1 G/M1010: İndirek immunoenzim testi, insan serumunda, parainfluenza 1 virus oluşan IgG ve /veya IgM antikorlarını test etmek için kullanılır. 96 test. GİRİŞ Parainfluenza virüsleri serotipler 1, ve 3, -4 yaş grubu çocuklarda çocuklarda laringotracheobronchitis (kuş palazı) hastalığına sebep olur. Serotip 3, 1 yaşından küçük çocuklarda (solunum syncytial virusten sonra) ikinci ajan olarak pnemoniaya sebep olur. Serotip 1 ve sıklıkla kuşpalazı hastalığıyla birleştirilir ve endemik modeldir. Sero diyagnostik teşhis için, son kullanılan metotlar, virüs nötrölizasyonu, indirek immunoflorasan komplement fiksasyon, hemagülasyon ve ELISA testleridir. ELISA hassas ve özel bir yöntemdir.. ELISA IgM testi, IgG etkileşiminden sakınmak için 6 aydan küçük çocuklarda kullanılır.bunların yanında, hastalığın başlangıcında, hızlı teşhis IgM antikorlarının tespiti ile konulur. TEST PRSİBİ: ELISA metodu numunelerdeki antikorla polstiren kuyucuklara kaplana antijenin reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkanıp atılır.enzim bağlı etiketli anti insan globulin, ikinci basamakta kompleks oluşturur. Yeni bir yıkama adımından sonra konjugat bağlanır, substratın (TMB) yardımıyla mavi renk oluşturur.stop solüsyonu ile sarı renge dönüşür. 7 VIRCELL TMB SUBSTRAT SOLÜSYONU: 15 ml substrat solüsyonu tetramethylbenzidine (TMB). Kullanıma hazırdır. 8 VIRCELL STOP REAKTİFİ: 15 ml stop solüsyon: 0.5 M sülfirik asit. 9 VIRCELL YIKAMA BUFER: 50 ml 0x yıkama solüsyonu :fosfar buffer Tween R -0 ve Prokilin. -8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Presizyonlu mikro pipet 5 ve 100 µl. 8 kanallı 100 µl mikro pipet. ELİZA pleyt yıkayıcı. Termostatlı inkübatör/su banyosu. ELISA pleyt okuyucu spektrofotometre, 450 nm ve 60 nm filtreli. Alternatif olarak, ELISA otomatik analizörü. Distile su. IgM testi için, insan IgG sorbent (ref. Vircell S001). SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: -8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız.bu kit -8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. AÇILAN REAKTİFLERİN SAKLANMASI: REAKTİF STABİLİTE VE SAKLAMA 1x yıkama solüsyonu 4 ay -8ºC Diğer reaktifler Paket insertünde yazan miad kadardır. ( -8ºC) STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: KİT ÖZELLİKLERİ: Yıkama solüsyonu hariç tüm reaktifler kullanıma hazırdır. Serum dilüsyon solüsyonu ve konjugat solüsyonu tekniğe yardım etmek için renklendirilmiştir. Numune ön dilüsyonu gerekli değildir. Kırılabilir kuyucuk sağlanır.test sayısı kadar kuyucuk ayrılır. KİT İÇERİKLERİ Anti-parainfluenza virus human IgG/IgM parainfluenza virus antigen 1 VIRCELL PARAINFLUZA PLATE: 1 96-kuyucuk pleyt, parainfluenza virüs antijen ile kaplı, strain Sendai/5 (ATCC VR-105). VIRCELL SERUM DILUT5 ml serum dilüsyon buffer solüsyonu: mavi renkli fosfat buffer, stabilizör ve proklin içerir. Kullanıma hazırdır. 3G VIRCELL IgG POZİTİF KONTROL: 500 µl pozitif kontrol serum IgG için, Prokilin içerir. 3M VIRCELL IgM POZİTİF KONTROL: 500 µl pozitif kontrol serum IgM için, Prokilin içerir. 4G VIRCELL IgG CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum IgG için, Proklin içerir. 4M VIRCELL IgM CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum IgM için, Proklin içerir. 5G VIRCELL IgG NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgG, Proklin içerir. 5M VIRCELL IgM NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgM için, Proklin içerir 6G VIRCELL IgG KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgG peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte, Proklin içerir, kullanıma hazırdır. 6M VIRCELL IgM KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgM peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte,proklin içerir, kullanıma hazırdır. Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. Yıkama ve reaktif ekleme arasında pleyti kuru bırakmayınız. Substrat solüsyonu ışığa hassastır. Işıktan sakınarak koruyunuz, mavi renk oluşursa atınız.substrat solüsyonu oksitleyicilerle örneğin çamaşır suyu ya da metallerle temas etmemelidir. Gerektiği kadar yıkama, serum dilüent solüsyonu, konjugat ve TMB solüsyonu kullanın geri kalan solüsyonları reaktif şişelerine geri koymayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir.. Sadece kitin içindekileri kullanın.diğer üreticilerin kitleri ile karıştırmayınız.sadece serum Diluent, yıkama, stop ve substrat solüsyonları diğer VIRCELL ELISA kitlerinden kullanılabilir. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 4. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. 5. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 6. Serum dilüenti, pleyt, konjugat ve kontroller hayvan kaynaklıdır. Kontroller insan kaynaklıdır. Bu kitin kontrolleri Hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), Hepatit C antikorları ve HIV antikorlarına karşı test edilip negatif bulunmasına rağmen enfeksiyon kapma riski varmış gibi davranılmalıdır. Hiçbir mevcut metot bu konularda kesin sonuç vermez. Kuyucuklar, inaktive edilmiş parainfluenza 1 virus antijen ile kaplıdır.yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır 7. Substrat solüsyonu deriyi ve mukus tabakayı irrite edebilir.bu solüsyon ile temas edilirse bol su ile yıkanıp medikal bir yardım alınmalıdır. Daha fazla bilgi, Material Safety Data Sheet mevcuttur. 8. Bu ürünü otomatik analizörde çalışmadan önce, öncelikle kitin performansını değerlendirmenizi öneririz. Bu amaç için VIRCELL de numune seti mevcuttur, manuel teknikle paralel olarak çalışmak için kullanılır.bu numune seti talep üzerine sağlanır. 9. İnkübasyon süresi boyunca, kuyucukları üzerini uygun bir bant ile kapatınız.kitin buharlaşmasını önleyip daha garanti bir sonuç verir. IN VITRO DİYAGNOSTİK KULLANIM İÇİNDİR Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Dominguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.1830 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.44164* Fax+34.958.51071
10. IgM test için, bu ürün VIRCELL insan IgG sorbent (Vircell ref. S001 ile birlikte tek kullanım için üretilmiştir) NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA : Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-0ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. Plazma kullanmayınız. REAKTİFLERİN ÖN HAZIRLIĞI: Sadece yıkama solüsyonu hazırlanmalıdır. 50 ml 0x yıkama solüsyonu 1 litre distile su ile karıştırılır.eğer yıkama solüsyonu saklama sırasında kristalleşebilir, hazırlanmadan önce 37ºC ye getirilmelidir.dilüe edilen solüsyonlar -8ºC de saklanmalıdır TEST PROSEDÜRÜ: 1.-İnkübatörü veya su banyosunu 37±1ºC ye getiriniz..-tüm reaktifleri çalışmaya başlamadan 1 saat önce dolaptan çıkarınız.pleyti paketinden çıkarmayınız. 3.-Tüm reaktifleri karıştırınız. 4.-Pleyti 1 paketten çıkarın.kaç kuyucuk kullanacağınızı tespit ediniz: : 4 tane kontrol için ayırınız. cut off serum, 1 pozitif kontrol ve 1 negatif kontrol içindir.: Gerekli olmayan kuyucuklar paketin içine konup ağzı kapatılmalıdır. 5.-.IgG testi için, tüm kuyucuklara 100 µl serum diluent ekleyiniz.5 µl serum, 5 µl pozitif kontrol 3G, 5 µl cut off kontrol 4G (çift olarak) ve 5 µl negatif kontrol 5G ilgili kuyucuklara pipetlenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 6.-IgM testi için, 5 µl VIRCELL IgG sorbent (ref. S001) tüm kuyucuklara ekleyiniz, kontrol kuyucukları hariç. 5 µl Numune ve 75 µl serum diluent ekelenir.her kuyucuğa 100 µl serum diluent ekleyin ve sonra 5 µl pozitif kontrol 3M, 5 µl cut off kontrol 4M (çift çalışma) ve 5 µl negatif kontrol 5M ilgili kuyucuğa eklenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 7.-.- Üzerini kapatıp 37±1ºC de 45 dk inkübasyona bırakınız. 8.- Üzerinden yapışkanı alıp tüm kuyucuklardan sıvıyı çekiniz ve 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile her kuyucuğu 5 defa yıkayınız.kuyucuklardan tüm solüsyonu çekiniz. 9.- Hemen, her kuyucuğa,100 µl IgG konjugat solüsyonu 6 ekleyiniz ya da IgM konjugat 6M solüsyonu ekleyiniz. 10.- Bir bant ile yüzeyini kapatınız ve 37±1ºC de 30 dk inkübe ediniz. 11.-Bantı çıkarınız, sıvıyı tüm kuyucuklardan çekiniz ve 5 defa 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile yıkayınız. Kalan tüm sıvıyı dışarı atınız. 1-Hemen 100 µl substrat solüsyonunu 7 her kuyucuğa ekleyiniz. 13.-Işıktan korunarak 0 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. 14.-Her kuyucuğa,50 µl stop solüsyonu 8 ekleyiniz. 15.- 450/60 nm de 1 saat içinde okuyunuz İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. Lotlara göre,son QC testleri mevcuttur. QC materyalleri referans numune panellerine karşı valide olmuş, ispat edilmiştir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. (O.D.) aşağıdaki aralıklarda olmalıdır.değilse, test geçersiz olup tekrar edilmelidir. KONTROL O.D. POZİTİF KONTROL >0.9 NEGATİF KONTROL <0.55 CUT OFF KONTROL SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Cut off un ortalama O.D. sini hesaplayın. <0.7 x(o.d. POZİTİF KONTROL) >1.5 x(o.d. NEGATİF KONTROL) Antikor indeks=(numune O.D./ cut off serum ortalama O.D.) x 10 INDEKS YORUM < 9 Negatif 9-11 Şüpheli >11 Pozitif Şüpheli serumlar mutlaka yeniden test edilmeli ve/veya yeni numune alınarak çalışılmalı. 9 dan küçük indeks sonucu, parainfluenza 1 virus karşı IgG ya da IgM antikoru oluşmadığını gösterir. 11 den büyük indeks sonucu, parainfluenza 1 virus IgG ya da IgM antikoru oluşturduğunu gösterir. LİMİTLER: 1.-Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir..- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.- Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir 6.-Erken alınan numunlerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum 14-1 gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 7.-Neonatallarda IgG tespiti değerlendirilmesi dikkatle yorumlanmalıdır, çünkü IgG anneden pasif bir şekilde doğumdan önce transfer edilir.igm testi 6 ayın altındaki çocuklarda bakmak daha faydalı olur. 8.-Tek bir numuneye antikor bakmak teşhis koymakta tek başına yardımcı olmak için kullanılmamalıdır.çift numune(akut ya da nekahat zamanı numunesi) alınmalı, serokonversiyon için test edilmeli yada yükselen antikor seviyesi izlenmelidir. 9.-IgM test çalışması için, insan IgG sorbent kullanılmalı. Yoksa, RF nin varlığından dolayı yanlış pozitiflik ya da IgG antikor fazlalığından dolayı yanlış negatiflik görülür. 10.- Kabakulak hastalığı virüsüne karşı, parainfluenza virüsleri özellikle, karşı çapraz reaksiyon gösterebilir. PERFORMANS HASSASİYET VE ÖZGÜLLÜK: 44 serum numunesi PARAINFLUZA ELISA IgG/IgM testi, farklı bir ELISA kiti ile karşılıklı IgG için test edildi.. 46 serum numunesi PARAINFLUZA ELISA IgG/IgM testi farklı bir ELISA kiti ile IgM için test edildi. Sonuçlar aşağıdadır: NUMUNE NR HASSASİYET ÖZGÜLLÜK IgG 44 100% 96.80% IgM 46 100% 100% Bulunamayan değerler son hesaplamadan çıkarıldı. INTRA-TEST PRESİZYONU:
3 IgG TESTİ 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: Lot Katalog No SERUM N %C.V. PC 10 1.74 NC 10 5.15 CO 10 4.87 Inserte bakınız <X>kuyucuklar IgM TESTİ 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır SERUM N %C.V. PC 10.14 NC 10 9.0 CO 10 3.58 INTER-TEST PRESİZYONU: IgG TESTi İÇİN 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10 3.15 NC 10 9,00 CO 10 5.93 IgM TESTİ 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10 3.09 NC 10 17.09 CO 10 8.5 ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Taksonomik grup (respiratory syncytyal virus (RSV) ve kızamık)ve sendromik grup (grip A ve B, adenovirus) pozitif olduğu bilinen 10 numune IgG ve IgM için test edildi. RF pozitif olduğu bilinen numune de IgM için test edildi. Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi DİĞER TESTLER İLE ETKİLEŞİMLER: Daha önce ANA pozitif olan1 numune ve RF pozitif olan 4 numune IgG ve IgM için 4 farklı ELISA kiti kullanılarak test edildi.(3 viral ve 1 bakterial)igm için numuneler IgG sorbenti ile kullanıldı. Sonuçlar gösterdiki Ana pozitif olan numunelerin % 96 sında, RF pozitif olna numunelri %100ünde düşük etkileşim görüldü. IgM için, önerilen sorbent test edildi ve IgG antkorların fazlalığından kaynaklanan yanlış negatifliğin engellendiği görüldü. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) ºC 8ºC -8ºC de saklayınız x Yeteri kadar r <X> test içerir.
4 TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ IgG için dilüsyon 100 μl serum diluent 5 μl serum ve kontroller 3G 4G 5G IgMiçin dilüsyon 5 μl sorbent 5 μl serum 75 μl serum diluent KONTROLLER 100 μl serum diluent 5 μl kontroller 3M 4M 5M 45dk 37ºC yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 6G 100 μl konjugat 6M 30 dk 37ºC yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 100 μl substrat 7 0 dk oda sıcaklığı 50 μl stop solüsyonu 8 Okuma 450/60 nm LİTERATÜR: 1. Bishai, F. R. and R. Galli. 1978. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to influenza A and B and parainfluenza type 1 in sera of patients. J Clin Microbiol 8:648-56.. Donati, D., C. Cellesi, A. Rossolini, V. Lorusso, D. Moschettini, T. Amato, and P. E. Valensin. 1998. Serological diagnosis of respiratory viral infections. A five-year study of hospitalised patients. New Microbiol 1:365-74. 3. Fedova, D., J. Novotny, and I. Kubinova. 199. Serological diagnosis of parainfluenza virus infections: verification of the sensitivity and specificity of the haemagglutination-inhibition (HI), complement-fixation (CF), immunofluorescence (IFA) tests and enzyme immunoassay (ELISA). Acta Virol 36:304-1. 4. Glezen, W. P., A. L. Frank, L. H. Taber, and J. A. Kasel. 1984. Parainfluenza virus type 3: seasonality and risk of infection and reinfection in young children. J Infect Dis 150:851-7. 5. Ukkonen, P., O. Vaisanen, and K. Penttinen. 1980. Enzyme-linked immunosorbent assay for mumps and parainfluenza type 1 immunoglobulin G and immunoglobulin M antibodies. J Clin Microbiol 11:319-3. 6. Whimbey, E., S. E. Vartivarian, R. E. Champlin, L. S. Elting, M. Luna, and G. P. Bodey. 1993. Parainfluenza virus infection in adult bone marrow transplant recipients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1:699-701. Sorularınız için lütfen aşağıdaki adres ile temasa geçiniz: technicalservice@vircell.com REVİZD EDİL TARİH: Ekim-06
5