ÇUKUROVA ÜN VERS TES DOKTORA TEZ. Zeynep KOLÖREN CRYPTOSPOR D UM PARVUM DA TRANS ENT TRANSFORMASYON

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ DOKTORA TEZ Zeynep KOLÖREN CRYPTOSPOR D UM PARVUM DA TRANS ENT TRANSFORMASYON B YOLOJ ANAB L M DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ CRYPTOSPOR D UM PARVUM DA TRANS ENT TRANSFORMASYON Zeynep KOLÖREN DOKTORA TEZ B YOLOJ ANAB L M DALI Bu tez Tarihinde A a ıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirli i le Kabul Edilmi tir. mza... mza... mza... Prof.Dr. Sadık D NÇER Doç. Dr. Soner KOLTA Doç Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ DANI MAN ÜYE ÜYE mza... mza... Doç. Dr. Gökhan CORAL Doç. Dr. M. Nisa ÜNALDI CORAL ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmı tır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu çalı ma Ç.Ü. Bilimsel Ara tırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmi tir. Proje No: FEF2005D6 Not : Bu tezde kullanılan özgün ve ba ka kaynaktan yapılan bildiri lerin, çizelge, ekil ve foto rafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA CRYPTOSPOR D UM PARVUM DA TRANS ENT TRANSFORMASYON Zeynep KOLÖREN ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ B YOLOJ ANAB L M DALI Danı man : Prof. Dr. Sadık D NÇER Yıl :2007, Sayfa : 158 Jüri : Doç. Dr. Soner KOLTA Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Doç. Dr. Gökhan CORAL Doç. Dr. M. Nisa ÜNALDI CORAL Bu çalı manın amacı Cryptosporidium parvum için genetik transformasyon sistemini (transient transformasyon) kurmaktır. Genetik transformasyon gen fonksiyonlarını analiz etmek için gerekli olup, C. parvum genleri ile henüz böyle bir analiz gerçekle tirilmemi tir. Bu amaç do rultusunda C. parvum un ribosomal protein genlerini ( BX segment 2/4 L11 protein genleri üzerinde baz dizisi) ta ıyan Crypto-construct GFP plazmidinin, C. parvum sporozoitlerine transformasyonu elektroporasyon ve lipofektamin yöntemleri kullanılarak yapılmı tır. Hücre kültürlerinde elde edilen transformantlar invert floresan mikroskop ve revers- transkriptaz PCR ile do rulanmı tır. Transformasyon ve elektroporasyon ko ullarını optimize etmek için Crypto construct GFP vektörün yanı sıra pcmv-dsred, peyfp-mem ekspresyon vektörleri de kullanılmı tır. C. parvum sporozoitlerini açı a çıkarmak için kullanılan eksistasyon ko ulları içinde ookistlerin % 80 oranında Taurocholic acid /cytomix:rpmi-1640 (1:1) besi ortamında existe oldu u gözlenmi tir. Bu ortam içerisinde bir elektrik akımı verilerek elektropore edilen sporozoitlerin HCT-8 hücre kültürlerini daha iyi infekte etti i belirlenmi tir. Hem elektroporasyon hem de lipofektamin yöntemiyle pcmv- DsRed ve peyfp-mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerine transfeksiyonu sa lanmı tır. Elektroporatörün 180 V, kapasitans 250 µf, resistans yok eklinde ayarlandı ı ko ullar altında pcmv-dsred ve peyfp-mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenirken, elektroporatörün 1000 V, 50 µf, 50 eklinde ayarlandı ı ko ullarda bu vektörlerin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenememi tir. Her iki elektroporasyon ko ulları altında Crypto construct GFP Vektörün transfeksiyonu sonucunda floresan mikroskop altında gözle görülebilir ekspresyon elde edilememi tir. Yapılan RT-PCR ve Nested PCR ile az olan GFP mrna ekspresyonu gözlenmi tir. Anahtar Kelimeler: Cryptosporidium, Hücre Kültürü, Elektroporasyon, Lipofektamin, Real time PCR I

4 ABSTRACT PhD THESIS TRANSIENT TRANSFORMATION OF CRYPTOSPORIDIUM PARVUM Zeynep KOLÖREN DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATUREL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisior: Prof. Dr. Sadık D NÇER Year: 2007, Pages : 158 Jury : Assoc. Prof. Dr. Soner KOLTA Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Assoc. Prof. Dr. Gökhan CORAL Assoc. Prof. Dr. M. Nisa ÜNALDI CORAL The goal of the present research is to develop a genetic transformation system for Cryptosporidium parvum. Genetic transformation is an essential tool for analyizing gene function and regulation, but it is not avaliable for C. parvum. Establish a transient transformasyon system for C. parvum, electroporetic transformation of sporozoites with plasmids carrying C. parvum intergenic regions flanking a reporter ( Prot L11 on BX segment 2/4, between bp ); detection of transformants in cell culture by fluorescent microscopy or reverse transcription PCR. In this study, transformation efficiency was optimized by testing different plasmid constructs (pcmv-dsred and peyfp-mem expression vectors) and electroporation conditions It was showed that all of the using excystation condition, TA/cytomix:RPMI-1640media (1:1) was the best condition and determined 80% of excystation rate. Electroporated sporozoites giving 1 pulse infected HCT-8 cell culture much more efficiently than the other pulse. pcmv- DsRed and peyfp-mem Vectors were transfected into HCT-8 cell line by using both electroporation and lipofectamine methods. Transfected pcmv-dsred and peyfp-mem Vectors expressions at 80 voltage, 50 capacitance, none resistance of electroporation condition observed by fluorescent microscopy. However when giving 1000 voltage, 50 capacitance, 50 resistance in electroporator, transfected pcmv- DsRed Vector and peyfp-mem Vector and Crypto-construct GFP Vector expressions could not be observed visually by fluorescent microscopy. There was no visually C. parvum (Crypto-construct GFP Vector) expression in both of elektroporation condition by fluorescent microscopy. In order to show incase of avaliable a little GFP mrna expression of C. parvum vector in transfected HCT-8 cells by two electroporation conditions was used RT-PCR, Nested PCR. Key words: Cryptosporidium, Cell culture, Electroporation, Lipofectamine, Real time PCR II

5 TE EKKÜR Tez konumun seçiminde, yürütülmesinde ve sonuçların de erlendirilmesinde gerekli tüm yardımlarını ve deste ini esirgemeyen danı man hocam Sayın Prof. Dr. Sadık Dinçer e ve ikinci tez danı man hocam Tufts Üniversitesi, Veterinerlik Fakültesi, nfeksiyon Hastalıkları Bölümünden Sayın Doç. Dr. Giovanni Widmer e, tez izleme komisyon üyelerim Doç. Dr. Soner KOLTA ve Sayın Doç Dr. Hatice Korkmaz a ükran ve saygılarımı sunarım. Çalı maların sırasında her konuda desteklerini esirgemeyen Tufts Üniversitesi, Veterinerlik Fakültesi, nfeksiyon Hastalıkları Bölümünden çalı ma arkada larım Sayın Dr. Sultan Tanrıverdi ye, doktora ö rencisi Sayın Yi-Lin YANG a ve laboratuvar teknisyeni Sayın Ruben Bonilla ya ve bölüm çalı anlarına, de erli arkada ım Ara tırma Görevlisi Sayın Ay enur Kaya ya te ekkür ederim. Yine bu özverili yolda manevi deste ini esirgemeyip oldukça sabırlı davranan e im ve aileme, projeye destek sa layan Ç.Ü. Ara tırma Fonu ve Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlü ü ne te ekkürü borç bilirim. III

6 Ç NDEK LER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TE EKKÜR... III Ç NDEK LER... IV Ç ZELGELER D Z N... XII EK LLER D Z N... XIV 1. G R Cryptosporidium parvum un Morfoloji, Biyoloji ve Ya am Döngüsü Plazmidler Do rulama Testleri LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Real time PCR) Nested PCR RT PCR ÖNCEK ÇALI MALAR MATERYAL ve METOD Materyal Kullanılan Parazit Cryptosporidium parvum Kullanılan Cihazlar Ultrasantrifüj Benmari nkübatör nvert floresan Mikroskop Elektroporasyon Cihazı PTC-100 TM Thermal Kontrol Cihazı Real Time PCR Cihazı 29 IV

7 Kullanılan Besi yerleri, hücre kültürleri ve kültür ortamları LB-agar ve LB-broth ortamı HCT-8 (Human adenocarcinoma, ileocecal) hücreleri RPMI-1640 kültür ortamı MDBK (Mardin-Darby bovine kidney) hücre kültürü DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium/High Modified) kültür ortamı DH5 Tm Escherichia coli kompetent hücreleri Kullanılan Laboratuvar Malzemeleri cm 2 ve 75 cm 2 lik steril plastik i eler ve 96 kuyucuklu plaklar Falkon tüpü Kryovial tüpler Nalgene Tm Cryo 1 o C freezing Konteyner Otomotik pipet Lab-Tek R Chamber Permanox Slide TM BTX bo küvet Kullanılan çözeltiler ve kimyasallar Sitomiks Tampon Çözeltisi L-glutamin FBS (Fetal Bovine Serum) At serumu Sodyum prüvat DMSO (Dimethyl sulfoksid Sigma D-8418) PBS (% 1) RNA later R (RNA yı stabilize eden solüsyon) Fenol:kloroform: zoamil alkol Etanol Glikojen veya pellet paint TE Tamponu (1X) MMLV Tamponu (5X) V

8 RNasin MMLV-RT (200U/µl) (Promega M170A) Taurocholic acid Glutathionin ve ATP Kullanılan Plazmidler Crypto construct GFP Vektör pcmv-dsred Ekspres Vektör (clontech PT3682-5) peyfp-mem Vektör (PT Clontech) Kullanılan Antibiyotikler Ampisilin (Kat no: L0168 Sigma) ve Kanamisin: (L0543 Sigma) Penisilin/streptomisin Kullanılan Kitler Puregene Genomic DNA Purification Kiti ve PureYield Plazmid Midiprep Kiti Lipofektamin 2000 Kiti RNeasy Mini Kit Superscript Tm First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kiti LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kiti Kullanılan Enzimler Restriksiyon Enzimleri Akkutaz Enzimi Kullanılan Primerler pcmv-dsred Ekspres Vektör Primerleri peyfp-mem Vektör primerleri Crypto construct-gfp primerleri (1). C-GFP F 1-R1 primerleri (2). C-GFP F 2-R (3). C-GFP Nested Primer C. parvum Primerleri (1). C. parvum VI

9 (2). L11 primerleri (3). tübulin primerleri (C. parvum baz dizisi) GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase housekeeping gen) Primerleri Metod Lipofektamin Yöntemiyle Transient Transformasyon Cryptosporidium parvum un Lipofektamin Yöntemi çin Hazırlanması (1). Cryptosporidium parvum Ookistlerinin Ço altılması (1).(a). Cryptosporidium Ookistleri çin Asit-Fast Boyama Yöntemi (1).(b). Asit-Fast Yöntemi ile Boyanmı Preparatta Ookist Skorunun Belirlemesi (1).(c). Karbol Fuksin Hazırlanı ı (1).(d).Ookistlerin Fare Dı kılarından zole Edilmesi (1).(e). Nycodenz (Histodenz) Gradient Safla tırma Yöntemi (Ultrasantrifüj Yöntemi) (1).(f). NaCl 2 Yüzdürme Metodu (1).(g). mmüno Manyetik Ayırma (IMS) lemi (2). Ookistlerin Yüzeysel Sterilizasyonu ve Eksistasyonu (3). Ookistlerin DNA zolasyonu çin Hazırlanması (3).(a). Ookistlerden DNA zolasyonu (4). DNA nın Restriksiyon Enzimleriyle (NcoI, SpeI) Kesilmesi Plazmidlerin Lipofektamin Yöntemi çin Hazırlanması (1). Plazmidlerin DH5 Tm Escherichia coli Kompetent Bakterilerine Transformasyonu (1).(a). Subcloning Efficiency TM DH5 Kompetent Hücre Kiti (1).(b). One shot Topo Cloning Kompetent Hücre Kiti. 57 TM VII

10 (2). Transformantların Ço altılması (2).(a). LB agar+ampisilin Besiyerinin Hazırlanması (2).(b). Plazmid zolasyonu (2).(b).(a). Eppendorf Perfectprep Plazmid zolasyon Kiti (Kat No: ) (2).(b).(b). Modifiye Edilmi Qiagen Maxipreps (2).(c). Plazmid DNA Konsantrasyonunun Ölçülmesi (2).(d). Transformantların Saklanması (2).(d).(a). Sıvı Besi Yerinde Büyüyen Bakteri Kültürünün Stoklanması (2).(d).(b). Katı Besi Yerinde Büyüyen Bakteri Kültürünün Saklanması (2).(e). zole Edilen Plazmidlerin Do rulanması (2).(e).(a). DNA nın Kesilmesi Protokolü Hücre Kültürünün Lipofektamin Yöntemi çin Hazırlanması % Konfluent MDBK Hücre Kültürünün Hazırlanması (Gibco Kat no: CCC-244) % Konfluent HCT-8 Hücre Kültürünün Hazırlanması (CCL-244, ATCC) Hücre Kültürlerinin Pasajı Hücre Kültürü Plaklarının Hazırlanması Hedef DNA nın Hücre Kültürlerine Transfeksiyonu Lipofektamine TM 2000 Kiti Lab-Tek R Chamber Permanox Slide TM IF ( mmunofloresan Method) Transformantların Do rulanması RT PCR (Lipofektamin 2000 için) (1). RNeasy Mini Kit (Qıagen Kat no: 74104) (2). RNA dan DNA Kontaminasyonunu Önlemek (2).(a). DNA se ile Muamele Kiti. 76 VIII

11 (2).(b). RNA nın DNaz Enzimiyle Muamele Edilmesi (3). RT PCR (3).(a). Red Vektör çin RT-PCR Yapılacak Örnekler (3).(a).(a). RFP Vektör ile Real-time PCR Ko ullarının Optimizasyonu (3).(a).(b). RFP Vektör Transformantlarının Realtime PCR da Do rulanması (3).(b). Crypto Construct GFP Vektör Transformantlarının RT-PCR ile Do rulanması (3).(b).(a). C-GFP Plazmidi ile Real-time PCR Ko ullarının Optimizasyonu (3).(b).(b). C-GFP Vektör Transformantlarının Realtime PCR da Do rulanması (3).(b).(b).(a). Crypto Construct GFP Vektör RNA Örnekleri (3).(b).(b).(b). Crypto construct GFP Vektör c- DNA Örnekleri Elektroporasyon Yöntemiyle Transient Transformasyon Cryptosporidium parvum un Elektroporasyon Yöntemi çin Hazırlanması (1). Cryptosporidium parvum Ookistlerinin Ço altılması (2). Ookistlerin Fare Dı kılarından zole Edilmesi (3). Ookistlerin Yüzeysel Sterilizasyonu ve Eksistasyonu Plazmidlerin Elektroporasyon Yöntemi çin Hazırlanması Hücre Kültürünün Elektroporasyon Yöntemi çin Hazırlanması Elektroporasyon Deneyi I Transfeksiyon Neticesinde Elde Edilen Transformantların Do rulanması Elektroporasyon Deneyi II Elektroporasyon Yöntemiyle Elde Edilen Transkriptlerden RNA Sentezi IX

12 Crypto-construct GFP Vektör Transformantları çin RT-PCR RT-PCR Yapılan GFP Vektor Transformant Örnekleri HCT-8 Hücrelerinin Enfeksiyonunun Do rulanması (1). L11 Primerleri (2). ß tübulin Primerleri GAPDH Primerleri GAPDH Primerleri Kullanılarak PCR Yapılacak Örnekler Crypto-construct GFP Vektör ile Real-time PCR Ko ullarının Optimizasyonu Crypto-construct GFP Vektör Transformantları çin Conventional PCR Crypto-construct GFP Vektör Transformantları (c-dna) çin C-GFPF2-R2 Primerleri ile Real time PCR Nested Primerleri le Real time PCR peyfp-mem Vektör Transformantları çin RT-PCR peyfp-mem Vektör ile Real-time PCR Ko ullarının Optimizasyonu RT-PCR Yapılan YFP Vektör Transformant Örnekleri BULGULAR ve TARTI MA Bulgular Lipofektamin NcoI ve SpeI Restriksiyon Enzimleriyle Transformantların Kesilerek Do rulanmasına Ait Bulgular pcmv- DsRed-Ekspress Plazmidinin Real time PCR ile Do rulanmasına Ait Bulgular Transfeksiyon leminden Sonra Plazmid Ekspresyonunun Fluoresans Mikroskop Altında ncelenmesi HCT-8 Hücrelerinin Sporozoitlerle Enfeksiyonunun Kontrolüne Ait Real time Optimizasyon Sonuçları. 112 X

13 pcmv-dsred Ekspres Vektörün HCT-8 Hücrelerine Transfeksiyonundan Sonra Elde Edilen m-rna Transkriptlerine Ait Real time PCR Sonuçları Crypto construct GFP Vektörün HCT-8 Hücrelerine Transfeksiyonundan Sonra Elde Edilen m-rna Transkriptlerine Ait Real time PCR Sonuçları Bulgular Elektroporasyon DH 5 Tm Escherichia coli Kompenent bakterilerine Transformasyonu Yapılan Crypto construct GFP Plazmidlerin Agaroz jel Analizi ile Do rulanması Ookistlerin Eksistasyonu Elektroporasyon Deneyi I Elektroporasyon ile Transfeksiyon leminden Sonra Plazmid Ekspresyonunun Floresan Mikroskop Altında ncelenmesi Elektroporasyon Deneyi II SONUÇLAR ve ÖNER LER KAYNAKLAR ÖZGEÇM XI

14 Ç ZELGELER D Z N SAYFA Çizelge 1.1. Cryptosporidium un taksonomik sınıflandırılması ve farklı konakçıları... 1 Çizelge 1.2. Kriptosporidiyoz sıklı ı... 4 Çizelge 1.3. Kriptosporidiyozlu immun sistemi normal ki iler ve AIDS hastalarında görülen semptomlar 5 Çizelge 1.4. Real-time PCR ile konvensiyonel PCR arasındaki farklar Çizelge 3.1. Yüksek devirli santrifüj kullanma rehberi 47 Çizelge 3.2. Farklı eksistasyon ko ulları.. 52 Çizelge 3.3. NcoI, SpeI restriksiyon enzimleriyle DNA nın kesilmesi protokolü Çizelge 3.4 One shot Topo Cloning kompetent hücre kiti için ligasyon protokolü Çizelge 3.5. Restriksiyon enzim kullanılarak DNA nın kesilmesi protokolü Çizelge 3.6. Hücre kültürü plaklarının büyüme ortamları ve maksimum hücre sayısı 68 Çizelge 3.7. RFP vektör ile Real-time PCR ko ullarının optimizasyonunda kullanılan program.. 81 Çizelge 3.8. RFP vektör transformantlarının do rulanması için kullanılan Real-time PCR programı. 82 Çizelge 3.9. Crypto Construct GFP vektör ile Real-time PCR ko ullarının optimizasyonu için kullanılan program 85 Çizelge C-GFP vektör transformant RNA larının Real-time PCR da do rulanmasına ait program Çizelge C-GFP vektör transformant c-dna larının Real-time PCR da do rulanmasına ait program Çizelge Farklı eksistasyon ko ullarında ookist eksistasyonu 88 XII

15 Çizelge GAPDH Primerleri ile GFP vektör mrna miktarlarının ölçüldü ü Real time PCR programı.. 98 Çizelge GFP vektör transformantlarının Real time PCR da do rulanmasına ait program. 100 Çizelge Crypto-construct GFP vektör m-rna larının Nested primerleri ile do rulanmasına ait Real time PCR programı. 103 Çizelge peyfp-mem vektör ile Real-time PCR ko ullarının optimizasyonuna ait program Çizelge YFP vektör transformantlarının do rulanmasına ait Real time PCR programı Çizelge 4.1. Farklı ko ullarda enfekte edilen HCT-8 hücrelerinin floresan mikroskop altında tespit edilen ortalama sayıları Çizelge 4.2. Farklı ko ullarda enfekte edilen HCT-8 hücrelerinin standart sapma de erleri Çizelge 4.3. Elektroporasyon i leminde elektroporatör cihazında okunan YFP vektöre ait elektrik alan kuvveti ve akımına ait bulgular 126 Çizelge 4.4. Elektroporasyon i leminde elektroporatör cihazında okunan GFP vektörüne ait elektrik alan kuvveti ve akımına ait bulgular Çizelge 4.5. Elektroporasyon i leminde elektroporatör cihazında okunan RFP vektörüne ait elektrik alan kuvveti ve akımına ait bulgular Çizelge 4.6. Elektroporasyon i leminde elektroporatör cihazında okunan YFP vektörüne ait elektrik alan kuvveti ve akımına ait bulgular Çizelge 4.7. Elektroporasyon i leminde elektroporatör cihazında okunan YFP vektöre ait elektrik alan kuvveti ve akımına ait bulgular 138 XIII

16 EK LLER D Z N SAYFA ekil 1.1. Cryptosporidium un yayılmasındaki kaynaklar ekil 3.1. Crypto construct GFP vektör eması ekil 3.2. pcmv-dsred ekspres vektör eması ekil 3.3. peyfp-mem Vektör eması 34 ekil 3.4. DH5 TM kompetent hücre kiti ile transformasyon deney düzene i. 55 ekil 3.5. One shot Topo Cloning kompetent hücre kiti ile transformasyon deney düzene i ekil 3.6. Lipofektamin TM 2000 kitinin esası.. 69 ekil 3.7. Lipofektamin TM 2000 kiti ile transfeksiyon deney düzene i 70 ekil 3.8. Chamber permanoks slayt ile transfeksiyon deney düzene i ekil 3.9. Elektroporasyon yönteminin esası 90 ekil Elektroporasyon I deney düzene i ekil Elektroporasyon II deney düzene i.. 93 ekil YFP vektörünün stabil transformasyon deney düzene i ekil 4.1. Crypto construct GFP vektörün NcoI ve SpeI Restriction enzimleriyle kesilmesi ekil 4.2. pcmv- DsRed-Ekspres vektör kolonilerinin melting curve analizi ekil 4.3. pcmv- DsRed-Ekspres vektör ve peyfp-mem Vektör ekspresyonlarının inverted mikroskop altındaki görüntüleri ekil 4.4. L11 primerlerinin Real-time PCR ile optimizasyonu ekil 4.5. Real time PCR da L11 primerleri kullanılarak testlenen RT PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri XIV

17 ekil 4.6. Real time PCR da - tübilin primerleri kullanılarak testlenen RT PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri ekil 4.7. pcmv-dsred Ekspres Vektörün m-rna ekspresyonunun Real Time PCR ile gösterilmesi 116 ekil 4.8. Crypto construct GFP Vektör primerlerinin Real-time PCR ile optimizasyonu sonucunda elde edilen PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri ekil 4.9. GFP Vektör transformantlarından elde edilen RNA örneklerinin c-gfp F1-R1 primerleri kullanılarak Real Time PCR ile do rulanması. 118 ekil GFP Vektör transformantlarından elde edilen cdna örneklerinin c-gfp F1-R1 primerleri kullanılarak Real Time PCR ile do rulanması. 119 ekil Crypto construct GFP Vektör DNA sının restriksiyon enzimleriyle (NcoI, SpeI) kesilmesi. 122 ekil Farklı ko ullarda enfekte edilen HCT-8 hücrelerinin standart sapma de erlerinin grafi i ekil YFP vektör transformantlarının floresan mikroskop altındaki görüntüleri ekil RFP vektör transformantlarının floresan mikroskop altındaki görüntüleri ekil YFP primerleriyle yapılan Real-time PCR da melting curve analizi ekil YFP vektör transkriptlerinin Real-time PCR da melting curve analizi. 133 ekil YFP vektör transkriptlerinin Real-time PCR da quantification analizi ekil YFP vektör transkriptlerinin GAPDH mrna ekspresyonlarının Real-time PCR da melting curve analizi XV

18 ekil YFP vektör transkriptlerinin GAPDH mrna ekspresyonlarının Real-time PCR da quantification analizi. 136 ekil YFP vektör transkriptlerinin GAPDH mrna ekspresyonlarının agaroz jel analizi ekil Enfekteli HCT-8 hücrelerinin - tübilin primerleri kullanılarak Real time PCR ile do rulanması. 140 ekil tübilin primerleri kullanılarak elde edilen Real time PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüsü. 140 ekil Enfekteli HCT-8 hücrelerinin - tübilin primerleri kullanılarak Real time PCR ile do rulanması. 141 ekil L11 primerleri kullanılarak elde edilen Real time PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüsü ekil GFP vektör ile GFP F 2 -R 2 primerlerinin Real time PCR cihazında optimizasyonu ekil GFP mrna transkriptlerinin Konvensiyonel PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüsü ekil GFP mrna transkriptlerinin Real-time PCR da melting curve analizi ekil GFP mrna transkriptlerinin Real-time PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüsü 144 ekil GFP mrna transkriptlerinin nested primerleri kullanılarak yapılan Real-time PCR da melting curve analizi ekil GFP mrna transkriptlerinin nested primerleri kullanılarak yapılan Real-time PCR melting curve analizinin agaroz jeldeki görüntüsü XVI

19 1. G R Zeynep KOLÖREN 1. G R 1.1. Cryptosporidium parvum un Morfoloji, Biyoloji ve Ya am Döngüsü Cryptosporidium spp. Apicompleksa ubesi, Alveolata grubu, Cryptosporidiidae familyasında bulunan hücre içi bir parazittir. Konakçı spesifikli i ve ookist morfolojisine dayanılarak u ana kadar 10 cinsi tanımlanmı tır (Chen ve ark, 2002). Adal ve ark (1995), Cryptosporidium un taksonomik sınıflandırılması ve farklı konakçılarını Çizelge 1.1 deki gibi belirtmi lerdir. Çizelge 1.1. Cryptosporidium un taksonomik sınıflandırılması ve farklı konakçıları Sınıflandırma Phylum: Apicomplexa Class : Sporozoida Subclass: Coccidiasina Order: Eucoccidiorida Suborder: Eimeriorina Family: Cryptosporidiiae Genus: Cryptosporidium Species: C.parvum C. muris C. baileyi C. melaegridis C. serpentis C. nasorum Konakçı Memelilerde Memelilerde Ku larda Ku larda Sürüngenlerde Balıklarda Cryptosporidium parvum mide ve ba ırsak mukozalsı epitel hücrelerinin mikrovillus bölgelerinde ya ar. Yerle im yeri nedeniyle di er hücre içi parazitlerinden ayrılır. Çünkü, onlar hücrenin sitoplazması içinde yerle irken, C. parvum hücrenin ekzositoplazmik alanında yerle ir ve birbirini izleyen e eyli ve e eysiz üremeyle ço alır. A ızdan alınan infektif, olgun ookist ince ba ırsakta bilinmeyen bir mekanizmayla açılır ve içindeki sporozoitler serbest kalır ve her biri bir epitel hücresi içine girerek parazitoforoz vaküole yerle ir. Hücre içindeki trofozoitler µm çapında, yuvarlak veya oval yapılardır. Hücre içinde beslenen, büyüyen trofozoit e eysiz olarak izogoni ile ço alır ve sonuçta 6-8 merozoit olu ur. Merozoitleri ta ıyan bu hücreye meront I ( izont) denir. Bunların parçalanmasıyla 1

20 1. G R Zeynep KOLÖREN açı a çıkan merozoitler di er hücrelere girer ve yeni bir izogoniyi ba latıp meront I veya meront II ye dönü ürler. izogoni sonucunda meront II içinde 4 merozoit olu ur. Hücre parçalanınca serbest kalan bu merozoitler yeni epitelyum hücreleri içine girerek mikro veya makro gametositlere dönü ürler. Bu gametositlerin gametlere dönü mesinden sonra mikrogamet makrogameti döller, olu an zigot ookistlere dönü ür. Ookistler konak hücre içinde olgunla ır ve içinde sporozoit olu mu dönemde konak ba ırsa ına, ordanda dı kıyla dı arı atılır (Saygı, 2002). C. parvum un e eyli üremesi sonucunda iki farklı tip ookist olu ur. Bunlardan ince çeperli olup içinde 4 sporozoit bulunanlar konak vücudu dı ına çıkmadan ba ırsak içinde açılır ve içlerinde bulunan sporozoitler serbest kalarak yeni epitelyum hücrelerine girerler. Bu durum iç oto enfeksiyon olarak tanımlanmı tır. Konak dı kısı ile dı arı atılan kalın çeperli ikinci tip ookist ise hem dı otoenfeksiyon yoluyla, hem ki iden ki iye direkt temasla, hem de bula ık yiyecek içeçeklerle a ızdan alınır. Bu ekilde parazitoz insana bula ır. C. parvum un ya am döngüsünde ara konakçı yoktur (Saygı, 2002). Adal ve ark, (1995), Cryptosporidium un yayılmasındaki kaynakları ekil 1.1 de oldu u gibi tanımlamı lardır. Hayvanlar (evcil ve vah i) Yüzey suların Yiyecekler Direk temas kontaminasyonu nsanlar (direk fekal oral) ekil 1.1. Cryptosporidium un yayılmasındaki kaynaklar 2

21 1. G R Zeynep KOLÖREN ntestinal bölge Kriptosporidiyozun primer alanıdır. Klinik semptom büyük ölçüde enfekteli ki inin immün sistemine ba lıdır. Enfeksiyon asemptomatik seyretmesine ra men pek çok hastada mukus içeren sulu ishal, nadiren kanlı ve lökositli dı kı görülmektedir. mmun sisteminde problem olmayanlarda hastalık genellikle ya asemptomatik veya sınırlı ölçüde semptomlarla kendini gösterir. Enfekteli hastaların % 90 nından fazlası 7-10 günlük inkubasyon periyodundan sonra yakla ık iki hafta akut sulu ishal, mide bulantısı, kusma ve kramp benzeri abdominal sızıyla; % 36 sı aynı zamanda ate gibi semptomlarla ortaya çıkar (Farthing, 2000). Dı kılama alı kanlı ında herhangi bir de i me olmayıp bir günde üç defadan daha az sayıda dı kıya çıkma (Hastaların % 4); Geçici enfeksiyon 2 aydan daha az bir süre ishal görülmesi; kronik enfeksiyon son iki ay ve daha fazla sürede ishalin devamlılı ı ve bu süreler boyunca dı kıda parazitin görülmesi (% 60). Günde en azından iki kez sulu dı kı çıkaran hastalar (fulminant enfeksiyon % 8). AIDS li hastalarda ishal genellikle sulu ve bir günde 10 kez veya daha fazla dı kıya çıkma eklinde kendini gösterir. Bu hastaların % 10 nunda kilo kaybı ve iddetli malabsorbsiyon görülür (Farthing, 2000). C. parvum apikompleksan bir protozoan olup immun yetersizligi olan ki ilerde ve AIDS li hastalarda iddetli semptomlara neden olmaktadır. Kriptosporidiyoz geli mekte olan ülkelerde özellikle çocuklarda kesintisiz ishallerle seyreden yaygın bir parazitozdur (Saygı, 2002). C. parvum Tip-1 ve Tip-2 olmak üzere 2 alt gruba ayrılır (Peng ve ark, 1997). Bu alt gruplar arasındaki farklılıklar genetik markerlar kullanılarak (Carraway ve ark, 1996; Widmer, 1995; Morgan ve ark, 2000) ve farklı konakçı dizilerinin oldu u belirlenerek tespit edilmi tir. C. parvum Tip-2 nin insanlarda ve çe itli hayvan türlerinde bulunmasına ra men Tip-1 in tipik bir ekilde sadece insanlarda görüldü ü belirlenmi tir. Kriptosporidiyozun kozmopolit bir da ılımı vardır. Prevalansı % arasında de i ir. Yurdumuzda da görülmü tür. Bu parazitoza çocukların eri kinlerden, anne sütü ile beslenenlerin, anne sütüyle beslenmeyenlere oranla daha sık yakalandıkları saptanmı tır (Saygı, 2002). 3

22 1. G R Zeynep KOLÖREN Asya, Afrika, ve Latin Amerika da yıllık milyon insan C. parvum la enfekteli hale gelmektedir (Adal ve ark, 1995). Diyareli ba ı ıklık sistemi normal ki ilerde yapılan, geli mi ülkelerdeki 43, geli mekte olan ülkelerdeki 35 çalı ma sonucunda, Kriptosporidiyoz sıklı ı Çizelge 1.2. deki gibi belirlenmi tir (Adal ve ark, 1995). Çizelge 1.2. Kriptosporidiyoz sıklı ı (Adal ve ark, 1995) Alan Kriptosporidiyoz / % total diyareli hasta Pozitif kontrol/ % total kontrol Geli mi Ülkelerde / (% 6.1) 61 / (% 1.5) Geli mekte Olan Ülkelerde / (% 2.1) 3 / (% 0.15) C. parvum Kriptosporodiyoz salgınlarına yol açan tehlikeli protozoon bir parazittir. Bu parazit çe itli çevresel stres ko ullarına ve gıda i leme prosedürlerine dirençli olan ookist formunda, kontamine su ve çi gıdalar ile nakledilebilmektedir. Gıda maddelerinin i lenmesi sırasında C. parvum ile bula ık suların kullanılması etkenin gıda i letmelerine giri inde potansiyel bir kaynak olarak görülmektedir (Çetinkaya, 2004). Geli mekte olan ülkelerde enfeksiyonun prevalansının endüstrile mi ülkelere oranla çok daha yüksek oldu u ve bu durumun endüstrile mi ülkelerde içme suyuna uygulanan etkili temizlik ve dezenfeksiyon prosedürlerine ba lı oldu u öne sürülmektedir. Yapılan seroprevalans çalı maları sonucunda, endüstrile mi ülkelerdeki populasyonun % inin, geli mekte olan ülkelerdeki populasyonun ise % 64 ünün Kriptosporidiyoz ile enfekteli oldu unu ortaya koymu tur. Çocuklar, kötü beslenen ki iler ile AIDS hastaları, kanser için kemoterapi gören hastalar, organ nakli gerçekle tirilen ki iler, immunsupresif hastalar gibi immünitesi zayıflamı ki iler enfeksiyon için çok daha büyük bir risk ta ımaktadır. Gerek immunitesi zayıflamı gerekse immün sistemi normal olan ki ilerde görülen gastrointestinal sisteme ili kin semptomlar iddetli diyare, dehidrasyon, abdominal kramplar, kusma, a ırlık kaybı ve elektrolit dengesizli idir. Etken ya enfekte hayvanlarla direk temas, kontamine su ve çi gıdalar ile insanlara ya da insanlardan 4

23 1. G R Zeynep KOLÖREN insanlara bula abilmektedir. Ba lıca bula ma yolu ise kontamine gıdalar ve suyun tüketimi sonucu fekal-oral yoldur. Son yıllarda Kriptosporidioyozun etkeni C. parvum; su ve gıdalar ile insanlara bula ması yanında sa lıklı ki ilerde yüksek morbidite ve duyarlı ki ilerde yüksek mortalite oranının görülmesi ve semptomların gözlendi i hastalarda etkeni yok etmede etkili bir tedavinin bulunmaması nedeniyle gıda endüstrisinde büyük bir kaygı yaratmaktadır (Çetinkaya, 2004). Kriptosporidiyozli AIDS hastalarında enfeksiyonun bulundu u bölgeye ba lı olarak asemptomatikten kolera benzeri semptomlara (Çizelge 1.3.) varıncaya kadar geni bir spektrum görülür (Chen, 2002). Çizelge 1.3. Kriptosporidiyozlu immun sistemi normal ki iler ve AIDS hastalarında görülen semptomlar mmun sistemi normal ki iler Özellikle bir ya ın altındaki çocuklar ve herhangi bir yastaki yeti kinler Genellikle intestinal sistemde AIDS li hastalar ntestinal veya extra intestinal Asemptomatik, akut ve persistent Asemptomatik, geçici ve kronik shal, ate, abdominal kramplar, shal, ate, kusma, kilo kaybı kusma, bulantı ve kilo kaybı 2 hafta kadar 2 günden tüm ya am boyunca Kriptosporidiyozun tanısında inceleme materyali dı kıdır. Laboratuvar enfeksiyonundan korunmak için üpheli örnekler formalin içine alınmalıdır. Dı kının incelenmesinde modifiye edilmi asit fast yöntemi veya Giemza boyası kullanılabilir. Ookistlerin yo unla tırılması için de modifiye çinko sülfat veya Sheather in eker solüsyonu ile yüzdürme yöntemi uygulanır. Parazitin hemen bütün evrim dönemleri ba ırsak biyopsisinde bulunabilir. Bu örnekler hematoksilen-eozin veya Masson un boyası ile boyanmaktadır. ndirekt immunfloresan yöntemiyle de ookistler saptanabilir (Saygı, 2002). Kriptosporidioyozun tanısında dokulardan veya vücut sıvılarından alınan örneklerin mikroskobik incelemelerinin yanı sıra klinik, endoskobik, immunolojik, ve moleküler teknikler kullanılabilir (Farthing, 2000). 5

24 1. G R Zeynep KOLÖREN C. parvum için selektif ilaç kullanımı sınırlı olmakla beraber, invivo daki enfeksiyonuna kar ı sadece birkaç ilacın etkili oldu u ortaya konulmu tur (Tzipori ve ark, 1982; Woods ve ark, 1996; Tzipori, 1995). C. parvum ile enfekteli insan ve hayvanlarda test edilen 150 antimikrobiyal ilacın hiçbirisi bu parazite kar i etkili bir çözüm olu turamamı tır (Griffiths, 1998). Ayrıca C. parvum ile sınırlı olarak enfekte edilen doku kültürü sistemlerine uygulanan antisporidial terapilerin de hiçbir yarar sa lamadı ı görülmü tür (Theodos ve ark, 1998). Bu çalı maları Meinhardt ve ark (1996) nın da yaptı ı çalı malar destekleyip C. parvum a kar ı henüz spesifik ve tamamen efektif bir tedavi yönteminin olmadı ı tespit edilmi tir. 150 antimikrobiyal ilaçtan fazlası Cryptosporidium ile enfekteli insan ve hayvanlar üzerinde test edildi. Ancak bunların hiçbirisi bu parazite kar ı devamlı bir etki gösterilmemi tir. Yine anti Kriptosporidial terapi için invitroda hücre kültürü çalı malarıyla da dikkate alınır sonuçlar kaydedilmemi tir. Bu patojenin genom yapısı, gen ekspresyonu ve regülasyonu, konakçı spesifitesi ve virülans mekanizması tam anlamıyla anla ılmadı ından yeni tedavi yöntemleri de (a ı ve yeni kemoterapiler) etkili olmamı tır. nsanlarda hastalı a neden olan C. parvum tip 2 nin genom dizisi tamamlanırken tip 1 in henüz bir kısmı tamamlanmı tır. Bu iki genomun kıyaslanması mümkün oldukça konakçı spesifitesinin ve virülans mekanizmasının da anla ılmasının kolay olaca ı dü ünülmektedir (Widmer ve ark. 2002) Plazmidler Hücre içerisinde kromozomların dı ında bulunabilen ve içinde bulundukları hücreye çe itli özellikler kazandıran DNA yapısındaki ekstrakromozonal DNA moleküllerine plazmid adı verilir (Solak ve ark, 2000). Bu yapılar içinde bulundukları bakterilerde antibiyotikleri inaktive eden maddeleri sentezleyen genetik bilgiler ta ırlar. Bir plazmid bakteri hücresinde kendili inden olu maz, plazmid ta ıyan bakterilerden aktarılır. Plazmidler çift 6

25 1. G R Zeynep KOLÖREN sarmallı çembersel yapıda, bakteri kromozomundan küçük moleküllerdir. Bir plazmidin bir bakteriden di erine aktarılabilmesi için tra genleri (transfer genleri) ne sahip olması gerekir. Bu tür plazmidlere konjugatif plazmidler denir (Nayler, 1987). Gen mühendisli i teknolojisi ile laboratuvarlarda çe itli amaçlarla kullanılabilecek yeni yapay plazmidler yapılabilmektedir. Bu tür yapay plazmidler içine çok çe itli genler yerle tirilebilmekte ve uygun konaklarda ço altılabilmektedir. Bakteriler arasında plazmidlerin transferi; transdüksiyon, konjugasyon ve transformasyon ile mümkündür (Mach ve Grimes, 1982; Mazodier ve Davies, 1991). Bakteri transformasyonu, alıcı hücrelerin bulundukları ortamdaki DNA moleküllerini hücre içine alabilme yetenekleri olarak tanımlanmı tır. Bu mekanizma Streptococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Rhizobium spp., Pneumococcus spp. gibi bakteri gruplarında do ada kendili inden olu maktadır. Fakat olu um frekansı oldukça dü üktür (Temizkan ve Arda, 1999). Bir çok bakteri türü farklı oranlarda transformasyon için do al olarak kompotent (yetenekli veya hazır) olabilir ancak Escherichia coli (E. coli) gibi kompotentli e inatçı türler, fiziksel ve kimyasal metodlarla kompotent hale getirilebilirler (Wang ve Taylor, 1990). Bu çalı mada genleri ökaryotik hücrelere aktarmak için Lipofektamin 2000 ve Elektroporasyon yöntemi kullanılmı tır. Elektrik akımıyla hücrelerin geçirgenli inin geri dönü ümlü olarak bozulması i lemi elektroporasyon olarak adlandırılır. Elektroporasyon nükleik asitlerin adherent ve süspansiyon eklinde hazırlanmı ökaryotik hücrelerine (elektro-transfeksiyon) ve prokaryotik hücrelere (elektro-transformasyon) transfer edilmesinde kullanılan en önemli yöntemlerden biridir (Shigekawa ve Dower, 1988). Elektroporasyon, ba langıçta memeli hücrelerine DNA sokmak için kullanılmı, ancak son zamanlarda çe itli bitki, bakteri ve maya türlerine DNA transferinde de uygulanmaya ba lamı tır. Elektroporasyonda elektrik alan kuvveti, akım süresi ve DNA konsantrasyonu dikkat edilmesi gereken noktalardır. Uzun süre yüksek voltaj uygulandı ında transformasyon etkinli inde artı saptanmı tır. Fakat bu durumda hücre canlılı ında dü ü görülmü tür. Ko ullar optimize edildi inde yüksek transformasyon etkinli i % hücre ölümüyle gerçekle mektedir. Ayrıca 7

26 1. G R Zeynep KOLÖREN halkasal DNA parçaları do rusal DNA ya göre daha etkin bir biçimde aktarılabilmektedir. Elektroporasyon yüksek transformasyon etkinli ine ( transformant/µg DNA) yol açmakla birlikte oldukça pahalı aletler gerektiren bir yöntemdir (Temizkan ve Arda, 1999). Elektroporasyon ile transformasyon etkinli i elektrik alan kuvveti, verilen elektrik akım süresi, sıcaklık, DNA yo unlu u ve kullanılan ortamın iyonik kompozisyonu gibi pek çok faktöre ba lıdır. Elektrik alan kuvveti: dü ük voltajda kültürü yapılmı hücrelerin plazma membranları hedef DNA moleküllerinin yeterli bir ekilde geçi ine izin vermez. Çok yüksek voltajda hücreler geri dönü ümsüz olarak zarar görebilir. Pek çok memeli hücrelerinde voltaj 250 V/cm -750 V/cm aralı ında kullanıldı ında maksimum transformasyon etkinli i elde edilmi tir. Bu uygulamayla hücrelerin canlılı ı % arasında belirlenmi tir (Sambrook ve ark., 1989). Verilen elektrik akım süresi:genellikle tek elek trik akımı hücrelerin içinden geçirilir. Elektrik akımının uzunlu u ve elektrik alan kuvveti kullanılan güç kayna ının kapasitesine ve kullanılan bo küvetin kalınlı ına ba lı olarak belirlenmelidir. Optimal elektrik akım süresi elektroporasyon için ms dir (Sambrook ve ark., 1989). Sıcaklık:Bazı ara tırıcılar transient ekspresyon için hücrelerin oda sıcaklı ında tutularak elektropore edilmesinin maksimum sonuç verdi i; bazılarının ise 0 o C nin maksimum sonuca götürdü ü hakkında iddaları vardır. Ancak elektroporasyon sırasında elektrik akımı verildikten sonra örneklerin 1-2 dakika elektroporatörde bekletilmesinin transient ekspresyonun etkinli ini arttırdı ı belirtilmi tir (Sambrook ve ark., 1989). DNA konsantrasyonu ve konformasyonu: Hem lineer hem de dairesel DNA ların elektroporasyon yöntemiyle transfekte edilmesine ra men lineer DNA nın daha fazla transient ekspresyona sahip oldu u belirtilmi tir. Etkili DNA konsantrasyonunun 1µg/ml - 80µg/ml arasında oldu u tespit edilmi tir (Sambrook ve ark., 1989). 8

27 1. G R Zeynep KOLÖREN Ortamın iyon kompozisyonu: Hücreler tuz solüsyonu içeren tampon çözeltilerde sükroz ve mannitol gibi iyonik olmayan tampon çözeltilerinden pek çok defa daha fazla transfeksiyon etkinli ine sahiptir (Sambrook ve ark., 1989). Hücrelerin büyüme a aması: En iyi sonucun hücrelerin aktif bir ekilde bölündü ü mid-log hücre kültürü büyüme fazı oldu u ortaya konulmu tur (Sambrook ve ark., 1989). Memeli hücrelerinin elektroporasyonu genellikle ~0.5 m s sabit zamanlı ve 25.0 µf kapasitans kullanılarak kültür ortamı veya tuz solüsyonu tamponu içerisinde yapılır (Sambrook ve ark., 1989). Elektrik alan kuvveti (E) = F(V,d) eklinde bir orantıya sahiptir. Verilen akımların elektrik alan kuvveti uygulanan voltajla do ru orantılı, kullanılan küvetin büyüklü ü olarak tanımlanan iki elektrod arasındaki mesafe ile ters orantılıdır. Pek çok firmanın üretti i 0.1 cm, 0.2 cm ve 0.4 cm lik küvetler vardır. Bu küvetlerin her birine 1000V elektrik akımı uygulandı ında, 0.1 cm lik küvette elektrik alan kuvveti V/cm, 0.2 cm lik küvette 5000 V/cm, 0.4 cm lik küvette 2500V/cm dir. (Sambrook ve ark, 1989). Elektroporasyon tekni i DNA nın çok çe itli hücrelere (bakteri, mantarlar, bitki hücreleri ve çok sayıda kültüre edilmi memeli hücre kültürler) transformasyonunda hızlı, kolay ve etkili bir tekniktir. Dolayısı ile bu tekni in en büyük avantajı hem prokaryot hemde ökaryot organizmalara uygulanabilmesidir (Sambrook ve ark., 1989). Elektroporasyon tekni iyle hücre membranlarında minimum 2 nm den maksimum birkaç nm çapında geçici hidrofobik porlar olu turulur. Bazen büyük hidrofobik porlar hidrofilik porlara dönü ebilir. Elektroporasyon i leminden sonra açılan porların tekrar kapanmaması için elektropore edilmi hücrelerin 0 o C de tutulması gerekir. Bu porlar açıkken 0.5 pg DNA dan daha fazla DNA hücrelere girebilir (Bertling ve ark, 1987). DNA yı ökaryotik hücrelere aktarmak için transient ve stabil transfeksiyon olmak üzere iki farklı yakla ım vardır. Transient transfeksiyonla, rekombinant DNA alıcı hücreye geçici olarak tranfer edilir. Ancak bu yöntemle yüksek seviyede ekspresyon elde edilmektedir. Transfekte edilmi DNA nın alıcı hücrenin 9

28 1. G R Zeynep KOLÖREN kromozomlarına entegre olması sözkonusu de ildir. Bu yöntemle çok sayıda örne in çok kısa sürede transfeksiyonu mümkündür. 1.3 Do rulama testleri LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Real time PCR) Bu sistem daha kısa sürede PCR ürünlerinin ço alması ve bir monitör yardımı ile bu ço almanın on-line olarak gözlenmesi esasına dayanır. PCR data analiz ko ulları ve her bir örnek verileri bu monitöre kaydoldu undan daha sonra kontrol etmek kolayla ıp hatayı tespit etmede yarar sa lamaktadır. PCR ürününü boyamada kullanılan birkaç floresan i aretleyici vardır. Bunlardan ethidium bromid agaroz jel analizinde PCR ürünlerini tespit etmek için kullanılan en yaygın floresandır. LightCycler System de ethidium bromid dü ük hassasiyeti ve spesifitesinden dolayı kullanılmamaktadır. Bu sistemde kullanılan sadece dsdna (çift zincirli DNA) ya ba lanan floresan boya SYBR Green I oldukça spesifik bir boyadır. Denatürasyon sonrasında olu an tek zincirli DNA ya SYBR Green I ba lanmaz dolayısıyle floresan yo unlu u dü üktür. Primerlerin hedef DNA ya ba lanması ve uzama a amasında DNA çift zincirli hale geçece inden SYBR Green I in sayısı artacak dolayısıyle floresan yo unlu u da artacaktır. Bu ekilde her bir örne e ait floresan yo unlu u monitorden takip edilmektedir. Amplifikasyondan sonra elde edilen dsdna örneklerinin her biri spesifik erime ısısına (melting temprature Tm) sahiptir. SYBR Green I ile PCR ürününün Tm ni belirlemek, bilinmeyen örneklerin te hisinde kullanılmaktadır. Bunun için pozitif kontrol olarak kullanılan örne in Tm i ile bilinmeyen örne in Tm i kıyaslanmaktadır. Yine aynı ekilde primer-dimer gibi spesifik olmayan PCR ürünü ile pozitif kontrolün Tm i ile kıyaslanarak tespit edilir. Spesifik olmayan PCR ürünü daima daha dü ük Tm vermektedir. Bu kit içerisinde Taq polimeraz enzimi ve tamponu, dntp karı ımı (dttp, datp, dctp, dgtp), SYBR Green I floresan boyası, MgCl 2 (1 mm son konsantrasyonda) ü bulunduran bir karı ım vardır. PCR i lemi sırasında dı ardan 10

29 1. G R Zeynep KOLÖREN sadece kalıp DNA, primerler ve e er gerekliyse ek MgCl 2 eklenir. Dolayısıyle karı ım zaten hazır ve steril oldu u için dı ardan bula abilecek bir kontaminasyon riski çok azdır. Bu metodda kullanılan karosel kapasitesi 32 örne i alacak kadardır. Karosele yerle tirilecek her bir kapiller tüpün maksimum alaca ı hacim 20 µl dir. Örnekler on-line takip edildi inden ço almayı durdurmak veya daha fazla döngü eklemek mümkündür. Real-time PCR ile konvensiyonel PCR arasındaki farklar Çizelge 1.4 de gösterildi i gibidir. Çizelge 1.4. Real-time PCR ile konvensiyonel PCR arasındaki farklar Konvensiyonel PCR Light Cycler Kalıp DNA µg/100 µl 50 ng ve üstü/20 µl Son hacim µl Maksimum: 20 µl Son konsantrasyon 1-3 mm 1-5mM Amplikon uzunlu u 3 kb genom bp LightCycler protokolü on-line olarak a a ıdaki gibi yazılır. Pre-inkübasyon: Taq DNA polim erazın aktivasyonu ve hedef DNA nın denaturasyonu için gerekli zamanı içeren ba langıçtaki inkübasyon zamanı. Amplifikasyon:Hedef DNA nın ço altıldı ı a ama Melting curve:pcr ürünlerinin te his edildi i a ama Cooling:Cihazın so uması için verilen zamanı içeren a amadır Nested PCR PCR metoduyla tüm bir genomdan istenilen tek bir lokus bir milyondan daha fazla ço altılabilir. Ancak bazı zamanlarda hedef DNA yanında spesifik olmayan dizilerinde aynı ekilde ço aldı ı dü ünüldü ünde spesifik olmayan dizinin de bir milyondan daha fazla ço alma ihtimali vardır. Bu noktada PCR metodunun spesifitesi yine di er bir PCR primerleri ile sa lanabilir. Nested PCR olarak tanımlanan ve ilk PCR ın spesifitesini sa layan bu metod için primerler u ekilde 11

30 1. G R Zeynep KOLÖREN dizayn edilir. Yapılan ilk PCR ın her iki primerleri arasında ikinci primerler dizayn edilir ve ilk PCR primerleri ile amplifiye edilmi ürünler ikinci PCR primerleri (nested primerler) için kalıp DNA yı olu turur. Nested primerleri ile elde edilen PCR ürünü birinci üründe daha kısa olacaktır. lk PCR ile e er yanlı lokus ço altılmı sa ikinci PCR primerleri ile bu yanlı lokusun ço altılması ihtimali çok dü ük olacaktır. Nested PCR aynı zamanda PCR ile elde edilen kopyaların sayısının çok az oldu u durumlarda yine spesifiteyi göstermek için kullanılır. Belirgin olmayan PCR ürünü spesifik de ilse nested primerleri ile fazlaca kopyası elde edilip ürünün arttırılması sa lanır. Bu durumda ürün miktarını arttırmak ve spesifiteyi sa lamak amaçlı Nested PCR yapılmaktadır ( RT PCR cdna sentezi için 3 yöntem vardır. 1) Gen spesifik primer kullanarak: 3 (antisense) gene spesifik primer mrna ya yapı ır ve reverse transkriptaz ile sentezlenir. Bu yöntemle primer konsantrasyonunu ve anneling sıcaklı ını optimize etmek gerekmektedir. 2) Oligo(dT) kullanılarak:bununla hedef mrna dı ında ortamda bulunan tüm mrna lar kullanılarak cdna sentezlenir. Oligo dt mrna nın poly A kuyru una yapı ır ve ortamdaki tüm mrna lar cdna ya dönü türülür. 3) Random hexamer:kısa oligonükleotidler (tipik olarak hexamerler) rastgele mrna moleküllerine tutunur ve cdna sentezlerler. Bu çalı mada hem gen spesifik primerler, hemde oligo dt kullanılmı tır. 12

31 1. G R Zeynep KOLÖREN Bu çalı manın amaçları; 1) Gelecekte yapılacak gen manüplasyon çalı malarına temel olu turması ve henüz kesin bir tedavi yöntemi olmayan Kriptosporidioyoz hastalı ına neden olan C. parvum genlerinin fonksiyonlarını ve bilinmeyen yönlerini ortaya çıkarmak için bu parazitin genetik transformasyon sisteminin kurulması 2) C. parvum ookistlerinin en iyi eksiste oldu u ko ulların optimize edilmesi 3) Eksiste olmu ookistlerin hücre kültürlerini enfekte edip etmediklerinin IMF yöntemi kullanılarak invert mikroskop altında incelenmesi 4) Transfeksiyon sırasında kullanılacak ve optimum sonuçların alınaca ı hücre kültürlerinin belirlenmesi 5) Transfeksiyon i lemi için elektroporasyon ve lipofektamin yöntemlerinin kullanılması ve optimize edilmesi 6) Crypo-construct GFP vektör ve bazı ekspresyon vektörlerinin hücre kültürlerine transfeksiyonundan sonra invert mikroskop altında bu vektör ekspresyonlarının foto raflanması ve do rulama testleri (Real time PCR, Nested PCR ve RT-PCR) ile do rulanmasıdır. 13

32 2. ÖNCEK ÇALI MALAR Zeynep KOLÖREN 2. ÖNCEK ÇALI MALAR Tyzzer (1907), tarafından farelerde sıklıkla bulunan protozoon parazit Cryptosporidium u tespit edilip bu adla isimlendirilmi tir. Tyzzer (1912), farelerin ince ba ırsaklarında daha küçük organizmalar oldu unu belirtip buna C. parvum adını verdikten yakla ık 70 yıl sonra bu parazit üzerinde tekrar çalı malar hızlandırılmı tır yılında genç hindilerin gastrointestinal bölgelerinde (Salvin, 1955), 1971 yılında sı ırlarda (Panciera ve ark, 1971) ve 1976 yılında da iki ba ımsız grup ilk iki kryptosporidiyozlu insanı tespit etmi tir (Meisel ve ark, 1976; Nime ve ark, 1976). Tzipori ve ark (1982), 16 antimikrobiyal ilacın (Ethopabate, Nicorbazin, Sulfaquinoksailin, Furaltadon, Enterolyte-N, Sulfamethazin, Trinamid, Amprol, fenamidin, Zoaquin, Halofuginon, Salinomisin, Monensin, Emtryl, Apprinosid, Amprolium) C. parvum a kar ı terapatik etkisini ara tırmı lardır. Bu ilaçlardan hiçbirisinin C. parvum enfeksiyonunu engellemedi i gibi herhangi bir de i iklik yapmadı ını, aynı zamanda Amprolium un fareler için oldukça toksik oldu unu tespit etmi lerdir. White ve ark (1994), kriptosporidioyoz için e er antiretroviral terapi etkili de ilse Paromomisin, azithromisin, nitazoksanid gibi ilaçların kullanımının yararlı olabilece ini belirtmi lerdir. Ayrıca Cryptosporidium ookistlerinin çevresel faktörlere, pek çok dezenfektanlara ve antiseptiklere kar ı oldukça dirençli oldu unu, pek çok aldehit, amonyak, alkol, klor ve alkalin gibi önemli ticari dezenfektantların bu parazit üzerinde etkisiz oldu unu tespit etmi lerdir. mmün yetersizli i olan ki ilerin herhangi bir i lem görmemi göl ve ırmak sularından kesinlikle su içmemeleri gerekti ini; genç hayvanlar ve enfekteli insanlarla temastan kaçınmalarını önemle vurgulamı lardır da 19 AIDS hastasının % 3.6 sının kriptosporidiyozlu oldu u kaydedilmi tir (Navin ve Hardy, 1987). Jurkat hücre tüpleri için DEAE dekstran yöntemi daha önce kullanılan en iyi yöntem olmasına ra men, elektroporasyon yöntemiyle bu tip hücrelerinin daha fazla ekspresyon olu turdu u gözlenmi tir (Siebenlist ve ark, 1986). 14

33 2. ÖNCEK ÇALI MALAR Zeynep KOLÖREN Maurice ve ark (1992), tarafından elektroporasyon yöntemi DNA nın memeli hücrelerine transfeksiyonunda kullanılan en kullanı lı yöntem oldu u görülmü tür. Elektrik akımının hücre memranlarında geri dönü ümlü por açtı ı dü ünülmektedir. Kullanılan ortamın iyonik bile iminin bu yöntemde büyük öneme sahip oldu u savunulup tampon olarak sitomiks tamponu (120 mm KCL; 0.15 mm CaCl 2; 10 mm K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ; 25mM Hepes; 2 mm EGTA; 5 mm MgCl 2 ph; KOH ile 7.6 ya ayarlanır) kullanılmı tır. Moore ve ark (1993), birkaç yüzme havuzu ve suların Cryptosporidium lu oldu unu belirlemi lerdir. Upton ve ark (1994), standardize edilmi kültür ortamı kullanılarak C. parvum un Mardin-Darby Bovine Kidney (MDBK) hücreleri ve Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC) alınan 10 farklı hücre kültüründe büyüme oranlarını kıyaslamı lardır. 68 saatlik enfeksiyon süresinden sonra Nomarski interference-contrast mikroskobu kullanılarak rastgele seçilmi 25 sahadaki enfekteli monolayerler sayılmı tır. Sonuç olarak C. parvum un insan ince ba ırsak kanser hücrelerinin (HCT-8), MDBK hücrelerinden 2 kat daha fazla geli imlerini sürdürdükleri sayılan enfekteli monolayerler ile tespit edilmi tir. C. parvum un BALB/3T3, HT-1080, HT-29 ve RL95-2 deki geli imi MDBK hücrelerindeki geli iminden % 20 daha az olarak tespit edilmi tir. Yine BT-549, Hs700T veya Ls- 174T de elde edilen parazit sayısı MDBK hücrelerinin yarısı kadar oldu u ; HCT-8 hücrelerindeki parazit sayısının ise di er tüm hücre tiplerinin yakla ık 2 katı kadar oldu u belirlenmi tir. Farklı konsantrasyonlarda ookistler kullanılarak MDBK ile HCT-8 hücreleri arasındaki parazit geli imi incelendi inde HCT-8 hücrelerinin daha fazla sayıda enfekte edildikleri saptanmı tır. Carraway ve ark (1996), insanlardan direk elde edilen bir grup C. parvum izolatı ile di er bir grup çe itli konakçı tiplerinden elde edilen C. parvum izolatları arasındaki genetik polimorfizmi tanımlamak için RAPD (Rapid amplified polymorphic DNA), 18 S rrna ve nternal transcribed spacer 1(ITS 1) bölgesindeki polimorfizmden yararlanmı tır. RAPD analizleri ile belirlenen genetik farklılıkları rrna lokuslarının dizi analizleri desteklemi tir. En büyük dizi de i imleri 18S rrna bölgesinde gözlenip, bu bölgede pozisyonundaki 3 bp TGA nın 15