Hücre Biyolojisi ve Genetikte Güncel Laboratuvar Protokolleri Kerimi E. GÖKAY, M.D., Ph.D Gökay Biyotek Ltd. Şti. / Medikal Yayın Grubu

Transkript

1 Hücre Biyolojisi ve Genetikte Güncel Laboratuvar Protokolleri Kerimi E. GÖKAY, M.D., Ph.D Gökay Biyotek Ltd. Şti. / Medikal Yayın Grubu Önsöz: Bilimsel bir araştırmanın kalitesi araştırma ile oluşturulan veri setinin güvenilirliği (teknik yeterlilik, sonuçların tekrar edilebilir olması, yapılan testlerin araştırma konusu ile doğrudan bağlantılı olması) ve veri analizinin bilimsel yeterliliği (istatistiksel anlamlılık, güncel literatür ile yeterli ve geçerli ilişkiler kurulmuş olması, analizin yorumunda varılan sonuçların tutarlı ve yenilikçi olması) ile belirlenir. Bu nedenledir ki, veri tabanı bilimsel hipotezleri test etmeye yönelik laboratuvar analizlerine dayalı tüm temel bilimlerde en güncel laboratuvar protokollerinin kullanılması ve güncel literatürün takibi kaçınılmaz bir zorunluluktur. James Watson ve Francis Crick in 25 Nisan 1953 tarihli Nature dergisinde yayınlanan Nükleik Asitlerin Moleküler Yapısı adlı bilimsel makalesi tıp ve bilim tarihinde bir dönüm noktası ve insanlık tatihi için ise yeni bir devrin başlangıcı olmuştur 1,2. Bu orijinal makalede de vurgulandığı üzere DNA (Deoksiribo-Nükleik Asit) molekülleri stabil ve olağan koşullarda antiparalel ve komplementer nitelikte biribirine bağlanmış helezonal çift sarmal bir dizin halinde bulunur. Bu yapı genetik bilginin sonraki nesillere aktarılmak üzere kopyalanması (Duplikasyon = Moleküler Kopyalama) yanısıra, yeri ve zamanaı geldiğinde Ribo-Nükleik Asit (mrna, rrna veya trna) türünden efektör moleküllere nitelik ve nicelik bakımından kontrol altında dönüştürülmesine (Transkripsiyon = Moleküler Yorumlama) imkan tanımaktadır. Ayrıca mrna şeklinde yorumlanmış genetik bilgi ribozomlar yoluyla yapısal veya effektör nitelikte farklı protein moleküllerinin sentezi için taslak oluşturmaktadır (Translasyon = Moleküler Tercüme). Hücre içerisinde genetik kalıtımın yorumunu teşkil eden proteinler hücrenin tüm metabolik, fonksiyonel ve yapısal görevlerini dikte eder. İlginçtirki hücrede sentezlenen proteinlerden bazıları (Örneğin: transkripsiyon faktörleri, DNA/RNA Polimerazlar ve nükleik asitlere şu veya bu şekilde bağlanan diğer effektör proteinler) nükleik asitlerin kopyalanma (Duplikasyon) ve yorumlanma (Transkripsiyon) sürecini kontrol altında tutarak bu döngüyü tamamlamaktadır. Hücre Biyolojisi Ana Bilim Dalında merkezi dogma (Central Dogma) olarak nitelenen bu döngü zaman içerisinde bilimsel araştırma ve analiz yöntemlerininde bu eksende guruplaşması ile sonuçlanmştır. Hücre biyolojisine dayalı analizler (morfoloji, hücre ve doku kültürleri, in vivo analizlerin tümü) biyolojik sistemlere holistik bir yaklaşım tekniği gerektirir. Ancak bu holistik analizlerin tümü moleküler analizlerle desteklenmedikçe gözlenen olgunun altında yatan mekanizmalar aydınlatılamaz. Bu nedenledirki, güncel metodolojide moleküler yaklaşım hücre biyolojisisin vazgeçilmez bir parçası haline gelmiştir. Merkezi dogmadan hareketle dört ayrı i

2 moleküler analiz yönteminden bahsedilebilir; 1) Genomik analiz, 2) Transkriptomik analiz, 3) Proteomik analiz ve 4) Metabolomik analiz. Resim 1: Merkezi Dogma ışığında hücre biyolojisi ve genetikte moleküler analiz metodları dört ana guruba ayrılmıştır; 1- Genom analizi (Genomics), 2- Transkripsiyon ara ürünlerinin analizi (Transcriptomics), 3- Proteinlerin analizi (Proteomics) ve 4- Metabolitlerin analizi (Metabolomics). Genomik analiz, DNA dizini olarak organizmanın kalıtım yoluyla miras aldığı, yaşam süreci boyunca olası mutasyonlarla çeşitlendirdiği ve duplikasyon yoluyla gelecek nesillere aktaracağı genetik bilginin incelenmesidir. Transkriptomik analiz ise genomun hücrede veya belli bir dokuda aktif olarak kullanılan kısmının analizidir. Bu niteliği ile nükleik asit dizinleri kalıtımın en temel sırlarını ve tüm bireysel özelliklerin (birçok hastalığa yatkınlık da dahil olmak üzere) şablonlarını dizinlerinde saklamaktadır. Dahası nükleik asitlerde saklanan genetik bilgi zaman içerisinde mutasyon yoluyla değişerek yeni türlerin ortaya çıkmasına (evrimleşme) yada belli türler içerisinde farklı fiziksel özelliklere sahip varyasyonlara (altcinsleşme) yol açmaktadır. DNA sekanslamada (dizin okuma) Sanger in dideoxy sekanslama yöntemi 3 ile tamamlanması belkide imkansız olan insan genomunun tamamını okuma projesi (Human Genome Project) 1990 larda ii

3 otomasyona geçişle beraber büyük ivme kazanmış ve 2003 yılında proje tamamlanmıştır ( bu bilgiye internetten ulaşımak için buraya tıklayınız). Paralel Pyro*Sekanslama ve DNA/RNA mikro-çip hibridizasyon teknolojileri sayesinde bugün artık transkriptomik analiz hiç bir zaman olmadığı kadar hızlı ve güvenilir teknikler arasına girmiştir. Bugün artık insan dahil birçok organizmanın sağlıklı ve patolojik dokularda farklı transkriptom haritaları ve komple baştan sona tüm genetik yapısı son kodonuna kadar bilinmektedir. İlk DNA sekanslama yönteminin bulmasından tam 30 yıl sonra 2007 yılında DNA/RNA sekanslama teknolojisi yıllık cirosu toplam 794 Milyon Dolara varan büyük bir endüstri haline gelmiştir. Bu yıl (2008 yılı sonu itibarıyla) global ekonomideki durgunluğa rağmen bu rakamın Milyon Dolar a varması, 2013 yılında ise ortalama her yıl % 14.7 civarında tahmini bir büyüme hızı ile endüstrinin toplam 1.7 MİLYAR Dolar ciroya ulaşması beklenmektedir 4. Dahası DNA sekanslama teknolojisi çevre dostu enerji üretiminden, sayısal bilgi depolamaya kadar farklı ve yeni Biyoteknolojik uygulama alanlarına baz oluşturmaktadır ( daha fazla bilgiye internetten ulaşımak için buraya tıklayınız). Merkezi dogma pencersinden bakıldığında HAYAT denilen olgu makro boyutta organizmaların birbirleri ile ve çevreleri ile etkileşimi, mikro düzeyde ise nükleik asitler ve/veya protein yapısında organizma içerisinde mevcut küçük fonksiyonel moleküllerin tek, tek veya devasa makro moleküler kurgular halinde karşılıklı etkileşimleri ve devinimleri olarak özetlenebilir. Proteomik analiz ve metabolomik analiz yöntemleri fonksiyonel hücre ve doku profilinin oluşturulmasına imkan tanımaktadır. Dahası birçok hastalığın daha en erken evrelerinde dahi patolojik değişikliklerin (örneğin; metastatik kapasiteye ulaşmış prostat kanseri hücrelerinde sarkozin metabolitinde artış gibi) tanımlanmasına imkan vermektedir. Artık doğru ve modern laboratuvar analiz yöntemleri ile bir damla idrar, bir damla tükürük eskisinen çok ama çok daha değerli bir tanı numunesi haline gelmiştir. Bu eserde amacımız Hücre Biyolojisi ve Genetik dallarında doktora düzeyini tamamlamış ve bilim dalının özelliklle Biyoteknolojik uygulamaları ve yeni metodolojileri ile ilgilenen meslekdaşlarımıza araştırma ve yeni uygulamalar için bir referans ve başlangıç noktası vermektir. Bu nedenle eserde örneğin Sanger in dideoxy sekanslama yöntemi, agaroz jel DNA elektroforezi veya SDS-Poliakrilamid Protein elektroforezi gibi basit ve temel uygulamalara yer verilmemiştir. Okurların bu gibi temel laboratuvar uygulamaları, temel hücre kültürü tekniğini, temel laboratuvar solüsyonlarının hazırlanması ve RT-PCR, Konfokal mikroskop, kapiller elektroforez veya sekanslama cihazı kullanımı gibi temel teknikleri bildiği ve özümsediği varsayımı ile yola çıkılmıştır. Bu veya benzeri konularda eğitim ve tecrübe eksiği olan meslekdaşlarımıza diğer daha temel kaynaklardan eksiklilklerini giderdikten sonra bu kaynağa başvurmalarını öneriyoruz. (Önerdiğimiz birincil başvuru kaynakları bu bölümün sonunda listelenmiştir.) Hücre biyolojisi ve genetik günümüzde yanlızca tababetin esası değil, aynı zamanda temel bilimlerin hepsinin bir arada yoğurup yep yeni biyoteknoloji uygulamalarına dönüştüren bir mühendislik koludur. O nedenledir ki, amacımız özgün olarak hem tıp hemde biyoteknoloji perspektifine odaklanmış bir bakışla, konuyla ilgilenen tüm bireyleri ve değerli meslekdaşlarımızı güncel laboratuvar uygulamaları hakkında bilgilendirip, onların araştırma ufuklarını geliştirmelerinde yardımcı olmaktır. Bu amaca uygun olarak eser dört ana bölüme ayrılmıştır; İlk bölümde ileri canlı hücre görüntüleme teknikleri, üç boyutu hücre/doku kültürleri, haptotaksis iii

4 analizi, fagokinetik mobilite analizi ve co-culture teknikleri gibi güncel hücre analiz teknikleri holistik morfolojik bir yaklaşımla verilmiştir. İkinci bölümde ise kapiller elektroforetik hibridizasyon analizleri, Real-time PCR, transkriptom sekanslama ve paralel Pyro*Sekanslama gibi özgün olarak genomik ve transkriptomik analiz yöntemleri anlatılmıştır. Üçüncü bölümde ise güncel kromatografik analizler, MALDI-TOF, RETOF kütle spektroskopisi ve GC/MS, LC/MS analizleri gibi proteomik ve metabolomik analizin vazgeçilmez teknikleri anlatılmıştır. Dördüncü ve son bölümde ise moleküler analizler için kan (serum), idrar, tükürük, doku-hücre ekstresi gibi numunelerin hazırlanma yöntemleri ve canlı hücre ayrıştırma yöntemleri (örnek sistem deriden kök hücre izolasyonu) ele alınmıştır. Eserin özellikle meslekte yeni bakış açıları arayan ve bilhassa özel sektörde giderek yaygınlaşmakta olan ileri teknoloji uygulamalara ilgi duyan bilim insanlarına faydalı olacağını umuyorum. Şahsım ve bu eserin hazırlanmasnda katkısı geçen Medikal yayın grubumuz adına bu satırları oluyan tüm saygıdeğer dostlarımıza sağlıklı, mutlu, başarılı ve parlak yarınlar dilerim. Dr. Kerimi Erden GÖKAY, Gökay-BIOTECH Ltd., CEO Kaynakça: 1: Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature Apr 25;171(4356): : CHAMBERS, D.A., 1995 The Double Helix : Perspective and Prospective at Forty Years Chambers D.A. (Editor) Annals of the New York Academy of Sciences Volume 758 New York, NY 3: Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A Dec;74(12): : BCC Research, DNA Sequencing: Emerging Technologies and Applications (BIO045B), [August 2008], 40 Washington Street, Suite 110, Wellesley, MA USA iv

5 Bu esere başvurmadan ÖNCE bilinmesi gereken birincill kaynakça: 1- ROSKAMS, J., 2002 Lab Ref ; A handbook of Recipes, Reagents and Other Reference Tools for Use at the Bench, Roskams J., Rodgers L. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY U.S.A. 2- MITCHELSON, K. R., 2001 Methods in molecular biology; Capillary electrophoresis of nucleic acids, Mitchelson, K. R. and Cheng, J., Humana Press Inc., Totowa, NJ U.S.A. 3- STARKEY, M. P., 2001 Methods in molecular biology; Genomics Protocols, Starkey M. P. and Elaswarapu R., Humana Press Inc., Totowa, NJ U.S.A. 4- BUDOWLE, B., 2000 DNA Typing Protocols; Molecular Biology and Forensic Analysis, Budowle B. et al., Eaton Publishing, BioTechniques, Natick, MA U.S.A. 5- HUNT, S. P., 2000 Functional Genomics; A Practical Approach, Hunt, S. P. and Livesey, F. J., Oxford University Press, Oxford, NY U.S.A. 6- BISHOP, M. J., 1997 DNA and Protein Sequence Analysis; A practical approach, Bishop M. J. and Rawlings C. J., Oxford University Press, Oxford, NY U.S.A. 7- MANIATIS, T., 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2 nd edition), Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY U.S.A. 8- TAYLOR, D. L., 1989 Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture; Quantitative Fluorescence Microscopy, Imaging and Spectroscopy, Taylor, D. L. and Wang, Y., Academic Press Inc., San Diego, CA U.S.A. DİKKAT Hücre Biyolojisi ve Genetikte Güncel Laboratuvar Protokolleri başlıklı yayınımızın Önsöz bölümü yukarıda ücretsiz olarak istifadenize sunulmuştur. Bu kitabın devamını okumak veya diğer Gökay-BIOTECH, Ltd. yayınlarından edinmek için Gbt-Kimlik Numaranız ile birlikte lütfen YAZILI OLARAK halkla ilişkiler ofisimize başvurunuz. Tüm yayınlarımız CD-ROM (Windows veya Macintosh uyumlu) Adobe-Acrobat (Pdf) formatında istenebilir. Başvurularda istenen adet ve formatın belirtilmesi rica olunur. NOT: Teknoloji transferinin önlenmesi için başlatılan yeni uygulamamız gereği yanlızca kayıtlı müşteri ve kurumumuz elemanlarına verilen Gbt-Kimlik Numarası beyanı telif hakları firmamıza ait tüm kaynak eserlerin siparişinde zorunlu hale getirilmiştir. Her hakkı saklıdır. v