X. Ulusal Nükleer Bilimler ve Teknolojileri Kongresi, 6-9 Ekim 2009,127-13S E.İ.Medine FITC İLE İŞARETLİ D-PENİSİLAMİNİN MANYETİK NANOPARÇACIKLARA KONJUGASYONU VE HÜCREDE GÖRÜNTÜLENMESİ E. İlker Medine 1 *, Perihan Ünak 1, Serhan Sakarya 2 'Ege Üniversitesi Nükleer Bilimler Enstitüsü 35100 Bornova, izmir 2 Bilim Ve Teknoloji Araştırma Ve Geliştirme Merkezi, Adnan Menderes Üniversitesi, 09100 Aydın Bu çalışmada bir aminoasit türevi molekül olan penisilamin silanlı manyetik nanoparçacıklar ile konjuge edilerek sonrasında floresan bir işaret olan FITC (fluoresceinisothiocyanate) parçacıklara takılmıştır. Elde edilen D-penisilamin bağlı manyetik nanoparçacıklann hücre düzeyindeki etkileri Detroit 562 Farenks kanser hücreleri üzerinde in vitro olarak incelenmiştir. Sentezlenen ve karakterizasyonu gerçekleştirilen manyetik nanoparçacıklar model olarak hazırlanan Detroit 562 Farenks hücre hatlarına uygulanmıştır. Floresan işaretli manyetik nanoparçacıklar hücre kültür ortamı içerisinde hücrelere uygulanmış ve belirlenen inkübasyon süreleri sonunda besiyerler ortamdan uzaklaştırılarak hücre yüzeyine bağlanan manyetik özelliğe sahip D- penisilamin floresan mikroskop altında görüntülenmiştir. FITC ile işaretli penisilaminin hücreye bağlanması 24 saatlik inkübasyon sonucunda çok net görülemezken FITC bağlı manyetik nanoparçacıklara konjuge edilen penisilaminin hücre yüzeyindeki bağlanması belirgin bir şekilde gözlenmiştir. Ayrıca, hücrelere manyetik alan uygulanmış ve manyetik alan uygulanması sonuçları anlamlı bir şekilde değiştirmiştir. Anahtar sözcükler: Manyetik Nanoparçacıklar, FITC (fluoresceinisothiocyanate), Penisilamin, Detroit 562 Farenks Kanser Hücreleri CONJUGATION OF FITC LABELED D-PENICILLAMINE TO MAGNETIC NANOPARTICLES AND IMAGING ON CELLS In this study, a aminoacid derivative D-penicillamine was conjugated antibody, labelled FITC(fluoresceinisothiocyanate) and then conjugated to magnetic nanoparticles. Fluorescein isothiocyanate (FITC) is widely used to attach a fluorescent label to proteins via the amine group. The isothiocyanate group reacts with amino terminal and primary amines in proteins. It has been used for the labeling of proteins including antibodies and lectins. D-penicillamine was labelled with FITC using amine group In vitro evaluation of the conjugated D-penicillamine to magnetic nanoparticle was studied on Detroit 562 cell lines. Prepared magnetic nanoparticles were used on Detroit cells. After incubation time, antibody incorporated cells were imaged with Fluorescein Microscopy. Incorporation on cells of FITC labeled and magnetic nanoparticles conjugated D-penicillamine was found higer than FITC labeled D-penicillamine. The results show that magnetic properties and applying magnetic field increased incorporation rates. Keywords: Magnetic Nanoparticles, FITC (fluoresceinisothiocyanate), Penicillamine, Detroit 562 cells. * ilkermedine@yahoo.com 127
1. GİRİŞ Penisilamin amino (-NH 2 ) ve karboksil" (-COOH) fonksiyonel gruplarını içeren trifonksiyonel bir amino asittir. Tüm amino asitlerde olduğu gibi Penisilaminin de D- ve L- konfıgurasyonları vardır. L-Penisilaminin ise doğal bir amino asittir ve toksisitesi yüksektir. D-Penislamin doğal olmayan bir amino asittir ve tıpta çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan güçlü bir şelatlama ajanıdır. D-Penisilamin farmakolojik açıdan bakıldığında doğal olarak bulunan L-izomerine karşı oldukça etkindir [1,3]. Penisilamindeki üç fonksiyonel grup karakteristik kimyasal reaksiyonlara uğramaktadır. Bunlar asit-baz dengesi, nükleofılik katılma ve yer değiştirme reaksiyonu, farklı metallerle bağ oluşturma, yükseltgenme gibi reaksiyonlarıdır. Ayrıca serbest radikaller oluşturabilirler. Penisilamin ilk kez bakır bağlayıcı ajan olarak Wilson hastalığında kullanılmıştır. Daha sonra farklı etkileri bulundukça romatoid, artrit, şkleroderma gibi hastalıklarda da kullanılmaya başlanmıştır. Penisilamin metallerle iyi bağlandığından nanomanyetik parçalara da iyi tutunur. Bu özelliğinden dolayı metallerden yararlanılarak uygulanan tedavilerde etkisi büyüktür. Bazı durumlarda hücrede toksik özellik gösterir. Hücrenin büyüme faktörü üzerine de etkilidir. Bu çalışmada, manyetik nanoparçacıklar bir aminoasit türevi olan penisilamin ile kojuge edilecek ve floresan bir işaret olan FITC (fluoresceinisothiocyanate) bu parçacıklara takılacaktır. Elde edilen bu işaretli bileşiğin in vitro etkinliği Detroit 562 Farenks kanser hücreleri üzerinde incelenecektir. Sentezlenen ve yüzey modfıkasyonu yapılan nanoparçacıkların D- penisilamine konjugasyonundan sonra kanser hücreleri üzerindeki tutulumunun görüntülenmesi amacıyla yaygın olarak kullanılan floresan bir boya olan FITC [2,4] kullanılacaktır. Bu şekilde penisilamin gibi bir ilaç molekülünün manyetik nanoparçacıklar vasıtasıyla manyetik alanda yönlendirilebilmesi kanser hücreleri ile etkileşmesi incelenecektir. 2. DENEYSEL 2.1. Kullanılan Kimyasallar Tripsin (Bio. Ind) Na 2SO3 (Fluka) CH3OH (Merck) C2H5 OH (Merck) HC1 (Merck) NH4CI (Merck) FeCl 3 6H 2 0 (Fluka) Borate Tampon Çözelti (ph: 9.18 25 CX) (Merck) MES( Sigma) PBS (Bio. Ind) FITC (fluoresceinisothiocyanate) (Sigma) Detroit 562Farenks (adenokorsinoma) epiteli (American Type culture collection Rockville, MD, ABD) Glutaraldehit (Merck) NH 3 (Merck) TEOS (tetraethyl orthosilicate) (Sigma) SG-Sİ900 (N-[3-(trimethyoxysiyl)propyl]-ethylenediamine) (Sigma) 128
2.2. Manyetik Parçacıkların Hazırlanması 12 ml 2 M FeCİ3, 2 M HCl'de hazırlandı ve 500 ml'lik üç boyunlu cam balona konulup, 100 ml saf su ile seyreltildi. 50 ml 0.08 M Na2SC>3 azot atmosferi altında yavaşça ilave edildi, %28'lik 8 ml NH3, 40 ml saf su ile seyreltildikten sonra balondaki çözeltiye yavaş yavaş ilave edildi. 15-30 dakika süresince çözelti sıcaklığının 70 C olması sağlandı. Sonrasında çözelti sıcaklığı 45 C'nin altına düşene kadar soğutuldu ve siyah çökelek oluşmaya başladı. Elde edilen manyetik parçacıklar birkaç kez saf suyla yıkandı ve daha sonra su-etanol (2:1) karışımı ile yıkamaya devam edildi. Çökelek 80 ml etanol ve 20 ml su içerisinde tekrar dağıtıldı. 5 ml tetra etil orto silikat (TEOS) ve % 10'luk 5 ml NH3 sırası ile ilave edildi. 40 C'de 12 saat süreyle karıştırmanın ardından parçacıklar metanol ile birkaç kez yıkanarak reaksiyona girmeyen TEOS ve bağlanmamış silika uzaklaştırıldı. Son olarak çökelek 100 ml metanol içine konuldu. Çökeleğin küçük bir bölümü tanecik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla vakum altında kurutuldu. Metanol içinde bulunan silika kaplı manyetik parçacıkların ağırlıkça % 20 si kadar bir silan bağlayıcı ajan olan N-(2-aminoetil)-3-aminopropil-trimetoksisilan (SG-Sİ900) bu parçacıkların üzerine eklendi. Karışım yaklaşık 5 dakika ultrasonik banyoda tutuldu ve 60 C sıcaklıkta 12 saat süreyle su banyosunda bekletildi. Son olarak reaksiyona girmeyen silan çifti ajanını uzaklaştırmak için karışım metanol ile birkaç kez yıkandı. Elde edilen çökeleğin küçük bir kısmı etüvde kurutuldu ve karakterizasyonu için kullanıldı. 2.3. D- Penisilaminin manyetik parçacıklarla immobilizasyonu Metanol içindeki bağlayıcı ajan SG-Sİ900 ile bağlanmış silika kaplı manyetik nanoparçacıkların (konsantrasyon>20 mg katı/ml) 1 ml'si santrifüj lendikten sonra sıvı kısım ortamdan uzaklaştırılıp katı kısım 4 kez 1 ml fosfat tamponu (PBS, ph=7.00) ile yıkandı. Yıkanan parçacıklar 1 ml PBS içinde 1 ml % 2.5' lik glutaraldehit ile 15 dakika ultrasonik banyoda tutulduktan sonra 4 C sıcaklıkta 4 saat süresince bekletildi. Bekleme sonunda oluşan süspansiyon 1500 (rpm) de 15 dakika santrifüj edilerek sıvı kısım uzaklaştırıldı ve katı kısım yukarıdaki gibi tekrar fosfat tamponu ile yıkandı. 1 mg D-Penisilamin, 0.15 M NaCl ve 0.005 M EDTA (ph=7.2) içeren 1 ml 0.1 M PBS içerisinde çözüldü. Hazırlanan bu çözelti manyetik parçacıkların üzerine eklenerek 12 saat oda sıcaklığında beklemeye bırakıldı. Bekleme sonunda parçacıklar borat tamponu (ph=9.2) ile 3 kez yıkandı. 0.5 mg/ml NaBH 4 1 M borat tamponu içinde çözüldü ve bu çözelti parçacıklara eklenerek 4 C'de 30 dakika bekletilerek aldehit grupları ve çift bağlar uzaklaştırıldı. Son olarak parçacıklar fosfat tamponu (ph=7.00) ile 3 kez yıkanarak 4 C'de 1 ml 0.5 M MES (ph=6.6) içinde saklandı. 2.4. Manyetik parçacıkların özelliklerinin incelenmesi Sentezlenen manyetik nanopartiküllerin karakterizasyonu scanning electron microscopy (SEM) (Phillips XL-30 S FEG) ve X-Ray diffraction (XRD) (Phillips X'Pert Pro) ile yapıldı 2.5. Penisilaminin FITC ile işaretlenmesi 25 mg D-penisilamin 5 ml tampon çözelti kullanılarak çözüldü. 1 mg FITC 1 ml DMSO içinde çözüldü ve hazırlanan FITC çözeltisinin 250 [il' si D-penisilamin çözeltisininin 129
üzerine damla damla eklendi. Bu şekilde hazırlanan çözelti 4 C sıcaklıkta 8 saat süreyle karanlıkta bekletildikten sonra çözeltiye NH 4 C1 eklenerek 4 C' de 2 saat boyunca beklemeye bırakıldı. Son olarak çözeltiye 100 /xl Xylene cyanol ile 500 /xl gliserin eklendi. Tepkimeye girmeyen FITC' leri ayırmak için FITC işaretli D-Penisilamin çözeltisi Sephadex G-25 (Sigma) kullanılarak hazırlanan kolondan geçirildi. FITC işaretli penisilamin çözeltisi kolonun altından toplandı ve 4 C sıcaklıkta beklemeye bırakıldı. Hazırlanan örnekler Detroit hücrelerine uygulandı ve inkübasyon süresi sonunda örnekler hücrelerin üzerinden alındı ve hücreler PBS ile yıkandı. Görüntü kalitesini artırmak için hücrelerin üzerine birer damla mounting medium eklenerek floresan mikroskop ile hücreler incelendi. 3. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bu çalışmada amin fonksiyonlu ve silika fonksiyonlu manyetit nanoparçacıklar sentezlenmiş ve D-Penisilaminin bu parçacıklara konjuge edilmiştir. SEM görüntüleri ile manyetik parçacıkların ortalama olarak 40-60 nm aralığında ve küresel olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte her iki çalışma sonucunda hazırlanan parçacıkların parçacıkların SEM görüntüleri birbirine benzer küresel görüntü vermektedir. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde parçacıkların silika ile kaplandıktan sonra silanlanmalannın parçacık boyutunda herhangi bir değişime sebep olmadığı tespit edilmiştir. Şekil 1. Silika kaplı manyetik parçacıkların 50.000 büyütmede SEM görüntüsü. 130
Şekil 2. Silanlı manyetik parçacıkların 50.000 büyütmede SEM görüntüsü. D-Penisilaminin ile konjuge edilen manyetik nanoparçacıklar detroit boğaz hücre hatlarına uygulanmış ve bu hücrelerin yüzeylerine bağlanmaları floresan mikroskop ile görüntülenmiştir. Şekil 3, ve Şekil 5 incelendiğinde D-penisilaminin hücrelere bağlandığı görülmektedir. Şekil 4 de ise manyetik parçacıklara konjuge olan D-penisilaminin hücrede tutulumunun arttığı tespit edilmiştir. Manyetik alan uygulaması ile bu artışın yaklaşık olarak 2 katına çıktığı görülmektedir (Şekil 5). Şekil 3. Floresan işaretli D-Penisilaminin floresan mikroskop ile görüntülenmesi 131
X. Ulusal Nükleer Bilimler ve Teknolojileri Kongresi, 6-9 Ekim 2009,120-125 TR11 ^^ M.Ûzyurt Şekil 4. Floresan işaretli manyetik nanoparçacıklara konjuge edilen D- Penisilaminin floresan mikroskop ile görüntülenmesi if i f' ' ^ P 1. - / 4 ö'i> * O ^. «c u.v', i- ~ «J?- 1 : «V i ov J <.. oo -ç - 11. "IH Şekil 5. Floresan işaretli manyetik nanoparçacıklara konjuge edilen manyetik alan etkisi altında bulunan D-Penisilaminin floresan mikroskop ile görüntülenmesi Elde edilen manyetik nanoparçacıklarmr görüntülemede kullanılabilirler. Demir oksit parçacıkları MR da iyi bir kontrast ajan olarak kullanılmaktadır. Ayrıca manyetik özellikleri bu parçacıkları hem dışardan uygulanacak manyetik alan vasıtasıyla hedefe yönlendirmede etkili bir ajan haline getirmekte hem de hipertermiyada terapötik kullanılabilirlik özellikleri sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar, bu konularda da çalışmanın ileri aşamalarında preklinik düzeyde araştırmalar yapılmasının yararlı olacağını göstermektedir. 5. KAYNAKLAR [1]Ç. Acar, S. Teksöz, P. Ünak, F. Z. Biber Müftüler, Investigation Of New Bifunctional Agents: D- Penicillamine, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 273, 641-647, 2007 132
X. Ulusal Nükleer Bilimler ve Teknolojileri Kongresi, 6-9 Ekim 2009,120-125 TR11 ^^ M.Ûzyurt [2]Hafeli, U.O., Sweeney, S.M., Beresford, B.A., Humm, J.L. and Macklis, R.M., Effective Targeting of Magnetic Radioactive 90-Y-Microspheres to Tumor Cells by an Externally Applied Magnetic Field. Preliminary In Vitro and In Vivo Results, Nucl. Med. Biol. Vol. 22, No. 2,147-155p, 1995 [3]Samuel E., Michael I. and Dale W.M., Kinetics of the Uracil-DNA Glycosylase/Inhibitor protein Asociation, The Journal of Biological Chemistry, Vol.268, No.36, 26879-26885p., 1993 [4]Mohapatra, S., Mallick, S.K., Skghosh, T. and Pramanik, P., Synthesis Of Highly Stable Folic Acid Conjugated Magnetite Nanoparticles For Targeting Cancer Cells, Nanotechnology, 18, 385102,9p, 2007 133