1- Spektroskopi: Işın-madde etkileşmesini inceleyen bilim dalına spektroskopi denir. UV Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon Spektroskopisi IR Spektroskopisi Raman Spektroskopisi NMR Spektroskopisi X-Işınları Spektroskopisi Radyokimya Kütle Spektroskopisi Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi Atomik Emisyon Spektroskopisi
2- Elektrokimyasal Metodlar: Elektrokimyasal Hücre, incelenen maddeyi içeren bir çözelti ya da erimiş tuz, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrotlar ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir dış devreden oluşur. Voltametri Polarografi Amperometri Kondüktometri (İletkenlik) Potansiyometri
3- Kromatografik Metodlar: Sıvı Kromatografisi HPLC Kromatografisi Katı-Sıvı Kromatografisi İyon Kromatografisi Gaz Kromatografisi Kromatografi: Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır.
4-Termal Analiz Yöntemleri: Örneğe ait bir fiziksel özelliğin sıcaklığın bir fonksiyonu olarak ölçüldüğü veya bir tepkimede absorplanan veya açığa çıkan ısının izlendiği yöntemlere Termal Analiz Yöntemleri denir. Termogravimetri: Sıcaklık artışına karşı örneğin kütlesindeki değişim ölçülür. Elde edilen sıcaklık-kütle eğrilerine Termogram denir. Erime gibi kütle değişimine neden olmayan faz değişimleri TG ile incelenmez.
Ölçülen Özellik Işın Absorpsiyonu Işın Emisyonu Işın Saçılması Işın Kırılması Işın Difraksiyonu Işın rotasyonu Elektrik potansiyeli Elektrik yükü Elektrik akımı Elektriksel direnç Kütle Kütle/yük Tepkime Hızı Termal Özellikler Radyoaktivite Aletli Analiz Yöntemi Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR spektroskopisi... Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger,) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi Refraktometri, interferometri X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri Polarimetri, dairesel dikroizm Potansiyometri, Kronopotansiyometri Kulometri Amperometri, Polarografi Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü) Gravimetri Kütle spektroskopisi Kinetik yöntemler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri
Analiz Süreci
Analizde Temel Bileşenler Enerji Kaynağı İncelenen Numune Analitik Bilgi
Analitik Yöntem Seçimi Beklenen doğruluk, Numune miktarı, Numunedeki analit (analizi istenen madde) konsantrasyonu, Numunedeki diğer maddelerin cevap durumu, Numune ortamının fiziksel ve kimyasal özellikleri, Kaç numune analiz edileceği Ayrıca hız, kolaylık, maliyet de yöntem seçimini etkiler
ELEKTROMANYETİK SPEKTRUM
UV-GÖRÜNÜR BÖLGE MOLEKÜLER SPEKTROSKOPİSİ Esası: Lambert-Beer eşitliğine göre moleküllerin monokromatik ışınları absorplamasına dayanır. Alet: Işık Kaynağı Monokromatör Örnek Dedektör Kaydedici
Moleküler absorpsiyon spektroskopisi 160-780 nm dalga boyları arasındaki ışığın b ışın yoluna sahip bir hücredeki çözeltinin geçirgenliğinin (T) veya absorbansının (A) ölçümüne dayanır UV/GB spektroskopisi çok sayıda organik ve inorganik bileşiğin analizinde kullanılmaktadır. Mor ötesi (ultraviole UV) görünür bölgeden daha kısa dalga boylarına sahiptir. Bu dalgalar her ne kadar insan gözüyle görülemeseler bile, eşek arısı gibi, bazı böcekler tarafından görülebilir Dünyanın çevresinde bulunan ozon tabakasının insanları UV ışınlarından koruması insanın yaşamını sağlıklı bir şekilde sürdürmesi için çok iyidir fakat astronomlar için bu evrenden bilgi toplamak için engel teşkil etmektedir. Yaymış oldukları UV ışınımlarının incelenmesiyle yıldız ve galaksiler hakkında çeşitli araştırmalar yapabiliriz.
INFRARED SPEKTROSKOPİSİ Moleküllerin IR ışığını (0,78 1000 µm dalga boylu veya 12800 10 cm-1 dalga sayılı) absorpsiyonuyla titreşim ve dönme enerji seviyelerine uyarılmalarının ölçümüne dayanır.
ÖRNEK IR SPEKTRUMLARI
Kırmızı altı bölgeye karşılık gelen elektromanyetik dalga ışınımı, elektromanyetik spektrumun mikrodalga spektrumu ile görünür bölge spektrumları arasında kalan bölgedir. İnfrared ışınımının temel kaynağı, ısı ve ısı ışınımları olduğu için, herhangi bir cisim, infrared olayında bir sıcaklık yayar. Normal vucut sıcaklığına sahip insanlar, yaklaşık 10 mikron büyüklüğündeki bir dalgaboyuna sahip olan çok güçlü bir infrared ışınımı yaymaktadır.
i. İnsanlar infrared ışınımını göremeyebilirler fakat çıngıraklı yılan ailesine ait olan, engerek yılanları, infrared ışınımlarını kullanarak görüntü oluşturmaktadırlar. ii. İnsan ve hayvan vucutlarının infrared ışınları yayması yanında, Dünya, Güneş, yıldız ve galaksiler gibi uzak cisimler de infrared ışınları yaymaktadırlar. iii. Görünür bölge ışınımları ile karalar ile bulutları kolaylıkla ayırt edilmesine rağmen, infrared ile daha ayrıntılı detaylar elde edilmektedir
RAMAN SPEKTROSKOPİSİ Bir numunenin GB veya yakın-ir monokromatik ışından oluşan güçlü bir lazer kaynağıyla ışınlanmasıyla saçılan ışının belirli bir açıdan ölçümüne dayanır. Işık Kaynakları olarak lazer kullanılır. Lazer (L.A.S.E.R.), zorlanmış emisyon ile ışık çoğaltılması anlamına gelen "Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation" sözcüklerinin baş harflerinden türetilmiş bir kısaltmadır. Raman spektroskopisi yöntemi ile katı sıvı ve gaz örnekler incelenebilir. Bir molekülün Raman ve infrared spektrumlarının birlikte değerlendirilmesi ile nitel analiz daha kolaylaşır. İnfrared spektroskopisinde çözücü olarak kullanılamayan su, Raman spektroskopisinde sık kullanılır.
NMR SPEKTROSKOPİSİ Çalışma ilkesi: Çekirdeklerin 4-900 MHz (75m -0,33m) aralığındaki Radyo frekansı aralığındaki elektromanyetik ışınların absorpsiyonuyla dönme enerji seviyelerine uyarılmalarının ölçümüne dayanır. NMR spektroskopisi kovalent bileşiklerin yapılarının aydınlatılmasında kullanılır. 1H, 11B, 13C, 15N, 31P3, 19F vb. NMR ları vardır. Organik maddelerin büyük bir kısmında hidrojen atomu bulunduğundan, yöntem önce protonlar için uygulanmıştır. Böylece NMR yöntemiyle örnekte hidrojen olup olmadığı, varsa ne kadar bulunduğu ölçülebilir. Organik ve inorganik bileşikler hidrojenden daha az karbon içerdiklerinden 13C-NMR spektrumu daha sadedir.
X-IŞINLARI SPEKTROSKOPİSİ Atomlardaki iç kabuklarda oluşturulan boşluğa dış kabuk elektronunun geçişi sırasında yayılan ve λ = 0,01 10 nm arasında değişen ışınlara X ışınları denir. Işığın dalgaboyu azaldıkça, enerjileri artmaktadır. X- ışınları, oldukça küçük dalga boylarına sahip olduğu için, bunların enerjileri ultraviole (morötesi) ışınlarından daha büyüktür. X-ışını Dünya atmosferinden yüzeyine nufus edemez. Bu bizim yaşamımızı sürdürmemiz için oldukça iyidir. Herhangi bir hastanede X-ışınları çektirilirken, vucudunuzun bir yanı üzerine X- ışınlarına hassas bir film koyulur ve sonra X-ışınları sizin vucudunuzdan geçip film üzerine düşecek şekilde ayarlanarak cıhaz çalıştırılır. Kemikler ve dişlerin yoğunluğu derinizden daha fazla olduğu için X-ışınlarını derinin soğurduğundan daha fazla soğurmaktadır ve deri bu ışınları tamamıyla geçirirken, kemikler ve dişler çoğunu soğurduğu için film üzerine kemik ve dişlerin bir silüeti düşer.
RADYOKİMYA Kararsız çekirdeklerin bozunmalarını ve bu bozunma ürünlerini inceleyen bilim dalına Radyokimya denir. Bir elementin tanecik veya elektromanyetik ışıma yayan izotopuna Radyoizotop denir. Dedektör: Sintilasyon dedektörleri, Ge(Li) yarıiletken dedektör.
KÜTLE SPEKTROSKOPİSİ Atom veya moleküllerden gaz fazında iyonlar oluşturularak, bu iyonlar kütlelerine göre ayrılır ve kaydedilir. İyonların bağıl miktarlarının (kütle/yük) oranına göre çizilen grafiğine kütle spektrumu denir. + veya iyonlar incelenebilmelerine karşın genellikle + iyonlar incelenir. Katı, sıvı ve gaz örnekler incelenebilir.
ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROSKOPİ Atomik absorpsiyon spektroskopisinde metallerin çoğu ile az sayıda ametal analiz edilir. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde element elementel hale dönüştürüldükten sonra buharlaştırılır ve kaynaktan gelen ışın demetine maruz bırakılır Aynı elementin ışın kaynağından gelen ışınları absorplar. Sulu Numune Bir alev içine yükseltgen gaz karışımı ile püskürtülür. Bu şekilde 70 kadar element(metal/yarı metal) analiz edilir. Ametallerin absorpsiyon hattı vakum UV bölgeye düştüğünden bu elementler bu metotla analiz edilemez. Metodun hassasiyeti yüksektir. Eser miktarda madde analizi yapılabilir. Işığı absorplayan atomlarda temel seviyedeki elektronlar, kararsız uyarılmış enerji düzeylerine geçerler ve absorpsiyon miktarı, temel düzeydeki atom sayısına bağlıdır.
Temel düzeydeki element atomlarının UV-Gör. Bölgedeki monokromatik ışınları Lambert-Beer yasasına göre absorplaması ilkesine dayanmaktadır. Işık Kaynağı Atomlaştırıcı Monokromatör Dedektör kaydedici
Oyuk Katot lambası Alevli Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi
ATOMİK EMİSYON SPEKTROSKOPİSİ Uyarılmış enerji düzeyine çıkarılan atomların ve tek atomlu iyonların daha düşük enerjili düzeylere geçişlerinde yaydıkları ultraviyole ve görünür bölge" ışımasının ölçülmesi, yaygın olarak kullanılan bir atomik spektroskopi yönteminin temelini oluşturur. Eğer atom veya iyonların uyarılmış enerji düzeylerine çıkmaları bunların ultraviyole veya görünür bölge ışımasını absorplamaları dışında bir süreçle gerçekleşmişse yayılan ışımanın ölçülmesi yöntemine atomik emisyon spektroskopisi (AES) adı verilir. Atomik emisyon spektroskopisi uyarmayı sağlayan enerji kaynağının türüne göre sınıflandırılır. Analiz örneğini atomlaştırmak ve uyarmak için alevin kullanıldığı yöntem Alev emisyon spektroskopisi adını alır. Atomlaşmanın ve uyarmanın elektriksel boşalım veya plazma gibi bir enerji kaynağı ile gerçekleştirildiği yöntem ise sadece atomik emisyon spektroskopisi veya optik emisyon spektroskopisi olarak adlandırılır.
ELEKTROKİMYASAL METODLAR i. Elektrokimyasal Hücre, incelenen maddeyi içeren bir çözelti ya da erimiş tuz, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrotlar ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir dış devreden oluşur. Bu elektrotlardan indirgenmenin olduğu elektroda katod yükseltgenmenin olduğu elektroda Anot denir. ii. Böylece meydana gelen elektron iletilmesi sonucu elektrik akımı oluşur. Metallerde metalik iletkenlik çözeltilerde ise iyonik iletkenlik söz konusudur. iii. Elektrik akımının birimi olan amper birim zamanda (sn) elektrik yük miktarı (culomb) olarak tanımlanır. iv. Elektrik akımının akması için gerekli olan 2 nokta arasındaki gerilim (potansiyel) (E) farkının birimi Volttur. E = IR eşitliğiyle gösterilen ilişkide E = Volt, I = Amper ve R orantı katsayısı olup değeri ohm ile verilir. v. Elektrik enerjisi birimi olan joule=volt X culomb
i. Bir elektrokimyasal hücrede 2 elektrot birleştirildiğinde bir kimyasal reaksiyon oluşuyor ve akım geçiyorsa böyle hücrelere Galvani Hücresi denir. Dıştan elektrik enerjisi verilmek suretiyle kimyasal reaksiyon oluşuyorsa elektrolitik hücre ve olaya da elektroliz denir. ii. Elektrolizde 1 eş-gr maddenin tepkimesine neden olan elektrik yük miktarı 96487 culomb dur. iii. 96487 C luk bu yüke 1 Faraday (F) denir. Cl2, Al metali, Naylon hammaddesi olan adiponitril, saf Cu, Ag, Au, Ni ve Cr kaplamaları PbSO4 ile akünün doldurulması elektrolizle olur. iv. Elektrokimyasal bir hücrede bulunan tuz köprüsü hem elektrik yük dengesini dengeler hemde iyonların hareket hızlarının farklı olmasından kaynaklanan yük dengesizliğini ifade eden sıvı bağlantı gerilimini azaltır. Bu nedenle tuz köprüsünde anyon ve katyonların hareket hızları yaklaşık v. eşit olan KCl,NH4NO3 veya KNO3 kullanılır. İndirgenme potansiyeli pozitif ve büyük olan elektrodun e- alma eğilimi (katod olması) daha fazladır.
Bir elektrokimyasal hücrede çalışma esnasında madde elektrot yüzeyine 3 yolla aktarılır. Bunlar; Elektriksel göç (migrasyon), difüzyon ve karıştırma (konveksiyon)dur. Elektriksel Göç : Katot ve anot arasında uygulanan gerilim farkı elektriksel bir alan oluşturur. İyonlar bu alan etkisiyle ters yüklü elektrotlara doğru göç ederler. İyonların elektriksel alandaki hareket hızları iyonun yüküne, büyüklüğüne ve çalışılan ortamdaki yönlenme biçimine bağlıdır. Difüzyon : Derişim farkından kütle aktarımıdır. Faraday olayları : Elektrot - çözelti ara yüzeyinde elektron aktarılmasıyla yürüyen olaylardır
Voltametri: Voltametride, Mikro çalışma elektrodu ile karşılaştırma elektrodu arasına uygulanan ve değeri zamanla değişen gerilime karşı hücrede çalışma elektrodu ile karşıt elektrot arasında geçen akım ölçülür. Gerilim Akım grafiğine Voltamogram denir. Çalışma elektroduna uygulanan gerilim yönde değiştirilirse indirgenme tepkimesi hızlanır ve katod olarak davranır. Katodik akım oluşur. Voltametri, bir indikatör ya da çalışma elektrodunun polarize olduğu şartlar altında akımın, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak ölçülmesinden faydalanarak, analit hakkında bilgi edinilen bir grup elektroanalitik metotlara verilen isimdir. Voltametri, potansiyometrik ölçümlerden farklı olarak tam konsantrasyon polarizasyon şartlarında bir elektrokimyasal hücrede oluşan akımın ölçülmesine dayanır (Potansiyometrik ölçümler, akımın sıfıra yaklaştığı ve polarizasyonun olmadığı şartlarda yapılır). Ayrıca elektrogravimetri ve kulometriden farklı olarak konsantrasyon polarizasyonunun etkilerini en aza indirmek için kullandığı tedbirler daha değişiktir.
POLAROGRAFi: Voltametride kullanılan mikro elektrot iç çapı 0,03 0,05 mm cam bir kapiler borudan akarak büyüyen ve belli bir büyüklüğe geldiğinde koparak düşen bir civa damlası ise yöntemin adı polarografidir. Elde edilen akım gerilim eğrisi de POLAROGRAM olarak adlandırılır. Civanın damlama hızı (10 60 kez/dk) civa haznesinin yüksekliği ile ayarlanır. Civa mikro elektroda uygulanan gerilim taraması 50 200 mv/dk olduğundan 1 damla süresi içerisinde hemen hemen sabit kalır. Hg yükseltgenmesi kolay olduğundan + 0,4 V tan daha pozitif gerilimlerde çalışılamaz. Yani yükseltgenme olaylarının büyük kısmı incelenemez. Göç akımını minimuma indirmek için ve analizlenen (elektroaktif) maddenin elektrot yüzeyine sadece diffüzyon akımla aktarılması için kullanılan destek elektrolit bazen bir tampon veya bazı iyonları maskeleyici görevi de yapar. Artık akıma neden olan O2; N2 gazının geçirilmesiyle uzaklaştırılır.
AMPEROMETRİ : V = IR eşitliğinde sabit gerilim uygulamasıyla akım ölçülmesine dayanır. Cihaz : Polarografide kullanılan cihaza mikro civa elektrodun daldırıldığı kapta bir mikro büret eklenmiştir. Eklenen titrant a karşı hücreden geçen akım ölçülür. Bu yöntem en çok O2 tayininde kullanılır.
KULOMETRİ : Bir elektrokimyasal hücredeki elekroaktif madde veya maddelerin elektroliziyle harcanan madde miktarı, harcanan elektrik yükü miktarıyla doğru orantılı olmasına dayanır. Voltamogramın plato bölgesinde seçilen bir gerilimde elektroliz gerçekleşirse Gerilim Kontrollü Kulometri denir..
KONDÜKTOMETRİ (İLETKENLİK) Bir elektrolit çözeltisindeki elektrik iletimi, pozitif yüklü taneciklerin katoda, negatif yüklü taneciklerin de anoda göç etmeleri olayıdır. "İletkenlik" akım ölçüsüdür ve çözeltideki yüklü taneciklerin sayısı ile doğru orantılıdır. İyonların tümü iletkenliğe katkıda bulunur; herhangi bir taneciğin taşıdığı bir akım, o taneciğin konsantrasyonuna ve ortamdaki hareket yeteneğine bağlıdır. Analizlerin doğrudan doğruya iletkenlik ölçümlerine dayanılarak yapılması, taneciklerin özellikleri nedeniyle, sınırlıdır. Bir çözeltinin toplam iletkenliğine çözeltideki her tür iyonun katkıda bulunması nedeniyle iyon karışımlarının bulunduğu çözeltilerde doğrudan iletkenlik ölçümünün seçici özelliği yoktur. Ancak yöntemin hassasiyeti yüksek olduğundan bazı uygulamalarda çok önemlidir. Yöntemin en önemli avantajı, çok seyreltik çözeltilere ve reaksiyonun tam olmadığı sistemlere de uygulanabilmesidir. Örneğin, seyreltik fenol (Ka 10-10) çözeltisinin, potansiyometrik veya indikatör dönüm noktası yöntemi ile yapılamayan analizi bu yöntemle yapılabilir.
POTANSİYOMETRİ Galvanik bir pil sisteminde iki elektrot arasındaki potansiyel farkını sıfır yada çok küçük akım altında saptamaya dayalı olarak yapılan ölçüm yöntemine potansiyometri denir. Potansiyelden gidilerek derişim saptanması, elektrotlardan birinin potansiyelinin değişmez olmasıyla mümkündür. Potansiyeli değişmez olan elektroda karşılaştırma elektrodu, potansiyeli değişen elektroda da göstergen elektrot denir. Göstergen elektrodun potansiyeline bağlı olarak derişim saptanabilir. Ayrıca titrasyonlarda indikatör gibi eşdeğerlik noktasının saptanmasında kullanılabilir. Böyle ölçümlere potansiyometrik titrasyonlar denir.
KROMATOGRAFİK METODLAR Kimyasal bileşik karışımlarını ayırmak ve arıtmak için, analitik kimyacıların kullandıkları iki önemli teknik vardır: Damıtma ve kromatografi. Damıtma, farklı sıcaklıklarda kaynayan bileşikleri ayırır. Ne var ki, birçok karışımın bileşenleri (özellikle biyolojik örnekler), ısıtıldıkları zaman bozulurlar. Bazıları aynı sıcaklıkta kaynar, bir bölümü de çok küçük miktarlarda bulunur. Bu nedenle, karışımların, sıvılardaki çözünürlüklerinden ya da katı maddelerin yüzeylerine tutunma farklılıklarından yararlanarak ayrılmasını sağlayan kromatografi geliştirilmiştir. Kromatografi, Yunanca chroma (renk) ve graphein (yazmak) sözcüklerinin birleşmesiyle oluşmuş olup, ilk kez 1903 yılında Rus botanikçi Michael Tsvett tarafından renkli bitki pigmentlerini ayırma amaçlı kullanılmıştır. Daha sonraları, çeşitli çok bileşenli numûnelerdeki bileşenlerin ayrılması ve saflaştırılmasında kullanılmaya başlanmıştır.
Kromatografi: Bir sâbit faz üzerinden hareketli faz geçirilerek, bir numûnedeki bileşenlerin dağılma ve adsorpsiyon gibi mekanizmalar yoluyla farklı zaman süreçlerinde taşınma ve ayrılması işlemidir. Bütün kromatografik metotlar numûne içerisindeki maddelerin sâbit ve hareketli fazla etkileşimi sonucu ayrışmaları esasına dayanır. Bu ayrışmanın nedeni, maddelerin hareketli veya sâbit faza olan farklı ilgileridir. Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır; Sâbit faz: Kromatografide, bir kolon içerisine veya düz bir yüzeye tutturulmuş faza, sâbit faz ( hareketsiz faz; durgun faz; stasyoner faz) denir. Bu faz daima bir katı veya bir katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından oluşur. Hareketli faz: Sâbit fazın üzerinden veya arasından geçen faza ise hareketli faz (sürükleyici faz, mobil faz) denir. Bu faz daima bir sıvı veya gazdan oluşur. Sâbit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografi de yüzey tutunması veya adsorpsiyon ile çözünürlük olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar.
KROMATOGRAFİ NİN SINIFLANDIRILMASI Analizde etkin olan mekanizmalara göre çeşitli kromatografik yöntemler geliitirilmiştir. Birbirlerinden farklı yöntemler olsalar da kromatografik yöntemlerde genellikle ayrımı yapılacak karışım; bir hareketli ve bir de sâbit faz ile etkileştirilerek bileşenlerine ayrılır. Bu nedenle kromatografi kısaca, sâbit ve hareketli fazların yarışı olarak özetlenebilir. Ayrılma Mekanizmalarına Göre; Uygulama Biçimine Göre; Faz Tiplerine Göre;
1-ayrılma Mekanizmalarına Göre Sınıflandırılması Adsorpsiyon kromatografisi: Katı veya sıvı moleküllerin, sıvı veya gaz moleküllerini çekim kuvvetleri yardımıyla yüzeyde tutmasına adsorbsiyon denir. Burada sözü edilen adsorbsiyon fiziksel adsorbsiyondur. Zayıf Van der waals, elektrostatik çekimler ve dipol-dipol etkileşimlerine dayanır, tersinirdir. Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen bir ayırma işlemidir. Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında etkileşir. Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı, gaz-katı kromatografisidir. Sabit faz : Durgun veya hareketsiz fazdır Hareketli faz : Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin ayrılmasını sağlayan fazdır.
Şeker, nişasta, selüloz, kalsiyum karbonat, magnezyum sülfat, alümina, silika jel ve kil gibi birçok madde adsorban katı faz olarak kullanılabilmektedir. Hareketli faz olarak ise alkol, aseton, kloroform gibi bütün organik çözücüler kullanılabilir.
Partisyon (dağılma) kromatografisi; Dağılım, bir karışımdaki maddelerin birden fazla çözücü içerisindeki çözünürlükleri oranında dağılmasıdır. Her madde, fiziksel ve kimyasal özelliklerine, yapısında bulundurduğu fonksiyonel gruplara göre farklı çözünürlüğe sahiptir..bu yöntemde, sâbit sıvı faz, yüksek yüzey alanlı gözenekli bir katı destek maddesine emdirilmiştir. Hareketli faz ise sıvı veya gazdır. Ayırımı gerçekleştirilecek bileşikler hareketli ve sâbit faz sıvılarında farklı çözünürler. Çözünürlük farkından dolayı bileşikler sistemi önce veya sonra terk ederler. Çözünürlüğü sâbit fazda olan bileşikler sistemde daha uzun süre tutulduğu için sistemi daha geç terk eder.
iyon değiştirme kromatografisi: Benzer yüklü iyonların tersinir şekilde yer değiştirmesine iyon değişimi denir. iyon değişimi; sâbit fazın yüzeyinde kimyasal bağlarla bağlanmış yüklü grupların hareketli faz ile sürüklenen karışımda bulunan ve kendileriyle benzer yüke sahip gruplarla yer değiştirmesi üzerine kurulmuş bir mekanizmadır. şehir kullanım sularının temizlenmesinde ve yumuşatılmasında bu kromatografi mekanizması etkin bir şekilde kullanılmaktadır.
Jel filtrasyon ( moleküler eleme ) kromatografisi; Jel filtrasyon mekanizması ile karışımdaki bileşenler büyüklük farkına dayanılarak ayrılırlar. Herhangi bir karışım gözenekli bir jel içerisine döküldüğünde, karışım içindeki küçük moleküller gözeneklere tutunurken büyük moleküller jelden akarak geçerler. Böylece özellikle kromatografik saflaştırma sırasında bozunabilecek biyolojik bazı karışımlar (protein, enzim, vb.) bu mekanizmanın etkin olduğu jel geçirgenlik kromatografisi ile ayrılabilir.
iyon çifti kromatografisi: Bu teknik, özellikle iyonlaşabilen asidik veya bazik maddelerin ayrılmasında kullanılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çifti reaktif, sâbit faz tarafından adsorplanır ve iyonize olmuş maddeler iyon çiftleri ile iyonik etkileşime girerek birbirinden ayrılır.
Afinite kromatografisi: Afinite, moleküllerin birbirine duyduğu ilgiyi ifade eder. Afinite kromatografisi, ise moleküllerin bu özelliklerinden faydalanılarak yapılan ayırma ve saflaştırma işlemlerine verilen genel addır. Afinite kromatografisi, bioteknolojide yaşanan gelişmelere paralel olarak önemi hızla artan ve biomakromoleküllerin ayırmasaflaştırma işlemlerinde kullanılan bir tekniktir. Bu teknikte, biomakromolekülleri tanıyan ve ligand adı verilen moleküller katı bir destek üzerine tutturulur ve biomoleküller ile etkileşmeleri sağlanır.
SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER
Tıpta Biyokimyanın Amacı Bir molekülün Var olup olmadığını (ne olduğu - işlevi) Miktarını belirlemektir
Tıpta temel araştırmalar Sağlıklı durumun nasıl işlediği Hastalıkların nasıl oluştuğu Hastalıkların nasıl önlenebileceği Hastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleri
Tıpta günlük kullanımda Ayırıcı tanı TANI Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi Hastalığın seyrinin takibi Tedavi seçimini yönlendirir Tedavinin etkili olup olmadığının takibi Tedaviye ait yan etkilerin takibi
ŞİKAYET SORGULAMA (ANEMNEZ) SİSTEMİK MUAYENE OLASI TANILAR A X B Y AYIRICI TANI C Z TANI
Tıpta günlük kullanımda Ayırıcı tanı TANI Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi Hastalığın seyrinin takibi Tedavi seçimini yönlendirir Tedavinin etkili olup olmadığının takibi Tedaviye ait yan etkilerin takibi
Biyokimyada ölçüm yapmanın temeli Varlığı ya da miktarı araştırılan molekül ile OLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİME giren bir araç gereklidir!
Spektrofotometrik yöntemlerde bu araç kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için yöntemlere eklenen immunolojik veya enzimatik tepkimelerdir
ANTİKOR ENZİM
genellikle Renkli Berrak Çözeltiler elde ederiz
Elektromanyetik ışıma, uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerji türüdür
Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdır
Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyon enerjisidir. Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki genellikle nanometre (nm), bazen angström (A o ) ve milimikron (mµ) olarak ifade edilir. Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.
İnsan gözü, yaklaşık 380-750 nm arasında dalga boylarına sahip olan ışık enerjilerine cevap verebilmektedir. <380 nm dalga boyundaki ışık Ultraviyole (Mor-ötesi, U.V.) 380-440 nm dalga boyundaki ışık Menekşe 440-500 nm dalga boyundaki ışık Mavi 500-580 nm dalga boyundaki ışık Yeşil 580-600 nm dalga boyundaki ışık Sarı 600-620 nm dalga boyundaki ışık Turuncu 620-750 nm dalga boyundaki ışık Kırmızı >750 nm dalga boyundaki ışık İnfraruj (Kırmızı-ötesi, IR) olarak tanımlanır.
Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa (absorpluyorsa) siyah görünür. Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür. yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür.
Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır. Sarı-Mavi Kırmızı-Yeşil
Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri: Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon) Yayılım (emisyon) Geçiş (transmittans) Tutulum (absorbans) Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)
ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Ölçülen Özellik Işın Absorpsiyonu Işın Emisyonu Işın Saçılması Işın Kırılması Işın Difraksiyonu Işın rotasyonu Elektrik potansiyeli Elektrik yükü Elektrik akımı Elektriksel direnç Kütle Kütle/yük Tepkime Hızı Termal Özellikler Radyoaktivite Aletli Analiz Yöntemi Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi Refraktometri, interferometri X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri Polarimetri, dairesel dikroizm Potansiyometri, Kronopotansiyometri Kulometri Amperometri, Polarografi Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü) Gravimetri Kütle spektroskopisi Kinetik yöntemler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri
Bir çözeltiden Lambert-Beer kanunu: geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır
İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UVgörünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).
Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.
Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir.
Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik dansite, A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin (soğurulduğunun) ifadesidir.
Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya konsantrasyonu ile %Transmittans (%T) arasında doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A) arasında doğrusal bir ilişki vardır.
Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert- Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu veya küvet çapının (l) artmasıyla azalır; ayrıca dilüe çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu (c) ile doğru orantılıdır. absorpsiyon katsayısı (ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert- Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur.
Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır
Görünen renk Absorbe edilen renk Işık (nm) - - 220-380 Sarı-yeşil Menekşe 380-440 Sarı Mavi 440-475 Portakal Yeşil-mavi 475-495 Kırmızı Mavi-yeşil 495-505 Mor Yeşil 505-555 Menekşe Sarı-yeşil 555-575 Mavi Sarı 575-600 Yeşil-mavi Portakal 600-620 Mavi-yeşil Kırmızı 620-700
Dersin Akışı Biyokimyanın Amacı Biyokimyada ölçüm yapmanın temeli Spektrofotmetri ile ilgili tanımlar Spektrofotometrenin bölümleri Spektrofotometre ile ölçüm yapılması Özet
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.
Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.
Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda) ışık seçilir.
Özet Miktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğince ÖZGÜN ETKİLEŞİM Emilen (absorbe olan) ışık miktarı konsantrasyonla doğru orantılıdır