ERZURUM DA TÜKETİME SUNULAN TAVUK ETLERİNDE LİSTERİA spp. NİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 ERZURUM DA TÜKETİME SUNULAN TAVUK ETLERİNDE LİSTERİA spp. NİN ARAŞTIRILMASI Emre KAYA Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Tez Danışmanı Prof. Dr. Mustafa ATASEVER Yüksek Lisans Tezi-2014

2 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ERZURUM DA TÜKETİME SUNULAN TAVUK ETLERİNDE LİSTERİA spp. NİN ARAŞTIRILMASI Emre KAYA Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Prof. Dr. Mustafa ATASEVER ERZURUM 2014

3 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ERZURUM DA TÜKETİME SUNULAN TAVUK ETLERİNDE LİSTERİA spp. NİN ARAŞTIRILMASI Emre KAYA Tez Savunma Tarihi : 27 Haziran 2014 Tez Danışmanı Jüri Üyesi Jüri Üyesi : Prof.Dr. Mustafa ATASEVER (Atatürk Üniversitesi) : Doç.Dr. Filiz KÖK (Adnan Menderes Üniversitesi) : Doç.Dr. Gülşah ÇANAKÇI ADIGÜZEL (Atatürk Üniversitesi) Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitü Müdürü Yüksek Lisans Tezi ERZURUM-2014

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR.. II ÖZET. III ABSTRACT.. IV SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.. V ŞEKİLLER DİZİNİ..... VI TABLOLAR DİZİNİ VII 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Tarihçe Taksonomi Listeria nın Etiyolojisi ve Koloni Özellikleri Listeria Etkeninin Gıda Maddelerindeki Varlığı Süt ve Süt Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Kırmızı Et ve Et Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Kanatlı Et ve Et Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Su ve Diğer Gıda Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu İzolasyon ve İdentifikasyon Yöntemleri Microbact 12 L İdentifikasyon Sistemi MATERYAL VE METOT BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR.. 56 EKLER.. 66 EK-1. ÖZGEÇMİŞ 66 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU.. 67 I

5 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince bilimsel katkıları ile bana yardımcı olan, eğitimim süresince desteklerini esirgemeyen tez danışman hocam Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Mustafa ATASEVER e teşekkür ve saygılarımı sunarım. Beni hiç yalnız bırakmayan ve daima yanımda olan; sevgisini, desteğini ve ilgisini benden hiçbir zaman esirgemeyen eşim Gülcan KAYA ya, tüm yaşamım boyunca desteklerini hep yanımda hissettiğim annem, babam ve kardeşime de teşekkürlerimi sunarım. Emre KAYA II

6 ÖZET Erzurum da Tüketime Sunulan Tavuk Etlerinde Listeria spp. nin Araştırılması Amaç: Bu çalışma, Erzurum da tüketime sunulan tavuk karkaslarında Listeria spp in varlığını ve yaygınlığını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Materyal ve Metot: Bu çalışmada Erzurum da tüketime sunulan 100 adet tavuk karkası örneği analize alınmıştır. Listeria spp. izolasyon ve identifikasyonunda modifiye USDA/FSIS (United States Department of Agricultural/Food Safety Inspection Service) metodu ve Microbact 12 L Listeria identifikasyon test kiti kullanıldı. Bulgular: Yapılan izolasyon çalışmalarında tavuk karkas örneklerinde 64 (%64) adet Listeria spp. izole edildi. İdentifiye edilen Listeria ların 16 (% ) sının L. monocytogenes, 26 (% 40.62) sının L. innocua, 12 (% 18.75) sinin L. grayi, 5 (% 7.81) inin L. murrayi ve 5 (% 7.81) inin L. welshimeri olduğu tespit edildi. Sonuç: Elde edilen bulgular neticesinde tavuk karkaslarının Listeria spp. etkeni ile yüksek oranda kontamine olduğu görülmüştür. Halk sağlığının korunması amacıyla tavuk karkaslarının uygun hijyenik ve teknolojik koşullarda üretilmesi gerekmektedir. Ayrıca antibiyotiklerin hastalıktan koruyucu ve büyümeyi artırıcı olarak kullanımları resmi otorite tarafından düzenli olarak kontrol edilerek önlenmelidir. Anahtar Kelimeler: Erzurum, Listeria spp., Tavuk karkası. III

7 ABSTRACT Presence Of Listeria spp. in Chicken Carcases Consumed in Erzurum Aim: This study was conducted to determine the presence and prevalence of Listeria spp. in chicken carcasses in Erzurum province. Material and Method: In this study, chicken carcases 100 samples were analysed. In the isolation and identification of Listeria spp. species were used modified USDA/FSIS method and Microbact 12 L Listeria Identification test Kit. Results: Listeria spp. were isolated from 64 of 100 (64 %) chicken carcasses samples, identification of those indicated 16 (25 %) isolates as L. monocytogenes, 26 (40.62 %) as L. innocua, 12 (18.75 %) L. grayi, 5 (7.81 %) L. murrayi and 5 (7.81 %) L. welshimeri. Conclusion: The results of this study suggest that the prevalence of Listeria spp. in chicken carcasses is relatively high in Erzurum. Chicken carcases should be produced under appropriate, hygienic and technological conditions for the prevention of public health. The use of antimicrobials as prophylactic or growth promoter agent should be controlled systematically by the governmental agencies. Key Words: Chicken Carcases, Erzurum, Listeria spp. IV

8 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ BAM : Bacteriological Analytical Manual BLEB : Buffered Listeria Selective Enrichment Broth CAMP : Christie Atkins ve Munch Peterson CRF : Serebro Spinal Sıvı DHHS : Department of Health and Human Services FDA : Food and Drug Administration FSIS : Food Safety and Infection Service HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Point. H 2 O 2 : Hidrojen Peroksit H 2 S : Hidrojen Sülfür ISO : International Standards Organisation LPM : Lithium Chlorid Phenilethanol Moxolactam Agar MOX : Modifiye Oxford Agar MRVP : Metil Red Voges Proskauer NB : Nitrate Broth SCA : Simmons Citrate Agar SIM : Semisolid Indol Motility Medium TSA : Tryptic Soy Agar TSB+YE : Tryptic Soya Broth + Yeast Extract TSIA : Triple Sugar Iron Agar USDA : United States Department of Agriculture V

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. CAMP Deneyinde Şüpheli Kolonilerin Kanlı Agara Ekimi 8 Şekil 2.2. Henry Aydınlatma Deneyi 10 Şekil 3.1. Listeria Türlerinin İzolasyon Metodu 28 Şekil 3.2. Listeria Türlerinin İdendifikasyon Metodu 32 Şekil 4.1. Listeria spp. nin PALCAM Agar da Üreyen Kolonileri. 37 Şekil 4.2. Listeria spp. Kolonilerinin Türlere Göre Grafiksel Dağılımı 38 Şekil 4.3. CAMP Testi Çalışma Petrisi 46 Şekil 4.4. Listeria Türlerinin SIM Mediumda Hareket Muayenesi 46 Şekil 4.5. Listeria Türlerinin Üre Testinde Pozitif-Negatif Reaksiyonu 47 Şekil 4.6. Microbact 12L Listeria İdentifikasyon Sistemi Tür Tayini Sonuçları 48 VI

10 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 1.1. Bazı Gıda Kaynaklı L.monocytogenes İnfeksiyonları 2 Tablo 2.1. Listeria Türlerininin Serotipleri ve O:H Antijenleri 6 Tablo 2.2. Listeria ların Üreme Koşulları 7 Tablo 2.3. Listeria Türlerinin Ayrımı 9 Tablo 2.4. L.monocytogenes in Bezer Bakterilerden Farklılıkları 17 Tablo 2.5. Listeria spp. için Biyokimyasal Testleri ve Tür Ayrımı Şeması 18 Tablo 2.6. Listeria monocytogenes için Kullanılan Ticari Test Ürünleri 18 Tablo 2.7. Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Sistemi Reaksiyon Tablosu 22 Tablo 2.8. Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Sistemi Veri Tablosu 23 Tablo 4.1. Şüpheli Listeria spp. Kolonilerinin Türlere Göre Dağılımı 38 Tablo 4.2. Tablo 4.3. Tablo 4.4. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Test Kitine Göre Tür Dağılımı Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Test Kiti Reaksiyon Sonuçları VII

11 1. GİRİŞ Hayvansal gıda üretimi; dünya nüfusunun hızlı artışına paralel olarak, protein ihtiyacının karşılanması maksadıyla artış göstermektedir. Buna bağlı olarak üretimden tüketime kadar olan tüm safhalarda sağlıklı hayvansal gıdaya ulaşmak için üretim endüstrisinde hijyen kavramı ön plana çıkmaktadır. Tavuk ise hayvansal protein ihtiyacının karşılanabilmesi maksadıyla hem üreticiler hem de tüketiciler tarafından en çok rağbet gören hayvansal üründür. Ayrıca üretim alan ihtiyacının az olması, istenilen ağırlığa kısa sürede ulaşabilmesi ve et veriminin diğer hayavansal üretimlere göre daha fazla olması sebebiyle dünya protein ihitiyacının karşılanmasında giderek önem kazanmaktadır. Tavuk etine karşı sürekli artan talebi karşılamak maksadıyla kapalı kümes sistemlerinde üreticilik ön plana çıkmaktadır. Yetersiz kapalı kümes alanlarında yüksek kapasitede üretimin yapılması ve uygun hijyen koşullarını karşılayamayan kesimhanelerde kesilerek geniş ürün çeşitliliğinde tüketime sunulması, kanatlı etlerine Listeria etkeninin bulaşma riskini artırmaktadır. Listeriozis insan ve hayvan sağlığı açısından önemli bir zoonoz hastalık olarak kabul edilmektedir farklı ülkede rapor edilen 1 toplam 782 literiozis vakalarının % 43 ünün maternal ve neonatal, % 29 unun septisemik, % 24 ünün merkezi sinir sistemi ve % 4 ünün ise atipik infeksiyonlara sebep olduğu bildirilmiştir. Yüksek risk grubunda ise hamileler, kanser hastaları ve bağışıklığı baskılanmış kişiler vardır. Son yıllarda kanatlıların yetiştirme ve kesim aşamalarında olması gereken hijyen kurallarına yeterince uyulmaması sonucunda; bu etleri tüketenlerde intoksikasyonlara, sporadik ölümlere, gebelerde abortuslara, çocuklarda menengit olgularına ve immün sistemi baskılanmış insanlarda ölümlere neden olmaktadır. Tablo 1.1 de dünya 1

12 genelinde rapor edilen bazı gıda kaynaklı Listeria monocytogenes infeksiyonları verilmiştir. 2 Tablo 1.1. Bazı Gıda Kaynaklı Listeria monocytogenes İnfeksiyonları 2

13 Listeriozis etkeni; patojen, fakültatif intrasellüler, düşük ph ya, soğuğa ve sıcağa dirençli olması nedeniyle gıdalarda kolayca çoğalabilen, genellikle sporadik olarak görülen, abortus, septisemi, meningoensefalitis, konjunktivitis ile karakterize, artrit, menenjit, endokardit ve hepatit gibi hastalıklara neden olan bir mikroorganizmadır. Listeria monocytogenes ve Listeria ivanovii insan ve hayvanlarda hastalık oluşturan patojen türlerdir. 3 Listeria türleri toprak, sebze, lağım suyu, nehirler ve tuz havzaları gibi çok çeşitli kaynaklarda mevcuttur. 4 L. monocytogenes ile kontamine olan ve usulüne uygun yapılmayan silaj L. monocytogenes için önemli bir rezervuar olarak rapor edilmiştir. 5 Bu çalışmanın amacı; Erzurum bölgesinde tüketime sunulan tavuk karkaslarından Listeria etkeninin izolasyonu ve identifikasyonu yapılarak Listeria türlerinin varlığını ve yaygınlığını tespit ederek bölgedeki halk sağlığı açısından listeriozis in risk seviyesinin ortaya konulmasıdır. 3

14 2. GENEL BİLGİLER Hayvansal gıda ürünleri çeşitli faktörler nedeniyle farklı sayı ve türde mikroorganizma içerebilmektedir. Kanatlı etlerindeki kontaminasyon ise çoğunlukla kesim sırasında meydana gelmektedir. Bu sorun da insanlarda kanatlı etlerinden kaynaklanan infeksiyonların görülmesine ve ekonomik kayıplara sebep olmaktadır Tarihçe Fransa da 1891 yılında Hayem, 1893 yılında ise Almanya da Henle isimli araştırmacılar Listeriozise benzer belirtiler gösteren bir hastalıktan ölen insan dokularında Listeria benzeri bakteriler izole etmişlerdir. İsveç te 1911 yılında Hülpers tavşan karaciğerinden izole edilen ve L. monocytogenes e çok benzeyen bakteriye Bacillius hepatitis adını vermiştir. 6 Listeria monocytogenes ilk olarak 1926 te İngiltere de Murray ve arkadaşları 6 tarafından tavşan ve domuz karaciğerlerinden izole edilmiş ve etkeni Bacterium monocytogenes olarak adlandırmışlardır. 3,6,7,8 Pirie 1927 yılında Güney Afrika nın Tiger River bölgesinde Tatera lobengulae isimli bir gerbil karaciğerinden izole ettigi bakteriyi Listerella hepatolytica olarak adlandırmıştır. 7 İlk olarak Nyfeldt, 1929 da üç hastadan izole etttiği listeria etkenin hastalarda mononükleer hastalığa neden olduğunu rapor etmiştir. 9 Bakterinin bugünkü ismi olan Listeria 1940 yılında Pirie isimli araştırmacı tarafından verilmiştir. 7 L. monocytogenes in 1975 ve 1976 yıllarında batı Fransa da insanlar için epidemic patojen olarak 10, 1983 te ise gıda kaynaklı patojen olarak İngiltere de tanımlanmıştır. 11 İnsanlardan ilk izole edildiği 1929 dan 1980 lere kadar pek çok listeriozis vakası bildirilmiştir. 12 Türkiyede ise L. monocytogenes izolasyonu ilk kez Özcebe ve Doğruer tarafından 1945 te gerçekleştirilmiştir. 13,14 Daha sonra Aslan ve arkadaşları 15 sığırların Serebro Spinal Sıvısı (CRF) ve gaitalarından L. monocytogenes i izole etmişlerdir. 4

15 2.2. Taksonomi Uzun süre taksonomik çalışmalarda Listeria soyunun yerinin belirlenmesi sorun olmuştur. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology de Listeria cinsine Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix, Brochothrix tür adı altında düzenli, sporsuz, Gram pozitif çomaklar bölümünde yer verilmiştir. 16 L. monocytogenes in yüksek mortaliteye sahip olması ve gıda kaynaklı epidemik sorunlara yol açması nedeniyle mikroorganizmanın taksonomisi, patojenitesi, tanısı ve epidemitolojisi ile ilgili araştırmalar hız kazanmıştır. 17, yılına kadar L. monocytogenes Listeria soyunun tek türü olarak kabul edilirken, sırasıyla 1961 de L. denitrificans, 1966 da L. grayi, 1971 de L.murrayi, 1983 te L.welshimeri ve L. seeligeri, 1984 te L. ivanovii Listeria soyuna dahil edilmiştir. 2,19,20,21 Bergey s Manual of Determinative Bacteriology nin 9. sayısına göre taksonomik sınıflandırmada Listeriaceae familyasında L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. grayi ve L. murrayi olmak üzere toplam 7 tür tanımlanmaktadır. 16 L. monocytogenes in insanlar ve hayvanlar için tek patojen iken, L. ivanovii nin sadece hayvanlar için patojen olduğu bildirilmiştir. 3,22 Yapılan en son DNA-DNA hibridizasyon ve 16 rrna katologlama çalışmalarına göre Listeria genusu iki gruba ayrılmaktadır. Birinci grupta L. monocytogenes, L. ivanovii, L.innocua, L. seeligeri ve L. welshimeri yer alırken, ikinci grupta ise L. grayi, L. grayi subsp murrayi, L. grayi subsp grayi türleri bulunmaktadır. 17,18 Son sınıflandırmada L. murrayi ve L. grayi nin, L.grayi nin iki alt türü olduğu belirtilmekte ve L. grayi subsp murrayi ve L. grayi subsp grayi olarak adlandırılmaktadırlar. 17,23 L. monocytogenes in 13 serotipi, somatik (O) ve flagellar (H) antijene bağlı olarak belirlenmektedir. 17,24,25 Bunlar arasında da insanlarda en sık hastalık oluşturduğu 5

16 bildirilen serotipler 1/2a, 1/2b ve 4b dir. 1,3,26 McLauchlin J. ve arkadaşları 27 diğer türlere ait serotip sayılarını L. ivanovii için 1, L. innocua için 3, L. welshimeri için 2, L. seeligeri içinse 4 adet olduğunu bildirmektedirler. Tablo 2.1 de Listeria türlerinin serotipleri ve somatik (O) ve flagellar (H) antijenleri verilmiştir. 17,24 Tablo 2.1. Listeria Türlerininin Serotipleri ve O:H Antijenleri Serotip O-Antijen H-Antijen L. monocytogenes 1/2 a I, II, (III) AB 1/2 b I, II, (III) ABC 1/2 c I, II, (III) BD 3 a II, (III), IV AB 3 bii, (III), IV, (XII), (XIII) ABC 3 c II, (III), IV, (XII), (XIII) BD 4 a (III), (V), VII, IX ABC 4 ab (III), V, VI, VII, IX, X ABC 4 b (III), V, VI ABC 4 c (III), V, VII ABC 4 d (III), (V), VI, VIII ABC 4 e (III), V, VI, (VIII), (IX) ABC 7 (III), XII, XIII ABC L. ivanovii 5III, (V), VI, (VIII), XABC L. innocua 4 abiii, V, VI, VII, IX, XABC 6 aiii, V, (VI), (VII), (IX), XVABC 6 biii, (V), (VI), (VII), IX, X, XVABC L. welshimeri 6 aiii, V, (VI), (VII), (IX), XVABC 6 biii, (V), (VI), (VII), IX, X, XVABC L. seeligeri 1/2 b I, II, (III) ABC 4 c (III), V, VII ABC 4 d (III), (V), VI, VIII ABC 6 biii, (V), (VI), (VII), IX, X, XVABC L. grayi III, XII, XIV E 6

17 2.3. Listeria nın Etiyolojisi ve Koloni Özellikleri Listeria türleri doğada yaygın olarak bulunurlar ve gram pozitif, sporsuz, kapsülsüz, peritrik flagellaları ile hareketli, psikrotrof özellikte, 0,5 μm eninde ve 1-2 μm boyunda kısa çubuk formunda, fakültatif intraselüler bakterilerdir. L. monocytogenes, L. ivanovii ve L. seeligeri Listeria ailesinde patojen türlerdir. 2,3,17,18 Listeria türleri içerisinde sadece L. monocytogenes insanlar için patojendir. 16 Bakteri 0-45ºC aralığında üreyebilmekte olup 20-25ºC ler arasında kuvvetli hareketlidir. Etken aerob, anaerob veya mikroaerofilik ortamlarda, geniş ph aralıklarında (4,3-9,6), 0,92 aw değerinde ve yüksek tuz konsantrasyonlarında (% 10) üreyebilmektedir. 2,3,18 Tablo 2.2 de Listeria ların üreme koşulları verilmiştir. 3 Tablo 2.2. Listeria ların Üreme Koşulları Min.- Maks. Optimal Sıcaklık(ºC) ph 4,3-9,6 7,0 aw 0,92 0,97 Listeria türleri oksidaz negatif, katalaz pozitiftir. Listeria ların Voges-Proskauer ve Metil Red testleri pozitif olup, indol ve H 2 S oluşturmazlar. Sodyum hippuratı ve eskülini hidrolize ederler. Oksijenli ortamda hareketli olduklarından Sulphate Indol Motility (SIM) mediumda şemsiye tarzında üreme gösterirler. 16 Listeria ların birçoğu karbonhidratları fermente ederek gaz oluşturmadan asit oluştururlar. Listeria etkeni ramnoz pozitif, ksiloz negatiftir. 3 Listeria lar içinde patojen olan türlerden olan 7

18 L. monocytogenes ve L. ivonavii kanlı agarda beta hemoliz oluşturma özelliğine sahiptirler. 3 Etken kanlı agarda Staphylococcus aureus ve Rhodococcus equi ile sinerjik hemolitik bir etki göstermekte ve bu test Christie Atkins Munch Petersen (CAMP) olarak adlandırılmaktadır. 27 Bergey s Manual of Determinative Bacteriology nin 9. sayısında L. monocytogenes ve L. seeligeri S. aureus ile pozitif, R. equi ile negatif CAMP reaksiyonu gösterdiği bildirilmiştir. L. ivanovii ise R. equi tarafında hemoliz oluşturur. 16,28,29 Şekil 2.1 de CAMP deneyinde şüpheli kolonilerin kanlı agara ekimi, Tablo 2.3 te Listeria türlerinin ayrımı verilmiştir. 25 Şekil 2.1 CAMP Deneyinde Şüpheli Kolonilerin Kanlı Agara Ekimi 8

19 Tablo 2.3. Listeria Türlerinin Ayrımı Tür Ramnoz Ksiloz Β- hemoliz CAMP S.A. CAMP R.E. L.monocytogenes * L.innocua v L.ivanovii L.seeligeri L.welshimeri v L.grayi S.A.: S.aureus suşu R.E.:R.equi suşu v : Değişken (+) : Pozitif Reaksiyon (-) : Negatif Reaksiyon (-*) : Pozitif sonuç verebilmektedir. Listeria spp. kolonileri kanlı agarda saatlik inkubasyon sonunda mm çapında, yuvarlak, çiğ damlası şeklinde, şeffaf, etrafı belirgin ve hafif kabarık koloniler oluştururlar. 16 Tryptic Soy Agar da (TSA) üreyen Listeria lar saatlik inkubasyon sonunda koloni mikroskobunda 45 lik açı ile gelen ışıkla alttan aydınlatıldığında (Henry Adınlatma Deneyi), smooth (S) koloniler ve yüzeyde çok ince gözenekli bir yapı ile birlikte karakteristik mavi-yesil röfle verirler. Normal ışıkta incelendiğinde mavimsi renkte ve granüler yüzeyli görünürler. 16,25,30 Şekil 2.2 de Henry aydınlatma Deneyi verilmiştir. 25 9

20 Şekil 2.2 Henry Aydınlatma Deneyi 2.4. Listeria Etkeninin Gıda Maddelerindeki Varlığı Listeria infeksiyonlarının gıda kaynaklı oluşumunda tüketime hazır gıdalar, patörize edilmemiş süt ve ürünleri, çiğ et ve et ürünleri ile salatalar başlıca risk grubu gıdalardır. 31 Listeria monocytogenes düşük ph değeri, buzdolabı sıcaklığı ve yüksek tuz konsantrasyonu gibi olumsuz koşullarda üreyebilmektedir. Bu durum halk sağlığı açısından önem arz etmektedir. L. monocytogenes in buzdolabı ısısında dahi üremesine devam edebildiği bildirilmiştir. 32 Hayvansal gıdalar içerisinde; çiğ ve pastörize süt ile peynir, dondurma, krema gibi süt ürünleri; kıyma ve diğer kırmızı et ürünleri, tavuk eti; balık ve diğer su ürünleri L. monocytogenes ve diğer Listeria türleri ile kontamine olabilmektedir. 3 10

21 Süt ve Süt Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Çiğ süt ve ürünleri L. monocytogenes infeksiyonları açısından riskli gıdalar arasında yer almaktadır. Listeria etkeninin süte kontaminasyonu daha çok dışkı ve silajla temas sonrası oluşmaktadır. 2 Yapılan çalışmalarda L. monocytogenes in süt toplama tankındaki prevalansı % 1-13 civarında iken süt işleme tesislerindeki bulunma oranı % 7-28 dir. 2,33 Fenlon ve arkadaşları 33 yapmış olduğu çalışmada; toplama tanklarındaki sütlerin L.monocytogenes ile kontaminasyon düzeyini incelemiş, 160 üreticiden elde edilen 25 (%15) inin süt örneğinin etken yönünden pozitif olduğunu tespit etmişler ve çiğ sütün süt üretim tesisleri için potansiyel kaynak olduğunu bildirmişlerdir. Illinois te pikniğe çıkan 45 kişide L. monocytogenes e bağlı infeksiyon tespit edilmiştir. Yapılan araştırmada infeksiyonun nedeninin piknikte tüketilen çikolatalı süt olduğu ve pastörize sütlerde saptanan L. monocytogenes 1/2a serotipi ile kontaminasyonunun pastörizasyon işlemi sonrası tesisteki yetersiz sanitasyona bağlı olarak oluştuğu bildirilmiştir. 34 Listeria infeksiyonlarında; çiğ sütten peynir yapılması, özellikle pastörizasyon sonrasında süt işletmelerindeki alet-ekipmandan kaynaklanan kontaminasyon halk sağlığı açısından önem arz etmektedir. 3 Özellikle yumuşak peynir türleri Listeria infeksiyonları için önem taşımaktadır. Yapılan çalışmalarda peynirlerin % 1-15 inin Listeria ile kontamine olduğu bildirilmiştir. 35,36, Kırmızı Et ve Et Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Listeria etkeni kırmızı etlere kesim işlemi sırasında veya sonraki aşamalarda kontamine olabilmektedir. Yapılan çalışmada kontaminasyon sonrasında L. monocytogenes in et yüzeyinden uzaklaştırılmasının veya inaktive edilmesinin oldukça zor olduğu bildirilmiştir. 38 Patojenin buzdolabında saklanan çiğ, işlenmiş ve tüketime 11

22 hazır et ve et ürünlerinde üreyebildiği, buna bağlı olarak kontamine gıdaların insanlarda listerioza sebep olduğu bildirilmiştir. 39,40 Yapılan çalışmalar kırmızı et ve et ürünlerinin değişik Listeria türleri ile kontamine olduğunu ortaya koymaktadır. Şireli ve Erol 41 Ankara ilindeki market ve kasaplardan alınan 100 hazır sığır kıyması numunesinden 97 (% 97) sinin 6 farklı Listeria türü ile kontamine olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmada identifiye edilen Listeria ların % 92 sinin L. innocua, % 28 inin L. monocytogenes, % 10 unun L. murrayi, %9 unun L. grayi, % 3 ünün L. seeligeri % 2 sinin L. welshimeri olduğunu rapor etmişlerdir. Sancak ve arkadaşlarının yılında Van ilinde tüketime sunulan et ve et ürünlerinde yapmış oldukları Listeria türlerinin izolasyon ve identifikasyon çalışmasında inceledikleri 120 adet numuneden 30 (% 25) unda Listeria izole etmişler ve identifikasyon çalışması sonucunda bunlardan 11 (% 9.2) inin L. monocytogenes, 14 (% 11.7) ünün L. innocua, 3 (% 2.5) ünün L. welshimeri, 1 (% 0.8) inin L. ivonavii, 1 (% 0.8) inin L. innocua ve L. seeligeri olduğunu bildirmişlerdir. Sırıken ve arkadaşlarının 43 Afyon ilinde yaptıkları çalışmada, marketlerden toplanan 100 sucuk örneğinin 9 unda Listeria spp. tespit edildiği, bu izolatlardan 7 sinin L. monocytogenes, 1 inin L. ivanovii ve 1 inin L. innocua olduğu bildirilmiştir. İsviçre de yapılan bir çalışmada 44, 211 sığır, 189 domuz olmak üzere toplam 400 kıyma örneğinin % 10,8 (43/400) inde L. monocytogenes tespit edilmiştir. İzole edilen L. monocytogenes türünün 9 unun serotipinin 1/2a, 2 sinin 1/2b, 12 sinin 1/2c ve 10 unun 4b olduğu rapor edilmiştir. Güven ve arkadaşlarının yılında Elazığ ilinde yapmış oldukları çalışmalarında 100 adet kıyma örneğinin % 13 ünde L. monocytogenes, % 26 sında L. innocua ve % 4 ünde ise her iki tür birlikte tespit edildiğini bildirmişlerdir. Aynı 12

23 çalışmada 70 adet parça et örneğinin % 11.4 ünde L. monocytogenes, % 18.6 sında L. innocua, 80 adet sucuk örneğinin % 7.5 inde L. monocytogenes, % 11.4 ünde L. innocua olduğu rapor edilmiştir Kanatlı Et ve Et Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Uygun hijyenik şartlar sağlanamadığında kanatlı etleri L. monocytogenes gibi enterik bakterilerle yüksek düzeyde kontamine olabilmektedir. 46 Kanatlı eti ürünlerinden kaynaklanan pek çok gıda kaynaklı infeksiyon rapor edilmiştir. Güven ve arkadaşlarının yılında Elazığ ilinde yapmış oldukları çalışmalarında tavuk eti örneklerinin % 38.8 inde L. monocytogenes, % 50 sinde L. innocua ve % 60 ında Listeria türleri tespit etmişlerdir. Özmen yılında Gemlik ilçesinde yaptığı çalışmada 100 adet tavuk karkası örneklerinden 76 (% 76) adet Listeria spp. izole ettiğini; identifiye ettiği Listeria kolonilerinin 24 (% 24) ünün L. monocytogenes, 43 (% 43) ünün L. innocua, 4 (% 4) ünün L. murrayi, 3 (% 3) ünün L. grayi ve 2 (% 2) sinin L. welshimeri olduğunu bildirmiştir. Ayaz 2 ise 2008 yılında Ankara ilinde hindi eti üzerine yapmış olduğu çalışmada Ankara da tüketime sunulan 180 hindi kıyma örneğinin 32 (% 17,8) sinin L. monocytogenes ile kontamine olduğunu bildirmiştir. Ceylan ve arkadaşları 48 Erzurum ilinde yaptıkları çalışmada 116 adet tavuk eti örneğinden 38 (% 32.76) inde Listeria monocytogenes olduğunu tespit etmişlerdir. Erol ve arkadaşları yılında tavuk kıyma örneklerinin % 35 inde, tavuk burger örneklerinin % 26.6 sında ve tavuk köftesi örneklerinin % 20 sinde Listeria monocytogenes izole ettiklerini bildirmişlerdir. Miettinen ve arkadaşları yılında 61 adet çiğ tavuk örneğinden 38 (% 62) inde L. monocytogenes tespit ettiklerini bildirmişlerdir. 13

24 Japonya da yapılan bir çalışmada çiğ tavuk kıymasının 17 sinin (% 37) L.monocytogenes ile kontamine olduğu rapor edilmiştir Su ve Diğer Gıda Ürünlerinde Listeria Kontaminasyonu Su ürünlerinin L. monocytogenes ile birincil kontaminasyon kaynağı işleme tesisleri olduğu bilinmektedir. L. monocytogenes, su ürünleri işleme tesislerinde kullanılan alet ve ekipmanlara tutunup üremekte ve buralarda biyofilm oluşturmakta, temizlik ve dezenfeksiyon işlemleri ile ortamdan uzaklaştırılmaları güç olmaktadır Yapılan bir çalışmada 55, su ürünlerinin insanlarda gıda kaynaklı Listeria infeksiyona sebep olduğu belirtilmiştir. Su ürünlerinden özellikle taze ve donmuş midye başta olmak üzere kabuklu deniz ürünlerinin, çiğ, salamura veya soğuk dumanlanmış balık etinin gıda kaynaklı listeriozis açısından riskli gıdalar oldukları bildirilmiştir. 56 Yapılan bir başka çalışmada ise Ankara daki süpermarketlerden toplanan dumanlanmış vakum paketli 76 balık örneğinin % 5,3 ünden (4/76) Listeria türlerinin izole edildiği, elde edilen izolatların % 2,6 sının (2/76) L. monocytogenes, % 1,3 ünün (1/76) L. innocua, % 1,3 ünün (1/76) L. grayi olduğunu rapor edilmiştir. 57 Başka bir çalışmada ise incelenen çiğ ve dumanlanmış alabalıklardan L. monocytogenes izole edilemediği bildirilmiştir. 58 Hayvansal ürün olmayan birçok gıdanında Listeria etkeni ile kontamine olduğu yapılan çalışmalarla tespit edilmiştir. Tayvan da marketlerde satılan marul, lahana ve yeşil soğanın % 12,2 sinin L. monocytogenes ile kontamine olduğu saptanmıştır. 59 Amerika da yapılan bir çalışmada marketlerde satışa sunulan patates ve turpların sırasıyla % 25,8 inin ve % 30,3 ünün L. monocytogenes ile kontamine olduğu rapor edilmiştir. 60 Bir yıl süre ile tarım alanlarındaki lağım sularında L. monocytogenes varlığının araştırıldığı çalışmada kontaminasyon düzeyinin % 73 olduğu belirlenmiştir

25 Kanada da 314 yüzey suyu örneğinin analizinde örneklerin 32 (% 10.2) sinin L. monocytogenes ile kontamine olduğu tespit edilmiştir İzolasyon ve İdentifikasyon Yöntemleri Listeria türlerinden özellikle halk sağlığı açısından gıda kaynaklı patojen bir bakteri olması sebebiyle önem arz eden L. monocytogenes türünün gıdalardan hızlı ve pahalı olmayan yöntemlerle tespiti önem taşımaktadır. L. monocytogenes in gıdalardan izolasyon ve identifikasyonu amacıyla çeşitli kültür yöntemleri geliştirilmiştir. Hayes ve arkadaşları 63 soğuk zenginleştirmeye dayalı yöntemde Tryptose Brothun inkübasyon süresinin 4ºC de 8 hafta olmasından dolayı pratik olmamasına bağlı olarak izolasyon yöntemi olarak USDA metodunu kullanmışlardır. Listeriozis olguların artmasıyla birlikte dünyada birçok kuruluş L. monocytogenes in identifikasyonu için metot geliştirmişlerdir. Bu kuruluşlar, Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), Amerika Tarım Bakanlığı/Gıda Güvenliği ve İnspeksiyonu Servisi (USDA/FSIS) ve Uluslararası Standartlar Organizasyonu (ISO) olarak sıranabilir. FDA tarafından önerilen metot daha çok süt ve süt ürünlerinden L. monocytogenes in izolasyonunda kullanılmakta olup zenginleştirme buyyonu olarak Listeria Enrichment Broth (LEB) kullanılmaktadır. Zenginleştirme sıvı besi yerinin selektivitesini arttırmak amacıyla akriflavin, nalidiksik asit ve siklohekzimid eklenmektedir. 30ºC de 48 saat yapılan inkübasyon sonunda örnekler katı besiyerine geçilmektedir. 64 USDA/FSIS metodu, McClain ve Lee 65 tarafından 1988 yılında geliştirilmiş olup çiğ kırmızı et ve kanatlı etlerinden L. monocytogenes in izolasyonu amacıyla kullanılmaktadır. Bu metotda genellikle iki aşamalı zenginleştirme işlemini takiben katı besiyerine ekim yapılmaktadır. Ön zenginleştirme University of Vermont Medium- 15

26 Modified Listeria Enrichment Broth da (UVM) 30ºC de 24 saat süreyle yapılmakta ve besiyeri akriflavin ve nalidiksik asit içermektedir. Ön zenginleştirme işlemini sonrasında Fraser Broth da 35-37ºC de 24 saat süreyle selektif zenginleştirme işlemi yapılmaktadır. Fraser Broth un selektivitesinin sağlanması için içerisine akriflavin, nalidiksik asit ve ferrik amonyum sitrat katılmaktadır. 2 Listeria monocytogenes belirlenmesinde kullanılan TS EN ISO nolu yöntemde ise 25 gr (ml) gıda, selektif olmayan ön zenginleştirme amacıyla 225 ml yarı konsantre Fraser Broth besiyerinde homojenize edilerek 30ºC da 24±2 saat inkübe edilmekte, daha sonra selektif zenginleştirme amacıyla 10 ml tam konsantre Fraser Broth besiyerine ön zenginleştirme kültüründen 0,1 ml ilave edilip, 35-37ºC da 48±2 saat inkübasyona bırakılmaktadır. Ön zenginleştirme kültürü ile selektif zenginleştirme aşamasının 24. ve 48. saatlerinde ALOA Agar (Listeria Ottaviani and Agosti Agar) ile kullanıcının tercihine bırakılan bir başka selektif katı besiyerine öze ile sürme yapılarak, inkübasyon sonunda şüpheli Listeria kolonilerine biyokimyasal ve fizyolojik testlerle tür belirlemesi yapılmaktadır. ALOA Agar besiyerinde L. monocytogenes, etraflarında opak hale olan mavi-yeşil renkli koloniler oluşturur. 25,66 Listeria türlerinin özellikle de insan için gıda kaynaklı patojen olan L. monocytogenes in gıdalardan izolasyonu ve identifikasyonu amacıyla günümüze kadar birçok sıvı ve katı besiyeri kullanılmıştır. Bu besiyerlerinden başlıcaları; Listeria Enrichment Broth (LEB), Fraser Broth (FB), Listeria Test Broth (LTB), University Of Vermont Medium (UVM), FDA Broth, Tripaflavin-Nalidik Asit-Serum Agar, Lityum Klorür-Feniletanol Moksalaktam Agar (LPM), Oxford Agar (OXA), Modifiye Oxford Agar (MOX), Akriflavin Seftazidim Agar (ASA), Lityum Klorür Seftazidim Agar (LSA), Polimiksin, Akriflavin, Lityumklorid, Seftazidim, Eskülin, Mannitol Agar (PALCAM), L-PALCAM, Al-Zoreky-Sandin Listeria Medium, CHROMagar 16

27 Listeria dır. Selektif zenginleştirme besiyerlerinde genellikle gram negatif bakterilerin inhibisyonu amacıyla nalidiksik asit ve akriflavin kullanılmaktadır. 2,6,7,16-18,24,25,63,64,67 Günümüzde Listeria izolasyonu için en sık kullanılan besiyerleri Oxford, modifiye Oxford ve PALCAM agardır. Oxford veya modifiye Oxford agarda Listeria kolonileri 35-37ºC de saat inkübasyon sonunda siyah haleli ve siyah renkte görünürler. Bu görüntü eskülin hidrolizi ve besiyerinde siyah demir fenolik bileşiklerinin oluşumundan kaynaklanır. PALCAM agarda L. monocytogenes siyah zeminde gri-yeşil koloniler meydana getirirler. PALCAM besi yerindeki bu görüntünün nedeni eskülin, ferik demir, D-mannitol ve ferol reddir. 17,18 Çeşitli genusların Listeria genusuyla birçok benzer özellikleri mevcuttur. Bu genuslar Streptococus, Erysipelothrix, Lactobacillus, Corybebacterium, Propionibacterium ve Enterococ türleriyle beraber klinik önemi olmayan genuslardan Kurthia ve Brochothrix tir. L. monocytogenes en çok Streptococcus türleri ile karıştırılır veya kontaminan bir diphtheroid olarak değerlendirilerek gözardı edilir. L. monocytogenes in benzer bakterilerden farklılıkları Tablo 2.4 te gösterilmiştir. 17 Tablo 2.4. L. monocytogenes in Bezer Bakterilerden Farklılıkları Organizma Katalaz Eskülin Hareket β-hemoliz H 2 S/TSI L.monocytogenes Corynebacterium + - -/+ -/+ - Propionibacterium + +/- - +/- - E.rhusiopathia Lactobacillus spp S.agalactiae Enterococci /+ - + = suşların %90 dan fazlası pozitif - = suşların %90 dan fazlası negatif +/- = değişken(suşların çoğu pozitif) -/+ = değişken(suşların çoğu negatif) 17

28 Listeria spp. identifikasyonu için biyokimyasal testleri ile tür ayrım şeması Tablo 2.5 te verilmiştir. 25,68 Tablo 2.5. Listeria spp. için Biyokimyasal Testleri ve Tür Ayrımı Şeması Testler L. monocytogenes L. ivanovii L. innocua L. welshimeri L. grayi L. seeligeri Gram boyama Katalaz Oksidaz SIM de hareket Nitrat red β-hemoliz CAMP test S.aureus/R.equi +/- -/+ -/- -/- -/- +/- Mannitol L-ramnoz + - d D - - D-ksiloz d: Değişken Listeria monocytogenes in identifikasyonu için klasik yöntemler dışında hızlı sonuç alınabilen ticari test ürünleri tablo 2.6 te verilmiştir. 69 Tablo 2.6. Listeria monocytogenes için Kullanılan Ticari Test Ürünleri Test Adı Analiz Tekniği Test Süresi (saat) Üretici AccuPROBE Nükleik Asid Hibridizasyonu Gen-Probe API Test Biyokimyasal Reaksiyonlar BioMérieux Inc. Assurance Listeria EIA Enzim İmmunoassay 50 BioControl Systems, Inc. BAX Polimeraz Zincir Reaksiyonu 45 Qualicon, Inc. 18

29 Tablo 2.6. Listeria monocytogenes için Kullanılan Ticari Test Ürünleri-Devamı Test Adı Analiz Tekniği Test Süresi (saat) Üretici Dynabeads anti-listeria İmmunomanyetik Separasyon 48 Dynal Inc. EIAFoss Liste ria ELISA ve IA Kombinasyonu 48 Foss North America, Inc. GENE-TRAK Nükleik Asid Hibridizasyonu 48 GENE-TRAK Systems ISO-GRID. Membran Filtrasyon 24 Listeria Rapid Test Enzim İmmunoassay 42 QA Life Sciences, Inc. Oxoid, Inc. Listeria-Tek ELISA 48 Organon Teknika Corp. ListerTest İmmunomanyetik Separasyon 24 Vicam, L.P. Microbact 12L Biyokimyasal Reaksiyonlar 4-24 BioControl Systems, Inc. MICRO-ID Listeria Lateks Aglütinasyon 24 Probelia PCR System Polimeraz Zincir Reaksiyonu 30 Reveal for L isteria ELISA (Sandwich) 48 Remel BioControl Systems, Inc. Neogen Corporation TECRA Listeria Visual Vidas LIS ELISA 48 Enzim Linked Fluoresan Assay 48 International BioProducts BioMérieux Inc. Vidas LMO Enzyme linked fluorescent assay 48 BioMérieux Inc. VIP for Listeria Visual immunoprecipitate 48 BioControl Systems, Inc. 19

30 2.6. Microbact 12L İdentifikasyon Sistemi Test; 11 farklı şeker (Esculin, Mannitol, Xylose, Arabitol, Ribose, Rhamnose, Trehalose, Tagatose, Glucose-1-Phosphate, Methyl-D-Glucose ve Methyl-D-Mannose) ve bir hemoliz test kuyucuğundan oluşur ve mikro-substrat sistemi ile şüpheli Listeria spp. kolonilerinin identifikasyonunu gerçekleştirir. Test kiti; tek bir koloni için saat inkübe edilerek kullanılabileceği gibi, inokülüm 0.5 MacFarland a ayarlandığında 4 saatlik hızlı test kiti olarak da kullanılabilir. 70 İnkübasyon sonrası kuyucuklarda oluşan renk değişimi kontrol kartına işlenerek elde edilen dört basamaklı kod özel bilgisayar programına tanımlanır ve program koloninin Listeria spp. nin hangi türe ait olduğu yüzdesel sonuç olarak vermektedir. 70 Üretici firma tarafından testin 4 saatlik inkübasyon sonrası % 92 güvenilir olduğu, 24 saatlik inkübasyon sonrası ise % 100 güvenilir olduğu belirtilmektedir. Microbact 12L Listeria identifikasyon sistemi reaksiyon tablosu Tablo 2.7 de Microbact 12L Listeria identifikasyon sistemi veri tablosu Tablo 2.8 de gösterilmiştir

31 Tablo 2.7. Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Sistemi Reaksiyon Tablosu Kuyucuk Reaksiyon sonucu Substrat Reaksiyon No Negatif Pozitif 1 Esculin Sarı Siyah 2 Mannitol Mor Sarı 3 Xylose Mor Sarı 4 Arabitol Mor Sarı 5 Ribose Mor Sarı Rhamnose Trehalose Tagatose Spesifik şekerlerin kullanımı asit özelligi taşıyan son ürünlerin oluşmasına neden olur. Mor Mor Mor Sarı Sarı Sarı 9 Glucose-1-Phosphate Mor Sarı 10 Methyl-D-Glucose Mor Sarı 11 Methyl-D-Mannose Mor Sarı 12 Hemoliz Kırmızı kan hücrelerinin hemolizi Kırmızı hücre Kahverengi Yorum Bromcreosol purple indikatörü asitli ortamda renk değiştirir. ÖNEMLİ : 4 saatlik inkübasyonun ardından pozitif reaksiyon pozitif sarıya geçiş gösteren kahverengi /saman sarısı renk sergileyebilir. Hemoliz varsa, kahverengi renk değişimi ile sonuçlanan kırmızı hücre hemolizi gerçekleşir. Hemoliz yoksa kırmızı hücreler kuyucuğun dibine çökerek kırmızı bir tortu oluşturur. 22

32 Tablo 2.8. Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Sistemi Veri Tablosu Esculin Mannitol Xylose Arabitol Ribose Rhamnose Trehalose Tagatose Glucose-1-Phosphate Methyl-D-Glucose Methyl-D-Mannose Haemolysis L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii L. seeligeri L. welshimeri L. grayi

33 3. MATERYAL ve METOT Bu çalışmada; Ocak 2013 ile Mayıs 2013 tarihleri arasında Erzurum bölgesinde tüketime sunulan 100 adet tavuk karkası piyasadan temin edilerek analiz numunesi olarak kullanıldı. Çalışma 3 aşamada gerçekleştirildi: 1. Tavuk karkasının temini ve analize hazırlanması, 2. Tavuk karkaslarının analizlerinin yapılması, 3. Listeria spp. şüpheli örneklerin identifikasyonu ve türlerinin belirlenmesi Tavuk Karkaslarının Temini ve Analize Hazırlanması Soğuk hava depolarında (-18 C) muhafaza edilen tavuk karkasları içerisinde buz aküleri bulunan termoslu kaplarla alınarak aseptik koşullarda laboratuvara getirildi. Karkas ambalajı açılmadan çözündürme dolabına (+4 C) alındı ve çözünmeye bırakıldı. Çözünme sonrası steril ekim odasında karkasın orijinal plastik ambalajı çift bek alevi arasında otoklavda steril edilen steril pens, makas ve bistüri yardımı ile steril poşetlere 25 gr miktarında tartılarak alındı Tavuk Karkaslarının Analizlerinin Yapılması Analizde Kullanılan Besiyerleri ve Hazırlanma Prosedürleri Fraser Listeria Selective Enrichment Broth Base (Merck ) Besiyerinden 55 gr alınarak 1000 ml distile suda çözündürüldü ve otoklavda 121 C de 15 dk sterilize edildi. ph 7.2 ± 0.2 olarak tespit edildi. Fraser Broth besiyeri yarım kuvvette inhibitör ilave edilmiş ve tam kuvvette inhibitör ilave edilmiş olarak iki farklı şekilde kullanıldı. 71 Ön zenginleştirme için 1 litre Selective sıvı besiyerine oda sıcaklığında bir vial amonyum sitret ve bir vial Listeria Selective Enrichment Supplement (Merck ) üzerine steril enjektör ile 1 er ml steril distile su ilave edildi ve iyice çözdürüldü. 24

34 Besiyeri 25 C ye kadar soğuduktan sonra üzerine hazırlanan supplement ilave edildi ve aseptik koşullar altında 225 ml lik steril erlenlere dağıtıldı. 71 Selektif zenginleştirme için 1 litre Selective sıvı besiyerine oda sıcaklığında bir vial amonyum sitrat ile iki vial Listeria Selective Enrichment Supplement (Merck ) üzerine steril enjektör ile 1 er ml steril distile su ilave edildi ve iyice çözdürüldü. Besiyeri 25 C ye kadar soğuduktan sonra üzerine hazırlanan katkılar ilave edildi ve aseptik koşullar altında 225 ml lik steril erlenlere dağıtıldı Fraser Listeria Supplement (Merck ) Fraser Broth (Merck ) sıvı besiyerinin yarım ve tam kuvvette selektif hale getirilmesi için kullanıldı ml Fraser broth hazırlamada yarım kuvvette selective için 1 vial amonyum demir 3 sitrat ve 1 vial selektif katkı kullanırken, tam kuvvette 1 vial ilave selektif katkı kullanıldı. Analiz için tek seferde 4 adet 225 ml lik Fraser Broth hazırlanarak çalışıldı. 71 Yarım kuvvette broth hazırlamak için 1 vial amonyum demir 3 sitrat ve 1 vial selektif katkı 1 ml lik steril damıtık su ile çözdürüldü. 1 ml lik çözdürülmüş katkılar 225 ml lik steril erlenlere dağıtılmış Fraser Broth içerisine ml miktarda mikro pipetle aktarılarak karışması sağlandı. Çalışma sonunda 4 adet yarım kuvvette Fraser Broth elde edildi. 71 Tam kuvvette broth hazırlamak için 225 ml lik ve 40 ml lik Fraser Broth hazırlandı. Her iki selektif katkı 1 ml lik steril damıtık su ile çözdürüldü. Amonyum 3 demir sitrat katkısı her 225 ml lik içeren Fraser Broth erlenlerine ml miktarda mikro pipetle aktarılarak karışması sağlandı. 40 ml lik erlene ise 0.04 ml olacak şekilde eklendi. Listeria Supplementi ise yarım ve tam konsantrasyon da eklendi. Buna göre 4 adet 225 ml Fraser Broth içeren erlene 225 ml miktarda miropipetle aktarılarak 25

35 karışması sağlandı. 40 ml lik erlene 0.08 ml ilave edildi. Daha sonra 40 ml lik broth 4 adet steril tüpe 10 ar ml olarak dağıtıldı PALCAM Agar (Merck ) Besiyerinden 35.9 gr alınarak 500 ml distile suda çözündürüldü ve ph 7.2 ± 0.2 olarak ayarlandı. Daha sonra otoklavda 121 C de 15 dakika sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 45 C ye kadar soğutuldu. Bir vial PALCAM Selective Supplement (Merck ) üzerine steril enjektör ile 1 ml steril damıtık su ilave edildi ve iyice çözünmesi sağlandı. Supplement eklenen besiyeri 12.5 er ml olacak şekilde petrilere döküldü PALCAM Agar Selective Supplement (Merck ) Bir vial PALCAM Selective Supplement (Merck ) üzerine steril enjektör ile 1 ml steril damıtık su ilave edilerek çözünmesi sağlandı ve hazır olan 500 ml PALCAM Agar (Merck ) üzerine 45 C de ilave edildi Oxford Listeria Selective Agar (Merck ) Besiyerinden gr alınarak 500 ml distile suda çözündürüldü ve otoklavda 121 C de 15 dakika sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 45 C ye kadar soğutuldu. ph 7.0 ± 0.2 olarak ölçüldü. 5 ml 1:1 oranında hazır olan steril damıtık su, alkol karışımı içinde çözdürülmüş 1 vial Oxford Listeria Selective Supplement (Merck ) selektif katkısı ilave edilerek homojen olarak karışması sağlandı. Daha sonra besiyeri 12.5 er ml olacak şekilde petrilere döküldü Oxford Listeria Selective Supplement(Merck ) 5 ml 1:1 oranında hazırlanmış olan steril damıtık su, alkol karışımı içinde çözdürülmüş 1 vial Oxford Listeria Selective Supplement üzerine steril enjektör ile 1 ml steril damıtık su ilave edildi ve iyice çözünmesi sağlandı. Daha sonra hazırlanmış olan 26

36 500 ml Oxford Listeria Selective Agar (Merck ) üzerine 45 ºC de ilave edildi Analizin Yapılması Analizler TS EN ISO Gıda ve Yem Maddelerinin Mikrobiyolojisi- Listeria monocytogenes in Aranması ve Sayımı Metoduna 25 uygun olacak şekilde yapılmıştır. Horizontal metot adıyla Aralık 1997 yılında 2006 yılında revize edilerek tekrar yayınlanmıştır. Bu yöntemde Listeria 'ların ayrı sıvı besiyerleri içerisinde ön ve selektif nitelikte esas zenginleştirmeleri yapılır. Ön zenginleştirmede; besiyerinde bulunan inhibitör maddelerin olumsuz etkisini azaltmak için, yarı konsantre Fraser Broth (bazal Fraser Broth ve yarı konsantre supplement), esas zenginleştirmede konsantre Fraser Broth kullanılır. Listeria türlerinin izolasyon metodu Şekil 3.1'de verilmiştir. 25,72 Yapılan ekimler ve inkübasyon süreleri sonunda PALCAM Agarda 1,5-2 mm çapında zeytin yeşili-gri renkli, bazen siyah merkezli ancak her zaman siyah zonlu, Oxford Agarda ise 2-3 mm çapında siyahımsı yeşil kahverengi, siyah zonlu çökük merkezli koloniler Listeria spp. şüpheli olarak değerlendirildi ve identifikasyon çalışmasına dahil edildi

37 Analiz Numunesi (25 gr) 225 ml 1/2 Fraser Broth 30 C de 24 Saat İnkübasyon PALCAM ve Oxford Agara Sürme 37 C de saat inkübasyon 0,1 ml 1/2 Fraser Brothtan 1/1 Fraser Brotha İnokülasyon C de 24.ve 48. Saat İnkübasyon PALCAM ve Oxford Agara Sürme 37 C de Saat İnkübasyon Petrilerin Değerlendirilmesi Şekil 3.1 Listeria Türlerinin İzolasyon Metodu 28

38 3.3. Listeria spp. Şüpheli Örneklerin İdentifikasyonu İdentifikasyonda Kullanılan Besiyerleri, Ayıraçlar ve Hazırlanma Prosedürleri Tryptone Soya Yeast Extract Agar Selektif katı besiyerinden alınan şüpheli Listeria kolonilerinin ilk doğrulanmasının yapılması için kullanılır. Üç ayrı besiyeri ve katkının karışımından oluşur. 30 gr/l CASO Broth(Merck ), 6 gr/l maya ekstraktı (Yeast Extract Merck ) ve 15 gr/l agar(merck ) damıtık su içinde eritildi ve otoklavda 121 C de 15 dakika sterilize edildi. Daha sonra besiyeri 12.5 er ml olacak şekilde petrilere döküldü Kanlı Agar (Merck ) Besiyerinden 40 gr alınarak 1000 ml distile suda çözündürüldü ve otoklavda 121 C de 15 dk sterilize edildi. Besiyeri 50 C ye soğutulduktan sonra % 5 lik steril defibrine koyun kanı ilave edilerek iyice karışması sağlandı Triple Sugar Iron Agar (Merck ) Besiyerinden 12 gr alınarak 1000 ml distile suya eklenir daha sonra kaynar su banyosunda 5-10 dakika tutularak ve sürekli karıştırılarak iyice çözünmesi sağlandı. Besiyeri sıvı halde iken 7 şer ml lik deney tüplerine dağıtıldı ve tüpler otoklavda 121 C de 15 dakika sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan tüpler cm kalınlığındaki çıtalar üzerine yatırıldı. Besiyerinin katılaşması beklendi Üre Broth (Merck ) Besiyerinden 38.5 gr alınarak 1000 ml distile suya eklendi daha sonra membran filtre ile sterilize edilip tüplere 3 ml dağıtıldı. ph 6.8 ± 0.2 olarak ölçüldü. Hazırlanan besiyeri berrak, portakal renkli olduğu gözlendi

39 Phenol Red Base (Merck ) Besiyerinden 1.5 gr alınarak 80 ml distile suda çözündürüldü ve 4 ml olacak şekilde deney tüplerine dağıtıldı. Daha sonra otoklavda 121 C de 15 dk sterilize edildi. 25 C ph 7.43 ± 0.2 olarak ölçüldü MR-VP Broth (Merck ) (Metil Red Ayıracı) Metil Red indikatöründen 0.1 gr alınarak 300 ml % 95 lik etil alkol içerisinde çözündürüldü. Üzerine 200 ml distile su ilave edilerek iyice karışması sağlandı Voges-Proskauer Ayıracı α-naphtol dan 5 gr alınarak 100 ml etil alkol içerisinde çözündürüldü KOH Çözeltisi KOH den 40 gr alınarak 100 ml distile su içerisinde çözündürüldü Kovaks Ayıracı Paradimetil aminobenzaldehit den 5 gr alınarak 70 ml ioamil alkolde çözündürüldü. Daha sonra üzerine 25 ml HCl ilave edilerek iyice karışması sağlandı Katalaz Test Ayıracı Hidrojen peroksit (H2O2) (% 30 luk) den 3 ml alınarak 97 ml distile su ile iyice karıştırıldı Griess-Hosvay ayıracı Eşit miktarda % 0.5 lik α - naftilamin, % 0.5 lik asetik asit ve % 0.8 lik sülfanilik asit karıştırıldı Referans Suşlar İzolasyon ve identifikasyon çalışmalarında Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı ndan temin edilen Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus ve Rhodococcus equi suşlarından yararlanıldı. 30

40 3.3.2 İdentifikasyon Çalışmaları PALCAM Agar ve Oxford agarda yapılan kontrollerde Listeria spp. şüpheli koloniler identifikasyon çalışmalarına dahil edildi. İdentifikasyon çalışmaları kapsamında şüpheli Listeria spp. kolonileri TSYE agar ile Kanlı Agara tek koloni düşecek şekilde ekimleri yapıldı ve petriler saat süreyle inkübasyona bırakıldı. 71 İnkübasyon sonunda Kanlı Agarda ve TSYE Agarda üreyen kolonilere Gram boyama, hareket muayenesi, katalaz, oksidaz, CAMP, karbonhidrat fermantasyon, H 2 S oluşumu, indol, nitrat, Metil Red, Voges-Proskauer, üre testleri uygulanarak kolonilerin identifikasyonu yapıldı. Kanlı Agar da üreyen şüpheli Listeria spp. kolonileri Microbact 12 L Listeria identifikasyon test kiti ile ayrıca değerlendirildi. Listeria türlerinin identifikasyon metodu Şekil 3.2 de verilmiştir Koloni Morfolojisi Kanlı agarda nonhemolitik veya dar bir hemoliz oluşturan S-formlu gri-beyaz koloniler şüpheli Listeria spp. olarak değerlendirildi. 71 TSYE Agarda 1-2 mm çapında konveks, renkli ya da opak düzgün kenarlı koloniler Listeria spp. olarak değerlendirildi Hemoliz Testi Kanlı Agarda koloni etrafında şeffaf renkte zon oluşumu β-hemoliz olarak değerlendirildi. β-hemoliz patojen türler olan L. monocytogenes ve L. ivanovii için tipik bir tür tayin özelliğidir Gram Boyama Kanlı Agarda üreyen şüpheli Listeria spp. kolonilerinden alınan tek koloni Gram boyama yapılarak mavi-mor renkteki Gram (+) küçük çomaklar pozitif olarak değerlendirildi

41 PALCAM ve Oxford Agarda Gelişen Tipik Koloniler Kanlı Agar 37 C de Saat İnkübasyon TSYE Agar 37 C de Saat İnkübasyon * Gram Boyama * Hareket Muayenesi * Katalaz * Oksidaz * CAMP Testi * Karbonhidrat Fermantasyon Testi * H 2 S olusumu * Nitrat Testi * Metil Red Testi * Voges-Proskauer Testi * Üre Testi Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Test Kiti Şekil 3.2 Listeria Türlerinin İdentifikasyon Metodu Hareket Testi Şüpheli Listeria spp. kolonileri TSYE ekildikten sonra 37 C de 18 ya da 24 saatlik inkübasyon sonrası üreyen koloniden örnek lamele alınarak üzerine çukur lam kapatılıp mikroskopta tipik takla atma hareketi (tumbling motility) bulunup bulunmadığı incelendi. 71 Yine TSYE de üreyen koloniden iğne uçlu öze ile SIM Mediuma dik daldırma yöntemi ile ekim yapıldı. Ekim hattından çevreye doğru 32

42 homojen bir yayılma, opaklaşma ve yüzeyin altında ters çam agacı veya semsiye tarzı üremenin olup olmadığı incelendi Katalaz Testi Lam üzerine bir damla % 3 lük H2O2 çözeltisinden konularak şüpheli Listeria spp. kolonisi öze ile alınarak lam üzerine değdirildi ve homojenize olması beklendi. Gaz kabarcıklarının oluşumu pozitif olarak değerlendirildi Oksidaz Testi Oksidaz testi için Bactident Oxidase (Merck ) test ayıracı kullanıldı. Test için koloni 1 ml saf suda çözdürüldükten sonra test şeritinin reaksiyon bölmesine kondu ve 60 sn içinde mavi-menekşe renk pozitif olarak değerlendirildi Hidrojen Sülfür (H 2 S) Oluşumu Kanlı Agarda gelişen şüpheli Listeria spp. kolonisiniden Tryptone Soya Yeast Extract Agara yapılan ekimden oluşan koloniden bir öze dolusu alınarak Triple Sugar Iron Agar (Merck ) besiyerine ekildi ve 37 C de 24 saat inkubasyona bırakıldı. Gaz ve H 2 S oluşumu pozitif olarak değerlendirildi Üre Testi Şüpheli Listeria spp. kolonisinin TSYE kültüründen 1 ml alınarak üre brothta ilave edildi ve 37 C de 24 saat inkübasyona bırakıldı. Pembe renk oluşumu pozitif olarak değerlendirildi Metil Red Testi 18 saatlik aktif kültürden, 5 ml lik MR-VP Broth (Merck ) besiyerine öze ile aşılama yapıldı ve 37 C de 96 saate inkübe edildi. İnkübasyon sonunda besiyerinden alınan bir miktar örnek üzerinde metil red damlatıldı. Rengin kırmızıya dönmesi pozitif olarak değerlendirildi

43 İndol Testi İndol testi yapılacak olan izolat ilk önce 5 ml Tryptone Water Broth(Merck ) besiyerine inoküle edildi ve 37 C de 24 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Daha sonra besiyerinin üzerine Kovacks İndol çözeltisi ilave edildi ve tüp elle karıştırıldı. En geç iki dakika içinde tüpün üzerinde vişneçürüğü renkli bir halka görülmesi pozitif olarak değerlendirildi Voges Proskauer (VP) Testi Hazırlanmış olan 5 ml lik MR-VP Broth (Merck ) besiyerine 18 saatlik aktif kültürden öze ile aşılama yapıldı ve 37 C de 96 saat inkübe edildi. 48. saatte kültürden alınan 1 ml lik örnek test tüpüne aktarıldı. Üzerine 0.6 ml α-naphtol eklendi ve karıştırıldı. Daha sonra 0.2 ml % 40 lık KOH çözeltisinden ilave edildi ve 4 saat sonra vişne çürüğü renk poztitif olarak değerlendirildi CAMP Testi Staphylococcus aureus ve Rhodococcus equi suşları % 5 lik koyun kanlı agar besiyerlerinin karşılıklı uçlarına paralel çizim şeklinde ekimleri yapıldı. Şüpheli kolonilerden bu ekim çizgilerine horizantal olarak ekim yapıldıktan sonra 37 C de 24 saat inkube edildi. L. monocytogenes ve L. seeligeri için S. aureus ile ok başı şeklinde sinerjistik hemoliz alanı oluşumu pozitif, Rhodococcus equi ile ise negatif olarak değerlendirildi Karbonhidrat Fermentasyon Testleri Fenol red indikatörünün peptonlu su ile hazırlanan solüsyonu ile glukoz, laktoz, mannitol, ramnoz, ksiloz, salisinin % 1 lik çözeltileri hazırlandı. Şüpheli Listeria spp. kolonisinin TSYE kültüründen bu çözeltilere 0.1 ml ilave edildikten sonra 37 C de 1-10 gün inkube edildi. İnkübasyon sonucu sarı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirildi

44 Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Test Kiti Kanlı Agar da üreyen şüpheli Listeria spp. kolonilere Microbact 12 L Listeria identifikasyon test sistemi yapıldı. Üreyen şüpheli kolonilerden yavaş test için (18-24 saat) tek bir koloni alındı ve sulandırma sıvısı ile karıştırıldı. Test stripi özel taşıma tepsisine kondu ve stripin üzerindeki koruyucu film sıyrılarak steril bir pipet ile her kuyucuğa hazırlanmış olan süspansiyondan 100 μl ve 12 nolu kuyucuğa 1 damla hemoliz reaktifi ilave edildi. 70 Stripler, 24 saat 35 ± 1 C de inbübe edildi. İnkübasyon sonucu kuyucuklarda oluşan renk değişimleri gözle okunarak kayıt formuna işlendikten sonra bilgisayar identifikasyon programına veri tablosundan elde edilen kod sayı girildi ve programdan izolatın hangi Listeria türüne ait olduğu okunarak sonuçlar kayıt edildi

45 4. BULGULAR Bu çalışmada; Erzurum bölgesinde tüketime sunulan toplam 100 adet tavuk karkası numune olarak piyasadan toplanarak kullanıldı. Listeria spp. nin identifikasyon çalışmalarında United States Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS) tarafından önerilen yöntem esas alınarak yapıldı. 65 Daha sonra Listeria spp. şüpheli numunelere yapılan biyokimyasal analizlerle tür tayini yapıldı. 73,74 Ayrıca Listeria spp. şüpheli koloniler Microbact 12 L Listeria İdentifikasyon Test Kiti ile tekrar analize alınarak tür tayinleri yapıldı. Çalışmanın birinci aşamasında aseptik koşullar ve soğuk zincir bozulmadan numunelerin laboratuvara sevki sağlandı. Daha sonra United States Department of Agriculture (USDA) önerdiği metoda göre numunelerin sırasıyla; ön zenginleştirme, zenginleştirme, selektif katı besiyerlerine ekim, kolonilerin incelenmesi, biyokimyasal testler ile identifikasyonu yapıldı. 73,74 Toplanan numunelerden en son PALCAM Agar ve Oxford Agar selektif besiyerlerine yapılan ekimlerinin ve inkübasyonları sonrası yapılan kontrollerde PALCAM Agarda 1,5-2 mm çapında zeytin yeşili-gri renkli, bazen siyah merkezli ancak her zaman siyah zonlu, Oxford Agarda ise 2-3 mm çapında siyahımsı yeşil kahverengi, siyah zonlu çökük merkezli koloniler Listeria spp. şüpheli olarak değerlendirildi. 71 Listeria spp. nin PALCAM Agarda üreyen kolonilerine ait görüntü Şekil 4.1 de verilmiştir. 36

46 Şekil 4.1. Listeria spp. nin PALCAM Agar da Üreyen Kolonileri PALCAM Agarda koloni oluşturan Listeria spp. şüpheli örneklerden kanlı agar ve TSYE besiyerlerine ekim yapıldı. İnkübasyon sonrası Kanlı Agar ve TSYE Agar besiyerlerine üreyen kolonilere Gram boyama, katalaz, oksidaz, hareket muayenesi, Metil Red, Voges-Proskauer, nitrat, H 2 S oluşumu, glikoz, laktoz, Ksiloz, Ramnoz, üre, CAMP, Beta Hemoliz, Mannitol ve indol testi uygulandı. İdentifikasyon çalışma sonuçlarına göre identifiye edilen Listeria ların 16 (% 25) sının L. monocytogenes, 26 (% 40.62) sının L. innocua, 12 (% 18.75) sinin L. grayi, 5 (% 7.81) inin L. murrayi ve 5 (% 7.81) inin L.welshimeri olduğu tespit edildi. Karkas örneklerinden yapılan izolasyonda tespit edilen şüpheli Listeria spp. kolonilerinin türlere göre dağılımı Tablo 4.1 de, şüpheli Listeria spp. kolonilerinin türlere göre grafiksel dağılımı Şekil 4.2 de, karkas örneklerinden identifiye edilen izolatların morfolojik ve biyokimyasal test sonuçları Tablo 4.2 de verilmiştir. 37

47 Tablo 4.1. Şüpheli Listeria spp. Kolonilerinin Türlere Göre Dağılımı Tespit Edilen Listeria Türleri Listeria spp. L. monocytogenes L. innocua L. grayi L. murrayi L. welshimeri Tespit Edilen Sayılar ve Yüzdeler (n=100) 64 (% 64) 16 (% 25) 26 (% 40.62) 12 (% 18.75) 5 (% 7.81) 5 (% 7.81) % %16 %26 %12 %5 %5 Listeria spp. L. monocytogenes L. innocua L. grayi L. murrayi L. welshimeri Şekil 4.2 Listeria spp. Kolonilerinin Türlere Göre Grafiksel Dağılımı 38

48 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s Oxford Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + / + +/ + +/ + +/ + +/ + / + / + / + +/ + Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat H 2 S Glikoz Laktoz ND ND + + ND ND ND ND ND ND Ksiloz Ramnoz + ND ND + + ND ND + Üre CAMP (Sa/Re) +/ / / / +/ +/ / / / +/ Beta Hemoliz Mannitol + + İndol Tanımlanan Listeria Türü L. monocytogenes L.grayi L.innocua L.innocua L. monocytogenes L. monocytogenes L.welshimeri L.welshimeri L.grayi L. monocytogenes 39

49 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-2 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme +/ + +/ + +/ + +/ + / + +/ + / + +/ + +/ + +/ + 1/2 F 24s / 1/1 F 48s Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat + + H 2 S Glikoz Laktoz + ND + ND ND + ND ND + ND Ksiloz Ramnoz ND ND ND + ND ND ND + Üre + + CAMP (Sa/Re) / / / +/ / / / / / +/ Beta Hemoliz + + Mannitol İndol Tanımlanan Listeria Türü L.innocua L.murrayi L.innocua L. monocytogenes L.grayi L.innocua L.grayi L.murrayi L.innocua L. monocytogenes 40

50 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-3 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + / + +/ + +/ + +/ + +/ + / + +/ + +/ + +/ + Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat H 2 S Glikoz Laktoz + ND ND + + ND ND ND + + Ksiloz Ramnoz ND + ND ND + + ND ND Üre CAMP (Sa/Re) / / +/ / / +/ / +/ / / Beta Hemoliz Mannitol + + İndol Tanımlanan Listeria Türü L.innocua L.grayi L. monocytogenes L.innocua L.innocua L. monocytogenes L.grayi L. monocytogenes L.innocua L.innocua 41

51 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-4 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s / + +/ + +/ + / + +/ + +/ + +/ + / + +/ + +/ + Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat + + H 2 S Glikoz Laktoz ND ND + ND + ND + ND ND ND Ksiloz Ramnoz ND ND ND + ND ND + Üre + + CAMP (Sa/Re) / / / / / +/ / / / +/ Beta Hemoliz + + Mannitol İndol Tanımlanan Listeria Türü L.grayi L.murrayi L.innocua L.grayi L.innocua L. monocytogenes L.innocua L.grayi L.murrayi L. monocytogenes 42

52 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-5 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + / + 1/2 F 24s / 1/1 F 48s Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat H 2 S Glikoz Laktoz ND + + ND ND ND ND Ksiloz Ramnoz ND ND ND ND + + ND ND ND Üre + + CAMP (Sa/Re) / / / / +/ +/ / / / / Beta Hemoliz + + Mannitol + İndol Tanımlanan Listeria Türü L.welshimeri L.innocua L.innocua L.welshimeri L. monocytogenes L. monocytogenes L.innocua L.innocua L.innocua L.grayi 43

53 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-6 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme +/ + / + +/ + +/ + +/ + +/ + / + +/ + +/ + +/ + 1/2 F 24s / 1/1 F 48s Gram Boyama Morfolojisi KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ KÇ Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat H 2 S Glikoz Laktoz + ND ND + ND ND ND + + ND Ksiloz Ramnoz ND ND ND + + ND ND + Üre CAMP (Sa/Re) / / / / +/ +/ / / / +/ Beta Hemoliz Mannitol + + İndol Tanımlanan Listeria Türü L.innocua L.grayi L.welshimeri L.innocua L. monocytogenes L. monocytogenes L.grayi L.innocua L.innocua L. monocytogenes 44

54 Tablo 4.2. İdentifiye Edilen İzolatların Morfolojik ve Biyokimyasal Test Sonuçları-7 Numune no: PALCAM Agarda Üreme 1/2 F 24s / 1/1 F 48s +/ + +/ + +/ + +/ + Oxford Agarda Üreme +/ + +/ + +/ + +/ + 1/2 F 24s / 1/1 F 48s Gram Boyama Morfolojisi Ç Ç Ç Ç Spor Katalaz Oksidaz Hareket Testi (25C ) Metil Red Voges-Proskauer Nitrat + H 2 S Glikoz Laktoz + ND + + Ksiloz Ramnoz ND ND ND ND Üre CAMP (Sa/Re) / / / / Beta Hemoliz Mannitol İndol Tanımlanan Listeria Türü L.innocua L.murrayi L.innocua L.innocua ND: Not Determinete (-): Negatif Reaksiyon (+): Pozitif Reaksiyon; K.Ç.: Küçük Çomak; Sa: Staphylococcus aureus Re: Rhodococcus equi 45

55 İdentifikasyon çalışmalarında yapılan morfolojik ve biyokimyasal testlerden CAMP Testi Çalışma Petrisi Şekil 4.3 te verilmiştir. Şekil 4.3 CAMP Testi Çalışma Petrisi Hareket muayenesi amacıyla Semisolid Indol Motility Medium Mediuma (SIM) yapılan ekim sonrası görülen üreme Şekil 4.4 de, üre testindeki pozitif-negatif reaksiyonu Şekil 4.5 te verilmiştir. Şekil 4.4 Listeria Türlerinin SIM Mediumda Hareket Muayenesi 46

56 Şekil 4.5 Listeria Türlerinin Üre Testinde Pozitif-Negatif Reaksiyonu Kanlı Agar da üreyen 64 adet şüpheli Listeria spp. kolonilere uygulanan Microbact 12 L Listeria identifikasyon test kiti sonucunda 25 (%25) adet Listeria türü tespit edildi. Bu Listeria türlerinin 7 (%7) sinin L.monocytogenes, 10 (%10) unun L. innocua, 6 (%6) sının L. grayi, 1 (%1) inin L. murrayi ve 1 (%1) inin L. welshimeri olduğu tespit edildi. Microbact 12 L Listeria identifikasyon sistemi tür tayini sonuçları Tablo 4.3 te, Microbact 12 L Listeria identifikasyon test kitine göre tür dağılımı Şekil 4.6 da, Microbact 12 L Listeria identifikasyon test kiti reaksiyon sonuçları Tablo 4.4 de verilmiştir. 47