ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DONDURMALARDAN Listeria spp. LERİN İZOLASYONU VE TANIMLAMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DONDURMALARDAN Listeria spp. LERİN İZOLASYONU VE TANIMLAMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA ALİ TEKİN YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu Tez 22/12/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ile Kabul Edilmiştir Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Prof. Dr. Mehmet GÜVEN Yrd. Doç. Dr. A. Doğan DUMAN Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009YL62 Not:Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ DONDURMALARDAN Listeria spp. LERİN İZOLASYONU VE TANIMLAMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yıl: 2010, Sayfa: 57 Jüri : Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Yrd. Doç Dr. Ahmet DOĞAN DUMAN Düşük sıcaklıklarda üreyebilmeleri, dondurma üreten işletmelerde varlığıyla sıkıntı yaratan Listeria spp. ler, aynı zamanda ortamda az olmaları nedeniyle de izolasyonları zor olan bakterilerdendir. Bu araştırmada, Adana ilinde faaliyet gösteren 4 farklı pastaneden 16 örnek, 10 küçük ölçekli imalathaneden 40 örnek ve 1 firmaya ait 4 paketli hazır dondurma örneği olmak üzere toplam 30 adet sade ve 30 adet çeşnili dondurma örneği çalışılmıştır. Listeria izolasyonunda iki farklı klasik kültürel yöntem (FDA ve ISO ) ve iki farklı seçici zenginleştirme besiyeri (Oxford Agar ve PALCAM Agar) kullanılmıştır. FDA metodu ile yapılan izolasyonda 8 plakta (3 plak sade dondurma örneklerinden, 5 plak meyveli dondurma örneklerinden), ISO metodu ile yapılan izolasyonda ise 13 plakta (7 plak sade dondurma örneklerinden, 6 plak meyveli dondurma örneklerinden) Listeria spp. şüpheli koloniler bulunmuştur. ISO metodunda Listeria spp. şüpheli koloniler bulunan 13 plağın 7 si PALCAM Agar dan, 6 sı da Oxford Agar dan elde edilmiştir. FDA metodunda Listeria spp. şüpheli koloniler bulunan 8 plağın 5 i PALCAM Agar dan, 3 ü ise Oxford Agar dan elde edilmiştir. Toplamda PALCAM Agar dan 12 plaktan, Oxford Agar dan ise 9 plaktan Listeria spp. şüpheli koloniler elde edilmiştir. Biyokimyasal tanımlamalar ve Microbact 12L tanımlama testi sonucunda şüpheli kolonilerin hiç birinin Listeria spp. olmadığı görülmüştür. Çalışılan örnekler Listeria spp. açısından temiz bulunmuştur. Bu çalışmada Listeria spp. izolasyonunda sıklıkla görülen sahte pozitif sonuçlara rastlanmıştır. İnhibisyon amacıyla kullanılan seçici katkılara rağmen PALCAM Agar ve Oxford Agar da tipik Listeria spp. görüntüsü veren refakatçi bakterilerin gelişmesi engellenememiştir. Ayrıca bazı plaklarda büyük koloniler gelişimi sonucu sahte negatif sonuçlar alınmış olma ihtimali de değerlendirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Dondurma, Listeria, İzolasyon, FDA,ISO I

4 ABSTRACT MSc. THESIS A RESEARCH ON THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Listeria spp. IN ICE-CREAM SAMPLES ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING Supervisor : Asst.Prof. Işıl VAR Year: 2010, Pages: 57 Jury : Asst.Prof. Işıl VAR Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Asst.Prof. Ahmet Doğan DUMAN Listeria species are able to grow up in cold enviroments and cause harm in ice cream production facilities, they are also difficult to isolate due to their existance in small amounts in the enviroment. 16 samples from 4 patisseries, 40 samples from 10 small plants and 4 packs icecreams from 1 firm in Adana provience; in total of 30 plain and 30 flavor ice-cream samples have been used in this research. FDA and ISO classical isolation methods and selective enrichment plates Oxford Agar and PALCAM Agar have been used in isolation process. Listeria spp. suspected colonies have been found in 8 plates (3 for plain ice cream samples, 5 for fruit ice cream samples) and 13 plates (7 for plain ice cream samples, 6 for fruit ice cream samples) by FDA and ISO isolation methods, respectively. The suspected colonies in 7 of 13 plates which were found with ISO method were isolated with PALCAM Agar and 6 of them were isolated with Oxford Agar. The suspected colonies in 5 of 8 plates which were found with FDA method were isolated with PALCAM Agar and 3 of them were isolated with Oxford Agar. Totally, we came across with 12 plates on which that have suspected Listeria spp. colonies were found with PALCAM Agar and 9 plates on which that have suspected Listeria spp. colonies were found with Oxford Agar. It was found that none of samples were Listeria spp. after biochemical identifications and Microbact 12L identification test. False positive results occur frequently in Listeria spp. isolation and so does in this research. Despite the selective ingridents that had been used for inhibition, grown of competitive flora which look like typical Listeria spp. image in PALCAM Agar and Oxford Agar couldn t be inhibited. Moreover the possibility of obtaining fake positive results because of grown of large colonies in some plates has also been considered. KeyWords: Ice cream, Listeria, Isolation, ISO,FDA II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmamın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam süresince her konuda desteklerini gördüğüm, sevgili arkadaşlarım Biyolog Mehmet Fatih DEĞİRMENCİ ye, Biyolog Nur Fidan KOÇ a, Gıda Yük. Müh. Sevgi ERGELDİ ye ve doktora öğrencisi Gıda Yük. Müh. Sinan UZUNLU ya teşekkürlerimi sunarım. Maddi ve manevi desteklerini, hayatım boyunca benden esirgemeyen, her zaman yanımda olan aileme sonsuz teşekkürlerimi borç bilirim. Yüksek Lisans çalışmalarım esnasında maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne (Proje no: ZF2009YL62) içten teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII SİMGELER ve KISALTMALAR... X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Listeria spp. Belirleme ve İzolasyon Amacıyla Yapılan Çalışmalar Listeria spp. Tarama Çalışmaları MATERYAL ve METOD Materyal Dondurma Listeria spp. Suşları Besiyerleri Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB) Fraser Broth Oxford Listeria Selective Agar PALCAM Listeria Selective Agar Tryptone Soya Yeast Extract (TSYE) Agar Metod Örneklerin Analize Hazırlanması İzolasyon ISO Metodu FDA Metodu Listeria spp. Tanımlanması Morfolojik Tanımlama (1) Bakteri Koloni Morfolojisinin İncelenmesi..30 IV

7 (2) Bakteri Hücre Morfolojisinin İncelenmesi Biyokimyasal Tanımlama (1) Oksidaz Testi (2) Katalaz Testi (3) Microbact 12L Listeria İdentifikasyon Sistemi ile Tanımlama ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Listeria türlerinin tanımlama kriterleri... 6 Çizelge 1.2. Listeria izolasyonunda seçici katı besiyerlerinde kullanılan bileşenler ve kullanım amaçları... 9 Çizelge 1.3. Listeria türlerinin tanımlamasında kullanılan alternatif testler Çizelge 3.1. Dondurma Örneklerinin Alındığı Firmalar, Örnek Sayıları ve Çeşitleri Çizelge 3.2. ISO metodu ile Listeria spp. izolasyonu Çizelge 3.3. FDA metodu ile Listeria spp. izolasyonu Çizelge 4.1. Listeria spp. şüpheli kolonilerin elde edildiği metodlar ve aşamalar Çizelge 4.2. İki Farklı Klasik İzolasyon Metodundan Elde Edilen Listeria spp. Şüpheli Koloni Tespit Edilen Örnek Sayısı ve Listeria spp. Şüpheli Koloni Bulunan Plak Sayıları Çizelge 4.3. Her iki metoddan ve besiyerinden elde edilen Listeria spp. şüpheli kolonisinin bulunduğu plak sayıları VI

9 VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Microbact 12L Listeria İdentifikasyon Sistemi Görüntüsü Çizelge 3.1. PALCAM Agar da şüpheli Listeria spp. Görüntüsü VIII

11 IX

12 SİMGELER VE KISALTMALAR FDA ISO : Food and Drug Administration (Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi) : International Organization for Standardization (Uluslararası Standartlar Organizasyonu) USDA IDF LEB BLEB TSA-YE kob : United States Department of Agriculture ( Amerika Tarım Departmanı) : International Dairy Federation (Uluslararası Sütçülük Federasyonu) : Listeria Enrichment Broth : Buffered Listeria Enrichment Broth : Tryptone Soya Agar- Yeast Extract : Koloni oluşturan birim X

13 XI

14 1.GİRİŞ 1. GİRİŞ Listeria türleri doğada çok yaygın bir haldedirler. Toprak, bitki, kanalizasyon, su, hayvan yemleri (özellikle silajlar) ve altlık gibi materyallerden izole edilmelerinin yanı sıra, sağlıklı hayvan ve insanların dışkılarından da sıklıkla izole edilebilmektedirler (Aslantaş ve Yıldız, 2003). Listeria'lar gıdalara doğrudan bulaşabildiği gibi, enfekte materyal veya kişiler tarafından gıdaların işlenmesi, muhafazası, paketlenmesi, satışı ve tüketimine kadar geçen süreç içerisinde sekonder olarak da bulaşabilmektedir (Ekici ve ark, 2004). Listeriosis, Listeria monocytogenes in neden olduğu rahatsızlığın adıdır ve bu hastalık hem hayvanlarda, hem de insanlarda görülmektedir (Peiris, 2005). Listeriosis hastalığı son yıllarda önemli bir sağlık sorunu olarak karşımıza çıkmaktadır. Menenjit, hamilelerde düşük, öldürücü septisemi, endokarditis ve ensefalitis en sık görülen sağlık sorunları arasındadır (Ekici ve ark, 2004). İnsanlarda görülen Listeriosis te hamileler, fetüsler, yeni doğan bebekler, yaşlılar ve bağışıklık sistemi zayıf düşen kişiler risk grubunu oluşturmaktadır (Mattila ve ark, 2008). Birçok çiğ, yarı işlem görmüş, pişirilmiş ve tüketime hazır gıdada genellikle gramda 10 organizmanın (kob/g) altında değerlerde saptanan L. monocytogenes in kolayca üreyebildiği gıdaların başında yumuşak peynirler, süt, pate, sosis, pişirilmiş et ve kanatlı eti, dumanlanmış balık, su kabukluları, işlem görmüş sebzeler gelmektedir. (Liu, 2008) Listeria monocytogenes 1891 yılından beri biliniyor olmasına rağmen, bakteriyi 1926 yılında hayvansal hastalık etmeni olarak ilk tanımlayan Murray olmuştur. Murray, laboratuvar tavşanlarında meydana gelen salgın sonucu izole ettiği bakteriyi Bacterium monocytogenes olarak isimlendirmiştir. Daha sonra bakterinin adı Cerrah Lord Lister anısına Listerella monocytogenes olarak değiştirilmiştir. Son olarak 1940 yılında yapılan isimlendirmede ise adı Listeria monocytogenes olarak bildirilmiştir. Listeria monocytogenes ilk başlarda hayvanlarda patojen olarak kabul edilmiştir. Bakterinin insan patojeni olarak kabul edilmesi; 1980 lerin başında gerçekleşen, yüksek ölüm oranına sahip ve yaygın seyreden bir gıda zehirlenmesi 1

15 1.GİRİŞ olayından sonra gerçekleşmiştir. O tarihten sonra da en çok araştırılan bakterilerden biri olmuştur (Lovett, 1989). Listeria monocytogenes başta olmak üzere diğer Listeria türlerinin dahil edildiği familyalar yıllar içinde bir çok değişiklik göstermiştir. Bergey s Manual of Systematic Bacteriology in 7. sayısında Listeria türleri Erysipelotrix cinsi ile birlikte Corynebacteriaceae familyasında gösterilmiştir. İlerleyen yıllarda Listeria ların Corynebacteria lardan daha fazla Lactobacillus, Streptococcus ve Bacillus cinslerine özellikle de Brochotrix cinsine yakın olduğu belirlenmiştir. 1974'de yayınlanan Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology' de "yakınlık ilişkileri kesin olmayan bakteri cinsleri" başlığı altında yer alan Listeria, birçok biyokimyasal test yanında peptidoglukan yapılarının ve G+C oranlarının belirlenmesinden sonra, yukarıda belirtilen aynı kitabın 1986 yılındaki baskısında, kendisine yakın cinsler olan Gram pozitif özellikteki Brochotrix, Erysipelotrix ve Kurthia cinsleriyle kıyaslanmıştır. G+C oranına göre; % 55' in altındaki G+C oranıyla Clostridium, Lactobacillus ve Bacillus cinslerine yakın bulunurken, 16 S rrna analizlerine göre Brochotrix cinsine yakın bulunmuştur. (Rocourt, 1988) yılında yayınlanan Bergey s Manual of Systematic Bacteriology e göre Listeria cinsi; L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L.murrayi, L. grayi, L. welshemiri ve L. denitrificans olmak üzere 8 türden oluşmuştur. Daha sonra L. denitrificans DNA yapısı ve 16S ribozomal RNA dizilişi sebebiyle farklı bir cins olan Jonesia ya transfer edilmiş ve J. denitrifcans olarak isimlendirilmiştir. Ayrıca L. murrayi ve L. grayi tek türde birleştirilerek L.grayi olarak isimlendirilmiştir (Datta, 2003, Rocourt ve ark, 1987). 6 adet olan Listeria türleri içinde sadece L. monocytogenes insanlar için patojen olarak kabul edilmekte, nadiren de olsa L. seeligeri ve L. ivanovii nin insanlarda patojenite gösterdiği bildirilmektedir (Rocourt, 1988). Listeria sistematiği (Seeliger ve Jones, 1986). Alem : Bacteria Takım: Bacillales Bölüm : Firmicutes Aile : Listeriaceae Sınıf : Bacilli Cins : Listeria 2

16 1.GİRİŞ Listeria türleri spor yapmayan, Gram pozitif, katalaz pozitif, oksidaz negatif olmaları ile tanınırlar. Şekilleri, kokobasil şeklinde, 0.5 μm eninde ve 1-2 μm uzunluğundadır. Gram boyama sonucunda tek tek veya küçük kısa zincirler halinde görülürler. ph aralığında, 0.83 ve üzeri aw değerinde, % 10 luk ve daha üzeri tuz konsantrasyonlarında gelişebilirler. Listeria lar sıvı ve katı besiyerinde aerobik, fakültatif anaerobik ve mikroaerofilik koşularda üreyebilirler o C arasında üreme özelliğine sahiptirler (Seeliger ve Jones, 1986; Galsworthy ve ark, 1990; Junttila ve ark, 1988). Listeria lar 1-45 C ler arasında geniş bir aralıkta üreme özelliğine sahip olmalarına karşın, optimal üreme sıcaklığı genellikle C ler arasıdır. Üreme sıcaklığı flagella formasyonunu etkilemektedir C ler arasında inkübe edilmeleri halinde 1 5 adet peritrik flagella yardımı ile hareket ederler. Fakat 37 C de inkübe edildiklerinde flagella olusumunun zayıf olması nedeniyle genellikle hareketsiz veya nadiren hareketli olabilirler. Listeria türlerinin saatlik buyyon kültürlerinden hazırlanan asılı damla preparatlarında, tipik sıçrama hareketi tumbling motility gözlendiği bildirilmiştir (Arda, 1997). Listeria türleri Semisolid Motility Medium a (SIM Medium) batırma tarzında ekilir ve C de inkubasyona bırakılırsa, ekim hattından çevreye doğru radyal tarzda bir bulanıklık oluşturur ve yüzeyin 3-5 mm altında şemsiye veya tersine çam ağacı görüntüsü şeklinde bir üreme bölgesi gözlenir. Bu şekilde yüzeyin 3-5 mm altından içe doğru üreme göstermeleri bu bakterilerin mikro aerofilik olmalarından kaynaklanmaktadır. Kanlı agarda saatlik inkübasyon sonucunda mm çapında, yuvarlak, çiğ damlası seklinde, şeffaf, etrafı belirgin ve hafif kabarık koloniler oluştururlar (Seeliger ve Jones 1986; Rocourt, 1988). Genel besiyerlerine % 0.5 oranında glikoz katıldığında üreme hızlanır. Ayrıca glukozu gaz oluşturmadan laktik aside kadar parçalayarak karakteristik taze ayran kokusuna benzer bir koku meydana getirirler. Glikozun yanı sıra sorbitol, trehaloz, amigdalin, selobioz, fruktoz, mannoz, maltoz ve salisini de fermente ederler. Eskülin ve sodyum hippuratı hidrolize ederler (Arda, 1997). Taze kültürlerden alınan koloniler yapışkanlık gösterirken, fizyolojik tuzlu su içerisinde kolay emülsifiye olurlar. Metil Red (MR) ve Voges-Proskauer (VP) testleri 3

17 1.GİRİŞ pozitiftir. Üre, jelatin, kazein ve sütü hidrolize etmezler. L. monocytogenes suşları penisilin veya glisin içeren ortamlarda üretilirse L-formları meydana gelmektedir (Seeliger ve Jones, 1986). L. monocytogenes, L. ivanovii ve L. seeligeri kanlı agarda β-hemoliz oluştururlar. Hemolitik aktivitenin araştırılmasında CAMP (Christie Atkins ve Munch- Peterson) testi kullanılır. CAMP testi; L. monocytogenes ve L. seeligeri için Staphylococcus aureus ile, L. ivanovii için Rhodococcus equi ile yapılır. L. monocytogenes ve L. seeligeri susları β-hemolitik Staphylococcus aureus ile sinerjik hemoliz alanı olarak yuvarlak ok başı şeklini oluşturur iken (pozitif CAMP testi), L. ivanovii nin R. equi ile oluşturduğu hemoliz alanı daha yayvan şekildedir (negatif CAMP testi) (Seeliger ve Jones 1986; Allerberger, 2003). Listeria ların somatik (O-faktör) ve flagella (H-faktör) antijelerinin spesifik antiserumlarla verdiği serolojik reaksiyonlara göre Listeria türleri serotiplere ayrılmıştır. Bunlar serovar olarak isimlendirilmiştir. Bu bağlamda L. monocytogenes 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e ve 7 serovardan oluşmaktadır (Liu, 2008). L. monocytogenes in 4b, 1/2a, 1/2b ve 1/2c serovarları insan Listeriozis vakalarının %98 inden sorumlu tutulurken 4b nin en sık rastlanan serovar olduğu belirtilmektedir. Yapılan deneysel çalışmalarda L. monocytogenes in 4b,1/2a,1/2b ve 1/2c nin diğer serotiplerden daha yüksek düzeyde hastalık yapma yeteneğine sahip olduğu ortaya konulmuştur (Liu, 2004). Listeria kolonileri eskülin içeren besiyerlerinde siyah haleli olarak üremektedirler. Triptoz Agar, McBride Agar, Triflavin - Nalidiksik Asit - Serum Agar besiyerlerinde Henry Illuminasyon Teknigi ile yapılan incelemede koloniler alttan aydınlatıldığında parlak mavi-yeşil renkte; Akriflavin Seftazidim Agar da şeffaf sarı renkte; Lityum klorür Feniletanol Moksalaktam Agar da kırılmış cam görüntüsünde beyaz kümeler halinde; Oxford Agar da siyah haleli siyah koloniler halinde; Modifiye Oxford Agar da siyah zeminde beyaz; PALCAM Agar da pembe zemin üzerinde siyah haleli yeşil; Al- Zoreky-Sandin Listeria Medium da siyah zeminde koyu yeşil renkli koloniler Listeria spp. şüpheli olarak değerlendirilir (Arda, 1997). 4

18 1.GİRİŞ Şüpheli olarak belirlenen kolonilere Gram boyama yapılır. Boyama sonucunda Gram pozitif, düzgün, yuvarlak uçlu, sporsuz, çomak şekilli bakterilere katalaz testi uygulanır (Arda, 1997). Hareket muayenesi için SIM Medium a yapılan ekim sonucu bulanıklık ve yüzeyin 3-5 mm altında tipik semsiye tarzında (tersine çam ağacı görüntüsü) üreme görülmesi pozitif değerlendirilir (Arda, 1997). Nitrat, D-ksiloz, mannitol, β- hemoliz, eskülin, Metil Red, Voges Proskauer ve CAMP testleri uygulanarak identifikasyon yapılır (Kerr ve Lacey, 1991). Listeria türlerinin ayırıcı tanısı Çizelge 1.1 de gösterilmiştir. 5

19 1.GİRİŞ Çizelge 1.1. Listeria Türlerinin Tanımlanma Kriterleri (Abay, 2004) Hidrolizasyon Asit Olşumu L. monocytogenes Listeria spp. Ayırıcı Tanı Kriterleri Eskulin Hippurat Jelatin Kazein Nişasta d - d - Selüloz Arabinoz - - -?? - Dekstrin d D-xylose Galaktoz d d -?? + Glikoz Laktoz d + +?? - β- Liksoz Mannitol Melezitaz d d d - Melebiaz α- Methyl- β-glukozid α- Methyl- β-mannosidasid Ramnoz + - d d - - Salisin Sorbitol d - -?? Sükroz - d d - β- Hemoliz oluşturma CAMP testi (Staphylococcus aureus) Metil Red Voges Proskauer Nitrat redüksiyonu Fosfataz Oksidaz Katalaz Lesitinaz d + d - Üre Mol % G + C Virulans Fare Testi d:değişken L. ivanovii L. innocua L. welshimeri L. seeligeri L. grayi 6

20 1.GİRİŞ Mikroorganizmalar, gıdalarda genellikle hasar görmüş olarak bulunmaktadır. Onların duyarlılığı izolasyon amacıyla kullanılan besiyerlerinde bulunan selektif maddelerin varlığıyla daha da artmaktadır. Az sayıdaki L. monocytogenes'in gıda ve çevresel örneklerde belirlenmesi için ön zenginleştirme besiyeri, selektif zenginleştirme besiyeri ve selektif katı besiyerinin kullanılması gerekmektedir. Yapılan bir çok çalışmada L. monocytogenes'in çeşitli çevre faktörlerine karşı direnci ve stres koşulları altında ne kadar zaman boyunca canlılığını sürdürebildiği belirlenmiştir. Herhangi bir strese maruz kalan L. monocytogenes, canlılığını sürdürmekte ve bir süre sonra, onarım mekanizması sonucunda tekrar aktivite kazanıp sağlık için tehdit oluşturmaktadır. Bu yüzden teşhis metotlarında, gıdada hasarlı olan hücrelerin canlandırılması sağlanmalıdır. Bu işlem ön zenginleştirme ve selektif zenginleştirme aşamalarında yapılmaktadır. Ancak gıdada hasarlı olan L. monocytogenes'in canlandırılıp, gelişmesi sağlanırken refakatçi flora da çoğalmaktadır (Koçan, 2007). Hayvansal gıdalardan L. monocytogenes in sıkça izole edilmesi daha hızlı ve seçici izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesini zorunlu kılmıştır (Koçan, 2007). Listeria spp. izolasyonu için ilk kullanılan metodlar genellikle basit bir agar ortamına direkt ekim yoluyla dayanıyordu; fakat bu şekilde L. monocytogenes izolasyonunun çok zor olması sebebiyle zamanla yeni teknikler geliştirilmiştir. Seçici bileşenler içeren zenginleştirme ve izolasyon besiyerlerinin geliştirilmesiyle daha iyi ve hızlı sonuçlar alınmaya başlanmıştır (Rijkeld ve Hazeleger, 2003). Listeriozis olgularının artmasıyla pek çok ülkede resmi kuruluşlar konu ile ilgilenmeye başlamıştır. United States Department of Agriculture (USDA), Food and Drug Administration (FDA), International Dairy Federation (IDF), International Standarts Organization (ISO) gibi kuruluşlar Listeria spp. izolasyonuna yönelik yöntemler geliştirmişlerdir (Erdoğan, 1988; Loncarevic ve ark., 1998). Son yıllarda Listeria türlerinin dirençli olduğu fakat diğer bakterilerin gelişmesini sınırlayan antibiyotikleri içeren besiyerleri geliştirilmiştir. Selektif zenginleştirme besiyerlerinde genellikle gram negatif bakterilerin inhibisyonu amacıyla Nalidiksik asit kullanılmaktadır (Bille, 2007). Bu besiyerlerinin başlıcaları: 7

21 1.GİRİŞ Ön Zenginleştirme İçin Sıvı Besiyerleri : Listeria Enrichment Broth (LEB) Fraser Broth (FB), Listeria Test Broth (LTB), University of Vermont Medium (UVM), Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB), Selektif Zenginleştirme için Katı Besiyerleri Lityum Klorür-Feniletanol Moksalaktam Agar (LPM), Oxford Agar (OXA), Modifiye Oxford Agar (MOX), Akriflavin Seftazidim Agar (ASA), Lityum Klorür Seftazidim Agar (LSA), Polimiksin-Akriflavin-Lityumklorid-Seftazidim-Eskülin-MannitolAgar (PALCAM), CHROMagar Listeria Agar Listeria Ottaviani and Agosti (ALOA Agar) (Bille, 2007). Yukarıda sıralanan besiyerlerinin bileşimde bir çok inhibitör katkı bulunmaktadır. Seçici katı besiyerlerinin bileşiminde bulunan katkılar ve kullanım amaçları Çizelge 1.2 de gösterilmiştir. 8

22 1.GİRİŞ Çizelge 1.2. Listeria izolasyonunda seçici katı besiyerlerinde kullanılan bileşenler ve kullanım amaçları (Donnely ve Nyachuba, 2007) KATKI ADI KULLANIM AMACI Polymiksin B Nalidiksik Asit Lityum Klorid/ Feniletanol Akrifilavin/ Tripafilavin Seftazidim Moksalaktam Gram negatif çubukların ve streptokokların gelişiminin durdurulması için Gram negatif bakterileri inhibe etmek için Listeria ları çoğaltmak için Gram pozitif kokları inhibe etmek için Geniş spektrumlu bir antibiyotiktir. Geniş spektrumludur. Staphylacoccus, Proteus ve Pseudomonas gibi bir çok Gram pozitif ve Gram negatif bakteriyi inhibe eder. Katı besiyerinde gelişebilen koloni sayısı, hedef mikroorganizma/refakatçi flora oranı açısından kritiktir. Hedef mikroorganizma sayısı 1/100 'den daha az ise sahte negatif sonuçlar kolaylıkla alınabilir. Bir diğer deyiş ile refakatçi floranın yoğun gelişimi sonunda hedef mikroorganizma kolonisinin fark edilerek saf halde izole etmek mümkün olmayabilir. Artan refakatçi flora inhibitör maddeler ile inhibe edilmeye çalışılmaktadır. Bu yüzden besiyeri bileşimindeki inhibitör maddelerin çeşitleri, etki spektrumları ve kullanım oranları çok önemli olmakta ve L. monocytogenes'in gelişimine olan etkisinin bilinmesi gerekmektedir (Koçan, 2007) yılında Lovett ve arkadaşları tarafından geliştirilen FDA metodu; süt, süt ürünleri, deniz ürünleri ve sebze meyveler gibi bir çok gıdadan Listeria spp. izolasyonu ve sayımı amacıyla kullanılmaktadır ve FDA-BAM 1995 olarak adlandırılmıştır. FDA metodu ilk geliştirilmesinden itibaren birkaç kez değişikliğe uğramıştır. Şu anda geçerli olan yönteme göre ön zenginleştirme besiyeri değiştirilmiş ve bu amaçla BLEB (Buffered Listeria Enrichment Broth) kullanılmaya başlanmıştır. Seçici katı besiyerleri olarak da Oxford ve PALCAM Agar önerilmektedir (Donnelly ve Nyachuba, 2007). 9

23 1.GİRİŞ International Dairy Federation (IDF) tarafından Listeria spp.izolasyonu için önerilen metod ise FDA metoduna benzemektedir yılında IDF tarafından süt ve süt ürünlerinden Listeria spp. izolasyonu için önerilmiştir. İzolasyon yapmak için LEB (Listeria Enrichment Broth) ön zenginleştirme besiyeri olarak kullanılmaktadır. Seçici katı besiyerleri olarak da Oxford ve PALCAM Agar önerilmektedir (Donnelly ve Nyachuba, 2007). Tüm gıdalardan Listeria spp. izolasyonu ve sayımı için uygulanabilen ISO metodu, tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. ISO tarafından izolasyon için 1996 yılında metodu önerilirken; sayım metodu olarak 1998 yılında yayımlanmıştır. Her iki metodda da ön zenginleştirme için Fraser Broth besiyerinin kullanımı önerilmektedir. Seçici katı besiyerleri olarak Oxford ve/veya PALCAM Agar önerilmekteyken, 2004 yılında ISO tarafından yapılan değişiklikte, ALOA Agar ın izolasyonda birinci temel besiyeri olduğu ve bunun yanı sıra bir başka seçici katı besiyeriyle birlikte kullanılmasını önerilmiştir (Anonymus, 2005a). Listeria türlerinin tanımlanması amacıyla klasik biyokimyasal yöntemlerin yanı sıra geliştirilen yeni testler Çizelge 1.3 de gösterilmiştir. 10

24 1.GİRİŞ Çizelge 1.3. Listeria türlerinin tanımlanmasında kullanılan alternatif testler (Özmen, 2006) TEST SÜRESİ TEST ADI ÇALIŞMA TEKNİĞİ (SAAT) ÜRETİCİ FİRMA AccuProbe Nükleik Asit Hibridizasyonu Gen-Probe API Test Biyokimyasal Reaksiyonlar BioMerieux Assurance Listeria EIA Enzim Immunoassay 50 BioControl BAX Polimeraz Zincir Reaksiyonu 45 Qualicon Chromogenic Listeria Kültür Biomedix Dynabeads anti- Listeria İmmunomanyetik Seperasyon 48 Dynal EIAFoss Listeria ELISA ve IA Kombinasyonu 48 Foss North America GeneTrak Nükleik Asit Hibridizasyonu 48 Neogen Corp. ISO-GRID Membran Filtrasyon 24 Neogen Corp. Listeria Rapid TESt Enzim Immunoassay 42 Oxoid Listeria-Tek ELISA 48 Organon Teknika Lister Test Immunomanyetik Seperasyon 24 Vicam Microbact 12L Biyokimyasal Reaksiyonlar 4-24 BioControl Systems MICRO-ID Listeria Lateks Aglutinasyon 24 Remel Probelia PCR System Polimeraz Zincir Reaksiyonu 30 BioControl Systems Reveal for Listeria ELISA(Sandwich) 48 Neogen Corp. TECRA VIA ELISA 48 Inter.BioProducts Transia Plate ELISA 48 Diffchamb VIDAS LIS Enzim Linked Fluoresan Assay 48 BioMerieux VIP for Listeria Visual Immunopresipitasyon 48 BioControl Systems Pathalert ELISA 48 Merck Microbact 12 L İdentifikasyon Sistemi nde 11 farklı seker ve bir hemoliz test kutucuğundan oluşan mikro-substrat sistemi ile Listeria spp. identifikasyonu gerçekleştirilir. Test kiti ile tek bir koloni saat inkübe edilerek kullanılabileceği gibi, inokülüm 0.5 MacFarland a ayarlandığında 4 saatlik hızlı test kiti olarak da kullanılabilir. İnkübasyon sonrası kuyucuklarda oluşan renk değişimi kontrol kartına islenerek elde edilen dört basamaklı kod özel bilgisayar programına girilir ve testi yapılan koloninin Listeria türlerinden hangisine ait olduğu program tarafından yüzde olarak verilir.testin güvenilirliği 4 saatlik inkübasyon sonrası % 92 iken 24 saatlik inkübasyon sonrası ise % 100 olduğu belirtilmektedir. 11

25 1.GİRİŞ API Listeria Test Kiti nde ise bir strip üzerinde aynı anda 10 adet biyokimyasal test yapılmakta ve saat içerisinde Listeria spp. ayrımı gerçekleştirilmektedir. Testte hemoliz gibi ek testlere ihtiyaç duyulmamaktadır L. monocytogenes'in buzdolabı sıcaklığında gelişmesi, dondurma işlemine ve donmuş muhafaza koşullarına direnci, orta ve yüksek tuz ile nitrit konsantrasyonuna karşı dayanıklılığı, biyofilm yapabilme özelliği ve bu nedenle çoğu dezenfektanlara karşı daha da fazla direnci, L. monocytogenes'in gıdalardan uzaklaştırılmasını ve gıda kaynaklı Listeriozis enfeksiyonlarının önlenmesini güçleştirmektedir (Erol ve Şireli 1999). Pastörizasyon işlemi uygulanmadan ya da yeterince uygulanmadan üretilen süt ve süt ürünleri özellikle de dondurma, Listeria spp. kaynaklı enfeksiyonlar için ciddi bir potansiyel oluşturmaktadır. İnsan tüketimine sunulan gıdalar üzerinde yapılan birçok çalışmada, özellikle Listeria monocytogenes' in geniş bir dağılıma sahip olduğu saptanmıştır. Dondurma; Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre içerisinde tat ve çeşidine göre, süt ve/veya süt ürünlerini, içme suyu, şeker ve izin verilen katkı maddelerini bulunduran, istenildiğinde salep, yumurta ve/veya yumurta ürünleri, aroma maddeleri ve çeşni maddeleri içeren henüz dondurulmamış haldeki karışımın pastörizasyon sonrası, tekniğine uygun olarak işlenmesi ve dondurulması ile elde edilen, yumuşak halde ya da sertleştirildikten sonra tüketime sunulan bir üründür (Anonymus, 2005b). Protein, karbonhidrat ve yağ ile birlikte A, C, D, E ve B grubu vitaminleri, kalsiyum, fosfor, magnezyum, sodyum, potasyum, demir ve çinko gibi mineralleri bünyesinde toplayan besin değeri yüksek bir üründür (Tekinşen, 2000). Dondurma proses gereği ısıl işlemden geçirilen ve mikrobiyal gelişim için uygun olmayan sıcaklıklarda muhafaza edilen bir ürün olduğundan ilk bakışta mikrobiyolojik açıdan güvenilir kabul edilebilir. Ancak, dondurma üretiminde mikse uygulanan yetersiz pastörizasyon, kontamine olmuş katkı maddelerinin kullanılması, kullanılan alet ve ekipman sanitasyonunun tam sağlanamaması, personel hijyenine dikkat edilmemesi, kullanılan suyun mikrobiyolojik bakımdan uygun olmayışı, çevre şartlarının uygunsuzluğu, ambalaj materyali, dağıtım ve satış esnasında uygun şartların sağlanamaması nedeniyle, mikroorganizmalar kolayca dondurmaya bulaşarak değerli 12

26 1.GİRİŞ bir gıda maddesi olan dondurmayı sağlığa zararlı bir ürün haline getirebilmektedir (Bostan ve Akın, 2001; Akarca, 2006; Ağaoğlu ve Alemdar, 2004). Dondurma miksinin depolama ve olgunlaştırma sıcaklığında patojen bakteriler çoğalabilirler. Özellikle bu bakterilerden +4 C de gelişmesini sürdürebilen, soğuğa dirençli ve bazı durumlarda pastörizasyon sıcaklığına dayanıklı bir mikroorganizma olan L. monocytogenes dondurma tüketicisi için diğer patojenlerden daha fazla önem taşımaktadır (Ağaoğlu ve Alemdar, 2004; Akarca, 2006). Bu çalışmada; halk sağlığı açısından tüm dünyada önemli bir sorun olan ve gıdalardan izolasyonunda problemler yaşanan başta Listeriosis in etmeni olan Listeria monocytogenes ve diğer Listeria türlerinin, model gıda olarak dondurma kullanılarak iki farklı yöntemle izolasyonu amaçlanmıştır. Örneklerdeki tarama Listeria türlerine yönelik yapılmış olup, sağlıklı, doğru ve hızlı bir şekilde analiz sonucu elde edebilmek için iki farklı klasik izolasyon yönteminin ve seçici katı besiyerlerinin birbirine olan üstünlükleri kıyaslanmıştır ve sonuçlar karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. 13

27 1.GİRİŞ 14

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1 Listeria spp. Belirleme ve İzolasyon Amacıyla Yapılan Çalışmalar Bille ve ark yılında 646 Listeria spp. izolatının API Listeria kiti kullanılarak % 85 inin tür bazında ayrımını gerçekleştirmişlerdir. Bu sistem ile 258 L. monocytogenes suşunun 252 sini (%97.79) ve 176 L. innocua suşunun ise 175 ini (%99.4) doğru olarak tanımlamışlardır. Waak ve arkadaşları, 1999 yılında İsveç te ISO metodu ile IDF metodu arasında kıyaslama yapmak amacıyla, marketlerden 61 mavi damarlı küflü peynir (Gorgonzola ve Adelost) ve 55 çiğ süt örneği toplamışlardır. ISO metodu ile yapılan izolasyonda PALCAM Agar da toplam 246 plaktan Listeria spp. kolonisi, Oxford Agar da toplam 231 plaktan Listeria spp. kolonisi elde etmişlerdir. IDF metodu ile yapılan izolasyonda ise PALCAM Agar dan 226 plaktan Listeria spp. kolonisi, Oxford Agardan 207 plaktan Listeria spp. kolonisi elde etmişlerdir. Sonuç olarak ISO metodunun IDF metodundan daha iyi çalıştığını ve PALCAM Agar ın Oxford Agar dan daha seçici olduğunu belirtmişlerdir. Pinto ve ark., 2001 yılında yaptıkları çalışmada, Oxford Agar ve PALCAM Agara karşılık Listeria monocytogenes Blood Agar (LMBA) ın gıda örneklerinden ve çevresel örneklerden Listeria izolasyonundaki hassasiyetlerini araştırmışlardır. Çalışmada 272 si gıda örneği, 173 ü de çevresel örnekler (bez yüzeyleri ve süt işletmelerinde kullanılan alet- ekipmanlar) olmak üzere toplam 445 örnek, L. monocytogenes izolasyonu amacıyla analize alınmıştır. Örnekleri ilk başta mini- Vidas cihazıyla analiz etmişlerdir ve 29 örneği L. monocytogenes pozitif olarak bulmuşlardır. Pozitif bulunan örneklerin klasik metodla da izolasyonu yapılarak sonuçlar karşılaştırılmıştır. Klasik izolasyon metodu olarak ISO metodunun ve 3 farklı seçici katı besiyerinin kullanıldığı çalışma sonucunda LMBA da 28 örnekten, Oxford Agar'da 12 örnekten ve PALCAM Agar'da 12 örnekten Listeria monocytogenes izole etmişlerdir. Sonuç olarak LMBA nın L. monocytogenes izolasyonunda daha başarılı olduğunu belirtmişlerdir. 15

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Capita ve ark yılında İspanya' da yaptıkları çalışmada; seçici katı besiyeri olarak PALCAM Agar ve MOX Agar 'ın, ikincil seçici zenginleştirme besiyeri olarak da Fraser Broth ve UVM Broth' un Listeria spp. izolasyonundaki hassasiyetlerini ve seçiciliğini kıyaslamışlardır. Bu amaçla marketlerden 100 tavuk örneği toplamışlardır ve izolasyon prosedürü olarak USDA metodunu kullanmışlardır. Sonuç olarak Fraser Broth ve UVM Broth kıyaslamasında her ikisinin de aynı hassasiyete ve seçiliğe sahip olduğunu; PALCAM Agar ve MOX Agar kıyaslamasında ise PALCAM Agar' ın daha üstün hassasiyete ve seçiçiliğe sahip olduğunu tespit etmişlerdir. Mena ve ark. (2004), başta süt ürünleri ve deniz ürünleri olmak üzere 1035 farklı gıda örneğini, L. monocytogenes varlığını araştırmak için analiz etmişlerdir. Tüm örnekler ISO metoduna göre ön zenginleştirme işlemine tabi tutulmuş ve ardından mini-vidas ta analiz edilmiştir. Mini-Vidas'ta pozitif çıkan örnekler seçici katı besiyeri olan PALCAM ve Oxford Agar a ekilmişlerdir. Sonuç olarak 72 örnek L. monocytogenes pozitif olarak bulunmuştur. Tüm örnekler içinde süt ve süt ürünlerinin sayısı 455 olup bunların 9'undan L. monocytogenes izole edilebilmiştir. Pelisser ve ark. (2001), 48 tavuk örneğini, FDA metodunu ve Clearview TM test kitini kıyaslamak amacıyla Listeria spp. varlığı açısından analiz etmişlerdir. Clearview TM test kitinin 43 saatte verdiği sonuca göre 17 örnekte Listeria spp. bulunmuş, test süresi saat olan FDA metoduyla da 14 örnekten Listeria spp. izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Oktay ve arkadaşları (2006), İstanbul da Listeria ve Salmonella tayininde ISO metodu ile mini-vidas sistemini karşılaştırmışlardır. Çalışmada materyal olarak 42 kaşar peyniri, 42 tereyağı ve 38 kumpir örneğini kullanmışlardır. Kumpir örneklerinde Listeria spp. tespit edememişlerdir. Peynirde ISO metodu ile 4 örnekte, mini-vidas metodu ile 3 örnekte Listeria spp. tespit etmişlerdir. Tereyağında ISO metodu ile 2 örnekte Listeria spp. tespit etmişlerdir, mini-vidas metodunda ise Listeria spp. tespit edememişlerdir. Sonuç olarak toplamda ISO metodunda tespit edilen Listeria spp. örnek sayısı, mini-vidas tan fazla bulunmuş ve örnekler tür olarak tanımlandığında 3 ünün Listeria monocytogenes olduğu her iki metodda da gösterilmiştir. 16

30 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Son yıllardaki çalışmalarda daha hızlı ve doğru sonucu veren besiyeri arayışına gidilmiş ve patojenik Listeria spp. için selektif ve kromojenik besiyerleri geliştirilmiştir. Bunlar ALOA Agar, CHROMAgar Listeria, BBL CHROMAgar Listeria ve OCLA adlarıyla ticari olarak piyasaya sürülmüştür. Ayrıca ptojenik olmayan Listeria spp. türlerinin izolayonunu kolaylaştıran besiyerleri de ticari olarak piyasaya sürülmüştür. Bunlar BCM, Rapid L.mono ve LIMONO-Ident-Agar adlarıyla piyasada bulunmaktadır (Reissbrodt, 2004) Rapid'L.Mono Agar besiyeri, karışık salata, Brie peyniri, surimi ve işlenmiş hindi etinden L. monocytogenes analizinde kullanılmış ve besiyerinin duyarlılığı %99.4 ve selektivitesi ise %100 olarak belirlenmiştir. Bu besiyeriyle zenginleştirme işleminin standart metodlara göre 24 saat daha kısalmış olduğu bildirilmiştir (Lauer ve ark, 2005). Jinneman ve ark., 2003 yılında yaptıkları çalışmada, BCM agarın Oxford ve PALCAM Agarla karşılaştırıldığı bir çalışmada BCM Agar ın Oxford Agar la veya PALCAM Agar la birlilkte kullanımının, Oxford Agar-PALCAM Agar ın birlikte kullanılmasından veya üçünden herhangi birinin tek başına kullanılmasından daha iyi sonuçlar verdiğini bildirmişlerdir. BCM besiyerinde bazı Bacillus türleri turkuaz mavi koloniler vermiş ancak bu koloniler, 3-4 mm'den daha büyük ve pürüzlü yapıda olmaları nedeniyle L. monocytogenes 'ten ayırt edilmiştir. Restaino ve ark yılında yaptıkları çalışmada ise sahte pozitif sonuca neden olan mikroorganizmaların, (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, B. thuringiensis ve mayalar) BCM besiyerinde gelişemediği bildirilmiştir. BCM ile yapılan başka bir çalışmada BCM'nin duyarlılığı %85.7, spesifikliği ise %100 olarak bulunmuştur (Manafi, 2000). ALOA Agarı geliştiren araştırmacılar (Ottaviani ve ark, 1998) L. monocytogenes serovarlarının bütün stres koşullarındaki kültürlerini denemişler ve besiyerinde etrafında opak hâleler olan mavi koloniler verdiğini ve ayırt edici opak hâle verme oranının en az 0.95 olduğnu bildirmişlerdir. Besiyerinde patojen olmayan Listeria türleri ve bazı Enterococcus ve Staphylococcus türleri mavi koloni vermekte ancak opak hâle oluşturmamaktadır. Bazı Bacillus cereus suşları L. ivanovii kolonilerine benzer koloni vermekte ve bu durum yanıltıcı olabilmektedir. Ancak 17

31 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR sadece bazı tanımlanamayan Listeria benzeri bakteriler sahte pozitif sonuç vermiştir (Koçan, 2007). Vlaemynck ve ark. nın 2000 yılında ISO metodunu kullandığı çalışmada ALOA Agar da doğal kontamine süt ve et ürünlerinde şüpheli kolonilerde, Genprob ve VIDAS kullanılmasına göre % 4.3 daha fazla pozitif sonuç belirlemişlerdir. ALOA Agar ile %13.9 sahte negatif sonuç alınırken PALCAM/Oxford Agar kullanıldığında % 38.9 sahte negatif sonuç almışlardır. El Marrakchi ve ark yılında CHROM Agar besiyeri ile PALCAM Agar ve Oxford Agar ı karşılaştırmışlardır. Sonuçta kromojenik besiyerini diğer iki besiyerinden önemli bir şekilde daha selektif bulmuşlar ve şüpheli kolonilerin % 87.5'unu CHROM Agar ile belirlemişlerdir. 2.2 Listeria spp. tarama çalışmaları Wilson (1995), İrlanda da 8360 yenilmeye hazır gıdayı, FDA medotunu kullanarak, Listeria spp. varlığı açısından analiz etmiştir. Analiz ettiği 425 dondurma örneğinin 14 ünden Listeria spp. izole etmiş ve bunların 3 ünü Listeria monocytogenes olarak tanımlamıştır. Gunasena ve ark. (1995) Sri Lanka da 139 çeşitli gıda örneğinde L. monocytogenes varlığını araştırmışlardır. FDA metodu kullanılarak yapılan izolasyon çalışmaları sonucu 12 dondurma örneğinin 4 ünden L. monocytogenes izole etmişlerdir. Ünlü ve ark. (1997), Sivas ta çiğ sütlerde Listeria spp. varlığını araştırmak için yaptıkları çalışmada, 100 adet çiğ süt örneği toplamışlardır. FDA metodu kullanılarak yapılan analiz sonucunda örneklerin 6 sını Listeria spp. yönünden pozitif bulmuşlardır. Bu 6 örneğin 4 ü L. monocytogenes olarak tanımlanmıştır. Ertaş (1997), Elazığ Bölgesinde koyun ve keçi sütlerinden aldığı 300 örnekten (100 tanesi sağlıklı koyunlardan, 50 tanesi atık yapmış koyunlardan ve 150 tanesi sağlıklı keçilerden), Listeria spp. izolasyonu yapmıştır. İzolasyon için FDA metodunu kullandığı çalışma sonucunda; sağlıklı koyun sütlerinden 4 adet Listeria 18

32 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR spp., keçi sütlerinden 1 adet Listeria spp. izole etmiştir. Atık yapmış koyunların sütlerinden ise izolasyon yapamamıştır. Windrantz ve Arias (2000) Costa Rica da 69 dondurma örneğini IDF metodunu kullanarak Listeria spp. varlığı açısından incelemişlerdir. 69 örneğin 16 sından Listeria spp. izole etmişlerdir. Bu 16 izolatın 8 inin L. monocytogenes ve diğer 8 inin de L. innocua olduğunu tespit etmişlerdir. Dığrak ve ark. (2000) Kahramanmaraş ta tüketime sunulan 86 dondurma örneği Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, E. coli, Listeria spp. varlığı yönünden araştırmışlardır. Bu örneklerin 42 sinde araştırılan mikroorganizmalar bulunmuştur. Örneklerin 4 ünde L. monocytogenes tespit edilmiştir. İzolasyonda ön zenginleştirme besiyeri olarak Tryptic Soy Broth+Yeast Exract (TSB+YE) besiyerini, zenginleştirme besiyeri olarak LEB besiyerini, seçici zenginleştirme besiyeri olarak da LSA besiyerini kullanmışlardır. Sağun ve ark. (2001), Van şehir merkezi ve merkeze bağlı çevre köylerden alınan 250 adet çiğ süt örneğinde Listeria türlerinin varlığını ve yaygınlığını, FDA metodunu kullanarak araştırmışlardır. Örneklerin 6 sını Listeria yönünden pozitif bulmuşlar ve izolatların 3 ünü L. monocytogenes, 1 ini de L. welshimeri olarak tanımlamışlardır. Cordano ve Rocourt (2001) Şili de FDA metodunu kullanarak, 68 ambalajsız ve 535 ambalajlı dondurma numunesi üzerinde yaptıkları çalışmada, ambalajsız dondurmaların 39 unda, ambalajlı dondurmaların 2 sinde L. monocytogenes tespit etmişlerdir. Vitas ve ark. (2003), İspanya Navarra da ISO ve FDA metodunu kullanarak yaptıkları araştırmada, 3685 adet değişik gıda örneği Listeria bakımından değerlendirilmiştir. Bu örneklerin %13 ünde L. innocua ve %8.3 ünde L. monocytogenes saptanmıştır. Çiğ inek sütünde L. monocytogenes bulunma oranı %3 olarak saptanmıştır. Aslantaş ve Yıldız (2003), Kars ta 150 çiğ süt ve 11 silaj örneğinde Listeria türlerinin varlığını FDA metodunu kullanarak araştırmışlardır. Çalışma sonunda 14 çiğ süt örneğinden Listeria spp. izole etmişlerdir. Bunların 3 ünü L. monocytogenes, 19

33 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 3 ünü L. grayi, 5 ini L. welshimeri, 2 sini L. murrayi ve 1 ini L. innocua olarak tanımlamışlardır. Silaj numunelerinin 1 inden L. monocytogenes izole etmişlerdir. Uysal ve Anğ (2003) İstanbul da FDA metodunu kullanarak 511 süt ve süt ürünü örneğinde Listeria türlerinin varlığını araştırmışlardır. Örneklerin 13 ünde L. monocytogenes, 1 inde de L. grayi tanımlamışlardır. Ağaoğlu ve Alemdar (2004), Van da tüketime sunulan dondurmalarda halk sağlığı yönünden önem taşıyan patojen bakterilerin varlığını belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada, 75 adet dondurma örneğinin 10 undan Listeria spp. izole etmişlerdir. İzolasyonda ön zenginleştirme besiyeri olarak Tryptic Soy Broth+Yeast Exract (TSB+YE) besiyerini, zenginleştirme besiyeri olarak LEB besiyerini, seçici zenginleştirme besiyeri olarak da LSA besiyerini kullanmışlardır. Akman ve ark. (2004), Adana ve Kahramanmaraş ta satılan dondurmalarda, FDA metodunu kullanarak, Listeria spp. varlığını araştırmışlardır. Adana da 30 ve Kahramanmaraş ta 28 dondurma örneğinde çalışmışlardır. Analizler sonucunda Adana daki örneklerin 10 undan, Kahramanmaraş taki örneklerin 14 ünden Listeria spp. izole etmişlerdir. İzole edilen Listeria spp. ler içinde Listeria monocytogenes bulamamışlardır. Sonuç olarak çalışılan dondurmaların Listeria enfeksiyonları yönünden potansiyel risk olmadığını, fakat bu ürünlerin tüketiminde dikkatli olunması gerektiğini belirtmişlerdir. Molla ve ark. (2004) Etiyopya da süt ürünlerinde Listeria monocytogenes ve Listeria türlerinin varlığını belirlemek için 46 dondurma örneğini ISO metodunu kullanarak incelemişlerdir. Örneklerin 20 si Listeria açısından pozitif bulunmuştur. Listeria pozitif örneklerin 9 unda Listeria monocytogenes, kalan 11 inde ise diğer Listeria türleri tespit edilmiştir. Sonuç olarak Listeria monocytogenes ve diğer Listeria türlerinin süt ürünlerinde yaygın olarak bulunduğunu bildirmişlerdir. El-Sharef ve ark. (2006), Libya nın Tripoli şehrinde satışa sunulan dondurmaların mikrobiyolojik kalitesini belirlemek amacıyla 111 i açıkta satılan ve 49 u paketli olarak satılan, toplam 160 sade dondurma örneğini incelemişlerdir. LEB ön zenginleştirme besiyerine aldıkları örnekleri 28 0 C de 48 saat inkübe ettikten sonra, LSA seçici zenginleştirme besiyerine ekip 48 saat 37 0 C de inkübe etmişlerdir. 20

34 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İnkübasyon sonunda şüpheli çıkan kolonileri Listeria-System 18R (Insulab, Italy) test kitinde tanımlamışlardır. Tanımlama sonunucunda açıkta satılan dondurma örneklerinin 7 sinde L. monocytogenes varlığını tespit etmişler, buna karşılık paketli dondurmaların hiçbirinde L. monocytogenes varlığını tespit edememişlerdir. Abrahao (2008), Brezilya da FDA metodunu kullanarak, 90 yumuşak ve yarı sert peynir ile 60 dondurma örneğini L. monocytogenes izole etmek amacıyla analiz etmişlerdir. 60 dondurma örneğinin hiçbirinden Listeria spp. izolasyonu yapamamışlardır. Peynir örneklerinin ise 12 sinden Listeria spp. izole etmişlerdir ve bunların 6 sını L. monocytogenes, 5 ini de L. innocua olarak tanımlamışlardır. Jalali ve Abedi (2008), İran da 617 gıda ürününde Listeria türlerinin varlığını araştırmışlardır. USDA metodu kullanılarak yapılan izolasyon sonucunda 39 dondurma örneğinin 1 inden Listeria spp. izole etmişler ve bunu L. innocua olarak tanımlamışlardır. Taşçı ve ark. (2010), Burdur da üretilen sütlerde ve silaj örneklerinde Listeria spp. varlığını araştırmışlardır. Toplamda 175 süt örneği ve 75 silaj örneğini FDA metodunu kullanarak analiz etmişlerdir. Analiz sonucunda silaj örneklerinin 5 inden, süt örneklerinin 1 inden L. monocytogenes izole etmişlerdir. Mahmoodi (2010), İran da L. monocytogenes izole etmek amacıyla, 120 çiğ süt, 60 beyaz peynir ve 180 yoğurt örneğini analiz etmiştir. Ön zenginleştirme besiyeri olarak LEB, seçici zenginleştirme besiyeri olarak da MOX Agar ı kullandığı çalışması sonucunda 3 çiğ süt örneğinden ve 3 beyaz peynir örneğinden L. monocytogenes izole etmiştir. Yoğurt örneklerinden izolasyon yapamamıştır. Issa ve ark. (2010), İstanbul da 350 süt örneğinde L. monocytogenes varlığını araştırmışlardır. Ön zenginleştirme besiyeri olarak LEB, seçici zenginleştirme besiyeri olarak da OCLA (Chromogenic Listeria Agar) besiyerlerini kullanmışlardır. Analiz sonucunda örneklerden 23 Listeria spp. izole etmişlerdir ve bunların 2 sini L. monocytogenes olarak tanımlamışlardır. Gönülalan (2010), Kayseri de satışa sunulan 50 dondurma örneğinde Listeria türlerinin varlığını araştırdığı çalışmasında metod olarak ISO medotunu kullanmıştır. Analiz sonucunda 9 örnekten Listeria spp. izole etmiştir. 21

35 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 22

36 3.MATERYAL ve METOD 3.MATERYAL ve METOD 3.1.Materyal Dondurma Bu çalışmada, Adana ve çevresinde faaliyet gösteren 4 farklı pastaneden 16 örnek, 10 küçük ölçekli imalathaneden 40 örnek ve 1 firmaya ait 4 paketli hazır dondurma örneği olmak üzere toplam 30 adet sade ve 30 adet çeşnili dondurma kullanılmıştır. Çalışma iki tekerrürlü olup toplam 60 örnek çalışılmıştır. Dondurma örneklerinin alındığı firmalar, örnek sayıları ve tekerrürleri Çizelge 3.1 de gösterilmiştir. Açıkta satılan örnekler, aseptik koşullarda, steril cam kavanozlara alınarak soğuk zincir altında laboratuara getirilip, bir kısmı aynı gün, diğerleri ise derin dondurucuda (-18 C) muhafaza edilip, en kısa zamanda analize alınmıştır. Ambalajlı örnekler orijinal ambalajında laboratuara getirilip aynı gün analize alınmıştır. Çizelge 3.1. Dondurma Örneklerinin Alındığı Firmalar, Örnek Sayıları ve Çeşitleri ÖRNEK FİRMA ADI ALIM YERİ SAYISI ÇEŞİT A ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET FISTIKLI B ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU C ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KARAMELLİ D ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ E ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET LİMONLU F CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU G CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET FISTIKLI H CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ I KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU J KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KARAMELLİ K KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ L KADİRLİ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU M KADİRLİ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAVUNLU N İMAMOĞLU 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ O PAKETLİ HAZIR ÖRNEK 4 2 ADET SADE, 1 ADET KAKAOLU, 1 ADET ÇİLEKLİ 23

37 3.MATERYAL ve METOD Listeria spp. Suşları Bu çalışmada dondurmalardan izole edilmesi amaçlanan Listeria türlerinin pozitif kontrolü olarak kullanılacak olan suş Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji laboratuarlarının saf kültür stoklarından temin edilmiştir Besiyerleri Kullanılan tüm katı ve sıvı besiyerleri uygulamadan hemen önce hazırlanmış ve taze olarak kullanılmıştır Buffered Listeria Enrichment Broth (Merck ) FDA tarafından önerilen metodda kullanılan besiyeridir. Besiyerinden 8.12 g alınarak 225 ml distile suda çözündürülmüştür. Daha sonra otoklavda 121 C de 15 dk. sterilize edilmiştir Fraser Broth (Merck ) ISO tarafından önerilen izolasyon yöntemi için kullanılan besiyeridir. Besiyerinden g alınarak 225 ml distile suda çözündürülmüştür.. Daha sonra otoklavda 121 C de 15 dk. sterilize edilmiştir Oxford Listeria Selective Agar (Merck ) g besiyeri hassas terazide tartılarak 500 ml distile su içerisinde çözündürüldü ve sonra otoklavda 121 o C de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Besiyeri otoklavdan çıktıktan sonra, dökme sıcaklığına soğuduğunda selektif katkı (Oxford Listeria Selective Supplement) (Merck ) eklenmiştir. Katkı 24

38 3.MATERYAL ve METOD eklendikten sonra, besiyeri katılaşmadan steril cam petrilere her bir petride yaklaşık 12.5 ml olacak biçimde dağıtılmıştır. Seçici katkı piyasada ticari olarak bir kutuda 12 vial (küçük şişe) şeklinde satılan hazır haliyle temin edilmiştir. Oxford Listeria Selective Supplement hazırlanışı: Seçici katkı 1 vial Steril distilesu 2.5 ml Saf alkol (%76) 2.5 ml Steril tek kullanımlık 10 ml lik bir pipet yardımıyla aseptik koşullarda 1 vial içine 2.5 ml steril distile su ve 2.5 ml saf alkol eklenmiş ve karışım vial içerisinde tamamen çözündürüldükten sonra 500 ml lik Oxford Selective Agar besiyerine eklenmiştir PALCAM Listeria Selective Agar (Merck ) g besiyerinin hassas terazide tartılarak 500 ml distile su içerisinde çözündürülmesinin ardından otoklavda 121 o C de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Besiyeri otoklavdan çıktıktan sonra, dökme sıcaklığına soğuduğunda selektif katkı eklenmiştir. Antibiyotik katkı eklendikten sonra katılaşma gerçekleşmeden besiyeri steril cam petrilere her birinde 12.5 ml olacak biçimde dağıtılmıştır. Selektif katkı (PALCAM Selective Supplement) (Merck ) piyasada ticari olarak bir kutuda 16 vial (küçük şişe) şeklinde satılan hazır haliyle temin edilmiştir. PALCAM Selective Supplement hazırlanışı: Seçici katkı 1 vial Steril distile su 1 ml 25