boyasız (unstained), bir boyalı tüp hazırlandı. 2.8. 1. Well Plate İçinde LD50 Doz ve Kombinasyonlarının Uygulanması Şekil 4. 12 Well Plate İçinde LD50 Doz ve Kombinasyonlarının Uygulanması 2.9. Annexin ve PI Boyanması Hücre Hazırlığı: 1. Hücreler üzerinden ortam uzaklaştırıldı. 2. 1 ml PBS eklendi 1 dakika sonra uzaklaştırıldı. 3. 12 kuyucuklu plate içinde bulunan bu hücrelere 1 ml Tripsin-EDTA solüsyonu eklendi. -7-
4. 37 C de 2 dakika bekletildi. 5. Yaklaşık 2 ml DMEM eklendi. 6. Hücre süspansiyonu pipetlenip 15 ml lik falkon tüpe aktarıldı. 7. 1300 rpm de 5 dakika santrifüjlenerek hücrelerin çökmesi sağlandı. 8. Üstteki ortam uzaklaştırıldı. 9. Hücre pelleti üzerine 200 µl PBS eklendi. Boyama Prosedürü: 10. Hücreler (1x10 6 ) 100 er µl olacak şekilde 2 adet akım sitometri tüplerine aktarıldı. Biri Anneksin-V ve PI boyanmaz (unstained) Biri Anneksin-V ve PI boyanır (apoptoz tayini için) 10. Apoptoz tayini olacak tüpe karanlık ortamda 5 µl FITC-Anneksin-V ve 10 µl Propidium İyodür eklendi. 11. 15 dakika + 4 C de inkübe edilir. 12. Süre sonunda 400 µl Anneksin Binding Buffer eklendi. 13. Akım sitometrik analiz yapıldı. 3. BULGULAR: 3.1. WST-1 canlılık testi sonuçları: Yöntemde anlatıldığı gibi WST-1 uygulaması yapıldı ve alınan sonuçlar aşağıdaki gibi oldu: Çizelge 1. Dozlara göre 24 saat sonunda elde edilen sonuçlar -8-
Çizelge 2. Dozlara göre 48 saat sonunda elde edilen sonuçlar. Çizelge 3. Dozlara göre 72 saat sonunda elde edilen sonuçlar. Not 2: Yapılan analizlerde belirlenen doz aralıkları canlılığı arttırdığı için daha yüksek doz aralığında çalışma tekrardan yapılmıştır. Yeni dozlar; 25-50 - 100-250 µm olarak belirlenmiştir. Çizelge 4. Arttırılan dozlara göre 24 saat sonunda elde edilen sonuçlar. 3.2. Akım Sitometrik Analiz Sonucu -9-
Yöntemde anlatıldığı gibi manyetik izolasyon yöntemi ile CD133+ olan kök hücreler ayrıldı ve Akım Sitometrik analiz sonucunda CD133 pozitifliği % 83,3 bulundu (Çizelge 5). Çizelge 5. Akım Sitometrik Analiz Sonucu 3.3. Apoptoz Sonuçları: Annexin ve PI Boyanması sonrasında akım sitometrik analiz sonuçları alındı ve alınan sonuçlardan sonra bu çıkan nokta grafikleri tabloya çevrildi. Bu tablolar ve nokta grafikleri: Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia Kontrol % 71,0 % 26,9 % 1,8 - % 28,7 Çizelge 6. Mia kontrol grubu apoptoz sonuçları. -10-
Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia Total 100 µm Deguelin % 16,4 % 4,9 % 78 % 35,3 % 83,6 Çizelge 7. Mia 100 µm dozuna göre apoptoz sonuçları. Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia Total 200 µm 5- FU % 49,8 % 5,0 % 42,6 % 10,4 % 50,2 Çizelge 8. Mia 200 µm 5-FU dozuna göre apoptoz sonuçları. -11-
Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia Total 100 µm Deguelin + 200 µm 5- FU % 11,6 % 69,5 % 16,4 - % 88,4 Çizelge 9. Mia 100 µm Deguelin + 200 µm 5-FU dozuna göre apoptoz sonuçları Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia Total CD133+ Kontrol % 86,7 % 11,2 % 0,3 - % 11,5 Çizelge 10. Mia CD133+ kontrol grubu apoptoz sonuçları. -12-
Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia CD133+ 100 µm Deguelin % 38,9 % 27,2 % 33,3 - % 61,1 Çizelge 11. Mia CD133+ hücreleri üzerinde 100 µm Deguelin dozuna göre apoptoz sonuçları. Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia CD133+ 200 µm 5- FU % 34,1 % 31,2 % 33,9 - % 65,9 Çizelge 12. Mia CD133+ hücreleri üzerinde 200 µm 5-FU dozuna göre apoptoz sonuçları. -13-
Grup Canlı Erken Geç Nekrotik Toplam Ölüm Mia CD133+ 100 µm Deguelin + 200 µm 5- FU % 24,2 % 31,2 % 39,5 - % 75,8 Çizelge 13. Mia CD133+ hücreleri üzerinde 100 µm Deguelin + 200 µm 5-FU dozuna göre apoptoz sonuçları. LD50 dozu Deguelin için 100 µm (% 49.2 canlılık), 5-FU için 200 µm (% 47.1 canlılık) son olarak kombine dozu (% 45.5 canlılık) olarak bulundu. CD133+ saflığı Akım Sitometri yöntemi ile bulundu. Total Mia hücrelerinde canlılık en çok 200 µm 5-FU verilen grupta (% 49,8), CD133+ canlı (% 38,9) 100 µm deguelin verilen grupta olarak gözlendi. Erken apoptoz tüm Mia hücrelerinde 200 µm 5-FU ve 100 µm deguelin verilen grupta en iyi olarak, erken apoptoz % 69.5, geç apoptoz % 16.4, toplam ölüm oranı ise % 88.4 olarak tespit edildi. 4. SONUÇ VE TARTIŞMA Pankreas kanseri son zamanlarda artan, ölüm oranı yüksek, tedavisi zor olan tehlikeli bir kanserdir. Biz de bu sebeple normalde kullanılan 5-FU ve bunun yanında deguelin kullanarak tek başına veya kombine olacak şekilde, sadece 5-FU kullanıldığı durumlardan daha başarılı olacak yeni ilaç karışımı yaptık. Yapılan deneyler sonucunda iki ilacın da en iyi oranlarından hem pankreas kök hücrelerinde hem de normal kanser hücreleri üzerinde daha yüksek bir öldürme oranına sahip kombine 200 µm 5-FU ve 100 µm deguelinden oluşan karışım elde edildi. 5. ÖNERİLER Literatürde bu çalışma ilk defa bizim tarafımızdan pankreas kanseri kök hücrelerinde denenmiştir. Daha önceden sadece pankreas kanserinde denenmiştir. Kök hücrelerde denenmemiştir. Deguelin pankreas kanseri hücrelerinde in vitro sitotoksik etki yaptı. 5- Fu nun etkisini bozmadı. CD133+ de apoptozu destekledi. Buna göre deguelin pankreas kanserinde tek başına 100 µm, 5-FU 200 µm, kombine ise 100 µm Deguelin + 200 µm 5- FU nun sonuçları alındı. LD-50 de bu iki maddenin tek başlarına yaptıkları sonuçlara göre daha kombine dozda daha başarılı bir sonuç alındı. Kombine dozun diğer ilaçlara göre verdiği yüksek apoptoz oranları nedeniyle kullanımı bu dozlarda önerilmektedir. -14-
KAYNAKLAR [1] HOLFORD Patrick, EFIONG Liz, Kansersiz Yaşamın Sırrı, KRP Yayıncılık [2] Sağlık Ansiklopedisi Cilt 4 Gözlem Yayınları [3] MEDICANA Genel Sağlık Ansiklopedisi Cilt 4 Ana Yayıncılık A.Ş. [4] http://evdesifa.com/pankreas-kanseri-tedavisi/ [5] https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/crl-1420.aspx?geo_country=tr [6] http://kanser.gov.tr/kanser/kanser-nedir/4-kanser-nedir.html [7] http://www.turkbiyokimyadernegi.org.tr/tbddergisi/tbd-ozel-sayisi-2015.pdf [8] CHABNER Bruce A., THOMSON J.Lynch, LONGO Dan L., Harrison Onkoloji El Kitabı, Uz. Dr. Binnur Dönmez, Nobel Tıp, İzmir 2009 [9] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27698853 [10] http://www.ejcancer.com/article/s0959-8049(02)00192-2/abstract?cc=y= [11] http://jnci.oxfordjournals.org/content/95/4/291.short [12] http://clincancerres.aacrjournals.org/content/10/3/1074.short -15-