Proteomiks Yaklaşımlar Uygulama Alanları ve Hizmetlerimiz Timuçin AVŞAR Proje Geliştirme Koordinatörü
Sunum Başlıkları Proteomiks Nedir? Neden Proteomiks? Nasıl çalışılır? Uygulama Alanları Proteomiks literatüründen örnekler Hizmetlerimiz
Proteomiks Proteom: Belli bir anda, bir hücrede (materyalde) ifadelenen proteinlerin tamamı Amaçlar: Protein fonksiyonu Protein miktarı Protein modifikasyonu PTM Protein lokalizasyonu Protein Protein ilişkileri
Santral Dogma: Benzerlik DNA Bilgi ~30.000 gen %100 RNA Mesaj ~50.000 mrna %50 - % 60 Protein AKTÖR 300.000 1.200.000 protein %20 - %30
Omiks... Proteom, genomun son ürünü Dinamik, değişen miktar ve içerik Az ifadelenen proteinlerin çalışılması Transkriptomik, yetersiz ve zor! Genomik, fonksiyonel bilgi az!
İnsan Proteinlerinin Sınıflandırması
Nasıl Yapılır?
Nasıl Yapılır? - Özet
Nasıl Yapılır?
Kütle Spektrometresi
Bio- Rad Imaging Por/olio GS- 800 Calibrated Densitometer CCD scanner Colorimetric samples Reflectance and transmivance modes 30 x 40 cm scanning area ChemiDoc MP Imaging System CCD camera CCD based UV/visible, mulkplex fluorescence, colorimetric and chemiluminescent imaging. Stain- free compakble Pharos FX / FX Plus Systems laser scanner/pmt Fluorescent and storage phosphor imaging 488 nm, 532 nm, and 635 nm laser excitakon sources GelDoc EZ CCD camera Stain-free compatible GelDoc XR+ and ChemiDoc XRS+ Imaging System CCD camera CCD based UV/visible, fluorescence, colorimetric and chemiluminescent imaging
ph Aralıkları 9 (ph 3-10) (ph 4-7) (4.5-5.0) (5.0-5.5) (5.5-6.0)
Why Imaging and Analysis? Farkı Görebiliyor musunuz?
Spot Analizi PDQuest Quantity One EXQuest Calibration Wizard
Why Imaging and Analysis? Zaman Çizelgesi Örnek hazırlanması: IPG strip rehidrasyonu: IEF run: SDS-PAGE: Jel boyama: 2-3 saat 22 saat 24 saat 19 saat 13 saat Toplam: ~ 4 gün
Why Imaging and Analysis? MS Prensibi Örnek + _ İyonizer Kütle Analizörü Detektör
Why Imaging and Analysis? Western Blot Proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılması ve tespit edilmesi Rölatif olarak protein miktarlarının tespiti Protein çorbası içerisinde hedef proteinin spesifik deteksiyonu SDS-PAGE kullanılarak proteinler ayrıştırılır Proteinler nitroselülöz membrana aktarılır.
SDS-PolyAcrylamide Why Imaging and Analysis? Gel Electrophoresis SDS-PAGE, Biyokimya Adli Tıp Genetik Moleküler biyoloji Elektroforetik mobilitelerine göre proteinler ayrıştırılır. polipeptit zinciri uzunluğu moleküler ağırlığı üç boyutlu yapılarına göre DNA-protein bağlanmalarına göre
Why Imaging and Analysis? PAGE Negatif yüklü denatüre proteinler elektrik alanı altında pozitif kutuba doğru hareket eder Küçük MW proteinler daha hızlı hareket eder Poliakrilamid jel Proteinlerin primer yapılarına göre büyüklükleri ölçülür
Why Imaging and Analysis? Western Blot Membran üzerindeki proteinler öncelikle jenerik proteinler ile inkübe edilir (Bloklama) Süt tozu Albumin (BSA) Hedef protein spesifik antikor uygulanır Monoklonal antikorlar Poliklonal antikorlar Antikor spesifitesi çok önemli! Primer antikor vs sekonder antikor
Why Imaging and Analysis? Blotlama Elektro- blot (akkf) vs Kapiler blot (pasif) Hız? Verim? Kalite? Blot kasek: Filtre kağıtları Whatman kağıdı Membran Emme pedleri Islak, yarı- ıslak, kuru
Why Imaging and Analysis? Antikor Rhan T et al, 2009 Nelson C. and Kennedy P et al. 2009 Neurogenesis, LafayeJa, Web, 2012
Why Imaging and Analysis? Western Blot Son olarak, sekonder antikora bağlı enzim reaksiyonu ile görüntüleme yapılır Horse radish peroxidase (HRP) konjuge nitro-blue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (NBT/BCIP) konjuge Radiolabel - konjuge
24
ELISA Why Imaging and Analysis? Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Antijen-antikor ilişkisi Kantitatif Birçok hastalıkta tanı amaçlı Viral ve parazit enfeksiyonlarında Enflamatuar hastalıklarda
Why Imaging and Analysis? ELISA Yöntemleri
Why Imaging and Analysis? Örnek Çalışmalar ve Literatür Bilgileri
AMAÇ: Yan et al. 2004, Use Proteomics to inves;gate molecular mechanisms of aging and gender differences In heart, J. Mol. Cell.Cardiol. Nov;37 (5) 28
52 GBM, 13 anap. astro, 10 astro, 10 normal doku Proteom tabanlı sınıflandırma analizi Evre ye özgül protein sınıflandırması Iwadate Y et al. 2004, Molecular Classifica;on and survival predic;on in human gliomas based on proteome analyses, Cancer Research 29
OJervald J et al, 2010, Mul;ple sclerosis: Iden;fica;on and clinical evalua;on of novel CSF biomarkers, Journal of Proteomics 30
Notch signaling pathway CD4+ ackvakng pathway nöroprotekkf elemanlar! Stoop MP et al, 2011, Proteomics comparison of CSF of RR and PP- MS, PLoS ONE 31
Kaushal SG et al, 2011, Novel approaches to detect serum biomarkers for clinical response to Interferon- β treatment in MS, PLoS ONE 32
Hizmetlerimiz Proteomik yöntemlerle biyobelirteç tayini Protein tanımlanması Protein miktar tayini Kromotografik ELISA Total protein tayini Western blot 33
Biyobelirteç Tayini İki boyutlu jel elektroforezi yöntemi ile proteinlerin hem moleküler ağırlıkları (Mw) hem de izoelektrik (pi) noktalarına göre ayrıştırılarak eş protein spotlarının kantitatif olarak karşılaştırılmalarını sağlayan nicel bir yöntemdir. Bu yöntem ile bir özelliğin/hastalığın ya da karakterin ayırt edici proteinleri spesifik olarak tespit edilebilir. Biyobelirteç tayini servis hizmeti hakkında: Protein izolasyonu ve saflaştırılması (opsiyonel) Total protein miktarının belirlenmesi 2D-PAGE uygulaması Proteinlerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Biyoinformatik analiz (opsiyonel) 34
Protein Tanımlanması MALDI-TOF kütle spektrometresi (MS) yöntemi kullanılarak, saflaştırılmış proteinlerin ya da protein spotlarının, kütlelerinin, iyon yüklerinin ve aminoasit dizilerinin belirlenmesi esasına dayanır. Proteinleri elde etmek için SDS-PAGE, 2D-PAGE, kromotografik yöntemler vb. saflaştırma yöntemleri kullanılabilir. Bu yöntemle, elde edilen peptit ya da protein dizileri protein veri bankaları ile karşılaştırılarak en az %99 doğrulukta veri elde edilmesini sağlar. Aşamaları: Proteinlerin saflaştırılması ve temizlenmesi MALDI-TOF MS uygulaması Verilerin biyoinformatik analizi (opsiyonel) 35
Protein Miktar Tayini Bir proteinin ya da bir örnekteki total protein miktarını kanktakf olarak yüksek sensikvite (0.1 ng/µl) ile tespit edilmektedir. Farklı örnekler arasındaki spesifik olarak proteinlerin miktarındaki değişimlerin gösterilmesi açısından önemli bir yöntemdir. Spesifik proteinlerin ölçümlerinde kromotografik yöntemler, total protein miktarının tayininde ise Bradford yöntemi kullanılmaktadır. Sunulan Hizmetler: Kromotografik yöntemler ELISA Western Blot 36