ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Atilla ÖZ YERLİ SIĞIR IRKLARINDA MYOSTATİN GEN POLİMORFİZMİNİN ARAŞTIRILMASI BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ YERLİ SIĞIR IRKLARINDA MYOSTATİN GEN POLİMORFİZMİNİN ARAŞTIRILMASI Atilla ÖZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Numan ÖZCAN Yıl : 2009, Sayfa: 64 Jüri : Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN Belçika Mavisi ve Piedmontese gibi ırklarında bulunduğu bazı etçi sığır ırklarında, II. kromozomda yer alan myostatin geninin III. ekzon (kodlama yapan) bölgesindeki 821. nükleotidden itibaren oluşan 11 bazlık delesyon (del11 mutasyonu) (Belçika Mavisi nde) ve ve yine III.ekzon bölgesinde bulunan 938. nükleotidindeki G A transversiyon nokta mutasyonu (Piedmontese de), bu gende mh dominant allelinin oluşmasına ve çift kaslılık denilen %20 et artışı ile yağlanmada %50 azalmalara neden olmaktadır. Bu çalışmada Türkiye deki bütün yerli ırklara ait myostatin geninin ekzon III bölgesi nt821del11 ve G A transversiyon mutasyonu bakımından karakterize edilmiştir. Bulgularda myostatin genine ait ekzon III bölgesinde herhangi bir nt821del11 ve G A mutasyonuna rastlanılmamıştır. Anahtar kelimeler: Çift kaslılık, Myostatin, Türkiye yerli sığır ırkları, Belçika Mavi, Piedmontese sığırı I

3 ABSTRACT MSc THESIS INVESTIGATION OF MYOSTATIN GENE POLYMORPHISM IN NATIVE CATTLE BREEDS Atilla ÖZ DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof.Dr. Numan ÖZCAN Year : 2009, Page: 64 Jury : Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Assist.Prof.Dr. B. Devrim ÖZCAN In some beef cattle breeds such as Belgium Blue and Piedmontese, exon III region of myostatin gene of chromosome II is mutated (del11 mutation at 821 nucleotid position for Belgium Blue, G A transversion at 938 nucleotid position for Piedmontese) to produce mh dominant allel there by increasing meat yield up to 20% and reducing carcass fat amount up to 50%. Turkish native cattle breeds DNA samples obtained from peripheral bloods were screened for exon III of myostatin gene for nt821(del11) frame shift mutation and nt938(g A) transversion mutation. The results revealed the non-existance of such mutations in Turkish native cattle breeds. Key words: Double muscling, Myostatin, Turkish native cattle breeds, Belgium Blue, Piedmontese II

4 TEŞEKKÜR Öncelikle yüksek lisans aşamamdan itibaren emeklerini ve özverilerini esirgemeyen, felsefi görüşleriyle beni her konuda aydınlatan, bilimsel felsefeyi bana öğreten sayın hocam Prof.Dr. Numan ÖZCAN a sonsuz teşekkürlerimi arz ederim. Eleştirileri ve değerli görüşleri ile tezimin şekillenmesine yapmış oldukları katkıdan dolayı tez jüri üyelerim sayın Prof.Dr. Burhan ARIKAN ve sayın Yrd.Doç.Dr. Bahri Devrim ÖZCAN hocalarıma teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans eğitimimden itibaren, laboratuar çalışmalarımda değerli yardımları ve özverileri ile bana destek olan Ç.Ü. Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji A.B.D. öğretim üyesi sayın Dr. Ali İrfan GÜZEL hocama teşekkürlerimi sunarım. Laboratuar çalışmalarımda desteklerini her zaman hissetiğim değerli arkadaşlarım Ali COŞKUN a ve Arş.Gör. Selçuk ULUSOY a teşekkür ederim. Desteğini benden esirgemeyen ve tanımaktan büyük mutluluk duyduğum değerli arkadaşım Volkan Vural TAŞ a teşekkür ederim. DNA dizi analizlerini değerlendirme aşamasında özverili katkılarından dolayı sayın Doç.Dr. Fahriye ERTUĞRUL a ve Arş.Gör. Ayşen YUMURTACI ya (TÜBİTAK-MAM) teşekkürlerimi sunarım. Oğulları olmaktan gurur duyduğum, haklarını hiçbir zaman ödeyemeyeceğim annem ve babam Saadet-Mustafa ÖZ e ve her konuda desteğini benden esirgemeyen ağabeyim Op.Dr. Kürşat ÖZ e ve değerli eşi Dr. Yeliz ÖZ e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

5 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ......I ABSTRACT.....II TEŞEKKÜR....III İÇİNDEKİLER.....IV ŞEKİLLER DİZİNİ....VI ÇİZELGELER DİZİNİ....VII RESİMLER DİZİNİ.VIII SİMGELER VE KISALTMALAR IX 1. GİRİŞ Çift Kaslılığın Doğası Çift Kaslılığın( Double- Muscling ) Genetiği Çift Kaslılığın( Double- Muscling ) Fizyolojisi Çift Kaslılığın( Double- Muscling) Karkas Özellikleri Transforming Growth Faktör-B ( TGF-B ) Myostatin (MSTN, GDF-8 ) Çalışmanın Amacı ve Kapsamı ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Myostatin Geni Polimorfizmi İle İlgili Sığırlarda Yapılan Çalışmalar Myostatin Geni Polimorfizmi İle İlgili Diğer Irklarda Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal DNA Materyali Kullanılan Aletler ve Diğer Malzemeler Kimyasal Maddeler Yöntem Genomik DNA izolasyonu...27 IV

6 Myostatin Gen Bölgesinin Çoğaltılması için Uygun Primerlerin Seçimi Myostatin Gen Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması PCR Ürününün Elektroforezi PCR Ürününün Uygun Restriksiyon Endonükleaz Enzimi İle Kesimi (PCR-RFLP) Myostatin Geni Ekzon-3 Bölgesinde RFLP RFLP Elektroforez Çalışmaları Jel Dökümantasyon Çalışmaları Myostatin Geni Ekzon-3 Bölgesi İçinde nt821(del11) ve nt938(g A) Polimorfizm Bölgelerine ait DNA Dizi Analizi İstatistiksel Analiz Hardy-Weinberg Denge Prensibine Göre Denge Analizi BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Myostatin Geni Nt821del11 Polimorfizminin Araştırılması Nt821del11 bölgesinin PCR ile Çoğaltılması Nt821del11 Polimorfizminin RFLP ile Doğrulanması Myostatin Geni Nt938G A Polimorfizminin Araştırılması Nt938G A Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması Nt938G A Polimorfizminin RFLP ile Belirlenmesi Myostatin Geni Ekzon-3 Bölgesi İçinde nt821del11 ve nt938g A Polimorfizm Bölgelerine ait RFLP çalışmasının DNA Dizi Analizi İle Doğrulanması Popülasyonların İstatistiki Bakımdan Analizi Tartışma SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER...58 V

7 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. TGF-b nin aktivasyonu..8 Şekil 1.2. Sığır myostatin geninin amino asit yapısı bakımından farklı türlerle karşılaştırılması. 10 Şekil 1.3. Holstein-Belçika Mavi, Holstein-Piedmontese sığır ırklarının myostatin geni ekzon-3 bölgesinin Southern Blot yöntemi kullanılarak karşılaştırılması..12 Şekil 2.1. Myostatin geni ekzon-3 PCR ürünlerinin oligonükleotid problar kullanılarak Southern Blot analizleri ile mutant Belçika Mavi,Piedmontese ve mutanat olmayan onaltı Avrupa sığır ırkının karşılaştırılması..16 Şekil 3.1. Bos taurus myostatin geni ekzon-3 DNA dizisi.28 Şekil 3.2. Myostatin geni ve 141 bp lik DNA fragmenti..33 Şekil 3.3. Nt 821del11 normal allel Şekil 3.4. Nt821del11 mutant allel Şekil 3.5. Myostatin geni ve124 bç lik DNA fragmenti Şekil 3.6. Nt938 G A Normal allel Şekil 3.7. Nt938 G A Mutant allel...34 Şekil 4.1. Nt821del11 polimorfizminin %3 lük Agaroz jelde tespiti.39 VI

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Kanların toplandığı merkezler 26 Çizelge 3.2. Çalışamada kullanılan primerler.28 Çizelge 3.3. PCR bileşenleri ve reaksiyonda kullanılacak optimum miktarları. 29 Çizelge 3.4. PCR sıcaklıkları...30 Çizelge 3.5. Kesim reaksiyonunda kullanılan bileşenler ve miktarları..31 Çizelge 3.6. Poliakrilamid jel bileşenleri...35 Çizelge 4.1. Irklara göre Nt821del11genotiplerinin dağılımı. 41 Çizelge 4.2. Irklara göre nt938g A genotiplerinin dağılımı VII

9 RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 1.1. Çift kaslı sığırlarda kas hipertrofisi ve iskelet hipotrofisinin yönelimi..7 Resim 1.2. Myostatin geninin aktivasyonu ve Myogenesis...9 Resim 1.3. Nt 821del11 ve nt 938G A mutasyonunun avrupadaki sığırlarda dağılışı...13 Resim 1.4. Çift kaslı Belçika Mavisi, çift kaslı fare ve normal fare görünümü.13 Resim 1.5. Normal(mh+/+) ve çift kaslı (mh+/-, mh-/-) alleline sahip sığır etleri.13 Resim 3.1. Myostatin geni ekzon-3 bölgesi restriksiyon haritası...32 Resim 3.2. %3 lük Agaroz jelde 141 ve 124 bç lik PCR ürünlerinin görüntüsü...36 Resim 4.1. Bazı yerli ırkların nt821del11 polimorfizminin %3 lük Agaroz Jelde görüntüleri Resim 4.2 Bazı yerli ırkların nt821del11 polimorfik bölgeye ait NmuCI/RFLP polimorfizm sonuçlarının %15 PAGE de görüntüsü Resim 4.3 Bazı yerli ırkların nt938g A polimorfik bölgeye ait FokI/RFLP polimorfizm sonuçlarının %15 lik PAGE jelde görüntüsü.42 Resim 4.4. Ekzon bölgesinin %1 lik agaroz jel görüntüsü...44 Resim 4.5. DNA dizi analizi sonuçları...45 VIII

10 SİMGELER VE KISALTMALAR APS : Amonyum persülfat (Amonium persulfat) BI : Boz Irk bç : Baz çifti cdna : Komplementer DNA (Complementary DNA) cm : Santimetre Ç.Ü : Çukurova Üniversitesi DAK : Doğu Anadolu Kırmızısı DM : Double Muscling DNA : Deoksiribonükleik asit dntp : Deoksinükleotid trifosfat EDTA : Etilendiamintetraasetik asit (Ethylenediaminetetraacetic acid) EtBr : Etidyum Bromid (Ethydium Bromide) FAO : Dünya Gıda ve Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organization) g : Gram GDF-8 : Büyüme ve Farklılaşma Faktörü-8 (Growth Differention Factor- 8) GH : Büyüme Hormonu (Growth Hormone) HWE : Hardy-Weinberg Dengesi (Hardy-Weinberg Equilibrium) IGF-I : İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü (Insulin-Like Growth Factor) IU : Uluslararası Birim (International Unit) kb : Kilo baz Ki : Kilis Irkı M : Molar ma : MiliAmper mg : Miligram μg : Mikrogram μl : Mikrolitre ml : Mililitre mm : Mili Molar Mh : Kas artışı (Musclus Hipertrofi) lokusu MSTN : Myostatin (Çift kaslılık) IX

11 Myostatin: Çift kaslılılık geni N : Normal NaCl : Sodyum Klorür NCBI :Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (National Center for Biotechnology Information) ng : Nanogram PAGE : Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Polyacrilamide Gel Electrophresis) PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) pmol : Pikomol QTL : Kantitatif Özellik Lokusları (Quantitative Trait Locus) RE :Restriksiyon Endonükleaz (Restriction Endonuclease) RFLP :Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmleri(Restriction Fragment Lenght Polymorphism) rpm : Bir dakikadaki rotor devir sayısı (Rotor Per Minute) SA : Siyah Alaca SDS : Sodyum dedoksisülfat SNP :Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotid Polymorphism) SSCP : Tek Zincir Yapısal Polimorfizm (Single Stranded Conformation Polymorphism) TEMED :N, N, N, N -Tetrametiletilendiamin (N, N, N, N -Tetramethylethylenediamine) TGF-b Transforming Growth Factor- beta Tris : Tris (Tris(hydroxymetyl)aminomethane) UV : Ultra Viyole (Ultra viole) V : Volt YK : Yerli Kara YS : Yerli Sarı X

12 1. GİRİŞ Atilla ÖZ 1. GİRİŞ 1.1. Çift Kaslılığın Doğası Çift kaslılığın ( Double-Muscling ) Genetiği Çift kaslılık sığırlarda ilk olarak Culley (1807), tarafından kanıtlanmış olup Kaiser (1888), tarafından ayrıntılı bir şekilde tanımlanmıştır. Çift kaslılık günümüzde bir çok sığır türünde gözlenmiştir. Ama gerçekte çift kaslılık uzun zamandan beri var olup kalıtsal yapısı hala kesin olarak bilinmemektedir. 80 yıl önce Wriedt (1929), yılında çift kaslılığın durumunun genetik belirleyici olarak tek bir genden kaynaklandığını öne sürdü. Arthur un (1995) bildirdiğine göre, Kronacher (1934), bu öneriyi değiştirerek trihibrit (üç gen) modelini önerdi ve bu model vasıtasıyla iki genin özelliğin ve kısmen de değişkenliğin kontrolünü sağladığını, üçüncü genin ise özelliğin baskılanmasından yada ifadesinden (expresyonu) sorumlu olduğunu belirtmiştir. Sõpena Quesada ve Blanco Cachafeiro (1971), dört fenotipik sınıf içerisindeki dokuz muhtemel genotipin belirlenmesiyle dihibrit (iki gene) model önerildi. Mevcut bilgilere göre bir çok araştırmacını üzerinde uzlaştığı görüş single otozomal major bir gen sendromun kalıtımından sorumludur. (Oliver ve Cartwright,1968; Logeay ve Vissac, 1970; Rollins ve ark, 1972; Hanset ve Michaux, 1985a, 1985b: Arthur, 1995 den). Çiftlik hayvanlarındaki bazı özelliklerin ekspresyonundan tek bir major genin sorumlu olduğu kanıtı mevcut literatür çalışmalarıdır. Bu hayvanlarda tanımlanmış major genler arasında dikkate değer bir gende koyunda ovulasyon oranını arttıran Booroola genidir (Piper ve ark, 1985: Arthur, 1995 den), Domuz için stres sendromuna neden olan major gen domuz etinin cıvımasına solmasına neden olmaktadır (Rempel ve ark, 1993 : Arthur, 1995 den). Çıplak boyunluluk geni ve kıvırcık tüylülük geni tropikal kümes hayvanlarının sıcaklılığa dirençliliği ile ilişkilendirilmiştir (Horst ve Mathur, 1990: Arthur, 1995 den). 1

13 1. GİRİŞ Atilla ÖZ Çift kaslılık sendromu kalıtımı üzerine ortak görüş single major gen modeli benimsenmiş olmakla birlikte bu genin etki mekanizması üzerinde farklı görüşler vardır. Bazı araştırmacılar (Wriedt, 1929; Raimondi, 1963; Logeay ve Vissac, 1970 Arthur, 1995 den). Bazı araştırmacılar çift kaslılık geninin dominant bir karakter sergilediğini ifade etmekte, bazıları ise resesif etki gösterdiğine inanmaktadırlar (Kieffer ve ark, 1972; Rollins ve ark, 1972; Hanset ve Michaux, 1985a, 1985b: Arthur, 1995 den). Çift kaslılığın etki mekanizmasına ilişkin alternatif diğer görüşler kısmi dominanslık, eksik resesiflik, tam olamayan etkililik ve gen değiştiriciler mevcuttur. Çift kaslılık allel ve normal allel için (double muscled/ normal) c/n, C/N, A/a, D/n, DM/dm, m/+ ve mh/+ gibi farklı semboller kullanılmıştır. Çift kaslı sığır ve normal sığırın melezlenmesi sonucu oluşan melez döller crossbred (melez), intermediate (orta, ara), semi double muscled (yarı çift kaslı) ve heterozigot gibi farklı isimlerle adlandırılmıştır. Çift kaslılık üzerine yapılan çalışmalar bir süredir çift kaslı sığır ile normal sığır ile yapılan melezleme çalışmalarını kapsamaktadır. Ebeveynler aynı veya farkı cinsten oluşsa bile çift kaslı ve normal sığır ile yapılan melezleme çalışmaları sonucunda melez yada çift kaslı melez sığır olarak meydana gelen döller incelenmiştir. Birçok araştırmacı çift kaslılığın oluşumundaki değişiklikleri rapor etmiştir. Son yıllarda normal (N) ve double muscled (DM) sığırlarının resiprokal çaprazlanması sonucu döllerin çift kaslılık karakter oranını DMxDM %86, DMxN %42, NxDM %49 ve NxN %24 olarak rapor etmişlerdir. Arthur ve ark (1989), göre aynı çaprazlamalara karşılık gelen oranları sırasıyla %77, % 45, %47 ve %4 olarak rapor edilmiştir. Bu yüzden DMxN ve NxDM sığırların çiftleştirmeleri sonucu oluşan döllerin karakterleri normal kaslanmadan aşırı yoğun kaslanmaya doğru korunurken DMxDM çiftleştirilmesiyle oluşan döllerin bazıları genellikle sendromun herhangi bir karakteristiği göstermemiştir. Benzer hayvanların yaşamları boyunca çift kaslılık karakterlerinin ifadesi de benzerdir (Hanset ve Michaux, 1985b: Arthur,1995 den). Bazı araştırmacılar çift kaslılığın fetus oluşumuyla birlikte meydana gelmeye başlayabileceğini ifade etmektedirler. Bazı araştırmacılar da 2

14 1. GİRİŞ Atilla ÖZ doğumdan birkaç hafta sonraki dönemde oluştuğu görüşündedirler. Çift kaslılığın etki mekanizması aynı zamanda beslenmeye ve cinsiyete de bağlıdır. Çift kaslı hayvanların tanımlanması genellikle kas kütlesinin derecesine bağlı olarak yapılmaktadır. Çift kaslılık için yapılan kas değerlendirilmesi, kas arasındaki olukların varlığına, leğen kemiğinin eğimi ve bu kemiğe bağlı diğer parçaların durumu gibi diğer karakteristik özelliklerin varlığına bakılarak değerlendirilir. Soy ağacı kayıtları geçerli uygulanabilir bir değerlendirme olarak da kullanılmaktadır. Soy ağacı kayıtlarına bağlı değerlendirme için verilerin kayıtlı olduğu defterler, belirgin karakteristik özelliklerin toplanarak skorlanması ya da bazı karkas özelliklerinin kombinasyonu ve bazı biyokimyasal ölçümler gibi yarı objektif olan skorlama sistemleri geliştirilmiştir. Yarı objektif metotlar ile tanımlama ancak karakteristik verileri aşırı olan normal ve çift kaslı hayvanlar için kullanılabilmektedir. Bu yüzden genin etki mekanizmasındaki çeşitlilik ve geni taşıyan sığırların tanımlanmasındaki biyolojik metotların eksikliği bu genin aktif yapısının tanımlanmasında yetersiz kalmaktadır. Bundan dolayı çift kaslılığın tanımlanması için ihtiyaç duyulan biyolojik metotların geliştirilmesi üzerine yoğun çalışmalar yapılamamıştır. Domuz stres sendromunun kalıtsal koşulları ile karakteristik özellikleri sığırlardaki çift kaslılık benzer özellikler göstermektedir. Domuzda meydana gelen bu sendrom halothan denilen anestezik olarak kullanılan bir kimyasal renksiz bir sıvıya duyarlılık göstermektedir. Bu yüzden domuzları taşımış oldukları gen kolay bir şekilde tanımlanabilmektedir (Rempel ve ark, 1993: Arthur, 1995 den). Ne yazık ki halothane olan duyarlılık testi sığırlar için geçerli değildir. Sığırlardaki çift kaslılık genini tanımlamaya yönelik biyolojik test geliştirme çabaları yapılmasına karşın şimdiye dek hiçbir metottan sonuç alınmamıştır. Bu biyolojik metotlar çift kaslı sığırlar ile normal sığılar arasındaki kas liflerinin yapısı, kasların motor sinirleri, kan içindeki tyroid hormon konsantrasyonu ve seratoin hormon konsantrasyonundaki farklılıklara dayanmaktadır. 3

15 1. GİRİŞ Atilla ÖZ Çift kaslılığın ( Double-Muscling ) Fizyolojisi Çift kaslı sığırların kasların büyümesinin nedeni aşırı kas liflerinin artmasıdır. Dahası bu artış normal sığırın kaslanmasına göre daha fazla olmaktadır (Hanset ve ark, 1982). Kaslanmadaki bu göreceli artış gebeliğin erken safhasında gözlenmiştir. Sonuç olarak çift kaslı olarak doğan sığır normal bir sığıra oranla yaklaşık iki kat daha kaslı olarak meydana gelmektedir (Gerrard ve ark, 1991). Çift kaslı sığırlar yüksek bir oranda beyaz kas liflerine sahip (West, 1974), olup bu lifler yüksek oranda aksonların uç kısımlarında artış göstermektedir (Swatland 1973; Novakofski ve ark, 1981: Arthur, 1995 den). Çift kaslı sığırların kas içeriğinde kollajen (bağ dokunun ana maddesini oluşturan albuminoid protein) miktarı düşüktür (Boccard, 1982; Uytterhaegen ve ark, 1994: Arthur, 1995 den). Kas içindeki kollojen miktarının bir kriter olarak kullanılabileceğini ve çift kaslı sığırların normal sığırlara göre hidroksiprolini %20 - %30 oranında indirgediğini rapor etmişlerdir (Hanset ve ark,1982: Arthur, 1995 den). Çift kaslı sığırların etindeki kollajeni düşük bir oranda çapraz bağlar içerir (Bailey ve ark, 1982: Arthur, 1995 den). Çift kaslı sığır ile normal sığır arasındaki yapısal farklılıkların bağ doku ile sınırlı olmadığı açıkça gözükmektedir. Fakat çift kaslı sığırlarda zar tahribatı mevcuttur (King ve ark, 1976: Arthur, 1995 den). Öte yandan çift kaslı sığırlar normal sığırlara göre alyuvarlar içindeki osmotik kırılganlığın artışı ve kas içindeki sodyum/potasyum oranındaki artış bunu kanıtlamıştır (King ve ark, 1976; Basarab ve ark, 1980: Arthur, 1995 den) Çift kaslı sığır ile normal sığırın karşılaştırılması ile dolaşım sistemindeki çeşitli hormonların seviyelerinde farklılıklar bulunmuştur (Lawrie ve ark, 1964: Arthur, 1995 den). Bu hormonlar arasında dikkate değer olarak growth hormon seviyesi (DM>N) ve insülin seviyesi (DM<N) olarak bulunmuştur (Michaux ve ark, 1982; Arthur ve ark, 1990: Arthur, 1995 den). Ayrıca bunlara ilaveten serum içindeki tridothyronin ve thyroxine seviyelerinde de farklılıklar rapor edilmiştir. Diğer yandan çift kaslılık (double muscled) ve normal sığırlar arasında fizyolojik farklılıklar tespit edilmiştir. Bu fizyolojik farklılıklar serum içerisindeki kreatin (creatine) ve kreatinin (creatinine) konsantrasyon farklılıkları (Hanset ve Michaux 1982; Masoero, 1982: Arthur, 4

16 1. GİRİŞ Atilla ÖZ 1995 den), plazma içerisindeki lipoprotein ve eritrosit glikoliziz konsantrasyon farklılıkları (Basarab ve ark, 1982a, 1992b: Arthur, 1995 den) ve kas içindeki IGF-II mrna konsantrasyonundaki farklıklar tespit edilmiştir (Gerrard ve ark, 1991: Arthur, 1995 den). Çalışmalar çift kaslı sığırların güç kullanmaları sırasında normal sığırlara göre daha çabuk fiziksel güç kaybı yaşadıklarını ortaya koymuştur (Holmes ve ark, 1973: Arthur, 1995 den ). Yorgunluğa neden olan faktörler arasında metabolik asidoza bağlı olarak kan dolaşımının azalmasına (düşük kan hacmi ve düşük hematokrit miktarı) neden olmakla birlikte bir taraftan oksijen taşınım azalması ve diğer yandan çift kaslı sığırların kas hücrelerindeki oksijenli solunum aktivitesinin azalması olarak açıklamıştır ( Mènissier, 1982a: Arthur, 1995 den). Sıcaklık stresi esnasında çift kaslı sığırların rektal ısıları normal sığırlar göre daha hızlı bir şekilde artış göstermektedir (Halipre, 1973; Strath ve ark, 1980: Arthur, 1995 den). Çift kaslı sığırların aşırı kaslanmaları sonucunda anormal yada aşırı ısı üretimiyle sıcaklık stresi ortaya çıkmakta beraberinde sıcaklık stresi ile oluşan ısı kaybını azaltmaktadır. Kapasite düşüklüğü (solunum kapasitesi düşmekte) oluşmaktadır. Ayrıca çift kaslı sığırlarda aç kalma stresi de rapor edilmiştir (Strath ve ark, 1980: Arthur, 1995 den). Açlık stresleri sonucunda çift kaslı boğaların normal boğalara göre kortisol ve kandaki üre seviyeleri yüksek olarak gözlenmiştir. Çift kaslı sığırlar ile normal sığırlar arasında bir takım fizyolojik ve biyokimyasal farklılıklar bulunmasına rağmen hala test edilmemiş durumlar vardır. Temel değişkenlerin çift kaslılık sendromundan sorumlu olduğu bilinmemekle birlikte çift kaslılık sendromunun değişkenlerini farklılık gösterilebileceğine inanılmaktadır Çift Kaslılığın ( Double-Muscling ) Karkas Özellikleri Çift kaslı sığırlar normal sığırlar ile karşılaştırıldığında birçok karkas özelliklerine sahiptir. Bu özellikler genellikle kas hipertrofisi, kasların olgunluğu, yağ birikmesinde düşük potansiyel ve küçük sindirim kanallarının olmasından kaynaklanmaktadır. Bugüne kadar yayınların büyük bir kısmında çift kaslılık karkaslarının yüksek oranda kaslanması, düşük seviyede yağ oluşumu ve karkasta 5

17 1. GİRİŞ Atilla ÖZ yer alan kemiklerden kaynaklandığını belirtmişlerdir (Oliver ve Cartwright, 1968; West, 1974; Kauffman ve ark, 1976; Dumont, 1982; Geay ve ark, 1982; Arthur ve ark. 1982: Arthur, 1995 den). Thiessen (1974), %30 a kadar olan kas artışını şu şekilde açıklamıştır: Çift kaslı sığırların karkaslarındaki kemik oranı ve çift kaslı hayvanlardaki vücut yapılarının anatomisi vücudun her tarafında aynı değildir. Çift kaslı sığırlar ile normal sığırlar karşılaştırıldığında yüksek hipertrofili, hipertrofili, ve hipotrofili olmak üzere 3 ayrı bölge bulunmaktadır (Boccard ve Dumont, 1974; Johnson, 1981; Dumont, 1982; Shahin ve Berg 1985: Arthur, 1995 den). Omurga bölgesinde yer alan kas hipertrofisinin hemen ardından boyun çevresinde önden arkaya doğru gelen eğim ile devam etmektedir. Kas hipertrofisi arka bölgelerden ziyade ön bölgelerde gözlenmektedir (Vissac, 1968; Boccard ve Dumont, 1974; Dumont, 1982: Arthur, 1995 den). Kas hipertrofisi aynı zamanda çevresel kasları da etkilemekte ve bunun sonucunda geniş bir yüz şeklini ortaya çıkarmaktadır (Boccard ve Dumont, 1974; Johnson, 1981: Arthur, 1995 den). Başka bir açıdan ise kas hipertrofisi distoproximal eğim ile de sonuçlanmakta ve ön kol ve bacak bölgelerinde bu seviye maksimuma çıkmaktadır (Butterfield, 1966; Hanset ve Ansay 1972; Shahin ve Berg 1985b: Arthur, 1995 den). Aynı yönelime bağlı olarak bacak kemikleri de bu düşüş için incelenmiştir (Vissac, 1968; Hanset ve Ansay, 1972; Shahin ve Berg, 1985: Arthur, 1995 dan). Çift kaslı sığırlardaki kas hipertrofisinin genel eğimi ve iskelet hipotrofisi Resim 1.1. de gösterilmiştir. Uzun kemiklerin büyüklüğü ve şeklindeki morfolojik farklılıklar çift kaslı sığırlar ile normal sığırlar arasında daha önce gösterilmiştir. Wriedt (1929), çift kaslı sığırların bacak kemiklerinin daha kısa ve yoğunluğunun azalmış olduğunu belirtmiştir. Arthur (1995), bildirdiğine göre, Vissac (1968), çift kaslı sığırların uzun kemiklerinin bağlantı yerlerinin daha ince olduğunu bunun yanında daha fazla epifize sahip olduğunu bildirmiştir. Hendricks ve ark (1973), yılında hafif ve kısa kemiklerin daha ince böbrek üstü zarları olduğunu rapor etmiştir. 6

18 1. GİRİŞ Atilla ÖZ Resim 1.1. Çift kaslı sığırlarda kas hipertrofisi ve iskelet hipotrofisinin yönelimini, kas hipertrofisinin artmasını göstermektedir > kol ve bacak kemiklerinin hipotrofisinin artmasını göstermektedir. (Vissac, 1968 : Arthur, 1995 den) Öne doğru çıkıntı oluşumu kaslanmanın aşırı gelişiminden kaynaklanmaktadır, bunun yanında diğer analizler yağ dokularının daha az gelişimi çift kaslı hayvanlarda daha önemli olduğunu göstermektedir (Dumont, 1982; Shahin ve Berg, 1985d: Arthur, 1995 den ). Bailey ve ark (1982), yapılan bir çalışmada ise yağ dokularının az gelişiminin yağ hücreleri hacimlerinin azalmasından kaynaklandığını belirtmiştir. İlk olarak çift kaslanmanın myostatin geninden kaynaklandığını göstermek amacıyla normal tip myostatin geni tarafından iskelet kası büyümesini, negatif yönde düzenleyici etkisini ilk defa farelerde tespit ederek, myostain geninin TGF-B ailesinin bir üyesi olduğunu tanımlamışlardır. (McPherron ve ark, 1997a). 7

19 1. GİRİŞ Atilla ÖZ 1.2.Transforming Growth Faktör-B ( TGF B ) Biyolojik fonksiyonlarına bakılarak GF (Growth Factor) ler geniş bir protein ailesidir.bunlar genellikle amino asit sekanslarına ve tersiyer yapılarına bakılarak gruplandırılır. GF lerin bir alt grubu da TGF-b (Transforming Growth Factor-b) ailesidir. TGF-b ler hücrelerden inaktif kompleks bir form da salgılanır. Buna karşın bu kompleks form parçalanıncaya kadar çok az miktarda veya hiçbir biyolojik aktivite göstermezler. TGF-b lerin ortak bir özelliği ise diğer büyüme faktörlerinin varlığında biyolojik aktiviteleri ortaya çıkmaktadır. Bu da hedef hücrelerin fizyolojik durumlarına ve diğer büyüme faktörlerinin varlığına bağlıdır (Volk, 2004). TGF-b lerin yapısına bağlı olarak bir çok alt türü vardır. Bunlardan bir tanesi GDF (Growth and Differentiation Factor) dir. GDF büyüme ve farklılaşmada düzenleyici rol oynamaktadır. GDF nin alt türü olan GDF-8 Myostatin olarak ta bilinmektedir. GDF-8 iskelet kası proteini olup farelerde ve sığırlarda çift kaslılığa neden olmaktadır (McPherron ve ark, 1997a). TGF-b hücrelerden inaktif kompleks bir formda salgılanırlar. Daha sonra kendi reseptörleriyle birleşerek reseptör proteinleri aktif hale getirirler. Reseptör proteinler ortamda bulunan büyüme faktörlerini (smad-2 yi veya smad-3 ü) aktifleştirirler. Aktifleşen smad-2,smad-4 ile birleşerek ilgili hedef gen bölgesinde görev alırlar. Böylelikle TGF-b aktifleşmiş olur (Kawabata ve Miyazono, 1999). (Şekil 1.1) Şekil 1.1. TGF-b nin aktivasyonu (Anonymous, 2009a) 8

20 1. GİRİŞ Atilla ÖZ 1.3. Myostatin( GDF-8, MSTN ) GDF-8 (Growth Differentiation Factor-8) olarakta bilinen myostatin TGF-B (Transforming Growth Factor-B ) ailesinin bir üyesidir. İskelet kası büyümesinde ve farklılaşmasında rol oynamaktadır. Myostatin (GDF-8) geni sığırlarda 2. kromozomda yer almakta 3 ekzon ile 2 intron dan meydana gelmektedir (Bellinge ve ark., 2005). GDF-8 ailesi daha çok sığır türlerinde araştırılmıştır. Bu araştırmalardan en önemli ikisi Belçika Mavisi ve Piedmontese sığır türlerinde myostatin genini kodlayan sekanslarda meydana gelen mutasyonlar kas-kütle artışını sağlamış ve bu artış çift kaslılık olarak tanımlanmıştır (Grobet ve ark, 1997; Kambadur ve ark, 1997). Myostatin geninin inaktivasyonu sonucu çift kaslılık ortaya çıkmaktadır. Bu protein myogenesis in negatif düzenleyicisi olarakta rol oynamaktadır (Resim 1.2.) ( Kambadur ve ark, 1997 ). Resim 1.2. Myostatin geninin aktivasyonu ve Myogenesis (Anonymous, 2009b) Diğer türlerden myostatin genlerini klonlamak için cdna kütüphaneleri oluşturulmuş ve olgun molekülün aktif kısmını içeren, korunmuş C-terminal bölgesi içeren fare myostatin probu yardımıyla görüntülenmiştir. cdna klonları kullanılarak fare, sıçan, insan, maymun, sığır, domuz, koyun, tavuk, hindi ve zebra balıklarından 9

21 1. GİRİŞ Atilla ÖZ elde edilen myostatin amino asit sekanslarının belirlenmiştir (Şekil 1.2). Bütün bu sekanslar salgılama için sinyal sekansları içermekte ve bu bölgeyi RXXR proteolitik işlem bölgesi ( amino asitleri) ile bütün TGF-b aile üyelerinde bulunan C- terminal sistin kalıntılarını içeren bölge izlemektedir. Bu diziden görüldüğü üzere myostatin türler arasında yüksek derecede korunmuştur. Gerçekte fare, sıçan, insan, domuz, tavuk ve hindi myostatin sekansları C-terminal bölgelerinde % 100 benzer olup, maymun, sığır ve koyun myostatini ise olgun proteinde 1 den 3 e kadar amino asit farklılıkları içermektedir. Zebra balığında ise daha fazla fark bulunup bu bölgede diğer türlere göre %88 farklılık göstermektedir (McPherron ve Lee, 1997b). Şekil 1.2. Sığır myostatin geninin amino asit yapısı bakımından farklı türlerle karşılaştırılması (McPherron ve lee, 1997b). 10

22 1. GİRİŞ Atilla ÖZ McPherron ve Lee, (1997b) yaptıkları araştırmada Belçika Mavi sığırlarının myostatin genlerinde mutasyon olup olmadığını belirlemek amacıyla sığırlardan alınan kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu ve PCR ile 3. ekzonun taraması yapmışlardır. İlk olarak myostatin geninin çift kaslılığa neden olduğunu fareler üzerinde yaptıkları bir araştırmayla gösterdikten sonra Holstein ırklarını referans alarak bu bulguları doğal mutant olan Belçika Mavi sığırı ve Piedmontese sığır ırkları üzerinde göstermeyi amaçlamışlardır. Bu amaç doğrultusunda, Belçika mavisi sığırına ait myostatin geninin kodlama bölgesi olan 3. ekzon bölgesinin nükleotidlerin silinmesi haricinde Holstein sığırı ile benzerliğini ortaya koymuşlardır (Şekil 1.3). Bu 11 bazlık nükleotidin delesyon çerçeve kaymasına sebep olmakta ve bunun sonucunda protein, mutasyon yerinin 14 kodon aşağısında sonlanarak kesik uçlu protein haline geldiği tahmin etmektedirler. Belçika Mavi sığırında görülen 11 bç lik delesyonun önemsiz mutasyon olması beklenmektedir. Çünkü C-terminal bölgesinden sadece 7 amino asit sonra meydana gelmiş ve 102 amino asidin kaybolmasına sebep olmuştur. Southern Blot analizleri ile oligonükleotidlerin kullanılarak bu mutasyon incelenen 14 tane Belçika Mavi sığırının hepsinin her iki allelinde de bulunmuştur. Diğer yandan çift kaslılığın yüksek oranda görüldüğü bir başka sığır türü olan Piedmontese sığırlarınında sekans analizleri yapılmıştır. Piedmontese sığırları Holstein sekansı ile benzerlik göstermekte ve sadece 2 nükleotid değişikliği içerdiği tespit edilmiştir. Bunlardan ilki ekzon 1 de yer alan C A dönüşümü olup 94. amino asitte lösinin fenilalanine dönüşmesi ile sonuçlanmaktadır. İkincisi ise 3. ekzonda yer alan G A dönüşümüdür. Bu dönüşüm 313. amino asit bölgesinde sistinin tirozine dönüşmesine sebep olmaktadır (Şekil 1.3). Southern Blot analizler ile incelenen 10 Piedmontese sığırlarından 10 unda her iki allel bakımından mutasyon tespit edilmiştir (McPherron ve Lee, 1997b). 11