MOLEKÜLER 2014-2015 BİYOLOJİ LABORATUVARI GÜZ DÖNEMİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI 7.HAFTA DERS NOTLARI GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ Sayfa 1 / 6
1. RFLP (RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUK POLİMORFİZMİ) ANALİZİ Genomdaki tek baz değişikliklerini belirlemeye yarayan bir tekniktir. Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimlerinin kullanıldığı bu yöntemde, restriksiyon endonükleazlar, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir. Bazen bir polimorfizm belirli bir RE ın kesim yerinde görülür ve RE ın tanıdığı palindromik diziyi bozar. Polimorfik bölge, palindromun bozulduğu için RE tarafından kesilemeyeceğinden, RFLP tekniği ile ortaya konulabilir. 2. RNA ANALİZİ RNA çalışmalarının tümünde ilk aşama RNA nın hücreden parçalanmadan izole edilmesidir. RNA izolasyonu yöntemlerinin ilk aşaması hücre çeperi ve zarının parçalanmasıdır (lizis). Daha sonra hücre lizatının santrifüjlenmesi ile RNA diğer hücresel makromoleküllerden ayrılır. RNA nın konsantrasyonunun belirlenmesinde spektrofotometrik yöntemler kullanılmaktadır. Spektrofotometrede 260 nm dalga boyunda ölçüm yapılarak RNA nın konsantrasyonu belirlenebilir. RNA analizinde kullanılan elektroforetik yöntemler içerisinde en sık kullanılan formaldehit/agaroz jeldir. Yöntem DNA agaroz jellerindeki gibidir. Tek fark içerisinde formaldehit olmasıdır. RNA, eğer elektroforez öncesi denatüre edilmemişse elektroforez süresince sekonder yapısını korur. Bu nedenle jel üzerinde farklı boyutlarda RNA görüntüsü oluşur. Agaroz jele eklenen formaldehit RNA nın doğrusal biçimde kalmasını sağlar. Sayfa 2 / 6
3. BAKTERİ TRANSFORMASYONU Transformasyon, dış kaynaklı DNA nın hücre tarafından içeri alınması ve genoma entegre edilmesi olayıdır. Transformasyon sonucunda alınan DNA ile birlikte hücrenin fenotipi de değişir. İzole edilmiş DNA nın hücreye aktarılması moleküler genetik ve rekombinant DNA çalışmalarında çok büyük önem taşmaktadır. Serbest DNA yı içine alabilen bakterilere kompetant bakteri adı verilir. Bazı bakteriler normal büyüme koşullarında oldukça kompetanttırlar; fakat bazılarının kompetant özellik kazanması için kimyasal veya fiziksel yöntemlerle muamele edilmeleri gerekmektedir. Kimyasal yöntemle kompetant hücre oluşturulması için hücreler CaCl 2 uygulanır. Kimyasal yöntemlerle kompetant hücre oluşturmanın yanısıra elektrik akımıyla hücre içerisine doğrudan DNA aktarımı (elektroporasyon) da son yıllarda geliştirilmiş bir başka transformasyon tekniğidir. 4. PZR ÇEŞİTLERİ A. Yuvalanmış (Nested) PZR Bu yöntemde ardı ardına iki PZR yapılır. İlk PZR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla sonuçlanır. İkinci PZR ise ilk PZR sonucu çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren nested primerler ile yapılır. İlk PZR ürünleri ikinci PZR için kalıp olarak kullanılır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilir. Sayfa 3 / 6
B. Demirlenmiş (Ancored) PZR Bir uçtan diziye özgü primerlerle, diğer uçta ise rastgele primerlerle çoğalmayı sağlayan PZR çeşididir. Amaç bilinen bölgeden yararlanılarak ilgilenilen DNA parçasının çoğaltılmasıdır. C. Geri (Revers) Transkripsiyon PZR (RT PZR) RT-PZR iki aşamalı olup RNA dan tamamlayıcı DNA (cdna) sentezi (revers transkriptaz enzimi ile) ve cdna nın standart PZR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar. RT-PZR, mrna veya viral RNA miktarlarının belirlenmesi ile RNA düzeyinde gen anlatımı çalışmalarında oldukça duyarlı bir yöntemdir. D. Asimetrik PZR Bu PZR çeşidinde kullanılan iki çeşit primerden biri miktarca diğerinden çok daha fazla kullanılır. Bu nedenle asimetrik PZR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok daha fazla miktarda çoğaltılır. Bu yöntem fazla miktarda çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır. E. Ters (Inverse) PZR Bilinen bir DNA dizisinden yararlanılarak bu DNA nın her iki ucundaki bilinmeyen bölgelerin çoğaltılması için kullanılır. Bu yöntemde bilinen diziyi içeren DNA önce restriksiyon enzimi ile doğrusal ve sonra bilinen DNA yı içerecek şekilde halkasal hale getirilir. Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir restriksiyon kesimi uygulamasıyla tekrar doğrusal olarak elde edilen DNA molekülü bilinen dizilere uygun olarak tasarlanan primerler yardımıyla çoğaltılır. Bu yöntem bilinmeyen DNA dizilerinin çoğaltılması için faydalıdır. F. In situ PZR Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları içindeki kalıp DNA nın PZR ile çoğaltılması işlemidir. G. Çoklu (Multipleks) PZR Bir PZR ile birden fazla hedef dizinin birlikte çoğaltılması işlemidir. Sayfa 4 / 6
H. Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD) RAPD nükleotid dizilimi rastgele seçilmiş primerler kullanılarak yapılan polimeraz zincir reaksiyonu olup, nükleotid dizi bilgisine sahip olmaksızın polimorfizmin belirlenmesini sağlar. RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiş, tek bir 9-10 bp oligonükleotidin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak PZR ile çoğaltma yapmasıdır. Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir. Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir. 5. NÜKLEİK ASİT MELEZLEME (HİBRİDİZASYON) Nükleik asit hibridizayon (melezleme) yöntemleri; tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden eşleşerek çift iplikli hibrid moleküller (melezler) oluşturma özelliğine dayanır. Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotid dizileri içeren tüm tek zincirli nükleik asit molekülleri arasında gerçekleşebilir (DNA/DNA; RNA/RNA; RNA/DNA). Bu özgün reaksiyonlar, hem RNA hem de DNA molekülleri üzerindeki belirli nükleotid dizilerini belirlemek amacıyla kullanılır. Yöntemin uygulanması için, araştırılan nükleik asit dizilerine eşlenik olan tek iplikli nükleik asit (DNA veya RNA) dizilerine ihtiyaç vardır. Ayrıca bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici ile işaretlenmesi gerekir. Ancak bu sayede hibridizasyon reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli molekül görülebilir hale gelir. Tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesine eşlenik olan ve belirleyici olarak kullanılan tek iplikli özgün nükleik asit parçalarına prob adı verilir. Belirli doku veya hücrelerden izole edildikten sonra jel elektroforezi ile ayrılan ve Sayfa 5 / 6
nitroselüloz veya naylon membranlara transfer edilen DNA moleküllerinin (Southern blotting) veya özgün RNA dizilerinin (Northern blotting) saptanması ve analizi için uygulandığı gibi, gerek RNA gerekse DNA dizilerinin belirli hücre veya dokulardaki varlığı ve dağılımını belirlemede (in situ hibridizasyon) de kullanılmaktadır. 6. PROTEİN ANALİZİ Protein analizlerin ilk aşaması diğer moleküllerde olduğu gibi hücreden proteinlerin saflaştırılmasıdır. Saflaştırılan proteinlerin miktarının ve saflığının belirlenmesi için spektrofotometrik yöntemler kullanılabilir. Proteinler 280 nm de maksimum absorbans gösterirler. Bunun haricinde protein miktarının belirlenmesi için biüret, lowry, bradford gibi yöntemler de kullanılmaktadır. Proteinlerin analizinde en sık kullanılan elektroforez yöntemi sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezidir (SDS-PAGE). Protein melezleme çalışmalarında kullanılan teknik ise western blotlamadır. Sayfa 6 / 6