Kanser Nanoteknolojisi: Sistemik veya Lokal Kemoterapi için Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Tasarımı ve Geliştirilmesi Prof. Dr. Erem BİLENSOY Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı ITAM Biyo- ve Nanoteknolojik İlaçlar Toplantısı 3 Aralık 2013
Sunum planı Kanserde ilaç tedavisi- kemoterapi Güncel durum ve zorluklar Nanoteknolojinin kanser tedavisinde önemi Nanopartikül Geliştirme Çalışmalarına Örnekler Sistemik etkili kemoterapötik nanopartiküller Siklodekstrin nanopartiküller (Oral ve enjektabl) Lokal etkili kemoterapötik nanopartiküller Mesane kanseri tedavisinde kullanılmak üzere katyonik nanopartiküller- Mitomisin C Lokal etkili immünoterapötik nanopartiküller Mesane kanseri tedavisinde kullanılmak üzere BCG yüklü nanopartiküller
Kanser Güncel Durum Kanser önde gelen bir ölüm sebebidir: Her yıl 10 milyon insanda kanser teşhis edilmektedir Her yıl 6 milyon ölüme sebep olur Tüm ölüm sebepleri içinde %12 oranında Kanser tedavisi maliyeti ; 157 milyar USD ABD de kanserden ölüm oranı 1950 ile 2001 yılları arasında degişmeden kalmıştır. Son 10 yılda ölüm oranında erkeklerde her yıl %1.8 ve kadınlarda her yıl %1.5 azalma vardır.
Kanserde kemoterapinin zorlukları Toksisite ve ciddi yan etkiler Formulasyon faktörleri Çözünürlük artırıcı eksipiyanlar (Cremophor EL) Antikanser ilaçların farmakokinetik degişkenlikleri Tedavide pulse rejim ve gerileme dönemleri Seçici olmayan sitotoksisite Antikanser ilaçların geniş dagılma hacmi ve kanser hücrelerinin yanısıra saglıklı hücrelere de sitotoksik etki göstermeleri Etkisiz kemoterapi İlaç özellikleri Düşük suda çözünürlük (paklitaksel, dosetaksel) Fizyolojik koşullarda stabilite problemleri (kamptotesin)
Kanserde kemoterapinin zorlukları İlaç direnci Fizyolojik bariyerlere bağlı direnç Tümörün zayıf damarlanmış bölgeleri Asidik çevre Yüksek interstisyel basınç ve düşük mikrovasküler basınç Hücresel mekanizmalar Spesifik enzim sistemlerinin aktivitelerinde degişiklik Topoizomeraz aktivitesi Apoptosis döngüsünde degişiklik Transport bazlı mekanizmalarda degişiklik P-gp pompası Antikanser ilaçların oral uygulamasında eksiklik Çok düşük oral biyoyararlanım
Tümör Tümör Yapısı Tümör sadece kanser hücrelerinden oluşmaz Kan damarlarını oluşturan epitelyal hücreler ve gelişen tümör damar ağını stabilize eden stromal perisitleri içeren komplike bir ag yapısı
Kanser tedavisinde hedeflenmiş nanopartiküller
Kanser tedavisinde hedeflenmiş nanopartiküller Tümöre hedeflendirme Pasif hedeflendirme Aktif hedeflendirme 400 nm.nin altında partiküllerle EPR etkisi Yüzey modifikasyonu ile dolaşımda uzun süre kalma ve hücre içine ilaç hedeflendirme Folat gibi yüzey reseptörleri ile tümör hücresine aktif hedeflendirme İntegrin reseptörleri ile tümörü besleyen damarlara hedeflendirme ANTİKANSER İLACIN TÜMÖR DOKUSUNDA SELEKTİF OLARAK BİRİKMESİ
Sistemik etkili nanopartiküller ve kemoterapi Enjektabl siklodekstrin nanopartiküller 6OCAPRO BCD Folat-PEG-CD Polikatyonik BCDC6 Oral nanopartiküller CS-CD nanokapsüller CS-PCL nanokapsüller
Siklodekstrinler Siklodekstrinler, nişastanın enzimatik degradasyonu sonucu elde edilen ve endüstriyel ölçekte üretilen siklik oligosakaritlerdir GRAS Gıda takviyesi-fda Orphan Drug statüsü 2012 Özel yapı: Apolar kavite ve polar dış yüzey Aktif molekülleri apolar kavitede tutma ve tutulan molekülün tüm fizikokimyasal özelliklerini maskeleme olanagı Çözünürlük artışı Stabilitede düzelme Yan etkilerin ortadan kaldırılması
Siklodekstrinler Primer yüz Apolar kavite OH (6) OH (3) OH (2) Sekonder yüz Modifikasyon bölgeleri Modifikasyon Nedenleri 1. Dogal siklodekstrinlerin iv uygulama sonrası yol açtığı hemoliz ve nefrotoksisiteyi azaltmak 2. ß-CD in sınırlı olan suda çözünürlügünü artırmak 3. CDlerin biyolojik membranlarle etkileşimini artırmak 4. Siklodekstrinlerin inklüzyon yapma kapasitelerini artırmak/geliştirmek 5. Dogal olaral hidrofilik olan siklodekstrinlere arayüzeylerde kendi kendine organize olma özelligi kazandırma (amfifilik karakter)
Amfifilik siklodekstrinler Amfifilik siklodekstrinler dogal siklodekstrinlerin kiyasal türevleridir (beta ve gama-cd) Alifatik zincirlerin primer ve/veya sekonder yüze takılması ile Farklı boylarda C2-C18 Farklı bag tipleri ile baglanarak Ester Eter Amid Tiyo Floro Farklı yapılarda Dogrusal Dallanmış Primer yüzü modifiye amfifilik siklodekstrin
O H O O H O C 6 3 O O 2 O C O 7 O O H O H C 3 6 N H 2 O O H O 7 O O H O H C 3 6 O 2 O O H O 7 O O H O H C 3 6 N H 2 O O H O 7 O C O H O H N H 6 2 3 O O H O 7 Amphiphilic CD MW (g/mol) Melting point (ºC) Solubility in alcohol mm mg/ml Solubility in acetone mm mg/ml HLB ß-CDC6 2506 230 0.6 1.5 1.0 2.5 8.9 6-O-CAPRO 1820 250 2.0 3.6 2.0 3.6 11.1 6-N-CAPRO 1813 224 1.0 1.8 0.4 0.72 11.2 6-N-MYRISTO 2597 198 0.4 1.04 0.4 1.04 7.8 Ramified 1813 309 0.2 0.36 0.8 1.44 11.2 Grubumuzca sentezlenen amfifilik siklodekstrin molekülleri
Surface pressure (mn/m) interfacial tension gi (mn/m) Amfifilik siklodekstrinler Yüzeylerarası davranış- yüzey etkinlik Hava-su arayüzeyi 30 Yag-su arayüzeyi 70 60 25 50 20 40 30 15 20 10 10 0 0 100 200 300 400 500 Molecular area (Å 2 ) 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 molecular density, d (x 1013 molecules/cm2 ) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1) -CDC6 2) 6-O-CAPRO- -CD 3) 6-N-CAPRO- -CD 4) 6-N-MYRISTO- -CD 5) Ramified -CD
Amfifilik CD nanopartiküller 6-O-CAPRO-ß-CD Nanoküre 6-O-CAPRO-ß-CD Nanokapsül Freeze-fracture sonrası TEM görüntüleri
Cell Viability % Cumulative % tamoxifen citrate released Tamoksifen sitrat Yan etkiler doza bağımlı Çözüm: Daha düşük dozla kolloidal taşıyıcılarla ilacı kanserli dokulara taşımak 120 120 100 80 100 80 60 60 40 40 20 20 0 Control ULNC ULNS LNC LNS TXCit-Sol. MCF7 ve MELN hücrelerine karşı iyi antikanser etkinlik 0 0 1 2 3 4 5 6 Time (hr) TMX HL NS TMX PL NS TMX CL NS Kontrollü salım sağlandı
Paclitaxel yüklü amfifilik CD nanopartiküller Doğal kemotarapötik, diterpenoid pseudo-alkaloid; ilk olarak Taxus brevifolia agacının gövdesinden ekstre edilmiş (Taxaceae) Çok düşük çözünürlüge sahip lipofilik ilaç 6 μg/ml Ticari enjektabl formülasyon: Cremophor EL:absolü alkol (50:50 v/v) Paklitaksel MF: C 47 H 51 NO 14, MA: 853,9 g/mol
PCX yüklü amfifilik CD nanopartiküller Problemler ve çözüm yaklaşımları Ticari vehikül Cremophor EL nin sebep olduğu ciddi hipersensitivite reaksiyonları ve yan etkiler Cremophor EL: elektrofoeretik mobiliteyi degistirir ve HDL nin biyokimyasal özelliklerinde degişiklige yol açar Cremophor EL: non-lineer dispozisyona yol açar Tümör bölgesinde terapötik doz saglayabilmek için gerekli PCX konsantrasyonunun yüksekligi sonucu kanserli hücrelerin yanısıra saglıklı hücrelere de sitotoksik etki Dilüe çözeltilerde rekristalizasyon ve çökme i.v. infüzyon setleri ile geçimsiz
Mean diameter (nm) Zeta potential (mv) PCX yüklü amfifilik CD nanopartiküller Güvenirlik E. Bilensoy et al, Int. J. Pharm., 347, 163, 2008 600 500 400 300 200 100 0-10 -15-20 -25-30 -35 0 1 7 30-40 Time (days) CL NS CL NC HL NS HL NC 0 1 2 3 4 5 µm nm 0 1 2 3 4 µm 0 0 160 0.5 0.5 140 1 1 120 1.5 1.5 2 100 2 0-5 0 1 7 30 Time (days) CL NS CL NC HL NS HL NC µm 0.8 0.7 0.6 0.5 2.5 3 3.5 4 4.5 2.5 80 3 60 3.5 40 4 4.5 20 0.4 0.3 0.2 0.1 5 µm 5 0 0 µm Taze 1-hafta 1-ay
Hemolysis % PCX yüklü amfifilik CD nanopartiküller Güvenirlik Boş vehiküllerin insan kanındaki hemolitik aktivitesi 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Molar CD concentration (mm) Nanosphere Nanocapsule cremophor:ethanol E. Bilensoy et al, Int. J. Pharm., 347, 163, 2008
PCX yüklü amfifilik CD nanopartiküller Güvenirlik Boş vehiküllerin L929 fare fibroblast hücrelerinde sitotoksisitesi % cell viability 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0,000 128 64 32 16 8 dilution (1/x) Cremophor:EtOH Nanosphere Nanocapsule E. Bilensoy et al, Int. J. Pharm., 347, 163, 2008
Cell viability % PCX yüklü amfifilik CD nanopartiküller Etkinlik PCX yüklü nanopartiküllerin MCF7 insan meme kanser hücre hattına karşı antikanser etkinligi 120 100 80 60 40 20 0 Cremophor:ethanol Nanosphere Nanocapsule Control E. Bilensoy et al, Int. J. Pharm., 347, 163, 2008
Kamptotesin Pekçok kanser tipine karşı çok etkili (AC, prostat, kolon, mide, yumurtalık karsinoma, melanoma, lemfoma ve sarkomalara karşı) Ancak klinik çalışmalarda terapötik etki gözlenmedi ve beklenmeyen yan etkilere rastlandı!!! Düşük suda çözünürlük ph ya bağlı hızlı hidroliz sonu aktif lakton formundan inaktif karboksilat formuna dönüş stabilite ve biyoyararlanım sorununa yol açıyor. CD nanopartiküller PLGA ve PCL nanopartiküllerle karşılaştırıldı Formulasyon Yüklenen ilaç miktarı (mcg/ml) % yüklenen ilaç ß-CDC6 28 9 6-O-CAPRO 48 13 PLGA 13 2.6 PCL 7 1.4
Cumulative CPT Release % Kamptotesin 120 100 80 60 40 20 0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 Time (hr) 6-O-CAPRO-β-CD β-cdc6 PLGA PCL
Cell viability (%) Cell Viability (%) Kamptotesin 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 Unloaded 6-O- CAPRO-βCD Nanoparticles BLANK β-cdc6 NP Unloaded PLGA Nanoparticles Unloaded PCL Nanoparticles L929 cell line MCF-7 cell line
Kamptotesin Fischer F344 dişi ratlar (150-175 g) (10-11 haftalık 10 µl 9L rat glioma hücre suspansiyonu (10 3 hücre) intrakraniyal implantasyon Stereotaksis deneysel düzenek ile 9L hücreleri doğru yere ekildi. 9L hücre implantasyonu ve tümör indüksiyonu MRI ile 5. gün tümör oluşumunun gözlenmesi
survival % Kamptotesin 100 80 60 40 20 0 1 10 19 28 37 survival time after 9 L gliosarcoma implantation 6-O-CAPRO-BCD B-CDC6 PLGA PCL 6-O-CAPRO-BCD-HIGH CONC Hayatta kalma oranları
Katyonik Nanopartiküller ve Kanser Pozitif yüzey yüküne sahip nanopartiküller biyolojik membranlarla etkileşim ve hücre içine giriş açısından avantajlı Katyonik polimerlerden hazırlanıyor veya bu polimerlerle kaplanarak pozitif yük veriliyor. Kitosan, PLL, PLArg, PEI, Polikatyonik siklodekstrinler Kan dolaşımından makrofajlarca uzaklaştırma ve RES alımı daha hızlı!! Lokal uygulamalar için daha uygun
Katyonik Nanopartiküller Katyonik «core-shell» nanopartiküller Core-Shell CS-PCL PLL-PCL mepeg-pcl CS-mePEG-PCL CS-CD Uygulamalar Mesane tümörleri Beyin glioma tümörleri Oral uygulama
SORUN Katyonik core-shell nanopartiküllerle mesane Yüksek nüks oranı (%80). kanseri tedavisi İlaçta doz kaybı ve asit ph ya dayanıksızlık İlaçların sistemik dolaşıma geçmesine bağlı yan etkiler ÇÖZÜM İlacın mesanede kalış süresini uzatabilen, mukozal yüzeyleri uzatılmış temas sağlayan, hücresel ilaç taşıyıcı özelliğe sahip ve kanserli hücrelere spesifik afinite gösteren bir yeni ilaç taşıyıcı sistem tasarımı
Formülasyon yaklaşımı AMAÇ 1. Mesane duvarında ilacın kalış süresini uzatma 2. Kanserli dokularda ilaç için bir konsantrasyon gradyanı oluşturma 3. MMC nin hızla degradasyonuna yol açan idrarın asit ph sına karşı ilacın dayanıklılığını artırma
Katyonik nanopartiküllerin formülasyon iyileştirme çalışmaları Çift emülsiyon ve nanopresipitasyon teknikleri ile nanopartikül hazırlama Nanoparticle Formulations Particle size (nm) Polydispersity Index Zeta Potential CS-PCL 318.6±5.23 0.184 10.5±1.19 PLL-PCL 293±1.73 0.268 11.2±1.2 CS 166.1±5.62 0.253 35.2±1.1 Nanoparticle Formulations Loading % after double emulsion Loading after nanoprecipitation CS-PCL 35.33 13.1 PLL-PCL 14.9 21.4 CS 19.05 21.1
Nanopartiküllerin morfolojisi (SEM) Blank CS Blank CS-PCL Blank PLL-PCL MMC-loaded CS MMC loaded CS-PCL MMC loaded PLL-PCL
Katyonik nanopartiküllerin formülasyonu ph 6.0 ph 7.8 MMC en çok ph 7.8 de stabil Nanopartiküllerle MMC nin asit ph daki stabilitesi korunuyor
Hücre canlılığı (%) Antikanser etkinlik Hücre kültürü 120 100 80 60 40 20 0 MB49 fare mesane karsinoma hücrelerine karşı sitotoksisite Nanopartiküller ticari ürüne göre daha sitotoksik Control CS PLL-PCL CS-PCL MMC sol MMC-CS MMC-CS- PCL Formulasyonlar (1/64 seyreltme) MMC-PLL- PCL
Sağlıklı ve kanserli mesane hücrelerinde hücresel etkileşim ve alım çalışmaları Ortalama floresans şiddeti Hücresel alım
Cumulative excreted MMC (mcg) Ticari ürüne karşı MMC yüklü katyonik nanopartiküllerin mesanede tutulma oranı 300 İntravezikal instilasyonla uygulama 250 200 Hacim: 500 mikrolitre Metabolik kafesler Her 2 saatte bir idrar örneği MMC tayini HPLC yöntemi ile 150 100 50 0 2 4 6 Time (h) MMC sol CS-MMC CS-PCL-MMC PLL-PCL-MMC
Cumulative urine volume (ml) Formülasyonun idrar hacmi üzerine etkisi 6 5 4 Formülasyonun mesaneyi iritasyonu veya mesane çıkışını tıkamasının incelenmesi 3 2 1 0 2 4 6 Time (h) CS-MMC CS-PCL-MMC PLL-PCL-MMC MMC sol
Mesane tümörü indüklenmiş rat modelinde antitümör etkinlik (Yerel Etik Kurul kararı. 2009/6-1) Mesane tümörü içme suyuna % 0.05 BBN eklenerek 8 haftalık bir sürede indüklendi. Tümör indüksiyonundan 1 hafta sonra ratlara intravezikal olarak nanopartikül formülasyonları haftada 1 kez uygulanmaya başlandı. 4 hafta boyunca MMC ticari ürün, MMC yüklü ve boş nanopartiküllerin antitümör etkinliği incelendi Hayatta kalma oranı (Kaplan-Meier yöntemi ile) Hematüri, ekstremitelerde kanama olup olmadığı Mesane ağırlığı Sistemik dolaşımda MMC varlığı Histopatolojik değerlendirme
Tümör indüklenmiş ratlarda hayatta kalma oranı
Mesane ağırlığı Sağlıklı rat mesanesine göre ağırlık artışı
Histopatolojik değerlendirme Positive control MMC-CS-PCL CS-PCL MMC solution Negative control MMC-CS CS Tümör dokularında nanopartikül birikmesi gözlendi
BCG yüklü katyonik nanopartiküller
BCG yüklü katyonik nanopartiküller
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri 6-O-CAPRO-B-CD -20 mv MW: 1822 g/mol Polycationic BCDC6 +40 mv MW: 2684 g/mol
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri Fiziksel stabilite (30 gün) 46
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri Fiziksel stabilite (30 gün) 47
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri 48
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri 50
Meme tümörü modelinde pozitif ve negatif yüklü CD nanopartikülleri 51
Sonuç Doğru uygulama yolu İlaç-polimer etkileşimi ve uyumu Biyobozunur ve biyouyumlu sistemler Aktif ve pasif hedeflendirme 2005 yılından beri FDA onayı ile piyasada bulunan farmasötik ürünler Uzun süredir piyasada bulunan kozmesötikler Orphan drug statüsü QUALITY, SAFETY, EFFICACY
Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji AbD Prof. Dr. Sema Çalış Prof. Dr. Yılmaz Çapan Prof. Dr. Süeda Hekimoğlu Prof. Dr. Levent Öner Prof. Dr. Sevda Şenel Prof. Dr. Selma Şahin Prof. Dr. İmran Vural Prof. Dr. Betül Arıca Yegin Doç. Dr. Neslihan Gürsoy Doç. Dr. Sibel Pehlivan Doç. Dr. Hakan Eroğlu Nanoteknoloji konusunda 30 yıllık deneyim ve araştırma potansiyeli Uluslararası Projeler İkili işbirlikleri AB 7. Çerçeve Projeleri TÜBİTAK İkili İşbirlikleri COST Projeleri Ulusal Projeler TÜBİTAK 1001, 1002 San-Tez HÜBAP Endüstri destekleri
Teşekkürler FR FR ES DK Dominique Duchene Amelie Bochot J. Michel Renoir Catherine Ringard-Lefebvre Adam Baszkin Daniel Charon Jean-Pierre Benoit Catherine Passirani Juan Manuel Benito Carmen Ortiz Mellet Thorbjorn Terndrup Nielsen Kim Lambertsen Larsen Erem Bilensoy Tel: 0 312 310 15 24/ 0 312 305 43 69 E-posta: eremino@hacettepe.edu.tr TR Atilla Hıncal Sema Çalış Alper İskit Aydın Mungan Murat Şen İmran Vural Lale Doğan Güneş Esendağlı Hakan Eroğlu Ayşe Ercan Oya Gurkaynak Yasemin Cirpanli Dicle Güner Gamze Işık Cem Varan Hale Ünal Nazlı Erdoğar Demet Daşkın