Bacillus Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi

Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi Cilt: 9, No: 1, 2014 (1-5) Electronic Journal of Food Technologies Vol: 9, No: 1, 2014 (1-5) TEKNOLOJİK ARAŞTIRMALAR www.teknolojikarastirmalar.com e-issn:1306-7648 Kısa Makale (Short Paper) Bacillus Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi Ali YARAŞ 1, Veyis SELEN 2, Dursun ÖZER 2 1 Bartın Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Bölümü, Bartın/TÜRKİYE 2 Fırat Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Elazığ/TÜRKİYE aliyaras@bartin.edu.tr Özet Günümüzde çeşitli endüstrilerde yaygın olarak kullanılan enzimlerin üretim maliyetlerini azaltmak için ortam optimizasyonu çalışmaları ile mikroorganizmaların enzim üretim kapasitelerinin artırılması amaçlanmaktadır. Bu çalışmada katı substrat olarak kullanılan soya küspesinin farklı partikül boyutlarının α-amilaz üretimi üzerine etkisi incelenmiştir. Maksimum enzim aktivitesi (1572 U/ml) -50+100 mesh boyutundaki fraksiyona sahip soya küspesi (20 g/l) içeren fermantasyon ortamında 37 o C, 150 rpm ve başlangıç ph ı 7.0 olan ortam şartlarında elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: α-amilaz, Bacillus Amyloliquefaciens, soya küspesi, fermantasyon Effect of Substrate Particle Size Using Bacillus Amyloliquefaciens on α-amylase Production Abstract Nowadays, in order to reduce the production cost of enzymes that widely used in various industries, the increasing of the enzyme production capacity of microorganisms is intended by media optimization. In this study, the effect of different particle sizes of used soybean meal as solid substrate on α-amylase production was studied. The maximum enzyme activity (1572 U/ml) was obtained in the fermentation medium containing soybean meal (20 g/l and -50 +100 mesh particle size) at 37 C 150 rpm and initial ph=7 conditions. Keywords: α-amylase, Bacillus amyloliquefaciens, soybean meal, fermentation Bu makaleye atıf yapmak için Yaraş, A.,Selen, V., Özer, D., B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi 2014,9(1) 1-5 How to cite this article Yaraş, A.,Selen, V., Özer, D., B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi 2014,9(1) 1-5

Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5 B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi 1. GİRİŞ α-amilaz (1-4 α-d-glukanohidrolaz, E.C.3.2.1.1) nişasta ve glikojen gibi polisakkaritlerin α-1-4- glikozitik bağlarını gelişi güzel parçalayarak maltoz ya da daha büyük oligosakkaritlere dönüştürebilen hücre dışı enzimlerdir [1]. α-amilaz hayvanlar ve bitkiler tarafından sentezlenmesine rağmen, kontrollü koşullarda kısa sürede ürün elde edilmesinden dolayı asıl kaynağı Bacillus türü mikroorganizmalar oluşturmaktadır [2]. Günümüzde α-amilaz enzimi, başta nişasta sıvılaştırma olmak üzere tekstil, deterjan ve kağıt gibi endüstrilerde yaygın olarak kullanılmaktadır. α-amilazın ekonomik olarak üretilmesi fermantasyon ortam maliyetinin azaltılması ile sağlanabilir. Bu amaçla pahalı olan sentetik ortam bileşenleri yerine daha ekonomik ve ucuz olan endüstriyel ve tarımsal yan ürün ve atıklar kullanılabilir [3]. Son yıllarda kassava bagası, şeker kamışı küspesi, kahve kabuğu ve atıkları, elma posası, arpa atıkları, soya fasulyesi atıkları, meyve suyu endüstrisi atıkları gibi katı substratlar mikrobiyal kaynaklı enzim üretimi için fermantasyon proseslerinde kullanılmaktadır [3;4;5]. Ayrıca fermantasyon sonrasında ortamda kalan protein içeriği ve besin değeri yüksek katı ürün hayvan yemi olarak da değerlendirilebilir [6]. Bu çalışmada Bacillus amyloliquefaciens ile soya küspesinin partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisi zamana bağlı olarak incelenmiştir. 2. MATERYAL METOT 2.1 Doğal Substrat ve Kimyasallar Bu çalışmada, Ordu Yağ Sanayi A.Ş. Fabrikası ndan temin edilen soya küspesi doğal substrat olarak kullanılmıştır. Soya küspesi öğütüldükten sonra ASTM standart eleklerde elenerek -16+30 mesh, -30+50 mesh, -50+100 mesh ve 100+200 mesh boyutlarında farklı fraksiyonlar elde edilmiş ve bu fraksiyonlar 70 ºC de 24 saat süreyle etüvde kurutulmuş ve kapalı kaplarda muhafaza edilerek deneylerde kullanılmıştır. Deneylerde kullanılan soya küspesinin bileşimi Tablo 1. de sunulmuştur. Ayrıca deneylerde kullanılan diğer bütün kimyasallar analitik saflıkta olup Merck ve Sigma firmalarından temin edilmiştir. Tablo 1. Soya küspesi bileşimi 2.2 Mikroorganizma Bacillus amyloliquefaciens NRRL B 645 türü bakteri NRRL (National Center for Agricultural Utilization Research, USA) kültür koleksiyonundan temin edilmiştir. 2.3 Mikroorganizma Büyüme Ortamı Bileşen (%) Nem 15.0 Protein 44.0 Yağ 0.9 Kül 6.0 Selüloz 7.0 Diğer 27.1 Metabolik Enerji 2400 kcal/kg Mikroorganizmanın gelişimi ve saklanması için kullanılan besi ortamları Tablo 2. de verilmiştir [7,8]. Stok kültürler 4 o C de kültür saklama besi ortamının bulunduğu eğik deney tüplerinde muhafaza edilmiş ve her 1 aylık periyotlar ile stok kültürler yenilenmiştir. Enzim üretiminde kullanılacak mikroorganizma 2

Yaraş, A., Selen, V., Özer, D. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5 Tablo 2 de verilen bakteri gelişim besi ortamından 50 ml alınarak erlende geliştirilmiştir. Mikroorganizma gelişim ve α-amilaz üretim besiyerlerinin başlangıç ph sı, 1 N HCl ve 1 N NaOH kullanılarak 7.0 e ayarlanmıştır. Otoklavda (Prior Clave 129) sterilizasyonu yapılan (121 o C, 1.2 bar, 15 dakika) besi ortamına steril şartlarda mikroorganizma ön ekimi yapılmış ve besi ortamı orbital çalkalayıcıda (37 o C de ve 150 rpm) 18 saat süreyle inkübe edilmiştir. Daha sonra mikroorganizmanın %1 (v/v) oranında ön gelişim ortamından alınarak 20 g/l konsantrasyonunda farklı tanecik boyutuna (- 16+100 mesh, -30+50 mesh, -50+100 mesh ve -100+200 mesh) sahip soya küspesi içeren fermantasyon ortamına ekimi gerçekleştirilmiş ve α-amilaz üretimi incelenmiştir. Deneylerde hem maliyet hem de içerdiği minerallerin olumlu etkisinden dolayı musluk suyu kullanılmıştır [4]. Tablo 2. Bacillus amyloliquefaciens için saklama ve gelişim besi yeri bileşimleri. Bileşen Kültür Saklama Besiyeri Bakteri Gelişim Besiyeri (g/l) [8] (g/l) [7] Glikoz 4.0 18.0 Pepton 1.0 Yeast ekstrakt 0.5 1.0 MgSO4.7H2O 0.5 NaCl 2.0 CaCl2.2H2O 0.1 KH2PO4 1.0 Et peptonu 8.0 Kazein peptonu 2.0 Agar 18.0 MnSO4.7H2O 0.01 FeSO4. 7H2O 0.01 (NH4)2SO4 5.0 2.4. Enzim Aktivitesinin Ölçülmesi Fermantasyon süresince, farklı zamanlarda alınan örnekler 5000 rpm de 15 dakika santrifüjlenerek (Hettich Eba 21) fermantasyon sıvısında aktivite tayini yapılmıştır. Aktivite ölçümlerinde %3 lük 2.3 ml çözünür nişasta, 1 ml 0.1 M CaCl2, 250 ml 0.1 M potasyum fosfat tamponu (0.025 M NaCl içeren, ph=6.2), 200 ml distile sudan oluşan karışım substrat çözeltisi olarak kullanılmıştır. Aktivite ölçümlerinde bir kontrol ve üç numune tüpü olmak üzere toplam dört tüp kullanılmıştır. Tüplere 4.5 ml substrat çözeltileri eklendikten sonra 37 o C de su banyosunda 5 dakika süreyle tutulmuştur. Daha sonra numune tüplerine 0.5 ml enzim ilave edilmiş ve 37 o C de 30 dakika süreyle inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonrasında kontrol tüpüne ve örnek tüplerine reaksiyonu durdurmak amacıyla 1 M 0.9 ml HCl çözeltisi eklenmiştir. Kontrol tüpüne 0.5 ml enzim çözeltisi konduktan sonra renk oluşumunu gözlemek amacıyla 0.1 ml iyot ayıracı (% 0.3 I, % 3 KI) ilave edilmiştir. 4 ml distile su ile hacim tamamlandıktan sonra vorteks de karıştırılarak absorbansların okunmasına geçilmiştir. α-amilaz aktivitesi iyodun nişasta ile verdiği renk esasına göre spektrofotometre (620 nm) (Chebios Optimum-One UV&VIS) kullanılarak belirlenmiştir. 1 birim enzim aktivitesi (U/ml), 37 o C de iyot çözeltisi ile nişastanın verdiği renkteki 0.0284 OD (optical density) lik azalma olarak tanımlanmıştır [9]. 3

Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5 B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi 3. SONUÇLAR Soya küspesi partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisini incelemek amacıyla yapılan deneylerden elde edilen sonuçlar Şekil 1. de verilmiştir. Şekil 1. den de görüldüğü gibi katı substrat olarak kullanılan soya küspesinin partikül boyutunun α-amilaz üretimi üzerine ve ortam ph sına belirgin bir etkisinin olmadığı görülmektedir. Maksimum enzim aktivitesi -50+100 mesh partikül boyutuna sahip soya küspesi içeren fermantasyon ortamında 1572 U/ml olarak elde edilmiş ve mikroorganizmanın tüm partikül boyutlarında katı halde bulunan substratı kullanabildiği gözlenmiştir. Enzim Aktivitesi (U/ml) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 9 8 ph 7 6 0 12 24 36 48 60 72 İnkübasyon Zamanı (Saat) Şekil 1. Soya küspesi partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisi ( -16+30 mesh, -30+50 mesh, -50+100 mesh, -100+200 mesh, fermantasyon sıcaklığı: 37 C, başlangıç ph:7.0) 4

Yaraş, A., Selen, V., Özer, D. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5 4.KAYNAKLAR 1. Kandra, L., 2003. α-amylases of medical and industrial importance, Journal of Molecular Structure (Theochem), 666-667: 487-498. 2. Fogarty, W.M. Microbial Enzyme and Biotechnology, Applied Science, 2-72, 1983. 3. Haq, I., Ashraf, H., Iqbal, J. and Qadeer, M.A., 2003. Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using economical medium, Bioresource Technology, 87: 57-61. 4. Tanyıldızı, M.S., Özer, D., Elibol, M., 2007. Production of bacterial α-amylase by B. amyloliquefaciens under solid substrate fermentation, Biochemical Engineering Journal, 37: 294-297. 5. Pandey, A., Soccol, C.R., Nigam, P., Soccol, V.T., Vandenberghe, L.P.S., 2000. Biotechnological potential of agro-industrial residues. II: cassava bagasse, Bioresource Technology, 74: 81-87. 6. Berovic, M. and Ostroversnik, H., 1997. Production of Aspergillus niger pectolytic by solid state bioprocessing of apple pomace, Journal of Biotechnology, 53: 47-53. 7. Syu, M.J. ve Chen, Y.H., 1997. A study on the α-amylase fermentation performed by Bacillus amyloliqyefaciens, Chemical Engineering Journal, 65: 237-247. 8. Yıldız, S., 1993. Değişik bakteri ve substratlar kullanılarak amilaz üretiminin incelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü. 9. Pfueller S.L., and Eliot W.H., 1969.The extraceluler α-amylase of Bacillus stearotermophillus, J. Biological Chemistry, 244, 48-54. 5