GĐRĐŞ Gıda örneklerinde maltoz, sakkaroz ve glukoz miktarının hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçümü için maltoz/sakkaroz/glukoz tayin kiti üretilmiştir. Maltoz bitki dokularında sukroz ve glukozla birlikte bulunan, iki glukoz molekülü içeren bir disakkarittir. Đsmini biracılıkta kullanılan malttan almaktadır ve nişastanın hidrolizi sonucu oluşmaktadır [1]. Maltoz α-glukozidaz enzimiyle glukoz birimlerine parçalanmaktadır. Enzimatik reaksiyon sonucu oluşan glukoz miktarı glukoz tayin kiti ile ölçülerek maltoz derişimi saptanmaktadır. α-glukozidaz enzimi α- 1-4 glukozidik bağları parçalayan bir enzim olması nedeniyle yapısında α-1-4 glukozidik bağ ile bağlanmış glukoz içeren moleküller maltoz analiz kitine girişim yapabilmektedir. Biyozim Maltoz/Sakkaroz/Glukoz Analiz Kiti nde yüksek saflıkta α- glukozidaz, invertaz, glukoz oksidaz ve peroksidaz enzimleri kullanılmış olup bu sayede örnek içerisindeki maltoz, sukroz ve glukozun spesifik ve doğru bir şekilde saptanması sağlanmıştır. Yöntem mümkün olduğunca basitleştirilmiş ve her aşamasında kullanıcı kolaylığı ön planda tutulmuştur. ANALĐZ PRENSĐBĐ Test kitinde iki aşamada enzimatik reaksiyonlar gerçekleştirilmektedir. Đlk aşamada α-glukozidaz enzimi varlığında maltoz glukoza, invertaz enzimi varlığında sakkaroz glukoz ve früktoza parçalanmaktadır. Maltoz + H O 2 α-glukosidase 2 D-Glukoz Sakkaroz + H O 2 α-glukosidase Đnvertaz D-Glukoz + Früktoz -1-
Đkinci aşamada enzimatik reaksiyonlar sonucu oluşan D-glukoz, glukoz oksidaz enzimi katalizörlüğünde, O 2 ve H 2 O varlığında glukonat a oksitlenmektedir. Bu reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksit, peroksidaz enzimi katalizörlüğünde 4-aminoantipirin ve fenol ile reaksiyona girerek, 505 nm de maksimum absorbans veren kırmızı renkli iminokuinon bileşiğini oluşturmaktadır. Glukoz oksidaz D-Glukoz+O 2 +H 2 O Glukonat+H 2 O 2 H 2 O 2 + 4-Aminoantipirin + Fenol Peroksidaz Đminokuinon + H 2 O Oluşan renkli bileşiğin miktarı, glukoz miktarı ile doğru orantılı olup, fotometrik olarak saptanabilmektedir. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl, 20-200 µl) Balon joje (100-250 ml) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Su banyosu (37ºC) Spektrofotometre (505 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Maltoz/Sakaroz/Glukoz analiz kiti; glukoz analiz reaktifi, glukoz analiz tamponu, glukoz standardı, sakkaroz analiz reaktifi, maltoz analiz reaktifinden oluşmaktadır. 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. -2-
1 nolu şişe (#01-050-1): Glukoz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Glukoz oksidaz 10,000 IU/şişe Peroksidaz 1,000 IU/şişe 4-Aminoantipirin 0.2 mm 2 nolu şişe (#01-125-2): Glukoz analiz tamponu (Derişik, 50 ml) Potasyum dihidrojen fosfat (0.4 M) Fenol (0.2 mm) 2 3 nolu şişe (#01-001-3): Glukoz standardı Glukoz 0.5 g (MA=180.42 g/gmol) 4 nolu şişe (#04-050-4): Sakkaroz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Sodyum sitrat tamponu (ph 4.5-0.20 mm) Đnvertaz 2,000 IU/şişe Sodyum azid (% 0.2) 5 nolu şişe (#04-050-5): Maltoz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Sodyum sidrat tamponu (ph 4.5-0.20 mm) α-glukozidaz 1,000 IU/şişe Sodyum azid (% 0.2) ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Maltoz/Sakkaroz/Glukoz tayini ile ilgili tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilir. Glukoz analiz reaktifinin hazırlanması: 1 nolu şişe üzerine 2.5 ml glukoz analiz tamponu ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Glukoz analiz reaktifi hazırlandıktan sonra 2-8 C de 1 ay 2 Fenol toksik bir madde olup bu çözeltiyi kullanılırken dikkatli olunmalıdır. -3-
süre ile saklanabilir. Çözelti hazırlandıktan sonra dondurulmamalıdır. 3 Glukoz analiz tamponu: Glukoz analiz tamponu kullanıma hazır halde sunulmuştur. Glukoz standart çözeltisinin hazırlanması: 3 nolu şişe içerisinde bulunan glukoz standardı kullanılarak 0.25 g/l, 0.50 g/l, 0.75 g/l ve 1 g/l derişimlerindeki glukoz çözeltilerini saf su kullanarak hazırlayınız. Dört farklı derişimdeki glukoz çözeltileri kalibrasyon grafiğinin üretilmesinde kullanılacaktır. Sakkaroz analiz reaktifi: Sakkaroz analiz tamponu kullanıma hazır halde sunulmuştur. Maltoz analiz reaktifi: Maltoz analiz reaktifi kullanıma hazır halde sunulmuştur. Çözeltileri dondurmayınız. STABĐLĐTE Analiz kimyasalları belirtilen koşullarda saklanması durumunda 12 ay süre içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. Analiz çözeltisi hazırlandıktan sonra 2-8ºC de muhafaza edilmesi durumunda 1 ay saklanabilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin üretilmesi aşamasında kullanılmak üzere hazırlanan glukoz çözeltilerinin günlük olarak hazırlanması gerekmektedir. Hazırlanan çözeltilerin uzun süre kullanımı için koruyucu ilave edilmeli ve/veya 2-8ºC de muhafaza edilmelidir. Analiz sayısına göre gerekli miktarda analiz çözeltisini hazırlayınız. Bu sayede analiz kimyasalları daha verimli olarak kullanılabilecektir. Bir seferde 50 nin üzerinde analiz yapılması gerekiyorsa 50 analiz için gerekli kimyasalların yer aldığı şişe içeriklerini daha büyük hacimli amber renkli cam bir şişe 3 Đhtiyacınıza göre 50 analizlik hacimler halinde hazırlayınız. Analiz reaktifinin muhafazası süresince pembe renk oluşumu gözlenebilir. Analiz reaktifi 1/25 oranında saf su ile seyreltildikten sonra 505 nm de ölçülen absorbans değerinin 0.05 in üzerinde olması durumunda analiz reaktifi kullanılmamalıdır. -4-
içerisinde birleştirilmelidir. Bu sayede her bir analiz şişesi için ayrı bir kalibrasyon grafiği hazırlamaksızın tek bir kalibrasyon grafiği ile ölçümler gerçekleştirilebilecektir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin berrak ve homojen olması gerekmektedir. Katı veya bulanık örneklerde analizi gerçekleştirilmesi durumunda EK1 de verilen berrak örnek hazırlama yöntemlerinden yararlanılmalıdır. Örneğin 4 g/l den fazla analit (maltoz+sakkaroz+glukoz) içermesi durumunda seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Glukoz derişimi (g/l) Örnek + Saf Su Miktarı Seyreltme Faktörü (SF) < 4-1 4.0-40.0 1 + 9 10 40.0-400.0 1 + 99 100 ANALĐZ BĐLGĐLERĐ >400.0 1 + 999 1000 Spekrofotometre dalga boyu : 505 nm Küvet : 1 cm standart (Plastik veya cam) Ölçüm sıcaklığı : 25ºC veya 37ºC ve 55ºC Spekrofotometre sıfır ayarı UYARILAR : Kör çözeltisi Analiz çözeltilerini hazırladıktan sonra dondurmayınız. Analiz çözeltilerini çapraz-kontamine etmeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. -5-
ANALĐZ PROSEDÜRÜ a) Örneğin glukoz derişiminin hesaplanması 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 3. Test tüplerine 0.05 ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 4. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. 5. 0.05 ml glukoz analiz reaktifini ilave ediniz. 6. 0.40 ml tampon ilave ediniz. 7. Son hacim 2.50 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. 8. 25ºC de 40 dakika veya 37ºC de 20 dakika inkübe ediniz. 9. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız. 10. 505 nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 4 b) Örneğin maltoz+glukoz ve sakkaroz+glukoz derişiminin saptanması 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 3. Test tüplerine 0.025 ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 4. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. 5. 0.05 ml maltoz analiz reaktifini ve 0.05 ml sakkaroz analiz reaktifi ilave ediniz. 4 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. -6-
6. Son hacim 1.25 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. 7. 55 C de 20 dakika inkübe ediniz. 8. 0.05 ml glukoz analiz reaktifini ilave ediniz. 9. 0.40 ml tampon ilave ediniz. 10. Son hacim 2.50 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. 11. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız. 12. 505 nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 5 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar tabloda özetlenmiştir. a) Örneğin glukoz derişiminin saptanması KÖR ÖRNEK Örnek veya standart - 0.025 ml Tüplerin, analiz çözeltisinin ve saf suyun analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. Glukoz analiz reaktifi 0.050 ml 0.050 ml Glukoz analiz tamponu 6 0.400 ml 0.400 ml Saf su 2.050 ml 2.025 ml 25ºC de 40 dk veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 505 nm de absorbans artışını ( A G ) ölçünüz. 5 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. 6 Analiz tamponunu ölçüm sıcaklığına gelmesini sağladıktan sonra ilave ediniz. -7-
b) Örneğin sakkaroz+glukoz ve maltoz+sakkaroz+glukoz derişiminin saptanması Sakkaroz +Glukoz Maltoz+Glukoz Kör Örnek Kör Örnek Örnek - 0.025 ml - 0.025 ml Tüplerin, analiz çözeltisinin ve saf suyun analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. Sakkaroz analiz reaktifi Maltoz analiz reaktifi 0.050 ml 0.050 ml - - - - 0.050 ml 0.050 ml Saf su 0.075 ml 0.050 ml 0.075 ml 0.050 ml 55ºC de 20 dk inkübe ediniz Glukoz analiz reaktifi 0.050 ml 0.050 ml 0.050 ml 0.050 ml Glukoz analiz tamponu 7 0.400 ml 0.400 ml 0.400 ml 0.400 ml Saf su 1.925 ml 1.925 ml 1.925 ml 1.925 ml 25ºC de 40 dakika veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 505 nm de absorbans ölçümü A 1 A 2 A 3 A 4 Absorbans A SG (A 2 -A 1 ) A MG (A 4 -A 3 ) 7 Analiz tamponunu ölçüm sıcaklığına gelmesini sağladıktan sonra ilave ediniz. -8-
KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE ÖRNEK GLUKOZ DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan glukoz standart çözeltileri kullanılarak derişim-absorbans ( A G ) grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orjinden geçiriniz. 8, 9 Eğilim çizgisinin eğimini (M, Örneğin glukoz derişimi: L abs x g glukoz ) saptayınız. Örneğin glukoz derişimi (g/l)= Glukoz için saptanan absorbans artışı ( A G) xsf Kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) Örneğin sakkaroz derişimi: Sakkaroz derişimi (g/l)= Sakkaroz için saptanan abs. Artışı ( A SG - A G ) Kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) x 342 180 x SF Örneğin maltoz derişimi: Maltozderişimi (g/l)= Maltoz için saptanan abs. Artışı A ( MG - A G ) Kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) x 360 180 x SF ÖNEMLĐ UYARI Derişim hesaplamalarında sadece sıvı örnekler (veya filtratlar) için seyreltme faktörü kullanılarak hesaplamalar gerçekleştirilmiştir. 8 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 9 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) 0.985 in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. -9-
Örneğinizde seyreltme tablosunda yer alan seyreltme harici herhangi bir ön seyreltme yapılmışsa hesaplamalarda mutlaka kullanılmalıdır. Katı örneklerde örneğin hazırlandığı toplam hacim ile hesaplanan derişim değerleri çarpılarak toplam analit miktarı saptanmalı ve sonrasında alınan örnek miktarına bölünerek birim örnek ağrılığı başına derişim değerleri hesaplanmalıdır. DOĞRUSALLIK SINIRI Hazırlanan Maltoz/Sakkaroz/Glukoz Tayin Kitinin 4 g/l derişimine kadar doğrusal olduğu saptanmıştır. Daha yüksek analit içeren örneklerin seyreltme tablosu kullanılarak seyreltilmesi gerekmektedir. HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Maltoz/Sakkaroz/Glukoz Tayin Kiti ortamda 4 g/l toplam analit (maltoz+sakkaroz+glukoz) varlığında yaklaşık 1.40 abs üretecek şekilde hazırlanmıştır. 0.001 Abs değerinde değişim olması durumunda glukoz derişimde ~1.43 mg/l lik bir değişim ölçülebilecektir. Ölçüm sınırı spekrofotometre gürültü seviyesinin 3 katı absorbans değerine eşdeğer glukoz derişimi olarak hesaplanmıştır. Ölçüm sınırı kullanılan spekrofotometreye bağlı olarak değişmekle birlikte üretim ve kalite kontrol sürecinde kullanılan Agilent UV/Vis Spekrofotometre için ölçüm sınırı 2.5 mg/l olarak saptanmıştır. DOĞRULUK Maltoz/Sakkaroz/Glukoz Tayin Kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı maltoz, sakkaroz ve glukoz derişiminlerinde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK=ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Tüm ölçüm sonuçları için %DK değeri % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. -10-
Örnekler Derişim (g/l) Standart Sapma % DK Glukoz Sakkaroz Maltoz 0.250 ± 0.007 2.80 0.900 ± 0.013 1.41 0.685 ± 0.003 3.80 2.000 ± 0.040 2.00 0.125 ± 0.004 3.20 0.800 ± 0.037 6.25 Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının uygun olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. -11-
GÜVENLĐK Maltoz/sakkaroz/glukoz analiz kitinde sodyum azid ve fenol kullanılmaktadır. Sodyum azid ve fenol toksik maddeler olması nedeniyle analiz sürecinde dikkatli olunmalıdır. Bu maddeleri içeren çözeltilerin koklanmaması, içilmemesi, vücuda temas ettirilmemesi gerekmektedir. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. GĐRĐŞĐM FAKTÖRLERĐ Maltoz, sakkaroz ve glukoz pek çok oligosakkaritin ve polisakkaritin yapısında bulunabilmektedir. Ortamda bu moleküllerin parçalanmasını katalizleyen enzimlerin ve/veya kimyasalların bulunması durumunda analiz kiti yanlış sonuçlar üretecektir. Böyle bir durumla karşılaşılması durumunda ortamdaki katalizörlerin aktivitelerini sonlandıracak tedbirler alınması gerekmektedir. Geliştirilen yöntemin glukozun oksidasyonu sonucu oluşan hidrojen peroksidin kantitatif olarak saptanmasını temel alan bir yöntem olması nedeniyle analiz ortamında hidrojen peroksidin bulunması veya reaksiyon süresince hidrojen peroksidin üretiminin gerçekleşmesi durumunda enzimatik test kiti yanlış sonuç üretecektir. Böyle bir durumla karşılaşıldığında üretici firma ile temasa geçiniz. Gerekli teknik destek üretici firma tarafından sağlanacaktır. -12-
EK 1. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin bulanık olmaması, herhangi bir partikül içermemesi, renksiz olması gerekmektedir. Renkli çözelti olması durumunda analize başlamadan önce her bir örnek için örnek miktarı kadar hacim analiz tamponu ile karıştırılmalı ve analiz tamponuna karşı okunarak örneğin neden olmuş olduğu absorbans artışı saptanmalıdır. Bu absorbans değeri örnek-analiz reaktifi varlığında saptanan absorbans değerinden çıkartıldıktan sonra saptanan absorbans değeri hesaplamalarda kullanılmalıdır. Absorbans değerinin çok yüksek olması durumunda örnek seyreltilerek ölçüm gerçekleştirilebilir. Örneğin seyreltilmesi durumunda örneğin glukoz derişimi glukoz tayin kiti ölçüm sınırının altına iniyorsa seyreltme işlemi yapılmaksızın renk giderici maddeler ile muamele edilmelidir. Örneğin ph değerinin analiz tamponu ph değerine yakın olması tercih edilmelidir. Seyreltik asit veya baz içeren örneklerde bu ph değeri aranmamaktadır. Fakat derişik asit veya baz içeren örneklerin ph değerleri ph 7.6 olacak şekilde sodyum hidroksit veya sülfürik asit ilave edilerek ayarlanmalıdır. ph nın ayarlaması esnasında meydana gelecek hacim artışı hesaplamalarda kullanılmak üzere kaydedilmelidir. Katı örnekler öğütülmeli homojenize edilmeli ve su kullanılarak çözünür maddeler ekstrakte edilmelidir. Bulanık çözeltiler filtre edilmelidir. Bulanık, renkli veya protein içeriği yüksek örnekler Carrez çözeltileri kullanılarak berraklaştırılmalıdır. Yağ içeren örneklerde eksraksiyon işlemi yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilmeli, su-yağ karışımı soğutularak veya santrifüj edilerek yağ fazının ayrılması sağlanmalıdır. Berrak su fazında glukoz ölçümü gerçekleştirilmelidir. Örneğinizde herhangi bir şekilde glukozu substrat olarak kullanan enzimin bulunması durumunda, bu enzimin çalışma koşullarının dışında analizin gerçekleştirildiğinden emin olunmalı, mümkünse enzimler inhibe edilmelidir. Ayrıca mikrobiyal gelişme ihtimali ortadan kaldırılmalı, örnekler bekletilmeden analizlenmeli veya uygun koşullarda saklamalıdır. Yapısında glukoz içeren di, oligo veya polisakkaritin ortamda bulunması durumunda bu moleküller parçalandığı takdirde örneğin glukoz içeriğinin artacağı unutulmamalı, -13-
kuvvetli asitlerle etkileştirilmemeli ve muhtemel enzimatik reaksiyonlar engellenmelidir. Yüksek miktarda renk maddesi içeren örneklerde polivinilpoliprolidon veya poliamid çözeltileri kullanılarak renk giderme işlemi gerçekleştirilmelidir (1g/100 ml). Karbondioksit ve benzeri gaz içerikli örneklerde mutlaka gaz giderme işlemi yapılmalıdır. Carrez Çözeltileri ile Çöktürme Đşlemi 100 ml lik balon joje içerisine sıvı örneğinizi pipet yardımıyla veya katı örneğinizi tartarak aktarınız (Örnek miktarına örneğin tahmini glukoz içeriğine göre karar verilmelidir.). Örnek üzerine 60 ml saf su ve sonrasında 5 ml Carrez-I çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Daha sonra 5 ml Carrez-II çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Çözeltinin ph değeri 7.6 olacak şekilde sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız, 100 ml ye saf su kullanarak tamamlayınız ve filtre ediniz. Filtratı analizinizde kullanınız ve bu işlemde gerçekleşen seyreltme faktörünü örneğinizin glukoz içeriğinin saptanmasında kullanınız. Carrez-I çözeltisi: 21.95 g çinko asetat dihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.2H 2 O] veya 24 g çinko asetat trihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.3H 2 O] suda çözülür, 3 ml glasiyal asetik asit katılır, damıtık su ile 100 ml'ye tamamlanır. Carrez-II çözeltisi: 10.6 g potasyum demir-ii siyanür trihidrat [K 4 Fe(CN) 6.3H 2 O] suda çözülür, 100 ml ye tamamlanır [2]. -14-
EK 2 ÖRNEK HAZIRLAMA UYGULAMALARI Meyve suyu ve benzeri örneklerde maltoz/sakkaroz/glukoz tayini: Bulanıklık etmenlerini örneği filtre ederek uzaklaştırınız. Gerekli olması durumunda Carrez çözeltilerini kullanarak berraklaştırınız. Örneğinizi yaklaşık glukoz içeriği 0.1-2.0 g/l olacak şekilde seyreltiniz. Renkli örnekleri seyrelterek rengin analiz üzerindeki olumsuz etkisini ortadan kaldırınız gerekiyorsa kimyasallar kullanarak renk giderme işlemi gerçekleştiriniz. Kimyasal renk giderme amacıyla 10 ml örnek üzerine 0.1 g poliamid veya polivinilpoliprolidon ilave ediniz, kuvvetlice karıştırınız ve sonrasında filtre ederek berrak çözeltide glukoz tayini yapınız. Gazlı alkollü ve alkolsüz içeceklerde maltoz/sakkaroz/glukoz tayini: Karbonik asidin örneğin yapısından ayrılması için 3 dk 35-40 C de karıştırınız ve sonrasında glukoz tayinini yapınız. Reçel ve benzeri örneklerde maltoz/sakkaroz/glukoz tayini: Örneği homojenize ettikten sonra yaklaşık 0.5 g örneği 100 ml lik balon içerisine tartınız ve saf su ile 100 ml ye tamamlayınız. Gerekli olması durumunda filtre ediniz ve berrak filtratta glukoz tayinini gerçekleştiriniz. Bal örneklerinde maltoz / sakkaroz / glukoz tayini: Spatül yardımıyla balı karıştırınız ve yaklaşık 20 g örnek alınız. Örneğinize 15 dk süre ile 60-65ºC de ısı uygulayınız ve bu süre içerisinde örneğiniz karıştırınız. Sonrasında soğumasını bekleyiniz. 100 ml lık balon içerisine 1 g örnek tartınız, aşamalı olarak saf su ile çözünüz ve son hacmi 100 ml ye tamamlayınız. Örneğinizi 1:10 oranında saf su ile seyreltiniz ve glukoz tayinini gerçekleştiriniz. Un, ekmek, bisküvi ve benzeri örneklerde maltoz / sakkaroz / glukoz tayini: Yaklaşık 10 g örneği 50 ml saf su içerisinde homojenize ediniz ve 250 ml lık erlen içerisine aktarınız. Erlene 150 ml saf su ilave ediniz, karıştırınız ve 5 ml Carrez I ilave ediniz, karıştırınız, 5 ml Carrez II ilave ediniz, karıştırınız. Karışımın ph sını 7.6 ya sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız ve sonrasında 250 ml lik balon jojeye -15-
transfer ediniz. Son hacim 250 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz ve 10, 11 çözeltiyi filtre ederek berrak filtratta glukoz tayini yapınız. Bitkisel ve hayvansal doku parçalarında maltoz / sakkaroz / glukoz tayini: Örneğinizin gerekli olması durumunda parçalayınız, öğütünüz, saf su kullanarak homojenize ederek glukozun örnekten ekstrakte ve sonrasında filtre edilebilmesini sağlayınız. (Bu aşamada örneğinizin kuru madde ve glukoz miktarına bağlı olarak değişmekle birlikte kuru bir örnek için 0.25 g örneğin alınması ve filtrasyon öncesi hacminin 100 ml ye tamamlanması tavsiye edilmektedir. 100 ml lik bir balon joje içerisine 50 ml filtratınızdan ilave ediniz ve sonrasında 5 ml Carrez-I ve 5 ml Carrez-II ilave ediniz. Her bir aşamadan sonra kuvvetli bir şekilde çalkalayınız ve sonrasında son hacmi 100 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. Karışımı filtre ediniz ve filtratınızda glukoz tayinini gerçekleştiriniz [3]. REFERANSLAR 1. Saldamlı Đ.S. ed.: Gıda Kimyası, Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, Türkiye (1998) 2. http://www.saglik.gov.tr/sb/extras/mevzuat/teb_sekerler_anali z.pdf 3. http://www.food-diagnostics.se/data/menu/produkter/rbiopharm/boehringermannheim/pdf/e0716251_pi.pdf 10 Örneğinizdeki glukoz içeriğini kuru madde üzerinden vermek istiyorsanız örneğinizdeki nem içeriğini saptayınız ve hesaplamalarınızda kullanınız. 11 Ekmek, bisküvi ve benzeri örneklerde gerekli olması durumunda 30 dk süre ile 60-70ºC de ısıl işlem uygulayınız -16-
UYARI Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almak ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. -17-