CMV-DSRED VE peyfp-mem EKSPRESYON VEKTÖRLERİNİN LİPOFEKTAMİN YÖNTEMİYLE HCT-8 HÜCRELERİNE TRANSİENT TRANSFORMASYONU *

Transkript

1 CMV-DSRED VE peyfp-mem EKSPRESYON VEKTÖRLERİNİN LİPOFEKTAMİN YÖNTEMİYLE HCT-8 HÜCRELERİNE TRANSİENT TRANSFORMASYONU * pcmv-dsred Ve peyfp-mem Ekspresyon Vektörlerinin Lipofektamin Yöntemiyle Hct-8 Hücrelerine Transient Transformasyonu Zeynep KOLÖREN Biyoloji Ana Bilim Dalı Sadık DİNÇER Biyoloji Ana Bilim Dalı ÖZET Bu çalışmada pcmv-dsred ve peyfp-mem ekspresyon vektörlerinin lipofektamin yöntemiyle HCT-8 hücre kültürlerine transient transformasyonu gerçekleştirilmiştir. CMV promotor bölgesine sahip ve Ds red ekspresyon reporter geni bulunduran pcmv-dsred vektör ile yine CMV promotor bölgesine sahip ve EYFP ekspresyon genleri bulunduran peyfp-mem vektör konsantrasyonunu arttırmak için önce LB sıvı ortamında çoğaltılmış daha sonra izolasyonu yapılarak Real time PCR yöntemiyle doğrulanmıştır. HCT-8 hücre kültürü 2 günde bir yeni kültür ortamı ilave edilerek % oranında konfluent olana kadar büyütülmüştür. Konfluent HCT-8 hücre kültürlerine lipofektamin 2000 kiti (1:2 oranında DNA/ lipofektamin) aracılığıyle transfekte edilen her iki plasmidin ekspresyonu invert mikroskop altında incelenmiştir. Transfeksiyon sonucunda pcmv-dsred vektör kırmızı floresan gösterirken, peyfp-mem vektör yeşil floresan göstermiştir. Sonuç olarak Lipofektamin yönteminin bu vektörlerin HCT-8 hücre kültürlerine transient transformasyonunda oldukça kolay ve etkili bir şekilde uygulandığı gözlenerek optimizasyonu yapılmıştır. Anahtar Kelimeler: Cryptosporidium, Hücre Kültürü, Elektroporasyon, Lipofektamin, Real time PCR ABSTRACT In this study transient transformation system were establihed for pcmv- DsRed and peyfp-mem ExpressVectors. Both vectors were propagated in LB broth and izolated. Then izolated vectors were checked by Real time PCR method. HCT-8 (Human illeocecal adenocarcinoma cells) were plated on tissue culture glass slides and grown to 80-90% confluence by renewing fresh culture media. * Doktora Tezi-Ph.D. Thesis 52

2 Transfected pcmv-dsred and peyfp-mem Vectors into HCT-8 cell line by using lipofectamine 2000 methods observed under fluorescent microscopy. While pcmv-dsred vector showed red fluorescent, peyfp-mem ExpressVectors showed green fluorescent. As a result the lipofectamine 2000 method is simple, highly reproducible, and effective for transient transformation of HCT-8 cell line. Key Words: Cryptosporidium, Cell culture, Electroporation, Lipofectamine, Real time PCR Giriş Lipofektamin yöntemi son 10 yıldır değişik tipte hücre kültürlerine genleri aktarmak için kullanılan biyokimyasal metodlardan biridir. Özellikle süspansiyon hücre kültürlerinde, tutunan hücre kültürlerinden (adherent) daha verimli sonuçlar elde edilmiştir (Sambrook ve ark, 1989). Bu metod ile katyonik lipid, hücre kültürleri üzerinde suni membran vezikülleri oluşturup DNA nın bu veziküllere tutunmasını sağlamaktadır. (Felgner ve Holm, 1989). Lipofektamin yöntemiyle göğüs kanseri tümör hücre kültürüne (Bacp 37) Interleukin 18 genleri başarılı bir şekilde transfekte edilmiş ve G418 seçici antibiyotiği kullanılarak transformantlar seçilmiştir. Interleukin 18 genlerinin biyolojik ekspresyonu RT PCR ve ELİSA yöntemiyle gerçekleştirilmiştir (Han ve ark, 2003). Epitelyum hücrelerinin lipid yöntemiyle transient transformasyonu, toksisite ve etkin olmamasından olayı sınırlı olarak kullanılmaktaydı. Ancak yapılan bir çalışma neticesinde Polarize edilmiş epitelyum hücre monolayırlarının transient transformasyonunda Lipofektamin plus ve 2000 yöntemleriyle lipidlerin etkili bir şekilde transfekte edildiği ve yok denecek kadar az veya hiç toksisitenin oluşmadığı ortaya konulmuştur. Bu yöntemlerle GFP (Green flloresan protein) ve LUC (lusiferaz reporter) genleri transfekte edilmiştir (Tucker ve ark, 2003). Bu çalışmada pcmv-dsred ve peyfp-mem ekspresyon vektörlerinin lipofektamin 2000 kiti kullanılarak insan incebağırsak kanser hücrlerine (HCT-8) transient transformayonunu gerçekleştirmek amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Materyal Kullanılan Plazmidler pcmv-dsred Ekspres Vektör: Bu plazmid BD Biosciences Clontech firmasından (Kat no: PT3682-5) satın alınmıştır. Neomisin ve kanamisin antibiyotiğine karşı dirençlidir ( peyfp-mem Vektör: Bu plazmid BD Biosciences Clontech firmasından (Kat no: PT3682-5) satın alınmıştır. Neomisin ve kanamisin antibiyotiğine karşı dirençlidir 53

3 ( Kullanılan Cihazlar İnvert floresan Mikroskop: Olympus CK2 ULWCD 0.30 invert mikroskop kullanılarak infekteli HCT-8 (Human Ileocecal adenocarcinoma cell) hücreleri incelenmiştir. Kullanılan Besi yerleri, hücre kültürleri ve kültür ortamları LB-agar ve LB-sıvı ortamı: (LB agar Invitrogen; Kat no: ), (LB Broth (Invitrogen; Kat no: ) ( Transformantların çoğaltılmasında kullanılan besiyerleridir. HCT-8 (Human adenocarcinoma, ileocecal) hücreleri: (CCL-244 ATCC Kat no: ). Bu hücreler ATCC firmasından satın alınmıştır. Elde edilen transformantların çoğaltılması amacıyla kullanılan hücre kültürleridir. RPMI-1640 kültür ortamı: RPMI-1640 [(25 mm Hepes içeren, sodyum bi karbonat ve L-glutamin bulunduran) (Sigma; R5886)] (Gibco, Kat no: ). HCT-8 hücrelerinin çoğaltılması için kullanılan besin ortamıdır. DH5α Tm Escherichia coli kompetent hücreleri: (Kat No: ; Invitrogen firmasından satın alınan bu bakteriler plazmidlerin transformasyonu işleminde kullanılacaktır ( Kullanılan Primerler pcmv-dsred Ekspres Vektör Primerleri F- CCCAGT TCCAGTACGG R- CCCAGCCCATAGTCTT peyfp-mem Vektör primerleri F:AACA GCCACAACGT CT R: CCT GCT GGA GTT CGT Metot Plazmidlerin Lipofektamin Yöntemi İçin Hazırlanması Plazmidleri çoğaltmak için Escherichia coli bakterilerine transformasyonu sağlanmıştır. Bu plazmidlerin DH5αTm E. coli kompetent bakterilerine transformasyonu için Subcloning Efficiency TM DH5α TM kompetent Hücre (Kat no: , invitrogen chemically Competent Cells) kiti kullanılmıştır. pcmv- DsRed-Ekspres (PT Kat no ) vektör çoğaltılırken seçici antibiyotik olarak kanamisin 50 μg/ml, peyfp-mem Vektör için 100 μg/ml lik ampisilin kullanılmıştır. Çoğaltılan plazmidler Eppendorf Perfectprep Plasmid İzolasyon Kiti (Kat No: ) kullanılarak izole edilmiştir. İzole edilen plasmidler Real time PCR da Çizelge 1 ve 2 de gösterilen programlar kullanılarak doğrulanmıştır. 54

4 Çizelge 1. pcmv-dsred ekspres vektör ile Real-time PCR koşullarının optimizasyonunda kullanılan program Analysis Mode Cycles Segment Target Temperature Hold Time Acquisition Mode Pre-Incubation None 1 95 o C 10 min none Amplification Quantification 45..Denaturation Annealing Extension Melting Curves 1 Denaturation Annealing Melting 95 o C 2 s none 68 o C (Primere bağlı) 2 s none 72 o C =amplicon/[bp]/25s 9 s single Melting Curve 1s none 95 o C 65 o C 15 s none 95 o C 0 s continuous Slope= 0.1 o C/sec Cooling None 1 40 o C 30s none Çizelge 2. peyfp-mem vektör ile Real-time PCR koşullarının optimizasyonuna ait program Analysis Mode Cycles Segment Target Temperature Hold Time Acquisition Mode Pre-Incubation None 1 95 o C 10 min none Amplification Quantification 35 Denaturation Annealing Extension Melting Curves 1 Denaturation Annealing 95 o C 1 s none 66 o C (Primere bağlı) 2 s none 72 o C =amplicon/[bp]/25s 10 s single Melting Curve 95 o C 0 s none 65 o C 15 s none 95 o C 0 s continuous Slope= 0.1 o C/sec Melting Cooling None 1 40 o C 30s none 55

5 % konfluent HCT-8 hücre kültürünün hazırlanması (CCL- 244, ATCC) HCT-8 hücre kültürü RPMI-1640 [(25mM Hepes + sodyum bi karbonat içerip L-glutamin bulundurmayan) (Sigma; R5886)] ortamı kullanılarak çoğaltılır. RPMI-1640 besi ortamını zenginleştirmek için % 10 At serumu (Gibco; Kat no: ), % 1 Penisilin/Streptomisin (Sigma; Kat No: P0781), 1 mm Sodyum prüvat (Sigma; Kat no: S8636), % 1 L-glutamin (Sigma; Kat no: G7513) ilave edilmiştir. Lipofektamin 2000 ile plazmidlerin transfeksiyonu Önce plazmidler RPMI-1640 besi ortamında aşağıdaki gibi sulandırılmışlardır. 0.4 μl stok YFP(1 μg/ μl ) /49.6 μl RPMI-1640 ortamı (serum ve antibiyotik içermeyen) 1.4 μl stok RFP (300 ng/ μl) /48.6 μl RPMI-1640 ortamı (serum ve antibiyotik içermeyen) Lipofektamin 2000 solüsyonu 96 kuyucuklu plakın her bir kuyucuğu için 0.5 μl lipofektamin 2000/25 μl at serumu ve antibiyotik içermeyen RPMI-1640 ortamı olacak şekilde hazırlanmıştır. Deneydeki 8 kuyucuk için 0.5 μl x 8= 4 μl lipofektamin 2000/ 25x8=200 μl at seumu ve antibiyotik içermeyen RPMI-1640 ortamı kullanılmıştır. 25 μl sulandırılmış plasmid DNA sı + 25 μl lipofektamin 2000 karışımı 20 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. 50 μl lik bu kompleks % konfluent olan 96 kuyucuklu plaklara aktarılmıştır. 4-6 saat sonra plaklardaki ortam, taze besi ortamıyle (at serumu ve antibiyotik içeren besi ortamı) değiştirilmiştir. 37 o C de % 5 CO 2 içeren inkübatörde saat bekletilmiştir. 24 saatlik inkübasyondan sonra plak invert floresan mikroskop altında incelenmiştir. Her iki vektör ekspresyonu floresan mikroskop altında gözlenmiştir. Araştırma Bulguları Bu çalışmada kullanılan plazmidler E.coli bakterilerine transfome edilip çoğaltıldıktan sonra izole edilen plazmidlerin peyfp-mem vektör olup olmadığı RFP primerleri kullanılarak yapılan Real-time PCR sonucunda doğrulanmıştır. Elde edilen Real time PCR melting curve analizi sonucu Şekil 1 de görüldüğü gibidir. 56

6 Şekil 1. YFP primerleriyle yapılan Real-time PCR da melting curve analizi (Örnek sırası: 1: H 2 0 (negatif kontrol); 2: YFP plasmid DNA 0.5 ng (pozitif kontrol); 3: YFP plasmid DNA 2 ng (bilinmeyen örnek); 4: YFP plazmid DNA 3 ng (bilinmeyen örnek)) peyfp-mem Vektör baz dizisinden sentezlenen primerler kullanılarak yapılan Real time PCR sonucunda her iki bilinmeyen plazmid DNA örneği, pozitif kontrol ile aynı Tm i vermesiyle doğrulanmıştır. pcmv- DsRed-Ekspress Plazmidinin Real time PCR ile Doğrulanmasına Ait Bulgular İzole edilen plazmidlerin RED vektör olup olmadığı RFP primerleri kullanılarak yapılan Real time PCR sonucunda doğrulanmıştır. Elde edilen Real time PCR melting curve analizi sonucu Şekil 2 de gösterildiği gibidir. 57

7 Şekil 2. pcmv- DsRed-Express vektör kolonilerinin melting curve analizi (Örnek sırası: 1: Negatif kontrol (sadece su); 2: Red plazmid vektör (pozitif kontrol); 3; MDBK DNA (hücre kültürü DNAsınegatif kontrol); 4: Negatif kontrol (sadece su- MgCl 0.8 için); 5: Red plazmid vektör (pozitif kontrol MgCl 0.8 için); 6: MDBK DNA (hücre kültürü DNA sı- negatif kontrol MgCl 0.8 için) pcmv- DsRed-Express Vektör baz dizisinden sentezlenen primerler kullanılarak yapılan Real time PCR sonucunda her iki bilinmeyen plazmid DNA örneğinin, pozitif kontrol ile aynı melting Tm i vermesiyle doğrulanmıştır. Transfeksiyon İşleminden Sonra Plazmid Ekspresyonlarının Fluoresans Mikroskop Altında İncelenmesi Plazmidler ve hücre kültürleri hazırlanıp lipofektamin ile transfeksiyon işleminden bir gün sonra chamber permanox slayt fluoresans mikroskop altında incelenip her bir plazmid ekspresyonunun fotoğrafları çekilmiştir (Şekil 3). 58

8 YFP RFP Negatif Kontrol Şekil 3. pcmv- DsRed-Ekspres vektör ve peyfp-mem vektör ekspresyonlarının inverted mikroskop altındaki görüntüleri (Birinci örnek sırası: YFP: HCT-8 hücrelerindeki YFP ekspresyonu; RFP: HCT-8 hücrelerindeki RFP ekspresyonu; Negatif Kontrol: sadece HCT-8 hücreleri) Lipofektamin ile transfeksiyon neticesinde floresan mikroskop altında YFP vektör yeşil fluoresan, RFP vektör ise kırmızı fluresan oluşturmuştur. Tartışma ve Sonuçlar Bakteri transformasyonu, alıcı hücrelerin bulundukları ortamdaki DNA moleküllerini hücre içine alabilme yetenekleri olarak tanımlanmıştır. Bu mekanizma doğada Streptococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Rhizobium spp., Pneumococcus spp. gibi bakteri gruplarında doğada kendiliğinden oluşmaktadır. Fakat oluşum frekansı oldukça düşüktür (Temizkan ve ark., 1999). Bakteriler arasında plazmidlerin transferi; transdüksiyon, konjugasyon ve transformasyon ile mümkündür (Mach ve Grimes, 1982; Mazodier ve Davies, 1991). Bir çok bakteri türü farklı oranlarda transformasyon için doğal olarak kompetent (yetenekli veya hazır) olabilir ancak E. coli gibi kompetentliğe inatçı türler, fiziksel ve kimyasal metodlarla kompetent hale getirilebilirler (Wang ve Taylor, 1990). Bu çalışmada pcmv-dsred-ekspres ve peyfp-mem Vektörleri DH5α Tm Escherichia coli kompetent hücrelerine başarılı bir şekilde transforme edilmiştir. Bu bakteriler önce kimyasal yolla (DH5α Tm Escherichia coli kompetent hücreleri; Kat No: ; Invitrogen) kompetent hale getirilmiştir. Transformantların seçilmesi için uygun antibiyotik içeren LB agar besi yerleri ve rekombinatların sayısını arttımak için de (dolayısıyle içindeki plazmid sayısıda 59

9 artmış olacağından) sıvı LB besi ortamı kullanılmıştır. Çoğaltılan plasmidlerin izolasyonu Eppendorf Perfectprep Plasmid İzolasyon Kiti (Kat No: ) ile sağlanmıştır. İzole edilen plazmidler Real time PCR cihazında her bir plasmid baz dizisinden elde edilen primerler kullanılarak yapılan melting curve analizi ile doğrulandıktan sonra bu plazmidler HCT-8 hücrelerine lipofektamin yöntemi ile transfekte edilmiştir. Weechrangsan ve ark. (2007), insan kanser hücre kültürlerinde katyonik vektörlerin (polyetilamin, PEI25K, lipofektamin), elektroporasyon yöntemi ve bu yöntemlerin her ikisinin birlikte uygulanmasının transfeksiyon üzerine olan etkilerini araştırmışlardır. Katyonik vektörler ve elektroporasyon yöntemleri ayrı ayrı uygulandığında trasfeksiyon etkinliğine sahipken, birlikte uygulandıklarında transfeksiyon üzerinde etkinliklerinin olmadığı bulunmuştur. Anji ve ark. (2003), primer kortikal nöronlarda lipid temelli transfeksiyon metoduna etanolün etkisini araştırmışlardır. Plazmid DNA sının nöron kültürlerine aktarılmasında çeşitli transfeksiyon yöntemleri kullanılmıştır. Viral infeksiyonu içeren metodla transfeksiyon gerçekleştirilirken, kalsiyum-fosfat presipitasyon yöntemi ve elektroporasyon yönteminin bu kültürler için etkili olmadığı tespit edilmiştir. Deneyler sırasında 50 mm etanol içeren ve içermeyen hücre kültürlerine lipofektamin yöntemi uygulanmıştır. Nöronlardaki ekspresyonu göstermek için üç memeli ekspresyon vektörüsırasıyla renilla lusiferaz, ateşböceği lusiferazı, ve beta galaktosidaz reporter genlerini taşıyan ekspresyon vektörleri kullanılmıştır. Sonuç olarak ateşböceği lusiferaz reporter geninin ekspresyonu etanol bulunan nöron kültürlerinde, etanol bulundurmayan nöron kültürlerinden yaklaşık 2.5 kat daha fazla ekspresyon gözlenmiştir. Yine etanol bulunduran nöron kültürlerinde beta galaktosidaz ekspresyonunun fazla olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışma fetal kortikal nöronlarda etanol muamelesinin reporter genlerin ekspresyonunu arttıran yönde etkili olduğunu ortaya koymuştur Nikcevic ve ark. (2003), lipofektamin (life teknologies) ve effekten (Qiagen) transfeksiyon yöntemiyle lacz reporter genlerini taşıyan pch110 ökaryotik deney vektörlerini NT2/D1 ve Hela hücre kültürlerine transfekte etmişlerdir. Effekten yöntemiyle transfeksiyon etkinliği için protokolün önerdiği plazmid DNA sından kez daha yüksek oranda DNA kullanılmış ve herhangi bir sitotoksisite sorunu ile karşılaşılmamıştır. Lipofektamin yöntemiyle ise her iki hücre kültüründe protokolün belirttiği optimal transfeksiyon etkinliği elde edilmiştir. Bu çalışmada lipofektamin 2000 yönteminin HCT-8 hücre kültürleri kullanılarak optimizasyonunda 1:2 DNA /lipofektamine 2000 şeklinde protokolün önerdiği miktarlar uygulanmıştır. Hücre kültürünün % konfluent olduğu ve YFP (1 μg/ μl ), RFP (300 ng/ μl) plasmidlerinin uygun konsantrasyonda kullanıldığı koşullarda lipofektamin yönteminin transient transformasyonda etkili ve kolay bir yöntem olduğu gözlenmiştir. Decastro ve ark. (2006), katyonik lipid temelli transfeksiyon yöntemlerini büyümekte olan vertebra embriyolarında gen ekspresyonlarını göstermek için kullanmışlardır. Bu amaçla lipofektamin, lipofektamin 2000, lipofektamin (mpeg- 60

10 SS-DOPE) gibi katyonik lipid transfeksiyon yöntemleri optimize edilmiş hücre kültürlerinde denenmiştir. İn vitro gen ekspresyonlarında lipofektamin 2000 (1:4 DNA/ lipofektamin 2000) ile % 7.5 oranında lipofektamin (mpeg-ss-dope) yöntemlerinin daha yüksek oranda ekspresyona neden oldukları belirlenmiştir. Her iki yöntemde etkili olmasına rağmen lipofektamin (mpeg-ss-dope) yönteminin lipofektamin 2000 yöntemine göre daha sınırlı hücre kültürlerinde etkili olduğu ortaya konulmuştur. Bu çalışmayla katyonik lipid temelli transfeksiyon yöntemlerinin elektroporasyon yöntemine alternatif kullanılabileceği tespit edilmiştir. Bu çalışmada Lipofektamin 2000 yöntemiyle YFP, RFP vektörler HCT-8 hücrelerine başarılı bir şekilde transfekte edilmiştir. YFP ve RFP vektörlerininin ekspresyonları invert mikroskop altında incelenip fotoğrafları çekilmiştir. RFP vektör DsRed-ekspres bölgesini (Discosoma spp. varyantı Red fluresan protein) kodladığı için invert floresan mikroskop altında kırmızı renkte floresan oluştururken; YFP vektör ise GFP (green floresan protein) nin bir varyantı olan yeşil floresan proteinlerini kodladığından yeşil renkte gözlenmiştir. Aynı zamanda bu yöntemle RFP vektörlerinin ekspresyonunun YFP vektör ekspresyonundan daha belirgin olduğu invert floresan mikroskop altında çekilen fotoğraflarda gözlenmiştir. Lipofektamine 2000 yönteminin uygulanabilirliği anlamında bu çalışma bir optimizasyon çalışmasıdır. Kaynaklar ANJII, A., SHAIK, S.A., KUMARI M., Effect of ethanol on lipid-mediated transfection of primary cortical neurons. Ann N Y Acad. Sci, 993: DECASTRO, M., SAIJOH, Y., SCHOENWOLF, G.C., Optimized cationic lipid-based gene delivery reagents for use in developing vertebrate embryos. Dev Dyn,235(8): FELGNER, P.L., HOLM, M., Cationic Liposome-mediated Transfection. Focus. Life Technologies, 11: HAN MING-YONG, ZHENG SHU, YU JIN-MING, PENG JIA-PING, GUO QI-SEN, WANG JIA-LIN, Study on interleukin-18 gene transfer into human breast cancer cells to prevent tumorigenicity. 1Cancer Institute, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou , China, 2Shandong Tumor Hospital, Jinan , China, SCI (4): MACH, P.A., GRIMES, D.J., R-plasmid Transfer in A Wastewater Treatment Plant. Appl.Env. Microbiol, MAZODIER, P., DAVIES, J., Gene Transfer Between Distantl Releated Bacteria, Annu. Rev. Genet., 25: NIKCEVIC, G., KOVACEVIC-GRUJICIC, N., STEVANOVIC, M., Improved transfection efficiency of cultured human cells. Cell Biol İnt. 27(9): SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition.(2004),

11 TEMİZKAN, G., YILMAZER, S., ÖZTÜRK, M., ARI Ş., ERTAN, H., OLGUN, A., SARIKAYA, T.A., ARDA, N., Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. 51:57 TUCKER, T.A., VARGA, K., BEBOK, Z., ZSEMBERY, A., MCCARTY, N.A., COLLAWN, J.F., SCHWIEBERT, E.M., SCHWIEBERT, L.M., Transient transfection of polarized epithelial monolayers with CFTR and reporter genes using efficacious lipids. Department of Physiology and Biophysics, University of Alabama at Birmingham, 35294, USA. Am J Physiol Cell Physiol. 284(3):C WANG, Y., TAYLOR, D.E., 1990, Natural Transformation in Campylobacter Species, J. Bacteriol, 172: WEECHARANGSAN, W., OPANASOPİT, P., LEE, R. J., In vitro gene transfer using cationic vectors, electroporation and their combination. Anticancer res, 27(1A):