Tavuk Sidirim Sistemi İn Vitro Simulasyonu ile Ticari Yem Katkı Enzimlerinin İncelenmesi

Transkript

1 Tavuk Sidirim Sistemi İn Vitro Simulasyonu ile Ticari Yem Katkı Enzimlerinin İncelenmesi Şems Yonsel 1, Mehmet Batum 2 ÖZET Tavuk yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılan yem katkısı enzimlerin randımanını enzimlerin aktivite değerlerine bakarak tanımlamak kolay olmamaktadır. Bunun esas nedeni enzim aktivite analizlerinin gerçekleştirildiği belirli substrat ve şartların (ph, sıcaklık) tavuk sindirim sistemini temsil etmemesidir. Ticari enzimlerin tavuk sindirim sistemi ortamındaki faaliyetlerini tanımlamak için bir sindirim sistemi simulasyonu gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık, ph, mekanik etkiler, süre gibi parametrelerin ayarlandığı laboratuar düzeneğinde, yem rasyonlarına tavsiye edilen dozlarında ticari enzimler karıştırılmıştır. Sindirim sürecinin sonunda ortaya çıkan Karbonhidrat, Protein, Fosfat analizlenerek enzim katkısının kontrole göre sağladığı fayda ölçülmüştür. Bu sistem mevcut ticari enzimlerin etkilerinin tanımlanmasında ve kıyaslanmasında ve yeni enzim kombinasyonları tasarlanmasında kullanılmaktadır. ANAHTAR KELİMELER: tavuk sindirim sistemi simulasyonu, yem katkı enzimleri ABSTRACT Enzymes are widely used as feed additives in poultry rearing. It is not easy to determine the performance of commercial enzymes by using given enzyme activities. The main reason is that specific substrates and conditions (ph, temperature) used by activity measurements do rarely represent gastro intestinal system of poultry. An in vitro simulation system for GI tract of poultry is developed. Parameters like ph, mechanical forces, temperature and duration time can be set in this laboratory device. Feed rations are mixed with commercial enzymes by recommended doses and the digestion is simulated. At the end of the digestion elaborated carbohydrates, proteins and phosphate are analysed in comparison to control without enzyme addition. This system is used to determine and compare the performance of commercial enzymes as well to design new feed enzyme combinations. KEY WORDS: poultry GI tract simulation, feed additive enzymes GİRİŞ Tavuk yetiştiriciliğinde yem katkısı enzimler yaygın olarak kullanılmaktadır. Piyasada rasyonların içeriğine uygun çeşitli enzim kombinasyonları bulunmaktadır. Enzimlerin performansı aktivite değerleri ile tanımlanır. Ticari enzimleri kıyaslamak, kalite ve maliyet analizi yapmak için aktivite verileri kullanılır. Enzimlerin aktivite ölçümlerinin temel prensibi enzimin substratı parçalayarak ortaya çıkan ürün miktarının ölçülmesidir. Her enzimin bir optimum çalışma sıcaklığı ve ph değeri vardır. Ayrıca temas süresi, substatın yapısı ve derişimi de aktiviteyi etkileyebilir. Aktivite ölçümleri enzimin optimum çalışma aralığında ve belirli seçilmiş substratlarla gerçekleştirildiği için çok sayıda analiz protokolü bulunmaktadır [1]. Aktivite değerlerine bakarak ticari enzimlerin kalitesini anlamak bu nedenle kolay olmamaktadır. Tavuk yemleri karbonhidrat, protein ve yağ içeren bitkisel hammaddelerden oluşmaktadır. Bu bileşikler tavuk sindirim sistemi içinde hidroliz ve enzimatik tepkimelerle monosakkaritler, aminoasitler ve yağ asitlerine parçalanarak emilir. Yem katkısı olarak kullanılan ticari enzimlerin tavuk sindirim sistemi ortamında aktivitelerini göstermeleri gerekmektedir. Bu ortam ise aktivite ölçümünün yapıldığı optimal şartlardan farklı olabilir. 1 Okan Üniversitesi, Mühendislik ve Mimarlık Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Tuzla Kampüsü, Akfırat-Tuzla / İstanbul, sems.yonsel@okan.edu.tr 2 Orba Biokimya Sanayi ve Ticaret A.Ş., Okul C. 26, Orhanlı, Tuzla / İstanbul

2 Ticari enzimlerin tavuk sindirim sistemi ortamındaki faaliyetlerini tanımlamak için bir sindirim sistemi simulasyonu gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık, ph, mekanik etkiler, süre gibi parametrelerin ayarlandığı laboratuar düzeneğinde, yem rasyonlarına tavsiye edilen dozlarında ticari enzimler karıştırılmıştır. Sindirim sürecinin sonunda ortaya çıkan Karbonhidrat, Protein, Fosfat analizlenerek enzim katkısının kontrole göre sağladığı fayda ölçülmüştür. Bu sistem mevcut ticari enzimlerin etkilerinin tanımlanmasında ve kıyaslanmasında ve yeni enzim kombinasyonları tasarlanmasında kullanılmaktadır. MATERYAL VE METOT Tavuk sindirim sistemi Literatürde insan ve çeşitli hayvanların sindirim sistemi modelleri, simulasyonlar için bilgisayar destekli laboratuar düzenekleri bulunmaktadır [2,3]. Bu çalışmada tavuk sindirim sistemi çeşitli kaynaklardan yararlanarak incelenmiş [4], sistemin her kademesindeki prosesler (hidroliz, öğütme, asit ilavesi, sindirim salgıları v.b.), sıcaklık ve ph değerleri saptanmış, bu kademelerdeki kalma süreleri [5] belirlenmiştir. Bu bilgiler çerçevesinde bir sindirim sistemi simulasyonu tasarlanmıştır. Aşağıdaki tabloda sindirim sisteminin kademeleri, sıcaklık ve ph değerleri verilmiş, seçilen kalma süresi ve proses adımlarının simulasyonu belirtilmiştir. Tablo 1 Tavuk sindirim sistemi proses ve in vitro simulasyonu Sindirim sistemi T [ o C] ph Süre [dak] Proses Yem ve su alımı, tükürük ile Gaga amilaz salgısı Esophagus Nakliye - Simulasyon Yem rasyonu hazırlama, değirmende öğütme Kursak 42 6,3 30 Su ile hidroliz 100 g yem g steril su + ENZİM HCl ile ph 1,8; pepsin HCl ile ph 1,8 Proventriculus 42 1,8 5 ilavesi Taşlık 42 2,5 25 Ezme, öğütme karıştırma Bilyeli erlende çalkalama Safra kesesi 42 Safra salgısı - Pankreas 42 Proteaz salgısı - Duodenum 42 6,4 10 Bikarbonat ile ph 6,4 Bikarbonat ile ph 6,4 İnce bağırsak 42 6,9 240 ph 6,9, peristaltik hareket, sindirim, besin emilimi ph 6,9 tamponu, çalkalayarak inkübasyon Sekum 42 6,9 Fermentasyon - Kolon 42 6,9 Su emilimi Filtrasyon Kloaka 4 7 Boşaltım Üst sıvı analiz için soğutulur Toplam 310

3 Enzimler Denemelerde ORBA Biokimya A.Ş. nin ticari enzimleri kontrole karşı kullanılmıştır: Mix (standart formülasyon) : Fitaz, ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz, proteaz Mix C1+C2 (üreticiye özel toz formülasyon): Fitaz, ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz, proteaz Mix C3+C4 (üreticiye özel toz formülasyon): Fitaz, ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz Multi-L (sıvı formülasyon, pelet sonrası uygulama) Ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz, proteaz Multi-D (üreticiye özel toz formülasyon) : Ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz Analizler Fosfat: Fosfat (PO 4-3 ) iyonu ile Vanadat-Molibdat ayracı sarı renk oluşturur. Spektrofotometrede örneklerin absorbansı 430 nm de ölçülerek fosfat tayini yapılmıştır. Protein: Doğal kaynaklardaki protein miktarını saptama yöntemlerinden olan Biüret Yöntemi [6] kullanılmıştır. Reaksiyonun temeli belirteçteki bakır iyonlarının (Cu +2 ) peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide nm de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleksin oluşumuna dayanır. Karbonhidrat: Nişasta ve türevleri enzimlerle glukoza çevrilerek glukoz oksidaz metoduyla spektrofotometrede ölçülmüştür. Toplam nişasta ve türevleri tayini için örnek önce termostabl alfa-amilaz ile maltodekstrinlere, daha sonra da amiloglukozidaz enzimi ile glukoza çevrilir. Bir taraftan bu üç enzim beraber ve ayrı kullanılarak diğer taraftan da nişasta türevleri alkolle ayrılarak örnekteki glukoz, büyük dekstrinler, toplam nişasta türevleri ve ham nişasta miktarları bulunabilir. BULGULAR Deneme süreci Denemelerde çok sayıda rasyon kombinasyonu kullanılmaktadır. Burada sonuçları verilen örneklerde mısır %33 + buğday %33 + soya küspesi %33 kullanılmıştır. Hammaddeler bir laboratuar değirmeninde öğütüldükten sonra 100 g rasyontablo 1 de belirtildiği gibi bir erlende 200 g 42 o C steril su ile karıştırılmıştır. Bu kontrol örneğinin yanında ikinci bir örnek tavsiye edilen dozlarında ticari enzim karıştırılarak hazırlanmıştır. Gerçek tavuk sindirim sisteminde amilaz, pepsin, proteazlar gibi enzimler vardır. Ancak ticari enzimlerin etkisini tam olarak saptayabilmek için denemelerdeki kontrollere enzim ilavesi yapılmamıştır. Erlen, Kursak kademesinde 30 dak 42 o C su banyosunda hafifçe çalkalanmış, proventriculus kademesinde HCl ile ph değeri 1,8 e indirilmiş, 5 dak sonra taşlık kademesinde ph 2,5 e ayarlanmış ve cam bilyelerle birlikte 25 dak en yüksek hızda çalkalanmıştır. Duodenum kademesinde 10 dak sürede ph bikarbonat ile 6,4 e ayarlanmıştır. İnce bağırsak kademesinde ph 6,9 a ayarlanan örnek 42 o C su banyosunda 240 dak çalkalanarak inkübe edilmiştir. Kolon kademesinde filtrasyon ile üst sıvı filtre kekinden ayrılmış, analizler için soğutularak saklanmıştır.

4 Deneme Çıktıları Deneme çıktıları kontrole göre standardize edilerek aşağıdaki tabloda verilmiştir. Kontrol Multi L Multi D Mix Mix C1+C2 Mix C3+C4 Fosfat (PO 4-3 ) Çözünmüş nişasta Çözünmüş protein TARTIŞMA VE SONUÇ Açığa çıkan fosfat açısından kıyaslama yapıldığında fitaz enzimi içermeyen Multi örneklerinde kontrole göre % 21 daha yüksek fosfat değerleri bulunmuştur. Hammaddelerdeki karbonhidrat içeren polimerler ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz, selülaz enzimleri tarafından parçalanınca fosfatın açığa çıkması kolaylaşmıştır. Mix örneklerinde bulunan fitaz miktarına uygun olarak % 59, 65, 73 daha fazla fosfat bulunmuştur. Yüksek ksilanaz, beta-glukanaz, hemiselülaz ve selülaz içeren ticari enzim örneklerinde beklendiği gibi daha fazla çözünmüş nişasta açığa çıkmıştır. Denemeye alınan tüm ticari enzim örneklerinde çözünmüş protein kontrole göre aynı oranda yükselmiştir. Doğal hammaddeler kompleks yapılardır. Örneğin bir tahıl tanesinin dış katmanları parçalanmadan merkezindeki maddelere ulaşmak mümkün olmaz. Bu nedenle sindirimi kolaylaştırma açısından enzim kombinasyonları daha başarılıdır. Geliştirilen in vitro sindirim sistemi simulasyonu ticari enzimlerin randımanını saptamak ve daha etkili ürünler tasarlamak için kullanılmaktadır.

5 KAYNAKÇA [1] Tarım Gıda ve Hayvancılık Bakanlığı, Hayvan Beslemede Kullanılan Yem Katkı Maddeleri Hakkında Yönetmeliğin 16. Maddesine Göre Kullanımına İzin Verilen Yem Katkı Maddeleri Kayıt Listesi, Güncelleme Tarihi , Enzim birimlerinin tanımı, S [2] Minekus, M., Havenaar, R., In vitro model of an in vivo digestive tract USP 5,525,305, June 11, 1996 [3] Smeets-Peters, M. Et al., validation of a dynamic computer controlled in vitro model of the canine gastrointestinal tract, Proceedings World Congr. On Alternatives to Laboratory Animal Science, Bolgna Italy 1999 [4] Jacob, J., Pescatore, T., Avian digestive system, University of Kentucy, College of Agriculture Food and Environment [5] Sundu, B., Gastro-intestinal response and passage time of pelleted diets in digestive tract of broilers, Int. J. Poultry Sci. 8 (10) 2009, [6] Ferdinand Rose (1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden" (On the compounds of albumin with metal oxides), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie, vol. 104, pages